Artigo Dengue - Seminario MAD DissertacaoVidyleisonCamargos

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI – UFSJ 
CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU – CCO 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE 
 
 
 
VIDYLEISON NEVES CAMARGOS 
 
 
 
 
Expressão heteróloga de uma isoforma solúvel do DC-SIGN 
(sDC-SIGN1A tipo III) em Escherichia coli e sua função no 
processo de infecção do Dengue virus 2 em monócitos e 
macrófagos 
 
 
 
 
 
DIVINÓPOLIS-MG 
MAIO-2016 
 
 
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI – UFSJ 
CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU – CCO 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE 
 
 
 
VIDYLEISON NEVES CAMARGOS 
 
 
 
 
Expressão heteróloga de uma isoforma solúvel do DC-SIGN 
(sDC-SIGN1A tipo III) em Escherichia coli e sua função no 
processo de infecção do Dengue virus 2 em monócitos e 
macrófagos 
 
Dissertação apresentada ao Programa de 
Pós Graduação em Ciências da Saúde, da 
Universidade Federal de São João Del Rei, 
como requisito parcial para a obtenção do 
grau de Mestre 
 
Orientadora: Drª Jaqueline Maria Siqueira Ferreira 
Co-orientadora: Drª Luciana Lara dos Santos 
 
 
 
 
DIVINÓPOLIS-MG 
MAIO-2016 
iv 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
Meus sinceros agradecimentos... 
À grande amiga e orientadora Jaqueline, pelo apoio, ensinamentos, paciência e 
magnífica orientação desde o primeiro ano da graduação. Deixo aqui o meu mais 
sincero muito obrigado! 
À Luciana pela oportunidade de desenvolver esse trabalho e também pela excelente 
orientação, paciência e conhecimentos compartilhados durante essa jornada. 
Ao Prof. Dr. Luiz Felipe Leomil Coelho por fornecer a linhagem celular usada na 
etapa final deste trabalho e, sobretudo, juntamente com o Prof. Dr. Rafael Gonçalves 
Teixeira Neto, pelas ótimas contribuições no trabalho e também compreensão e 
disponibilidade em aceitarem o convite de fazer parte da banca mesmo com o prazo 
apertado. 
À Profa. Dra. Débora de Oliveira Lopes pela orientação nos experimentos de 
expressão e contribuições essenciais neste projeto. Á todos que também 
contribuíram com o trabalho, Prof. Dr. Alexandro Sobreira Galdino, Prof. Dr. Leandro 
Augusto de Oliveira Barbosa, Dr. Carlos Eduardo Calzavara e Dra. Andréa Teixeira. 
Aos órgãos de fomento CNPq, CAPES, FAPEMIG e, principalmente, a UFSJ por 
proporcionar a realização deste trabalho. Aos professores do Programa de Pós 
Graduação em Ciências da Saúde pelo ensino e reflexões em suas disciplinas. 
Aos amigos Cássio, Rodrigo, Diego, Lailah, Bruno, Bárbara, Rafael e todos os outros 
membros do laboratório de Biologia Molecular, pelo auxílio nos experimentos desde 
o primeiro dia no laboratório, pelas discussões e amizade dentro e fora do 
laboratório. 
Aos amigos do laboratório de Microbiologia. Álan, Camyla e Michelli não só pela 
grande amizade e companheirismo, mas também pelo auxílio na cultura de células. 
Karina, por ser tão prestativa e calma para auxiliar a todos no laboratório. E todos os 
outros companheiros que de alguma forma me ajudaram nessa jornada. 
Aos pesquisadores, funcionários e colegas que contribuíram direta e indiretamente 
para a realização desse trabalho. 
À minha família, em especial à Maria José, minha queria mãe, e meu irmão Verlison 
pela compreensão, incentivo e apoio constante durante todos esses anos. 
Igualmente, à todos meus amigos de longa data, Leonardo, Dênis, Adilson, Paulo e 
Vinícius. 
A todos, muito obrigado! 
v 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Don’t let your dreams be dreams” 
(Jack Johnson) 
vi 
 
RESUMO 
A dengue é um grave problema de saúde pública mundial, que é causada pela 
infecção pelo Dengue virus (DENV). O DENV se adere às células hospedeiras por 
meio da interação da glicoproteína E viral com o receptor DC-SIGN (Dendritic Cell-
Specific ICAM-3 Grabbing Non-integrin) da célula hospedeira, através do seu 
Domínio de Reconhecimento de Carboidratos. Este receptor é codificado pelo gene 
CD209, que sofre splicing alternativo gerando diversas isoformas solúveis ou de 
membrana. Embora estudos envolvendo o DC-SIGN na infecção do DENV já terem 
sido descritos, o papel das isoformas solúveis neste processo ainda não é bem 
conhecido. Então, a fim de contribuir para maiores esclarecimentos sobre as funções 
do DC-SIGN e do mecanismo de infecção do DENV, o objetivo deste trabalho é 
avaliar o papel de uma isoforma solúvel deste receptor no processo de infecção do 
DENV. A sequência de cDNA da isoforma sDC-SIGN1A tipo III foi sintetizada e 
clonada no vetor de expressão pJ414 pela empresa DNA 2.0 (EUA). A expressão 
heteróloga foi realizada a 18 ºC, por 18h após a indução por 0,5 mM de IPTG, 
utilizando a linhagem Escherichia coli BL21 DE3 Rosetta, sendo analisada por SDS-
PAGE e Western Blot. A proteína foi purificada por cromatografia de afinidade em 
coluna de cobalto e analisada novamente por SDS-PAGE e Western Blot. A 
isoforma foi produzida com sucesso, obtendo 1,09 mg da proteína recombinante. 
DENV-2 foi mutiplicado na linhagem celular C6/36 de Aedes albopictus e 
quantificado pelo ensaio de TCID50 (50% Tissue Culture Infective Dose) em células 
BHK-21, obtendo um título viral de 1,6 x 106 TCID50/mL. Ensaios funcionais in vitro 
com a proteína recombinante foram realizados para verificar a sua capacidade de 
alteração da infecção do DENV em monócitos da linhagem THP-1 e macrófagos, 
obtidos através da estimulação das células THP-1 com acetato miristato de forbol. A 
diferenciação foi analisada pelas alterações na aderência e morfologia celular. A 
quantificação viral dos ensaios funcionais foi realizada pela titulação por TCID50. 
Devido à baixa expressão de DC-SIGN, as células utilizadas nos ensaios funcionais 
não são altamente permissíveis ao vírus, por isso a carga viral não foi detectada 
pela técnica de TCID50. Portanto, testes com outras linhagens celulares, serão 
necessários para melhor avaliação do efeito da isoforma sDC-SIGN1A tipo III no 
processo de infecção do DENV. 
Palavras chave: DC-SIGN, CD209, Dengue virus, expressão heteróloga, infecção 
do DENV. 
vanessameireles
Realce
vanessameireles
Realce
vanessameireles
Realce
vanessameireles
Sublinhado
vii 
 
ABSTRACT 
Dengue is a major global public health problem, which is caused by infection with 
Dengue virus (DENV). The virus adheres to host cells through interaction of viral 
glycoprotein E with DC-SIGN receptor (Dendritic Cell-Specific ICAM-3 Grabbing Non-
integrin), by its Carbohydrates Recognition Domain. This receptor is encoded by the 
CD209 gene which undergoes alternative splicing generating several different 
membrane and soluble protein isoforms. Although studies involving DC-SIGN in 
DENV infection have been described, the role of soluble isoforms in this process is 
not well known. Thus, in order to contribute to further clarification on DC-SIGN 
functions and DENV infection mechanism, the aim of this study is to evaluate the role 
of a soluble isoform of this receptor in DENV infection process. The cDNA sequence 
of sDC-SIGN1A type III isoform was synthesized and cloned into expression vector 
pJ414 by DNA 2.0 company (USA). The heterologous expression was carried out at 
18 °C for 18 hours after induction with 0,5 mM IPTG, using Escherichia coli BL21 
DE3 Rosetta strain, and analyzed by SDS-PAGE and Western blot. The protein was 
purified by affinity chromatography in cobalt column and analyzed again by SDS-
PAGE and Western blot. The protein isoform was successfully produced, yielding 
1.09 mg of the recombinant protein. DENV-2 was multiplied in Aedes albopictus 
C6/36 cell line and quantified by the TCID50 assay (50% Tissue Culture Infective 
Dose) in BHK-21 cells, obtaining a viral titer of 1.6 x 106 TCID50/mL. In vitro functional 
assays with the recombinant protein were performed to evaluate its capacity of 
changing DENV infection in monocytes of THP-1 cell line and macrophages, 
obtained by stimulation of THP-1 cells with phorbol myristateacetate. Differentiation 
was assessed by changes in cell adhesion and morphology. The viral quantitation in 
functional assays was performed by TCID50 titration. Due to the low DC-SIGN 
expression, the cells used in functional assays are not highly permissive to the virus, 
hence, the viral load was not detected by the TCID50 technique. Therefore, new tests, 
including other cell lines, will be needed to further evaluate any effect of sDC-
SIGN1A type III on DENV infection process. 
Keywords: DC-SIGN, CD209, Dengue virus, heterologous expression, DENV 
infection 
viii 
 
