Trabalho imunológia

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Escola Técnica Municipal de Sete Lagoas
(FUMEP)
Tatiane Pereira Campos
Imunologia 
SETE LAGOAS/MG
2016
· Imunofluorescência 
Imunofluorescência é definida como uma técnica que possibilita a visualização de antígenos nos tecidos ou em suspensões celulares, por meio da utilização de anticorpos específicos, marcados com fluorocromo, capazes de absorverem a luz ultravioleta (UV), emitindo-a num determinado comprimento de onda, permitindo sua observação ao microscópio de fluorescência (com luz UV).
Dentre os fluorocromos mais comumente utilizados estão:
· Fluresceína (FITC);
· Rodamina (TRICT).
Após os fluoróforos serem excitados por um determinado comprimento de onda, emitem fótons de luz fluorescentes a um comprimento de onda superior.
Existem dois tipos distintos de imunofluorescência. São elas:
· Imunofluorescência direta;
· Imunofluorescência Indireta;
Imunofluorescência Direta
Utiliza-se esta técnica, também conhecida como técnica de camada simples, para detecção de antígenos em amostras clínicas utilizando-se anticorpos marcados com fluorocromos.
As etapas deste procedimento compreendem:
· Fixação do esfregaço da lâmina;
· Tratamento com anticorpo marcado;
· Incubação;
· Lavagem para remover excesso de anticorpos marcados não ligados;
· Visualização no microscópio fluorescente.
As indicações desta técnica são: detecção de vírus, parasitas, antígenos de tumor de amostras ou monocamadas de células do paciente. É utilizado também na identificação da distribuição de um antígeno no interior de um tecido ou compartimento de uma célula.
Imunofluorescência Indireta
Utiliza-se este tipo de imunofluorescência, também conhecida como técnica de dupla camada, na detecção de anticorpos no soro do paciente por meio de antígenos fixados em uma lâmina, na qual se aplica primeiramente um anticorpo específico não fluorescente. Por fim, coloca-se um anticorpo fluorescente com especificidade marcada contra determinados antígenos do primeiro anticorpo usado para reagir com o antígeno.
Esta técnica tem como vantagem possibilitar uma fluorescência mais evidente, uma vez que os anticorpos fluorescentes associam-se somente aos anticorpos primários, além de permite trabalhar com diversos anticorpos primários específicos para distintos tipos de antígenos, sendo capaz de identificar qual a classe a qual o anticorpo pertence.
Habitualmente, a imunofluorescência indireta é utilizada na detecção de auto-anticorpos, e também, na detecção de anticorpos anti-nucleares encontrados no soro de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico.
· RADIOIMUNOENSAIO
O radioimunoensaio é um dos métodos mais sensíveis para a análise quantitativa das reações antígeno-anticorpo, permitindo medidas rápidas e precisas; mesmo em preparações não purificadas, apresenta limiar de detecção da ordem de nanogramas ou picogramas. Com limitações destacam-se o custo do teste, a vida média dos reagentes e o risco operacional.
O radioimunoensaio pode ser utilizado para quantificar hormônios, drogas, marcadores tumorais, alérgicos e anticorpos e antígenos em doenças parasitárias. Há muitas variações, mas o princípio é o mesmo: a quantidade de reagente marcado (antígeno ou anticorpo) quantifica o antígeno ou anticorpo não marcado na amostra.
Radioimunoensaio Direto:
No radioimunoensaio direto, uma quantidade fixa e limitada de anticorpo é ligada a um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa e pequena de antígeno marcado, misturada com uma amostra em teste ou com as soluções padrão que contêm concentrações conhecidas do antígeno não marcado. Após um período de incubação, remove-se o antígeno não ligado e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida.
A partir da resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva.
Radioimunoensaio de competição:
No radioimunoensaio de competição, uma quantidade fixa do antígeno é imobilizada em um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa de anticorpo marcado específico, misturada com a amostra em teste ou uma série de soluções padrão com concentrações variadas do antígeno solúvel. Após um período de incubação, o anticorpo marcado que não se ligou à fase sólida e o antígeno solúvel são removidos por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida.
A partir da resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva.
Radioimunoensaio de captura:
No radioimunoensaio de captura, uma quantidade fixa de anticorpo é imobilizada em um suporte. A solução teste, com quantidade desconhecida de antígeno, ou as soluções padrão, com concentrações conhecidas do antígeno são adicionadas. Após a incubação, remove-se o antígeno não-ligado e adicionam-se anticorpos marcados específicos para o antígeno, com sítio de ligação diferente do sítio do anticorpo de fase sólida. O anticorpo marcado não-ligado é removido por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida.
A partir da resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva.
No radioimunoensaio clássico os reagentes são:
• O Anticorpo
• O antígeno marcado
• O antígeno frio contido nas amostras e padrões.
