Caracterização da MAGP-1 na Trombogênese

Prévia do material em texto

CARACTERIZAÇÃO	
  DOS	
  DOMÍNIOS	
  DA	
  GLICOPROTEÍNA	
  ASSOCIADA	
  
À	
  MICROFIBRILA	
  (MAGP-­‐1)	
  IMPORTANTES	
  NA	
  TROMBOGÊNESE	
  
Fabiana	
  Uno	
  de	
  Souza,	
  Tallita	
  Vassequi	
  da	
  Silva,	
  Claudio	
  Chrysostomo	
  Werneck	
  
Departamento	
  de	
  Bioquímica	
  –	
  InsDtuto	
  de	
  Biologia	
  –	
  Laboratório	
  de	
  Fibras	
  ElásDcas	
  
Agência	
  Financiadora:	
  Pibic-­‐CNPq	
  
Palavras-­‐chave:	
  	
  	
  MAGP-­‐1	
  	
  	
  	
  -­‐	
  	
  	
  	
  Trombogênese	
  	
  	
  	
  -­‐	
  	
  	
  	
  Microfibrila	
  
.	
  
INTRODUÇÃO	
  
	
  	
  
As	
   fibras	
   elásDcas	
   são	
   importantes	
   componentes	
   de	
   tecidos	
   que	
   estão	
   sob	
  
constante	
   estresse	
   mecânico,	
   sendo	
   compostas	
   primordialmente	
   por	
   elasDna	
   e	
  
microfibrilas.	
   A	
   Glicoproteína	
   associada	
   à	
   microfibrila-­‐1	
   (MAGP-­‐1)	
   é	
   idenDficada	
  
como	
  parte	
  integrante	
  da	
  rede	
  de	
  microfibrilas,	
  embora	
  suas	
  funções	
  intracelulares	
  
e	
   extracelulares	
   ainda	
   não	
   tenham	
   sido	
   elucidadas.	
   UDlizando	
   os	
   camundongos	
  
nulos	
   para	
  MAGP-­‐1	
   em	
   ensaios	
   de	
   trombose	
   arterial,	
   foi	
   possível	
   verificar	
   que	
   a	
  
ausência	
  de	
  MAGP-­‐1	
  leva	
  a	
  uma	
  deficiência	
  na	
  trombogênese	
  e	
  ainda,	
  que	
  a	
  injeção	
  
prévia	
  de	
  MAGP-­‐1	
  recombinante	
  corrige	
  esta	
  deficiência,	
  levando	
  ao	
  tempo	
  normal	
  
de	
  formação	
  do	
  trombo.	
  Esta	
  aDvidade	
  pró-­‐trombóDca	
  da	
  MAGP-­‐1,	
  pelo	
  menos	
  em	
  
parte,	
  pode	
  ser	
  obDda	
  uDlizando	
  um	
  pep`deo	
  encontrado	
  na	
  região	
  C-­‐terminal	
  que	
  
apresenta	
  dois	
  resíduos	
  de	
  valina	
  na	
  sua	
  porção	
  central.	
  O	
  objeDvo	
  desse	
  projeto	
  é	
  
a	
   obtenção	
   de	
   formas	
   mutantes	
   de	
   MAGP-­‐1	
   nestes	
   resíduos	
   de	
   valina	
   e	
   a	
  
caracterização	
   de	
   seu	
   papel	
   na	
   trombogênese	
   arterial	
   através	
   do	
   estudo	
   da	
  
interação	
   da	
   MAGP-­‐1	
   com	
   proteínas	
   importantes	
   no	
   processo	
   de	
   coagulação	
  
sanguínea/trombose,	
   bem	
   como	
   a	
   	
   avaliação	
   “in	
   vivo”	
  dos	
   efeitos	
   destas	
   formas	
  
mutantes	
  uDlizando	
  camundongos	
  deficientes	
  em	
  MAGP-­‐1	
  e	
  animais	
  selvagens.	
  	