SUMÁRIO 
LISTA DE FIGURAS ...............................................................................................x 
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .................................................................xii 
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................1 
1.1) Aspectos gerais da Dengue ...................................................................1 
1.2) O processo de infecção do Dengue virus e o DC-SIGN ........................4 
1.3) O gene CD209 .......................................................................................12 
1.4) Domínio de Reconhecimento de Carboidratos ......................................15 
1.5) Funções do DC-SIGN no sistema imune ...............................................17 
1.6) Produção de proteínas recombinantes ..................................................18 
1.7) Justificativa ............................................................................................20 
2. OBJETIVOS ........................................................................................................24 
2.1) Objetivo geral ........................................................................................24 
2.2) Objetivos específicos .............................................................................24 
3. METODOLOGIA .................................................................................................25 
3.1) Análises in silico ....................................................................................25 
3.2) Síntese do gene e vetor de expressão ..................................................26 
3.3) Ensaios de Biologia Molecular ...............................................................27 
3.3.1) Obtenção de bactérias eletrocompetentes ...............................28 
3.3.2) Transformação de bactérias eletrocompetentes ......................29 
3.3.3) Extração plasmidial ..................................................................30 
3.3.4) Confirmação da clonagem .......................................................30 
3.3.5) Expressão da proteína recombinante em pequena escala ......31 
ix 
 
3.3.6) Expressão da proteína recombinante em larga escala ............32 
3.3.7) Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE ...................33 
3.3.8) Western blot .............................................................................34 
3.3.9) Purificação da proteína recombinante ......................................35 
3.3.10) Dosagem de proteínas ...........................................................35 
3.4) Cultura de células ..................................................................................36 
3.4.1) Células e vírus .........................................................................36 
3.4.2) Produção e purificação parcial de DENV-2 ..............................37 
3.4.3) Titulação de DENV-2 ...............................................................37 
3.4.4) Diferenciação da linhagem THP-1 em macrófagos ..................38 
3.4.5) Ensaios funcionais ...................................................................38 
3.4.6) Quantificação de RNA viral ......................................................39 
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..........................................................................42 
4.1) Caracterização da sDC-SIGN1A tipo III através de análise in silico ......42 
4.2) Expressão e purificação da sDC-SIGN1A tipo III ..................................45 
4.3) Multiplicação e quantificação de DENV-2 ..............................................55 
4.4) Ensaios funcionais .................................................................................59 
5. CONCLUSÕES ...................................................................................................66 
6. PERSPECTIVAS .................................................................................................66 
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................67 
x 
 
LISTA DE FIGURAS 
Figura 1: Mapa mundial de distribuição de Dengue ................................................1 
Figura 2: Nova classificação clínica da dengue de acordo com a Organização 
Mundial da Saúde ...................................................................................................3 
Figura 3: Estrutura genômica do Dengue virus .......................................................5 
Figura 4: Ciclo de multiplicação do Dengue virus ....................................................8 
Figura 5: Representação esquemática do gene CD209 ..........................................13 
Figura 6: Estrutura do DC-SIGN ..............................................................................14 
Figura 7: Domínio de Reconhecimento de Carboidratos e sua interação com o 
Dengue virus ...........................................................................................................16 
Figura 8: Mapa do plasmídeo pJ414 .......................................................................27 
Figura 9: Mapa do plasmídeo pRARE .....................................................................28 
Figura 10: Sequência gênica e proteica da isoforma sDC-SIGN1A tipo III ..............42 
Figura 11: Predições de glicosilações e peptídeo sinal ...........................................44 
Figura 12: Alinhamento da sequência proveniente do sequenciamento do produto de 
miniprep ..................................................................................................................46 
Figura 13: Análise da expressão da sDC-SIGN1A tipo III recombinante ................48 
Figura 14: Análise da solubilidade da proteína recombinante expressa a 18 ºC por 
18 h .........................................................................................................................51 
Figura 15: Expressão em larga escala da sDC-SIGN1A tipo III recombinante ........52 
Figura 16: Purificação da proteína sDC-SIGN1A tipo III recombinante ...................54 
Figura 17: Multiplicação de DENV-2 em células C6/36 de Aedes albopictus ..........55 
Figura 18: Titulação de DENV-2 por TCID50 em células BHK-21 ............................56 
Figura 19: Análise de produtos de PCR por PAGE .................................................57 
xi 
 
Figura 20: Análise de qPCR para quantificação de RNA viral .................................58 
Figura 21: Diferenciação de macrófagos a partir da linhagem monocítica THP-1 ...60 
Figura 22: Avaliação da carga viral pelo ensaio de TCID50 .....................................62 
xii 
 
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS 
ADE: aumento da infecção dependente de anticorpos 
Ala: aminoácido alanina 
AgNO3: nitrato de prata 
Asn: aminoácido asparagina 
Asp: aminoácido ácido aspártico 
BHK-21: fibroblastos de Rim de Hamster Bebê 
BOD: estufa de Demanda Bioquímica de Oxigênio 
B(OH)3: ácido bórico 
BSA: albumina bovina sérica 
C: proteína do capsídeo do Dengue virus 
CD: cluster de diferenciação 
CD209: gene que codifica o receptor DC-SIGN 
cDNA: DNA complementar 
CHO: Células de Ovário de Hamster Chinês 
CMV: citomegalovírus 
CO2: dióxido de carbono 
CO(NH2)2: amônia 
Cq: cicle quantification 
Cys: aminoácido císteína 
DCs: célulasdendríticas 
DC-SIGN: Receptor Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-
Grabbing Non-integrin 
DENV: Dengue virus 
DF: febre do dengue 
DHF: febre hemorrágica do dengue 
DMEM: meio mínimo essencial de Eagle modificado por Dulbecco 
DRC: domínio de reconhecimento de carboidratos 
DSS: síndrome do choque do dengue 
DTT: (2S,3S)-1,4-Bis-sulfanilbutano-2,3-diol 
E: glicoproteína do envelope do Dengue virus 
ECP: efeito citopático 
EDTA: ácido etilenodiamina tetracético 
xiii 
 
Fc: fragmento cristalizável 
FcRII: receptor de IgE de baixa afinidade 
FcR: receptores Fc gama 
gp120: glicoproteína gp120 do HIV 
Glu: aminoácido ácido glutâmico 
GRAVY: grande média de hidropaticidade 
HCl: ácido clorídrico 
HEPES: [N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-2-ácido etanosulfônico] 
HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana 
ICAM-3: Moléculas de Adesão Intercelular-3 
iDCs: células dendríticas imaturas 
IFN-: interferon beta 
IL: interleucina 
IMAC: cromatografia de afinidade por íons metálicos 
IPTG: isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo 
KH2PO4: fosfato monopotássico 
KCl: cloreto de potássio 
L-15: meio Leibovitz L-15 
mDC: células dendríticas maduras 
M (proteína): proteína de membrana do Dengue virus 
M (unidade): molar 
mDC-SIGN: isoforma de membrana do DC-SIGN 
MgCl2: cloreto de magnésio 
MOI: multiplicidade de infecção 
NaCl: cloreto de sódio 
Na2HPO4: fosfato dissódico 
NaH2PO4: fosfato monossódico 
NCBI: National Center for Biotechnology Information 
NF-B: fator nuclear de transcrição kappa B 
(NH4)SO4: sulfato de amônio 
NS: proteína não estrutural do Dengue virus 
OD: densidade óptica 
PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida 
xiv 
 
PAMPs: Padrões Moleculares Associados a Patógenos 
PBMC: células mononucleares de sangue periférico 
PBS: tampão fosfato-salino 
PCR: Reação em Cadeia da Polimerase 
PMA: acetato miristato de forbol 
prM: proteína precursora de membrana do Dengue virus 
PRR: Receptores de Reconhecimento de Padrões 
qPCR: Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real 
RPMI: Meio Roswell Park Memorial Institute 1640 
RT-PCR: Transcrição Reversa por Reação em Cadeia da Polimerase 
sDC-SIGN: isoforma solúvel do DC-SIGN 
SDS: dodecil sulfato de sódio 
SDS-PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS 
SFB: soro fetal bovino 
TCID50: 50% Tissue Culture Infective Dose 
TLR: receptores do tipo Toll 
THP-1: linhagem monocítica humana THP-1 
TNF-: fator de necrose tumoral alfa 
Tris: 2-Amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol 
1 
 
1. INTRODUÇÃO 
1.1) Aspectos gerais da Dengue 
 A dengue é a mais importante arbovirose que afeta o homem atualmente, 
causada pela infecção por um dos quatro tipos do Dengue virus (DENV 1-4) que são 
transmitidos por vetores artrópodes do gênero Aedes. A doença é considerada um 5 
grave problema de saúde pública mundial, gerando um grande impacto econômico 
para os países localizados em regiões endêmicas (GUZMAN e HARRIS, 2015). 
 Cerca de 390 milhões de infecções pelo DENV ocorrem todos os anos, sendo 
aproximadamente 96 milhões de casos com sintomas aparentes da doença (BHATT 
et al., 2013). Aproximadamente 3,97 bilhões de pessoas vivem atualmente em áreas 10 
de risco de transmissão do vírus, compreendidas em 128 países (Figura 1; BRADY 
et al., 2012). Desta forma, há um alto custo relacionado à dengue no mundo, 
estimado em cerca de US$2,1 bilhões anuais nas Américas e quase US$1 bilhão na 
Ásia, desconsiderando, ainda, os gastos com o controle do vetor, o que subestima o 
custo total associado à doença (SHEPARD et al., 2011; SHEPARD et al., 2013). 15 
 
 
Figura 1: Mapa mundial de distribuição de Dengue. Regiões em vermelho 
apresentam maior prevalência de dengue. A presença da doença é menor nas 
regiões com tons mais fracos de vermelho. Fonte: Guzman e Harris (2015). 20 
 