· Imunoenzimático- Elisa 
A ELISA (do inglês, Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) se baseia na identificação de anticorpos e ou antígenos, por anticorpos marcados com uma enzima, de maneira que esta enzima age sobre um substrato e a reação faz com que o cromógeno mude de cor.O produto da reação, além de colorido, é insolúvel para não difundir do local da formação.
A reação é desenvolvida, frequentemente, em microplacas contendo vários poços onde são depositados os reagentes. Há várias maneiras (métodos) de se processar o ensaio imunoenzimático.
O método competitivo é mais usado para identificação de antígenos, mas pode também ser empregado para a detecção de anticorpos. Neste método primeiro se adsorve o anticorpo no poço da microplaca. Após a adsorção do anticorpo, uma solução que possivelmente contém o antígeno é adicionada sobre os anticorpos adsorvidos. O próximo passo é adicionar o antígeno marcado com uma enzima. Os poços que não possuem o antígeno primário (da solução problema) aderido ao anticorpo ficam coloridos, enquanto que os poços que possuem antígenos aderidos aos anticorpos não mudam de cor.
O método indireto é utilizado para detecção de anticorpos. Neste caso o antígeno fica aderido aos poços da microplaca. Em seguida coloca-se o soro problema e em seguida um anticorpo marcado com uma enzima que reage com o substrato fazendo com que o cromógeno mude de cor. A presença de cor nos poços indica a presença do anticorpo, e os poços que não mudarem de cor indica a ausência do anticorpo em questão.
O método de sanduíche, ou captura, é indicado para identificação de antígenos, e este antígeno fica entre dois anticorpos. Assim, um anticorpo primário específico ao antígeno é adsorvido no poço da microplaca. Em seguida o antígeno na solução problema é adicionado. Depois o segundo anticorpo específico ao antígeno é marcado com uma enzima é adicionado. Esta enzima que reage com o substrato fazendo com que o cromógeno mude de cor. A presença de cor nos poços indica a presença do antígeno, e os poços que não mudarem de cor indica a ausência do antígeno em questão.
· ELFA
A sorologia para Toxoplasmose é o método mais utilizado no diagnóstico desta doença. Entretanto, não existe nenhum teste, que de forma única, suporte ou afaste o diagnóstico de infecção recente ou tardia. Assim, a análise do resultado deve ser cautelosa. Anticorpos IgG surgem em 1 a 2 semanas com pico em 1 a 2 meses; caem variavelmente podendo persistir por toda vida. Valores elevados com IgM negativo não significam maior probabilidade de infecção recente. Anticorpos IgM surgem em 5 dias, diminuindo em poucas semanas ou meses. Podem persistir por até 18 meses, não significando necessariamente infecção recente. Um resultado de IgM negativo ou positivo na gravidez não diagnostica ou afasta infecção aguda,sendo necessária complementação diagnóstica. O IgM Não ultrapassa a placenta, sendo útil no diagnóstico da infecção congênita em recém-nascido. Anticorpos IgA 
são detectados em infecções agudas e na doença congênita. Podem persistir por meses, até mais de 1 ano. Maior sensibilidade que IgM na infecção congênita. 
Teste de Hemaglutinação: útil para indicar prevalência, mas não para o diagnóstico de infecção neonatal ou quadro recente em gestante, devido à possibilidade de falsos-positivos. Detecta anticorpos mais tardiamente que a imunofluorescência e que os testes imunoenzimáticos. Imunoensaio enzimático IgA: detectada na infecção recente, permanecendo elevada por, no mínimo, 26 semanas. Não atravessa a placenta e não é absorvida pelo leite materno, tendo, pois, utilidade no diagnóstico de Toxoplasmose congênita. Apresenta sensibilidade de 83,3% e especificidade de 94% em crianças com toxoplasmose congênita durante os doze primeiro meses de vida. No primeiro mês de vida, a combinação de IgA e IgM melhora o desempenho dos ensaios em relação aos mesmos de forma isolada. Imunoensaio enzimático IgM: trata-se de 
método totalmente automatizado, preciso, rápido e de alta reprodutibilidade. Apresenta especificidade de 98% e sensibilidade de 95%. Por tratar-se de método sensível, pode permanecer detectável até dois anos após a infecção aguda. Um único resultado positivo não pode ser considerado patognomônico de toxoplasmose recente. Conforme orientação norte- americana do FDA, resultados positivos requerem confirmação por uma forma alternativa de ensaio, como ELFA, e coleta de nova amostra após 3 semanas. Imunoensaio enzimático IgG: esse método apresenta especificidade de 98% e sensibilidade de 96%. Independente do nível de anticorpos, não pode predizer se a infecção é recente ou tardia. Alto índice de positividade na população brasileira. Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) IgM - captura: método automatizado, de grande reprodutibilidade, que elimina as interferências do fator reumatóide. Devido à sua alta sensibilidade, pode detectar níveis baixos de anticorpos por longos períodos após fase aguda (18 meses). Útil para confirmação de IgM 
positivo em outros ensaios. Apresenta sensibilidade de 100% e especificidade de 98,6%. Em pacientes imunocomprometidos resultado negativo desse teste não exclui o diagnostico de toxoplasmose. Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) IgG: títulos altos não predizem, de forma isolada, infecção recente. Apresenta sensibilidade de 98,1% e especificidade próxima a 100%. Teste de Avidez IgG (Imunoensaio enzimático): na fase aguda anticorpo IgG liga-se fracamente ao antígeno (baixa avidez). Na fase crônica (> 4 meses) tem-se elevada avidez. 