  
	
  	
  
MÉTODOS	
  
	
  
O	
  processo	
  de	
  mutagênese	
  completo	
  levou	
  à	
  obtenção	
  de	
  duas	
  mutações	
  pontuais	
  
sequenciais	
  na	
   região	
  C-­‐terminal	
  da	
  molécula	
  MAGP-­‐1.	
  O	
  produto	
  do	
  processo	
  de	
  
PCR	
   (Polymerase	
   chain	
   reacDon)	
   foi	
   transformado	
   em	
   células	
   supercompetentes	
  
Max	
   Efficiency.	
   TM.	
   DH5αTM	
   (Invitrogen)	
   e	
   plaqueado	
   em	
   meio	
   semi-­‐sólido.	
   As	
  
colônias	
   submeDdas	
   à	
   reação	
   de	
   sequenciamento	
   cujo	
   resultado	
   mostrou-­‐se	
  
posiDvo	
  para	
  a	
  mutação	
  de	
  interesse	
  foram	
  uDlizadas	
  na	
  transformação	
  de	
  células	
  
M15,	
   com	
   subsequente	
   cultura	
   em	
   presença	
   de	
   anDbióDcos	
   seleDvos	
   (ampicilina	
  
100ug/ml	
  e	
  kanamicina	
  25ug/ml)	
  e	
   indução	
  de	
  expressão	
  com	
  IPTG	
  (concentração	
  
final	
   5mM).	
  O	
  processo	
  de	
  purificação	
  em	
  coluna	
  uDlizando	
   resina	
  de	
  NTA-­‐Níquel	
  
(ácido	
   nitrilo	
   tri-­‐acéDco)	
   foi	
   realizado	
   de	
   acordo	
   com	
   as	
   instruções	
   do	
   fabricante	
  
(QIAGEN).	
  
Para	
  determinar	
  as	
  possíveis	
   interações	
  entre	
  a	
  proteína	
  de	
   interesse	
  mutada	
  nos	
  
processos	
   trombóDcos	
   em	
   camundongos	
   selvagens	
   (C57BL6)	
   e	
   deficientes	
  
(MAGP-­‐/-­‐),	
   realizou-­‐se	
  a	
   injeção	
  de	
  proteína	
  MAGP-­‐VG1	
   (com	
  dupla	
  mutação)	
  em	
  
ambas	
  as	
  linhagens	
  (50ug/kg	
  de	
  peso	
  do	
  animal)	
  e	
  procedeu-­‐se	
  com	
  a	
  determinação	
  
do	
  tempo	
  de	
  oclusão	
  através	
  de	
  modelo	
  fotoquímico	
  de	
  trombose	
  arterial.	
  
	
  	
  
	
  	
  
RESULTADOS	
  E	
  DISCUSSÃO	
  
	
  
O	
  processo	
  de	
  mutagênese	
  culminou	
  na	
  subsDtuição	
  sequencial	
  de	
  um	
  aminoácido	
  
alvo,	
   Valina,	
   por	
   um	
   segundo,	
   Glicina,	
   sem	
   que	
   houvesse	
   outras	
   alterações	
  
detectáveis	
  no	
  restante	
  da	
  sequência	
  geral	
  da	
  molécula.	
  
	
  
	
  
	
  	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Figura	
  1.Ssequências	
  de	
  DNA	
  correspondentes	
  ao	
  vetor	
  pQE30-­‐MAGP-­‐1	
  selvagem	
  (A)	
  que	
  foi	
  submeDdo	
  ao	
  processo	
  de	
  mutagênese	
  
síDo	
  dirigida	
  apresentando	
  a	
  primeira	
  mutação	
  em	
  (B)	
  e	
  a	
  dupla	
  mutação	
  em	
  (C).	
  Em	
  destaque,	
  nota-­‐se	
  a	
  alteração	
  dos	
  nucleo`deos	
  
alvo	
  resultando	
  na	
  subsDtuição	
  inicial	
  de	
  um	
  aminoácido	
  em	
  VG2	
  (B),	
  seguido	
  de	
  uma	
  dupla	
  subsDtuição	
  em	
  VG1	
  (C).	
  