Segundo a Organização Pan-Americana de Saúde, até a semana 
epidemiológica 52 de 2015, foram registrados 2.326.829 casos suspeitos de dengue 
nas Américas no ano, ocorrendo 1.181 mortes. Os quatro tipos do vírus foram 
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2 
 
encontrados em diversos países do continente (PAHO, 2016). No Brasil, foram 
registrados 1.649.008 casos suspeitos de dengue em 2015, dos quais foram 
confirmados 1.569 casos de dengue grave e 20.329 casos de dengue com sinais de 
alarme, além de 863 fatalidades. Houve um grande aumento destes números 
quando comparados com o mesmo período de 2014, quando foram notificados 5 
589.107 casos de dengue, sendo confirmados 764 casos de dengue grave, 8.436 
casos de dengue com sinais de alarme e 473 óbitos. Os quatro tipos do vírus 
circulam no país, sendo os tipos 1 e 4 mais prevalentes, com 93,8% e 5,1%, 
respectivamente. Além disso, de todos os casos registrados, 62,2% destes foram 
somente na região Sudeste do país. Em Minas Gerais, 189.378 casos foram 10 
notificados, o segundo maior número entre todos os estados brasileiros (SAÚDE, 
2015). Em Divinópolis, município localizado no centro-oeste de Minas Gerais, foram 
notificados 4.686 casos de dengue em 2014, sendo 4.143 casos confirmados e 6 
óbitos. Em 2015 houve uma redução no número de casos no município, uma vez 
que foram notificados 2.270 casos, com 1.774 casos confirmados e um caso fatal. 15 
Porém, o número de casos aumentou em 2016. Até o início de maio, 3.732 casos 
foram notificados, dos quais 1.226 foram confirmados, e ocorreram três mortes 
(SEMUSA, 2016). 
A infecção pelo DENV causa quadros clínicos que variam desde formas 
assintomáticas até formas graves. Durante muitos anos, a doença foi categorizada de 20 
acordo com as manifestações clínicas em: febre indiferenciada, febre do dengue (DF) 
e febre hemorrágica do dengue (DHF). DHF ainda era classificada em 4 graus de 
gravidade, sendo os dois últimos definidos como síndrome do choque do dengue 
(DSS). No entanto, a dificuldade de classificação de alguns casos na prática clínica 
levou a Organização Mundial da Saúde (OMS), em 2009, a propor uma nova 25 
classificação. Atualmente, baseada em parâmetros clínicos e laboratoriais, a doença 
é classificada em três grupos mais bem definidos: dengue sem sinais de alarme, 
dengue com sinais de alarme e dengue grave. Os critérios adotados para o 
diagnóstico da dengue de acordo com essa classificação estão resumidos na Figura 
2. 30 
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Figura 2: Nova classificação clínica da dengue de acordo com a Organização 
Mundial da Saúde. Manifestações clínicas de pacientes com dengue (com ou sem 
sinais de alarme) e dengue grave. Pacientes de ambos os subgrupos de dengue 
podem desenvolver dengue grave. Fonte: adaptado de WHO (2009). 5 
 
Indivíduos que viajaram ou vivem em áreas endêmicas de dengue que 
apresentam dois ou mais sinais ou sintomas da doença, incluindo sinais de alarme, 
são considerados casos suspeitos de dengue. Ambos os pacientes, com e sem sinais 
de alarme, podem evoluir para dengue grave (WHO, 2009). 10 
De acordo com Simmons e colaboradores (2012), os sintomas da dengue 
aparecem abruptamente após o período de incubação e seguem três fases: febre 
inicial, fase crítica e fase de recuperação. Na primeira fase, são observados os sinais 
e sintomas clássicos da doença, como febre alta, comumente acima de 38,5 ºC, 
cefaleia, mialgia, dor nas articulações, manifestações hemorrágicas brandas, entre 15 
outros. Esta fase perdura por aproximadamente 2 a 7 dias. A fase crítica se inicia 
entre os dias 3 e 7 da doença, quando ocorre o aumento da permeabilidade vascular. 
Manifestações hemorrágicassão mais comuns nessa fase. Uma pequena proporção 
dos pacientes ainda pode desenvolver uma síndrome de liberação plasmática 
sistêmica, evidenciada pelo aumento da hemoconcentração, hipoproteinemia, 20 
derrame pleural e ascite. Por último, pode ocorrer a reversão do quadro de alteração 
da permeabilidade vascular do paciente em torno de 48 a 72 horas, com a melhora 
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dos sintomas rapidamente, apesar de que adultos podem ter fadiga excessiva por 
várias semanas após a recuperação. 
 Epidemias de dengue já foram registradas desde o século XVIII, apesar de a 
doença não ser considerada um problema de saúde pública, exceto quando 
ocorriam epidemias esporádicas, pois naquela época circulavam apenas um ou dois 5 
tipos virais na maioria das regiões tropicais. Após a Segunda Guerra Mundial, 
especialmente nas últimas décadas, a dengue vem acometendo populações em 
várias regiões do mundo. Com a expansão geográfica dos vírus e mosquitos 
vetores, a frequência e magnitude das epidemias de dengue também aumentaram. 
Isso pode ser devido a vários fatores, como decadência da infraestrutura de saúde 10 
pública, mudanças no estilo de vida, alterações evolutivas dos vírus, entre outros. 
Entretanto, três fatores são considerados principais: ineficácia do controle vetorial, 
urbanização não planejada e a globalização. Desta forma, o DENV encontrou um 
ambiente propício para a sua sobrevivência. Grandes centros urbanos que não 
apresentam controle vetorial eficiente e com aeroportos modernos, que transportam 15 
milhões de pessoas, muitas delas infectadas, transportam também o vírus, para 
diversas regiões do mundo (GUBLER, 2011). 
Assim, o controle da dengue requer uma série de medidas que precisam ser 
adotadas ou reforçadas, como a vigilância epidemiológica e controle vetorial, nas 
quais necessitam de um esforço político para serem efetivadas, além de 20 
contribuições no âmbito científico (GUBLER, 2011). No entanto, ainda é necessário 
aperfeiçoar o conhecimento relacionado às interações vírus-hospedeiro e vírus-
vetor, a fim de contribuir com o desenvolvimento de técnicas de diagnóstico, 
abordagens terapêuticas, marcadores de prognóstico, novos inseticidas e vacinas. 
Nesse contexto, também é necessário compreender os mecanismos de patogênese 25 
da doença, que ainda não são completamente elucidados. Por exemplo, alguns 
pacientes se curam da infecção rapidamente e sem complicações, enquanto outros 
desenvolvem quadros hemorrágicos graves e potencialmente fatais (ST. JOHN et 
al., 2013). 
 30 
1.2) O processo de infecção do Dengue virus e o DC-SIGN 
O DENV é membro da família Flaviviridae, na qual estão inseridos vários 
outros vírus de relevância médica humana, como o Zika virus, vírus da Febre 
vanessameireles
Sublinhado
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Amarela, vírus do Oeste do Nilo, vírus da Encefalite Japonesa e vírus da Encefalite 
Transmitida por Carrapatos, entre outros (ST. JOHN et al., 2013). O DENV é 
constituído de RNA fita simples e polaridade positiva, com um genoma de 10,7 kb 
contendo regiões 3’ e 5’ não traduzidas que flanqueiam a sequência de uma única 
poliproteína, que, após o processamento por proteases virais e do hospedeiro, gera 5 
3 proteínas estruturais [capsídeo (C), precursora de membrana (prM)/membrana (M) 
e envelope (E)] e 7 não-estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5; 
Figura 3; GUZMAN et al., 2010). A partícula viral madura é esférica, com diâmetro 
aproximado de 50 nm, contendo múltiplas cópias das proteínas E, C e M, gerada 
após processamento da prM (WHO, 2009). Já as proteínas NS são expressas na 10 
célula hospedeira infectada e estão envolvidas, principalmente, na replicação do 
genoma viral, processo que ocorre intimamente às membranas celulares (WELSCH 
et al., 2009). 
 
Figura 3: Estrutura genômica do Dengue virus. O genoma é constituído de RNA 15 
de polaridade positiva e possui uma única janela aberta de leitura, flanqueada por 
regiões 3’ e 5’ não traduzidas, que codifica uma poliproteína, na qual gera 3 
proteínas estruturais (C, prM/M e E) e 7 proteínas não-estruturais após o seu 
processamento por proteases celulares e virais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, 
NS4B, NS5). Fonte: Guzman et al. (2010). 20 
 