É indicado para mulheres grávidas, principalmente no primeiro trimestre, que apresentam IgG e IgM positivos. A detecção de anticorpos de alta avidez em pacientes com IgM positivo indica infecção adquirida há mais de 4 meses. Tratamento antiparasitário pode manter a baixa avidez por mais de 4 meses. Estudo em amostra brasileira evidenciou ser o teste de IgG avidez o melhor marcador de infecção aguda em pacientes com IgM positivo. 
· Western blot 
A técnica de western blotting também pode ser denominada protein immunoblot e consiste na detecção de proteínas específicas em amostras de lisados celulares ou de tecidos. Os passos para a elaboração dessa técnica pode ser resumida em cinco etapas:
(1) Extração e quantificação das proteínas; 
 (2) fracionamento das proteínas da amostra em um gel de poliacrilamida;
 (3) transferências dessas proteínas para uma membrana;
 (4) incubação da membrana com um anticorpo para detectar a proteína específica a ser analisada; e 
 (5) revelação dessa membrana para análise dos dados.
· PCR (Reação em cadeia de polimerase)
A Reação em Cadeia da Polimerase (que em inglês é Polymerase Chain Reaction – PCR) é definida como uma técnica de amplificação de ácido desoxirribonucleico (DNA) sem utilizar organismos vivos.
Este processo foi descrito primeiramente por Kary Mullis, no ano de 1983, sendo que somente dez anos depois foi lhe concedido o Prêmio Nobel da Química pelo seu trabalho. No ano de 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patenteou esta técnica.
Atualmente, o PCR é utilizado em laboratórios de investigação médica e biológica objetivando diferentes tarefas, como a identificação de doenças hereditárias, a construção de árvores filogenéticas, a clonagem de genes, teste de paternidade, detecção de organismos causadores de infecções, concepção de organismos transgênicos, entre outras.
Para a realização deste procedimento, o primeiro passo é extrair o material genético da célula ou do local a ser estudado com cuidado para que o mesmo não seja danificado e nem sofra contaminação. Habitualmente, o material coletado é o DNA; todavia, pode-se utilizar o RNA em uma RT-PCR que consiste em um desdobramento do PCR e apresenta outras aplicações.
Após a extração do material, juntamente a este é adicionada uma mistura, também chamada de pré-mix, na qual estão presentes os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfato), sendo estas bases nitrogenadas ligadas com um três fosfato, os denominados primers (também conhecidos por oligonucleotídeos ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase em uma solução tampão. Este material vai para um aparelho conhecido como termociclador, aquecendo e esfriando o material ali contido em ciclos de temperatura pré-estabelecidos.
Primeiramente, o tudo é aquecido a uma temperatura entre 90° a 96°C para que ocorra a desnaturação do DNA (separação das fitas). Por conseguinte, a temperatura do termociclador cai (50° a 60°C) para que haja a hibridização ou anelamento. Neste ponto do procedimento, os primersse ligam com especificidade às suas sequencias complementares do DNA. Subsequentemente há uma elevação da temperatura a aproximadamente 72°C para que ocorra a síntese pela polimerase (extensão de uma nova molécula). Em seguida, um novo ciclo é iniciado, sendo que normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação, apresentados taxa de replicação exponencial.
A análise do resultado é feita por um meio da eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida, sendo interpretada por um profissional treinado.
Certos problemas técnicos podem interferir no resultado do PCR, como a contaminação do material por substâncias que conhecidamente inibem a reação, como é o caso da hemoglobina, bem como a contaminação por um material genético que não está sendo estudado. Deste modo, para reduzir as chances de erro, os profissionais que manuseiam as amostras devem adotar certas medidas, como o uso de luvas, tubos descartáveis, dentre outras.
· Fontes 
Radioimunensaio: Técnicas de Marcadores Radioativos, disponível em: http://www.zemoleza.com.br/trabalho-academico/biologicas/bioquimica/radioimunensaio-tecnicas-de-marcadores-radioativos/ acessado em, 15 de novembro de 2016 ás 16h14min.
Reação cadeia de polimerase, disponível em: http://www.infoescola.com/genetica/reacao-em-cadeia-da-polimerase/ acessado em, 15 de novembro de 2016 às 16h33min.
Reação imunoenzimática-Elisa, disponível em: https://www.portaleducacao.com.br/farmacia/artigos/6972/reacaoimunoenzimatica-elisa acessado em, 15 de novembro de 2016 ás 16h49min.