	
  
	
  
	
  
O	
   padrão	
   de	
   bandas	
   obDdo	
   a	
   parDr	
   de	
   eletroforese	
   em	
   gel	
   de	
   poliacrilamida	
  
corresponde	
   ao	
   de	
   uma	
   proteína	
   de	
  massa	
  molecular	
   aparente	
   de	
   32kDa,	
   o	
   que	
  
coincide	
  com	
  o	
  padrão	
  de	
  massa	
  molecular	
   também	
  observado	
  na	
   forma	
  proteica	
  
selvagem	
  (figura	
  2).	
  	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Figura	
  2.	
  (A)	
  MAGP	
  bovina	
  com	
  mutação	
  VG1.	
  em	
  gel	
  de	
  poliacrilamida	
  10%,	
  após	
  transformação	
  em	
  células	
  M15[pREP4]	
  e	
  indução	
  de	
  
expressão	
  protéica.	
  Amostras	
  submeDdas	
  à	
  indução	
  com	
  IPTG	
  (5mM)	
  evidenciadas	
  por	
  bandas	
  escuras	
  com	
  aproximadamente	
  37kDa	
  
(a,	
  c,	
  e,	
  g),	
  enquanto	
  amostras	
  não	
  induzidas	
  (b,	
  d,	
  f)	
  não	
  apresentam	
  banda	
  significante	
  
	
  
O	
   tempo	
  de	
  oclusão	
  mensurado	
  para	
  animais	
   selvagens	
  que	
   receberam	
  a	
   solução	
  
placebo	
   é	
   muito	
   semelhante	
   àquele	
   observado	
   para	
   animais	
   que	
   receberam	
   a	
  
proteína	
   mutada	
   VG1,	
   não	
   havendo	
   ação	
   aparente	
   da	
   molécula.	
   De	
   maneira	
  
semelhante,	
   não	
   há	
   evidência	
   de	
   recuperação	
   do	
   tempo	
   de	
   oclusão	
   nos	
   testes	
  
envolvendo	
  animais	
  deficientes	
  (Figura	
  3).	
  
	
  
	
  
	
  
	
  	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Figura	
  3.	
  Tempo	
  de	
   formação	
  de	
   trombo	
  arterial	
   (em	
  minutos)	
  em	
  camundongos	
   selvagens	
   (C57BL6)	
  e	
  deficientes	
  para	
  a	
  proteína	
  
MAGP-­‐1.	
   Observa-­‐se	
   resultados	
   correspondentes	
   à	
   resposta	
   desses	
   grupos	
   à	
   injeção	
   de	
   solução	
   placebo	
   e	
   de	
   proteína	
   MAGP-­‐1	
  
mutante	
  (VG1).	
  
	
  
CONCLUSÃO	
  
	
  
Os	
  dados	
  obDdos	
  pelo	
  modelo	
  de	
   trombose	
   (Figura	
  3),	
  demonstram	
  que	
  VG1	
  não	
  
atuou	
  recuperando	
  o	
   tempo	
  de	
  oclusão	
  normal	
   (função	
  que	
  é	
  desempenhada	
  por	
  
sua	
  forma	
  selvagem),	
  indicando	
  que,	
  provavelmente,	
  a	
  região	
  na	
  qual	
  induziu-­‐se	
  as	
  
mutações	
  pontuais	
  desempenha	
  papel	
  importante	
  na	
  sua	
  aDvidade	
  pró-­‐trombóDca.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
0.0	
  
20.0	
  
40.0	
  
60.0	
  
80.0	
  
100.0	
  
120.0	
  
140.0	
  
MAGP1+/+	
  	
   MAGP1+/+	
  VG1	
   MAGP1-­‐/-­‐	
  	
   MAGP1-­‐/-­‐	
  VG1	
   MAGP-­‐/-­‐	
  	
  MAGP-­‐1	
  
REFERÊNCIAS	
  
	
  
1.	
  Davis,E.	
  C.	
  (1994)	
  J	
  Cell	
  Sci	
  107	
  (	
  Pt	
  3),	
  727-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐736	
  
2.	
   Segade,	
   F.,	
   Trask,	
   B.	
   C.,	
   Broekelmann,	
   T.	
   J.,	
   Pierce,	
   R.	
   A.,	
   and	
  Mecham,	
   R.	
   P.	
  
(2002)	
  J	
  Biol	
  Chem	
  277,	
  11050-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐11057	
  
3.	
   Werneck,	
   C.	
   C.,	
   Vicente,	
   C.	
   P.,	
   Weinberg,	
   J.	
   S.,	
   Shifren,	
   A.,	
   Pierce,	
   R.	
   A.,	
  
Broekelmann,	
  T.	
  J.,	
  Tollefsen,	
  D.	
  M.,	
  and	
  Mecham,	
  R.	
  P.	
  (2008)	
  Blood.