Na fase inicial da dengue, fêmeas do vetor infectadas liberam as partículas 
virais durante o repasto sanguíneo, que infectam inicialmente células dendríticas 
(DCs) e macrófagos presentes na pele, além de monócitos recém-recrutados para a 
derme (SCHMID e HARRIS, 2014). 25 
Monócitos, macrófagos e DCs são células que compõem o sistema 
mononuclear fagocitário. Estas desempenham um papel importante na manutenção 
da integridade dos tecidos, seja no seu desenvolvimento ou na recuperação após 
uma lesão, e também nas respostas imune inata e adaptativa (YONA et al., 2013). 
Monócitos são células originadas da medula óssea que circulam na corrente 30 
sanguínea e podem migrar para tecidos periféricos durante a homeostase e 
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inflamação. Após o seu recrutamento, os monócitos podem se diferenciar em 
macrófagos ou DCs (SHI e PAMER, 2011). Os monócitos são o alvo primário de 
infecção e replicação ativa do DENV in vivo entre células mononucleares de sangue 
periférico (PBMC), tanto em infecções primárias, como secundárias (DURBIN et al., 
2008; KOU et al., 2008). 5 
Os macrófagos são células fagocitárias residentes em tecidos linfoides e não 
linfoides envolvidas na homeostase desses tecidos, realizando a remoção de células 
apoptóticas e produzindo fatores de crescimento (GEISSMANN et al., 2010). Os 
macrófagos também possuem um papel importante no processo de infecção da 
dengue, uma vez que são alvos do DENV e também são a principal fonte de 10 
produção de citocinas inflamatórias (WU et al., 2013). Estudos indicaram a infecção 
pelo DENV em macrófagos do baço e linfonodos, humanos e murinos, entre outras 
células de diferentes órgãos e tecidos humanos (BLACKLEY et al., 2007; KYLE et 
al., 2007; BALSITIS et al., 2009). 
As DCs fazem parte do sistema imune inato e estão presentes em sítios de 15 
invasão de patógenos, como pele e mucosas. Quando não ativadas, elas 
apresentam alta atividade fagocítica, englobamantígenos e reconhecem patógenos 
através de Receptores de Reconhecimento de Padrões (PRR – pattern-recognition 
receptors). Uma vez ativadas após o reconhecimento de patógenos, as DCs 
produzem citocinas, migram para os linfonodos e apresentam os antígenos para as 20 
células T (SCHMID et al., 2014; MERAD et al., 2013). Entre as DCs presentes na 
pele, as células de Langerhans são um tipo de células dendríticas imaturas (iDCs) 
consideradas o alvo inicial do DENV (WU et al., 2000). Essas células possuem 
grande capacidade de infecção pelo vírus, devido à sua alta expressão do receptor 
DC-SIGN (Dendritic Cell-specific ICAM-3 Grabbing Non integrin), o que sugere que 25 
esse receptor seja um fator crítico no início da infecção do DENV (NAVARRO-
SANCHEZ et al., 2003; TASSANEETRITHEP et al., 2003). 
A interação do vírus com a célula hospedeira ocorre, principalmente, por meio 
da ligação da glicoproteína E do vírus ao DC-SIGN (NAVARRO-SANCHEZ et al., 
2003). Outro receptor envolvido na infecção do DENV é o Receptor de Manose 30 
(MR), que, assim como o DC-SIGN, se liga à glicoproteína E viral (MILLER et al., 
2008). A importância desses receptores foi demonstrada por Alen e colaboradores 
(2011), onde o bloqueio do DC-SIGN por anticorpos monoclonais em iDCs 
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promoveu a inibição da infecção do DENV em 80%, enquanto o bloqueio de ambos 
os receptores, DC-SIGN e MR, reduziu a infecção em mais de 90%. Isso também 
sugere a existência de outros receptores envolvidos. Segundo Hidari e Suzuki 
(2011), diversos receptores presentes em células de mamíferos já foram propostos, 
como GRP78 (78 kDa glucose-regulated protein), HSP70/HSP90 (heat shock 5 
protein), proteínas associadas a CD14, entre outros. 
Após essa interação inicial, o vírus move na superfície celular até entrar na 
célula hospedeira por endocitose clatrina-dependente, mediada por receptor (VAN 
DER SCHAAR et al., 2008 – Figura 4). Apesar do DC-SIGN ser responsável pela 
ligação do vírus à superfície celular, a endocitose da partícula viral não é 10 
essencialmente dependente desse receptor (LOZACH et al., 2005). Após a 
endocitose, ocorre a acidificação do endossomo, que induz uma alteração 
conformacional drástica na glicoproteína E, que promove a fusão entre as 
membranas viral e endossomal, liberando o nucleocapsídeo do vírus no citoplasma 
celular (MODIS et al., 2004). No citoplasma, ocorre a tradução de proteínas virais e 15 
replicação do genoma viral em estruturas vesiculares associadas ao retículo 
endoplasmático (WELSCH et al., 2009). Por fim, ocorre a associação do RNA viral 
às proteínas do capsídeo e o brotamento para dentro do retículo endoplasmático. 
Neste processo, o nucleocapsídeo adquire a membrana lipídica com as proteínas 
prM/M e E e as partículas virais passam pelo processo de maturação para serem 20 
liberados da célula por via secretória do hospedeiro (GUZMAN e HARRIS, 2015). 
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Figura 4: Ciclo de multiplicação do Dengue virus. Esquema demostrando as 
principais etapas do ciclo de multiplicação do DENV: uma partícula viral (passo 1) é 
adsorvida à superfície da célula hospedeira por meio de um receptor celular (passo 2) 
e o vírus penetra na célula por endocitose mediada por receptor (passo 3). 5 
Posteriormente, após a acidificação do endossomo, ocorre a liberação do RNA viral 
no citoplasma celular (passo 4). O RNA viral é traduzido, produzindo uma única 
poliproteína (passo 5), que após o processamento por proteases celulares e virais, 
forma o complexo de replicação (passo 6). Com a replicação e tradução do RNA viral, 
novas partículas virais (passos 7 e 8) são formadas, que após maturação no 10 
complexo de Golgi (passo 9), são liberadas no meio extracelular por exocitose. 
Adaptado de Screaton et al. (2015). 
 
As partículas virais produzidas durante a infecção de uma célula hospedeira 
podem conter níveis variados da proteína prM, a qual é normalmente convertida na 15 
proteína M durante a maturação dos vírions. Esse processo é muito importante para 
o vírus, uma vez que partículas completamente imaturas são consideradas não-
infecciosas, possivelmente devido à interação vírus-receptor e o evento de fusão de 
membranas serem afetados (ZYBERT et al., 2008; RICHTER et al., 2014). Apesar 
disso, a presença de anticorpos contra a proteína prM, durante uma infecção 20 
secundária, por exemplo, pode facilitar a ligação e penetração de partículas virais 
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imaturas em células expressando Receptores Fc (FcR), restaurando a capacidade 
infecciosa desses vírus (RODENHUIS-ZYBERT et al., 2010). A expressão de DC-
SIGN também pode contribuir para a infecção de partículas virais imaturas. Richter e 
colaboradores (2014) mostraram que partículas do DENV imaturas foram capazes 
de infectar iDC e células Raji, uma linhagem de células B, transfectadas 5 
eficientemente com DC-SIGN, enquanto não foi possível em iDC com DC-SIGN 
bloqueado por anticorpos, nem em células Raji não-transfectadas com DC-SIGN. 
Existem diversos fatores que podem estar relacionados à fisiopatologia da 
dengue, como a infecção e ativação de células da resposta imune inata, ativação do 
sistema do complemento, células T e B, produção de anticorpos autoimunes e 10 
presença de anticorpos não neutralizantes derivados de uma infecção primária 
(GUZMAN e HARRIS, 2015). Este último fator é considerado um dos principais 
responsáveis pela maior gravidade da doença, embora não seja unanimidade na 
literatura (LIBRATY et al., 2009). 
 Após a infecção primária por um sorotipo do DENV, o indivíduo desenvolve 15 
imunidade protetora permanente contra o sorotipo infectante e proteção cruzada 
temporária contra sorotipos heterólogos (GUZMAN e HARRIS, 2015). Em 
concentrações subneutralizantes, os anticorpos heterólogos podem desempenhar o 
papel inverso, contribuindo para o aumento da infecção, um efeito denominado 
“aumento da infecção dependente de anticorpos” (ADE, antibody-dependent 20 
enhancement). Neste caso, esses anticorpos, adquiridos ativamente (por infecção 
primária) ou passivamente (crianças nascidas de mães imunes à dengue), podem 
formar complexos com o vírus, facilitando a infecção de células expressando FcR, 
via interação com a porção Fc dos anticorpos. Com esta interação, há um aumento 
nas células infectadas que leva a uma carga viral maior do que ocorre em indivíduos 25 
infectados na ausência de tais anticorpos (GUZMAN et al., 2013). Desta forma, a 
expressão de FcR modula a infecção nas células durante ADE, ocorrendo maior 
infecção nessas células na presença de anticorpos não neutralizantes do que na 
ausência destes, como, por exemplo, acontece em células dendríticas maduras 
(mDC), macrófagos e monócitos (SCHMID et al., 2014). 30 
 Além disso, durante a infecção com ADE, o DENV é capaz de alterar diversos 
componentes do sistema imune, inibindo vias de sinalização, como de receptores do 
tipo Toll (TLR – Toll-like receptors) e fator nuclear de transcrição kappa B (NF-B – 
10 
 
Nuclear Factor Kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), suprimindo a 
resposta antiviral mediada por interferon. O vírus também pode estimular a 
expressão de citocinas imunossupressoras, como interleucina(IL) -10, que leva à 
redução da produção de IFN e óxido nítrico (MODHIRAM et al., 2010, UBOL et al., 
2010). De uma forma geral, vários componentes do sistema imune são alterados, a 5 
fim de facilitar a multiplicação do vírus, gerando uma alta carga viral no hospedeiro. 
Boonnak e colaboradores (2008) detectaram uma alta produção das citocinas 
pró-inflamatórias IL-6 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-) em mDC cultivadas 
com uma concentração ótima de soro que causa ADE nessas células. Inclusive, a 
produção elevada destas citocinas não foi detectada quando o receptor FcRIIa foi 10 
bloqueado por anticorpos, nem quando a mesma linhagem celular foi cultivada na 
ausência do soro, mesmo quando uma alta carga viral (e. g.: multiplicidade de 
infecção [MOI] de 1 versus 5) foi utilizada para infectá-las. De fato, não apenas a alta 
carga viral está associada com dengue grave, mas também uma alta produção de 
citocinas pelo sistema imune do paciente, como TNF- (GAGNON et al., 2002). Uma 15 
vez que as características hemorrágicas graves da dengue iniciam coincidentemente 
com a diminuição da carga viral, juntamente com o aumento da produção de 
citocinas, majoritariamente derivadas de células T, é possível que a dengue grave 
seja uma síndrome mediada pelo sistema imune do paciente (MATHEW e 
ROTHMAN, 2008; DUANGCHINDAA et al., 2010). 20 
Apesar do fenômeno de ADE possibilitar que várias células diferentes sejam 
infectadas pelo DENV, nem todas as células normalmente permissíveis ao vírus 
possuem essa capacidade de aumento da infecção. Ao contrário das mDC, as iDC 
não possuem capacidade de ADE, apesar de sua expressão de FcRs. Isso 
provavelmente é devido ao nível de expressão do DC-SIGN. Apesar de ambas as 25 
células expressarem níveis similares de FcRIIa, o nível de expressão de DC-SIGN 
é menor nas mDC. Inclusive, é considerado que o ADE seja correlacionado 
inversamente com a expressão de DC-SIGN (KOU et al., 2008; BOONNAK et al., 
2008). 
Em uma infecção secundária, outra teoria complementar à ADE que pode 30 
contribuir com maior gravidade da dengue é o “pecado do antígeno original” (original 
antigenic sin). Neste fenômeno, células T e B de memória geradas após uma 
11 
 
infecção primária (“antígeno original”) são estimuladas pelo sorotipo viral heterólogo, 
expandindo e produzindo uma resposta mais rápida que as novas células 
específicas contra este vírus (ROTHMAN, 2011; SCREATON et al., 2015). Uma vez 
que essas células apresentam baixa avidez contra o novo sorotipo infectante, é 
gerada uma resposta imune celular e humoral inadequada, ocorrendo um aumento 5 
na produção de citocinas inflamatórias e também atraso na resolução da infecção 
viral (ROTHMAN, 2011; GUZMAN e HARRIS, 2015). 
Durante o processo de ativação de células T, as moléculas de adesão 
intercelular-3 (ICAM-3) desempenham um papel importante na adesão entre estas 
células e DC. Geijtenbeek e colaboradores (2000b) estudaram receptores de adesão 10 
celular envolvidos neste processo de ativação de células T e identificaram o DC-
SIGN. Esse receptor mediava à adesão entre DC e ICAM-3 expressas por células T 
em repouso através de um mecanismo integrina-independente que requer cálcio 
(Ca2+), no qual é característico de lectinas do tipo C. Os autores estenderam seus 
achados, mostrando que o DC-SIGN se ligava com a glicoproteína gp120 do 15 
envelope do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). Apesar do receptor não 
promover a penetração do vírus em DC, ele promovia infecção in trans de células 
que expressavam CD4 e receptores de quimiocinas. Desta forma, o vírus poderia se 
ligar às DC nas mucosas através do DC-SIGN, ser transportado para órgãos 
linfoides secundários e, então, infectar células T CD4+ por um mecanismo in trans 20 
(GEIJTENBEEK et al., 2000a). 
Posteriormente às publicações de Geijtenbeek e colaboradores, Mummidi e 
colaboradores (2001) descreveram um extenso repertório de transcritos do gene que 
codifica para a proteína DC-SIGN (CD209). Além disso, eles também identificaram 
outro gene com grande homologia com o DC-SIGN, designado como DC-SIGN2 25 
(CD209L), que também foi descrito por Soilleaux e colaboradores (2000), 
coincidentemente no mesmo ano e nomeado como DC-SIGNR (DC-SIGN related 
gene). Esse alto número de transcritos eram gerados pelo splicing alternativo do pré-
mRNAdo gene CD209. 
O splicing alternativo é um mecanismo de controle da expressão gênica, que 30 
desempenha um papel fundamental de regulação entre os processos de transcrição 
e tradução (KORNBLIHTT, 2013). Neste processo, enquanto o pré-RNA é 
sintetizado no núcleo, os íntrons (sequências não codificantes) são reconhecidos e 
12 
 
removidos da molécula de RNA de formas alternativas, possibilitando que alguns 
éxons também sejam retirados, ou que sejam realizados cortes em sítios de splicing 
5’ ou 3’ alternativos. Desta forma, após conectados e transportados para o citosol, 
os transcritos alternativos podem gerar uma gama de proteínas DC-SIGN diferentes 
(KELEMEN et al., 2013). 5 
Considerando que cerca de 95% dos genes humanos multiéxons sofrem 
splicing alternativo e que ocorrem, em média, sete eventos de splicing alternativo por 
gene humano multiéxon, é de se esperar que haja uma ampla gama de proteínas 
que podem ser expressas pelas diferentes células em um organismo humano (PAN 
et al., 2008). Deste modo, aumentando a diversidade de mRNA expresso pelas 10 
células, isoformas diferentes de uma determinada proteína podem ser geradas. Essa 
nova proteína pode não ter uma função específica, ou a evolução pode selecioná-la 
para desempenhar uma função bem definida ou até mesmo apresentar alguma 
funcionalidade somente quando ela for expressa juntamente com outra isoforma em 
um evento de splicing coordenado (KELEMEN et al., 2013). 15 
 
1.3) O gene CD209 
O gene CD209 (Figura 5) está localizado no braço curto do cromossomo 19, 
região 1, banda 3, sub-banda 3 (19p13.3), próximo aos genes CD209L e CD23 
(receptor de IgE de baixa afinidade - FcRII) e todos estão sujeitos a eventos de 20 
splicing alternativo. O gene CD209 possui seis éxons (I-VI) e cinco íntrons, sendo 
que os eventos de splicing alternativo podem gerar, pelo menos, 14 transcritos 
diferentes, codificando proteínas associadas à membrana ou solúveis (MUMMIDI et 
al., 2001). Apesar de Geijtenbeek e colaboradores (2000b) terem detectado a 
expressão de DC-SIGN somente em DC, segundo Mummidi e colaboradores (2001), 25 
a sua expressão é mais ampla, incluindo placenta, PBMCs e monócitos da linhagem 
THP-1. 
 
 
13 
 
Figura 5: Representação esquemática do gene CD209. O gene CD209 apresenta 
seis éxons (algarismos romanos na porção inferior) e cinco íntrons (algarismos 
romanos na porção superior). Os números relacionados ao éxon III mostram o 
número de repetições em sequência deste éxon. +1 e +101 indicam os potenciais 5 
sítios de início da tradução. Asterisco (*) no éxon VI indica o códon de término da 
tradução dos transcritos DC-SIGN1A, m- e sDC-SIGN1B. Asterisco no éxon Ib indica 
o códon de término da tradução dos transcritos tDC-SIGN1B. Adaptado de Mummidi 
et al. (2001). 
 10 
Considerando que (i) o gene CD209 apresenta dois sítios de início da 
tradução, localizados nas porções “a” e “b” do éxon I, (ii) que a porção “b” do éxon 
pode ser removida durante o splicing alternativo e (iii) que o éxon II codifica o 
domínio transmembrana do DC-SIGN e também pode ser eliminado durante o 
splicing alternativo, gerando uma isoforma solúvel, Mummidi e colaboradores (2000) 15 
classificou as isoformas do DC-SIGN em 5 grupos distintos: mDC-SIGN1A, sDC-
SIGN1A, mDC-SIGN1B, sDC-SIGN1B e tDC-SIGN1B. Os transcritos que mantinham 
tanto o códon de iniciação da tradução do éxon Ia, como o éxon II, foram 
classificados como mDC-SIGN1A, enquanto aqueles que iniciavam a tradução no 
éxon Ia, mas perdiam o éxon II, como sDC-SIGN1A. Já aqueles que mantinham a20 
porção “b” do éxon I e também o éxon II foram agrupados como mDC-SIGN1B, 
enquanto os que continham o éxon Ib, porém perdiam o éxon II, foram classificados 
como sDC-SIGN1B. Finalmente, o uso do sítio de início da tradução localizado no 
éxon Ia pelos transcritos DC-SIGN1B geram uma isoforma truncada de 41 
aminoácidos, classificada como tDC-SIGN1B. Logo, as isoformas dos grupos m- e 25 
sDC-SIGN1B iniciam a tradução no sítio localizado no éxon Ib. De forma geral, os 
transcritos foram agrupados observando se mantinham o éxon II (mDC-SIGN) ou 
não (sDC-SIGN) e também se continham o éxon Ib (DC-SIGN1B) ou não (DC-
SIGN1A). 
O DC-SIGN apresenta basicamente quatro componentes: domínio 30 
citoplasmático na região N-terminal, domínio transmembrana, região de pescoço e 
Domínio de Reconhecimento de Carboidratos (DRC) na região C-terminal (Figura 6). 
Cada um destes componentes é codificado por um éxon diferente, exceto o DRC, 
14 
 
que é codificado pelos últimos três éxons, IV, V e VI (GEIJTENBEEK, 2000b; 
MUMMIDI et al., 2001). 
 
 
Figura 6: Estrutura do DC-SIGN. O DC-SIGN possui quatro componentes 5 
principais: o domínio citoplasmático, codificado pelo éxon I, o domínio 
transmembrana, codificado pelo éxon II, a região de repetições (ou região de 
pescoço), codificado pelo éxon III, e o DRC, codificado pelos éxons IV, V e VI. 
Adaptado de Wu e KewalRamani (2006). 
 10 
O éxon I codifica para a maioria da cauda citoplasmática do DC-SIGN. Como 
mencionado anteriormente, ele apresenta três porções distintas, Ia, Ib e Ic, sendo 
que algumas isoformas podem manter ou perder o éxon Ib. Além do códon ATG na 
porção exônica Ia (+1), há uma forte sequência de Kozak flanqueando a posição 
+101 para o início da tradução na porção Ib (GCCATGG; MUMMIDI et al., 2001). 15 
Alguns estudos mostram uma importância do domínio citoplasmático no processo de 
internalização de algumas moléculas ou vírus, onde células expressando um DC-
SIGN mutante que não contém o domínio citoplasmático apresentaram uma 
internalização significativamente reduzida de partículas semelhantes a vírus ou até 
mesmo impediram a internalização de vírions HIV-1 (SMITH et al., 2007; MANZO et 20 
al., 2012). 
O éxon II do gene CD209 codifica para todo o domínio transmembrana, além 
de 5 aminoácidos do domínio citoplasmático, e a sua eliminação do mRNA durante o 
splicing alternativo gera isoformas solúveis do DC-SIGN. Uma possibilidade a ser 
considerada é de que estas isoformas poderiam ser secretadas no meio extracelular 25 
e inibir competitivamente a interação entre o DC-SIGN e seu ligante (como ICAM-3 
15 
 
ou HIV) in vivo ou regulando a expressão das isoformas de membrana do DC-SIGN 
(MUMMIDI et al., 2001). 
O éxon III codifica para uma região de pescoço extracelular do DC-SIGN, 
constituída por 7 repetições e meia em sequência de 23 aminoácidos (MUMMIDI et 
al., 2001; POKIDYSHEVA et al., 2006). Na superfície celular, o DC-SIGN apresenta-5 
se em um estado oligomérico, formando um tetrâmero, enquanto somente o DRC se 
apresenta como um monômero (MITCHELL et al., 2001). Uma vez que a 
oligomerização contribui com a afinidade pelo seu ligante, essa região possui grande 
importância para a funcionalidade da proteína, uma vez que ela é responsável pela 
tetramerização do DC-SIGN (SNYDER et al., 2005; FEINBERG et al., 2005). A partir 10 
do uso de técnicas bioquímicas e biofísicas mais avançadas, pesquisadores 
puderam explorar ainda mais o nível de organização do DC-SIGN na superfície 
celular, que vai além da tetramerização, demonstrando que o DC-SIGN não apenas 
formam microdomínios, como também nanodomínios na superfície celular. A 
formação e a estabilidade destes domínios são dependentes da região de pescoço e 15 
do DRC, sendo que essa clusterização contribui para maior interação com o ligante 
do DC-SIGN, provavelmente permitindo a ligação de patógenos de diferentes 
tamanhos (LIU et al., 2012; MANZO et al., 2012). 
Por fim, o DRC, que forma o ectodomínio do DC-SIGN juntamente com a 
região de pescoço, é codificado pelos éxons IV, V e VI. Esta é a porção mais externa 20 
da molécula, sendo responsável, de fato, pela interação com o seu ligante 
(MUMMIDI et al., 2001). Desta forma, o DC-SIGN se liga a diversos patógenos, 
como bactérias, fungos, helmintos e vírus, por meio de estruturas contendo manose 
ou fucose na presença de Ca2+ (GEIJTENBEEK et al., 2009). 
 25 
1.4) Domínio de Reconhecimento de Carboidratos 
Análises cristalográficas do DC-SIGN complexado com ligantes carboidratos 
mostram que o DRC apresenta uma estrutura mista / com duas folhas  
antiparalelas principais, sendo que, afastado das terminações amino e carboxila, 
vários loops se agrupam para formar o sítio de ligação do DRC (Figura 7A; 30 
POKIDYSHEVA et al., 2006). O DRC está compreendido no domínio extracelular 
entre os resíduos Cys253 e Ala404, e apresenta três sítios de ligação a íons Ca2+, 
16 
 
sendo que a interação com o ligante é dependente de pelo menos dois íons Ca2+, o 
qual não pode ser substituído por outro cátion bivalente (GEIJTENBEEK et al., 
2000b). 
Entre os três sítios de ligação ao Ca2+ (sítios 1-3), o sítio 2 é considerado o 
sítio primário, onde quatro resíduos de aminoácidos, Glu347, Asn349, Glu354 e Asn465, 5 
se interagem com o íon bivalente através de seus grupos carbonila. O resíduo 
Asp366 coordena a ligação ao Ca2+, mas não contribui para a interação com o ligante, 
apesar de ser essencial para a ligação, uma vez que a substituição de Asp para um 
resíduo de Ala resulta na perda total da interação com o ligante (GEIJTENBEEK et 
al., 2002a). 10 
Com relação ao DENV, o DRC se liga ao vírion através dos resíduos 
glicosilados Asn67 de duas glicoproteínas E adjacentes (Figura 7B). Uma unidade 
icosaédrica do DENV, constituída por três monômeros de glicoproteína E, possui 
seis sítios de glicosilação, três Asn67 e três Asn153, mas o DRC se liga apenas a dois 
Asn67 próximos, pois os outros sítios são distantes entre eles, impossibilitando a sua 15 
ligação (POKIDYSHEVA et al., 2006). 
 
 
Figura 7: Domínio de Reconhecimento de Carboidratos e sua interação com o 
Dengue virus. A) Estrutura cristalográfica do monômero do DRC, mostrada em 20 
vermelho e verde, ligado a um oligossacarídeo, representado em amarelo. Íons Ca2+ 
ligados estão representados em azul. B) Esquema demonstrando as interações do 
DRC com o DENV, representadas pelos círculos em azul, que ocorrem por meio da 
sua ligação aos resíduos Asn67 de duas glicoproteínas E adjacentes. Adaptado de 
Pokidysheva et al. (2006). 25 
17 
 
1.5) Funções do DC-SIGN no sistema imune 
 O DC-SIGN possui uma ampla capacidade de reconhecimento de patógenos, 
desde vírus a parasitos. Além disso, este receptor também funciona como um PRR, 
reconhecendo Padrões Moleculares Associados a Patógenos (PAMPs) e induzindo 
ou modulando a expressão gênica em resposta aos patógenos reconhecidos. A 5 
resposta imune modulada pelo DC-SIGN é dependente do patógeno que está 
envolvido (GEIJTENBEEK et al., 2009). 
 Em DC, DC-SIGN pode capturar e internalizar Mycobacterium bovis através 
de um componente da parece celular de micobactérias chamado 
lipoarabinomanana. Além disso, a ligação desse componente ao DC-SIGN previne a 10 
maturação de DC por meio da alteração da sinalização de TLR, causando 
imunossupressão do paciente (GEIJTENBEEK et al., 2002b). Essa modificação na 
sinalização por TLR também pode ocorrer em diferentes patógenos, mas a 
sinalização celular produzida antes e após essa alteração pode variar. Patógenos 
que expressam glicoproteínas ricas em manose, como Mycobacterium tuberculosis e 15 
HIV-1, modulam a sinalização de TLR diferentemente de patógenos que expressam 
fucose, como Helicobacter pylori, levando a expressão de diferentes níveis de 
citocinas pró- e anti-inflamatórias (GRINGHUIS et al., 2009). 
 Apesar de diversos estudos terem sidos publicados envolvendoa isoforma 
mais comum do DC-SIGN, que é associada à membrana, a função das outras 20 
isoformas desse receptor, especialmente as isoformas solúveis, ainda não é bem 
conhecida. Existem trabalhos prévios envolvendo estas isoformas, mas os 
resultados ainda não foram esclarecedores. Por exemplo, alguns estudos mostraram 
que a incubação de sDC-SIGN com células expressando DC-SIGN inibiram a 
infecção ou a ligação do HIV a estas células (KWON et al. 2002; BIGGINS et al., 25 
2007). Em contraste, Hijazi e colaboradores (2011) demonstraram que o sDC-SIGN 
inibia a infecção de HIV em células PM1 (linhagem contínua de células T CD4+) em 
concentrações nanomolares, porém aumentou a infecção viral em concentrações 
sub-nanomolares. As hipóteses sugeridas pelos autores foram que em altas 
concentrações, o excesso de DC-SIGN ligado à gp120 do HIV bloquearia o sítio de 30 
ligação ao CD4, um receptor essencial para a infecção do vírus. Em baixas 
concentrações ocorreria a potencialização da infecção devido ao aumento da 
afinidade do complexo gp120-DC-SIGN pelo CD4. No entanto, mais estudos são 
18 
 
necessários para confirmar estas hipóteses. Outros trabalhos demonstraram que a 
incubação de iDC com o DRC do DC-SIGN inibiu mais de 90% da infecção do 
DENV, entretanto Plazolles e colaboradores (2011) evidenciaram que a isoforma 
sDC-SIGN1A tipo I promoveu um aumento da infecção de Citomegalovírus (CMV) 
humano nestas mesmas células (NAVARRO-SANCHEZ et al., 2003; PLAZOLLES et 5 
al., 2011). Diante disso, ainda são necessários mais estudos para validar a 
verdadeira função dessas isoformas. 
 
1.6) Produção de proteínas recombinantes 
No desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante, a indústria 10 
microbiológica tradicional se fundiu com a biologia molecular, dando origem a 
processos recombinantes otimizados para a produção de variados produtos 
celulares, especialmente enzimas e proteínas de interesse farmacológico. Para isto, 
microrganismos são modificados geneticamente para a fabricação destes produtos 
e, dentre os processos de recombinação nestes organismos, destaca-se a 15 
transformação, na qual envolve a captação e expressão de um DNA por células 
competentes. Essa competência pode ser induzida em laboratórios, alterando-se o 
ambiente físico-químico onde as células se encontram, por exemplo, pelo tratamento 
com cloreto de cálcio gelado, choque térmico, eletroporação, entre outros (ADRIO e 
DEMAIN, 2010; TU et al., 2016). 20 
Entre os vetores utilizados na transformação, destacam-se os plasmídeos. 
Algumas características de um plasmídeo de expressão podem influenciar a taxa de 
expressão do gene clonado neste vetor, sendo as principais: o seu promotor, o sítio 
de ligação ao ribossomo, um gene que confere resistência a um antibiótico e o 
número de cópias do plasmídeo, determinado pela origem de replicação. Desta 25 
forma, a configuração do vetor de expressão deve ser analisada cuidadosamente a 
fim de se obter um nível adequado de síntese proteica (MAKRIDES, 1996; ROSANO 
e CECCARELLI, 2014). 
A maioria dos biofármacos produzidos atualmente é de origem recombinante, 
sendo que o sistema de expressão escolhido para a produção de determinada 30 
proteína recombinante dependerá da sua qualidade, funcionalidade, rendimento e 
velocidade de produção. Entre os sistemas biológicos mais utilizados para fins 
19 
 
biotecnológicos, destacam-se as células de mamíferos e insetos, leveduras e 
bactérias (ADRIO e DEMAIN, 2010, SANCHEZ-GARCIA et al., 2016). Dentre estes, 
Escherichia coli é um organismo já bem estabelecido para a expressão de proteínas 
recombinantes, além de ser a primeira escolha de organismos para essa finalidade, 
uma vez que apresenta fácil manuseio e um longo histórico de uso na biotecnologia 5 
(TEGEL et al., 2010, CHEN 2012). Entre os sistemas utilizados na produção de 
proteínas recombinantes nos mercados dos Estados Unidos e Europa, cerca de 40% 
são bactérias, sendo a grande maioria delas alguma linhagem de E. coli (RADER, 
2008). 
Mesmo que existam diversos sistemas de expressão disponíveis, muitos 10 
ainda estão em desenvolvimento, tanto microrganismos convencionais, como E. coli 
e Saccharomyces cerevisae, como também plataformas mais recentes, como 
Pseudoalteromonas haloplanktis, Trichoderma reesei, Chlamydomonas reinhardtii, 
Leishmania tarentolae, entre outros (CORCHERO et al, 2013; SANCHEZ-GARCIA et 
al., 2016). Assim, há um grande número de opções disponíveis para a produção de 15 
proteínas e dificilmente é possível alcançar uma combinação ideal, pelo menos 
inicialmente. Condições para a produção de determinado produto gênico podem não 
funcionar para outro produto gênico, nem modelos confiáveis de predição de 
expressão proteica estão disponíveis, então o processo de produção de proteínas 
continua empírico. Por isso, múltiplas condições são testadas para otimizar esse 20 
processo e obter a proteína desejada (TEGEL et al., 2010; ROSANO E 
CECCARELLI, 2014). 
A expressão heteróloga em E. coli pode ser afetada por diversos fatores, 
como características estruturais da sequência gênica, a estabilidade e eficiência da 
tradução do mRNA, a capacidade de enovelamento proteico, a degradação da 25 
proteína por proteases celulares, a diferença do uso de códons entre organismos, a 
possível toxicidade da proteína produzida ao hospedeiro, entre outros (MAKRIDES, 
1996, ROSANO E CECCARELLI, 2014). Diversas linhagens de E. coli já foram 
modificadas, dando origem a novas cepas capazes de diminuir ou evitar as suas 
desvantagens na produção de proteínas recombinantes. Linhagens deficientes em 30 
proteases, o que confere maior estabilidade de proteínas heterólogas, como as 
BL21(DE3) e outras derivadas são bastante utilizadas. Estirpes que melhoram a 
formação de pontes dissulfeto também já foram desenvolvidas, bem como cepas 
20 
 
capazes de realizar glicosilação (CHEN, 2012; ROSANO e CECCARELLI, 2014). A 
variação nos códons utilizados por eucariotos e procariotos no processo de tradução 
também pode influenciar a produção de proteínas eucarióticas em E. coli. Esse viés 
pode ser atenuado pela alteração dos códons raros no gene a ser expresso por 
códons mais utilizados em E. coli ou pela utilização de linhagens capazes de realizar 5 
a expressão de tRNAs raros (KOPANIC et al., 2013). 
Apesar de otimizações serem realizadas para atingir uma alta expressão da 
proteína de interesse, muitas vezes essa produção excessiva em E. coli pode 
resultar na formação de agregados proteicos no citoplasma da célula bacteriana, 
denominados corpos de inclusão, onde é necessário a sua solubilização, 10 
renovelamento e purificação a fim de se obter a proteína funcionalmente ativa. 
Porém, ainda que a formação de corpos de inclusão seja muitas vezes indesejada, 
ela pode ser explorada como uma vantagem, uma vez que ocorrerá uma alta 
expressão da proteína de interesse nesses agregados, nos quais, além de 
prevenirem a degradação proteica por proteases celulares, podem ser facilmente 15 
isolados e purificados em um número de etapas reduzido (SINGH e PANDA, 2005; 
ROSANO E CECCARELLI, 2014). 
A produção de proteínas recombinantes é uma área da ciência extensa, onde 
um grande progresso nesse campo foi alcançado nas últimas décadas e ainda está 
em constante desenvolvimento (CHEN, 2012). Vários sistemas de expressão estão 20 
disponíveis e cada um deles, seja procarioto ou eucarioto, possui suas vantagens e 
desvantagens. Então a escolha entre eles precisa ser analisada previamente de 
acordo com a proteína de interesse. Nesse contexto, a utilização de E. coli é bem 
estabelecida e se tornou o sistema de expressão mais popular atualmente 
(ROSANO e CECCARELLI, 2014). Desta forma, com o constante acúmulo de 25 
conhecimento e o desenvolvimento de novas estratégias biotecnológicas, espera-se 
que a produção de proteínas biologicamente ativas seja cada vez mais exequível.1.7) Justificativa 
 A dengue é considerada a arbovirose mais importante que afeta o homem 30 
atualmente e que, mesmo sendo uma doença presente em quase todo mundo, ainda 
continua em expansão. Desta forma, é esperado um aumento na frequência, 
21 
 
proporção e gravidade das epidemias nas regiões afetadas (GUBLER, 2011). O 
desenvolvimento de vacinas ou fármacos contra o vírus seriam importantes 
ferramentas no combate a doença, no entanto, para que isso seja possível, é 
necessário elucidar os mecanismos de patogênese da dengue, que ainda não são 
completamente conhecidos. 5 
 Durante a fase inicial da dengue, as partículas virais introduzidas na pele pelo 
mosquito vetor infectam, principalmente, macrófagos e DCs presentes na pele 
(SCHMID e HARRIS, 2014). Em seguida, o DENVse dirige aos linfonodos e corrente 
sanguínea, infectando DCs, macrófagos e monócitos. Uma vez na corrente 
sanguínea, o vírus pode se dispersar e infectar células em diversos órgãos, como 10 
fígado, baço, cérebro, coração, entre outros (PRESTWOOD et al., 2012; SCHMID e 
HARRIS, 2014). A alta susceptibilidade das iDCs ao vírus, em comparação aos 
macrófagos e monócitos, se deve provavelmente ao seu alto nível de expressão do 
receptor DC-SIGN (SCHMID e HARRIS, 2014). Este receptor atua reconhecendo, 
ligando e/ou internalizando diferentes classes de patógenos, gerando diferentes 15 
respostas nas células envolvidas nesse reconhecimento ou até mesmo no 
organismo como um todo (GRINGHUIS et al., 2009). 
 Devido ao processo de splicing alternativo, o gene CD209 que codifica para 
este receptor tem a capacidade de gerar diversas isoformas da proteína, tanto de 
membrana quanto solúveis. Dentre os poucos estudos envolvendo as isoformas 20 
solúveis, os resultados obtidos não elucidaram completamente a função dessas 
proteínas. Alguns autores observaram que elas poderiam contribuir com o aumento 
da infecção, enquanto outros encontraram o inverso, a inibição da infecção viral 
(KWON et al., 2002; BIGGINS et al., 2007; HIJAZI et al., 2011; PLAZOLLES et al., 
2011). Consequentemente, ainda é necessário o desenvolvimento de novos 25 
trabalhos para avaliar qual é, de fato, a função dessas isoformas do DC-SIGN, 
especialmente com relação à infecção pelo DENV, uma vez que os estudos 
realizados previamente são relacionados ao vírus HIV e citomegalovírus. 
Além disso, estudos já revelaram que um mesmo indivíduo pode apresentar 
diferentes níveis de expressão de mRNA das isoformas do DC-SIGN o que poderia 30 
contribuir para a variabilidade fenotípica associada à infecção por dengue. 
(MUMMIDI et al., 2001; PLAZOLLES et al., 2011). A expressão dessas isoformas 
também pode variar em diferentes condições fisiológicas, como a maior expressão 
22 
 
de sDC-SIGN em amostras de tecidos sob inflamação versus não inflamados. 
(PLAZOLLES et al., 2011; JIANG et al., 2014). Todos estes estudos sugerem um 
grande nível de complexidade relacionado à expressão das isoformas do DC-SIGN 
no organismo humano. Complexidade a qual ainda precisa ser melhor 
compreendida, avaliando o papel das variantes do DC-SIGN em determinadas 5 
condições fisiológicas, como no caso de infecções virais. 
Estudos anteriores do grupo de pesquisa da Profa. Dra. Luciana Lara dos 
Santos (CCO/UFSJ) avaliaram a expressão gênica do DC-SIGN em indivíduos 
saudáveis e detectaram a expressão de cinco isoformas do DC-SIGN. A modelagem 
comparativa de quatro delas mostrou que duas perdiam os três sítios de Ca2+ do 10 
DRC, o que levou a sugerir a perda da interação destas proteínas ao ligante, no 
caso o DENV. Várias isoformas estão sendo avaliadas in vitro por este grupo de 
pesquisa, tanto as que possivelmente perdem a interação ao ligante quanto à 
isoforma deste estudo, que não possui alteração no DRC, mas que ainda não tem 
papel definido no processo de infeção viral. 15 
O DENV é capaz de infectar células de variadas linhagens, especialmente 
monócitos, macrófagos e DCs, sendo que o nível de infecção varia de acordo com a 
subpopulação dessas linhagens e também com a condição fisiopatológica do 
indivíduo, como durante uma infecção primária ou secundária (SCHMID et al., 2014). 
Esta variação pode ser relacionada ao DC-SIGN, pois o DENV infecta 20 
preferencialmente uma célula alvo através do DC-SIGN quando níveis suficientes 
deste receptor estão presentes, não ocorrendo a entrada do vírus via FcR nessa 
condição (BOONNAK et al., 2008). 
Além disso, devido ao papel ambíguo de inibição e aumento da infecção viral 
promovido pelo sDC-SIGN, Plazolles e colaboradores (2011) propuseram um 25 
modelo hipotético onde (i) em altas concentrações da proteína, os vírions são 
rapidamente complexados, impedindo a sua ligação e internalização pela célula 
hospedeira, mas (ii) em concentrações menores, em uma estequiometria “ótima”, o 
sDC-SIGN atua como uma opsonina, levando a internalização do maior número de 
vírions ligados ao sDC-SIGN; já (iii) em concentrações muito baixas, a maioria dos 30 
vírions estão livres e o nível de infecção é semelhante àquele na ausência de sDC-
SIGN. 
23 
 
Desta forma, considerando a grande variação do nível de expressão do DC-
SIGN nas diversas células alvo do vírus, além de que o sDC-SIGN pode ser 
secretado durante uma infecção viral, é difícil prever o que pode ocorrer no 
microambiente fisiológico de um paciente durante a infecção pelo DENV 
(PLAZOLLES et al., 2011; SHMID et al., 2014). Assim, estudos por meio da 5 
expressão proteica das variantes do DC-SIGN e sua incubação junto ao DENV em 
diferentes células alvo poderiam trazer um melhor entendimento acerca da função 
das isoformas solúveis na interação com o DENV. 
Portanto, frente ao desafio que a dengue representa à saúde pública, faz-se 
necessário compreender melhor sua etiopatogênese. Estudos avaliando a 10 
participação do DC-SIGN e suas variantes neste processo são importantes para 
maiores esclarecimentos sobre o mecanismo da doença e, consequentemente, para 
a avaliação da possibilidade de bloqueio da multiplicação viral no hospedeiro. 
24 
 
2. OBJETIVOS 
2.1) Objetivo geral: 
Avaliar o papel da sDC-SIGN1A tipo III na capacidade de infecção do Dengue 
virus em monócitos e macrófagos. 
 5 
2.2) Objetivos específicos: 
 Caracterizar a isoforma sDC-SIGN1A tipo III através de análises in silico; 
 Produzir e purificar a sDC-SIGN1A tipo III por expressão heteróloga; 
 Verificar se existe alteração na capacidade de infecção celular do Dengue 
virus na presença ou ausência da proteína recombinante sintetizada em 10 
monócitos e macrófagos. 
 
25 
 
3. METODOLOGIA 
3.1) Análises in silico 
A sequência de nucleotídeos que codifica para a isoforma sDC-SIGN1A tipo 
III, assim como a sequência de aminoácidos da proteína, foram obtidas através do 
GenBank, sob código de acesso AY042227.1e AAK91852.1, respectivamente. 5 
 Análises in silico foram realizadas utilizando softwares de bioinformática, a fim 
de se determinar algumas características estruturais e físico-químicas da proteína. 
Todas as ferramentas utilizadas nas análises estão disponíveis na Plataforma 
ExPASy (SIB Swiss Institute of Bioinformatics, Suiça – http://www.expasy.org/tools/). 
Um dos softwares utilizados foi o ProtParam (SIB Swiss Institute of 10 
Bioinformatics, Suiça – http://web.expasy.org/protparam/), uma ferramenta de 
proteômica capaz de calcular parâmetros físico-químicos de uma proteína, como a 
massa molecular, ponto isoelétrico teórico, hidropaticidade (índice GRAVY), 
composição de aminoácidos e de átomos, entre outros (GASTEIGER, 2003). 
A localização celular da proteína foi estimada pelo PSORT (Human Genome 15 
Center, Japão – http://www.psort.org/). Este software requer uma sequência 
completa de aminoácidos de origem bacteriana, leveduriforme, vegetal ou animal. 
De acordo com a origem assinalada, o programa atribui possíveis sítios de 
localização da sequência de aminoácidos inserida.Então, ele calcula o valor de 
variáveis referentes a características da sequência, interpreta estes valores e estima 20 
a possibilidade de localização em cada um dos sítios atribuídos inicialmente, 
mostrando o(s) mais provável(eis) entre eles (NAKAI e HORTON, 1999). 
A busca por domínios proteicos funcionais foi realizada pelo ScanProsite (SIB 
Swiss Institute of Bioinformatics, Suiça – http://prosite.expasy.org/scanprosite/). Este 
software faz a identificação de combinações proteicas contra assinaturas do 25 
PROSITE database, que é uma base de dados constituída por uma grande coleção 
de assinaturas com relevância biológica que são descritas como padrões ou perfis, 
usados para a detecção de motivos curtos ou perfis generalizados para detecção 
sensível de maiores domínios (CASTRO et al., 2006). 
A presença de modificações pós-traducionais foi analisada por dois softwares 30 
diferentes, YinOYang e NetNGlyc (Center for Biological Sequence Analysis, 
Dinamarca). Em sequências proteicas eucarióticas, essas ferramentas produzem 
26 
 
previsões de redes neurais para determinar sítios de ligação de O--GlcNAc 
(YinOYang – http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/) e N-glicosilação no contexto 
de sequons Asn-Xaa-Ser/Thr (NetNGlyc – http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc), 
respectivamente. 
Por fim, a presença do peptídeo sinal, que é uma sequência sinalizadora para 5 
que a proteína recém-sintetizada seja secretada pela célula, foi analisada pelo 
software SignalP (Center for Biological Sequence Analysis, Dinamarca – 
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Pela combinação de várias redes neurais, 
essa ferramenta é capaz de distinguir peptídeos sinais e não-sinais, além de 
reconhecer seus sítios de clivagem, predizendo, assim, a presença e localização do 10 
peptídeo sinal em sequências de aminoácidos de diferentes organismos procariotos 
e eucariotos (NIELSEN et al., 1997). 
 
3.2) Síntese do gene e vetor de expressão 
 A síntese da sequência de nucleotídeos do gene que codifica para a isoforma 15 
sDC-SIGN1A tipo III foi realizada pela empresa DNA 2.0 (EUA), sendo incluída uma 
cauda de histidina na porção C-terminal, para auxiliar na posterior identificação e 
purificação da proteína . A sequência foi fornecida pela empresa já modificada com 
os códons preferenciais para expressão em E. coli, para otimização da expressão, e 
ligada ao vetor de expressão pJ414 (série pJexpress 411-416), que contém o 20 
promotor T7 e gene de resistência à ampicilina (Figura 8). 
27 
 
 
Figura 8: Mapa do plasmídeo pJ414. A) Mapa simplificado do vetor pJ414 da série 
pJexpress. B) Mapa completo do plasmídeo pJ414, que contém o gene de 
resistência à ampicilina (Ampicillin-r_*), origem de replicação (Ori_pUC) e o promotor 
T7 (P_T7). 5 
 
28 
 
3.3) Ensaios de Biologia Molecular 
3.3.1) Obtenção de bactérias eletrocompetentes 
 A linhagem utilizada neste trabalho foi E. coli BL21 DE3 Rosetta [F- ompT 
hsdSB(rB
- mB
-) gal dcm (DE3) pRARE (CamR)]. Esta cepa é transformada com o 
plasmídeo pRARE, no qual codifica genes de tRNAs de códons raros para E. coli, 5 
permitindo, assim, uma maior expressão de proteínas de outros organismos (Figura 
9). Como parte da classe BL21, ela possui os genes das proteases lon e ompT 
deletados, o que garante maior estabilidade de proteínas recombinantes utilizando 
essa estirpe bacteriana. Além disso, assim como outras linhagens DE3, ela 
apresenta a sequência do fago λDE3, levando, assim, uma cópia cromossomal do 10 
gene da T7 RNA polimerase sob controle do promotor lacUV5, o que a torna 
adequada para a expressão de genes clonados em vetores sob o controle do 
promotor T7, através da indução por isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG – 
NOVY et al., 2001; GOPAL e KUMAR, 2013). 
 15 
 
Figura 9: Mapa do plasmídeo pRARE. Mapa do plasmídeo pRARE utilizado na 
transformação de linhagens E. coli para a criação de hospedeiros da série Rosetta™ 
para a maior expressão de genes contendo códons raros de E. coli. Adaptado de 
Novy et al. (2001). 20 
 
 O meio de cultura utilizado para o cultivo microbiano foi 2xYT [0,5% (p/v) 
NaCl, 1% (p/v) extrato de levedura e 1,6% (p/v) peptona de carne], cujo pH foi 
ajustado para 7,2. No caso de meio sólido para utilização em placas de Petri, foi 
adicionado 1,5% (p/v) de ágar bacteriológico ao meio 2xYT. 25 
29 
 
Para obtenção de bactérias eletrocompetentes, primeiramente, foi realizado 
um pré-inóculo de bactérias E. coli BL21 DE3 Rosetta em 10 mL de meio 2xYT 
líquido e incubado em shaker orbital (Solab, Brasil) a 37 ºC a 180 rpm por 18 h. Após 
este período, uma alíquota de 5 mL desta cultura foi transferida para 500 mL de 
meio 2xYT e incubada a 37 ºC a 180 rpm até atingir a densidade ótica de 600 nm 5 
(OD600) entre 0,20 e 0,25. Posteriormente, as células foram sedimentadas por 
centrifugação a 1250 g, 4 ºC por 20 min. Então, foram realizadas sucessivas 
lavagens do pellet: O meio de cultura foi descartado, o pellet ressuspendido em 80 
mL de glicerol 10% gelado e nova centrifugação foi feita a 1250 g, 4 ºC por 20 min. 
Esse processo de lavagem foi repetido com volumes decrescentes de glicerol 10%: 10 
80 mL, 40 mL, 20 mL, 10 mL e 1 mL. Por fim, 25 L dessa suspensão celular foram 
transferidos para 10 mL de glicerol 10% e a sua OD600 foi verificada, com valor 
esperado de 0,15. Então, a suspensão celular de 1 mL foi aliquotada em microtubos 
e armazenadas a -80 ºC. 
 15 
3.3.2) Transformação de bactérias eletrocompetentes 
 As células eletrocompetentes de E. coli BL21 DE3 Rosetta foram 
transformadas através de eletroporação. Em banho de gelo, 1 a 10 ng de DNA (vetor 
com o gene de interesse) foram adicionados a 30 L das bactérias 
eletrocompetentes. Após homogeneização, a mistura foi transferida para uma cubeta 20 
de eletroporação de 0,2 cm (BioRad, EUA) e submetidas a um pulso elétrico de 250 
V utilizando o programa Ec2 do eletroporador MicroPulser (BioRad, EUA). Em 
seguida, as células foram ressuspendidas em 1 mL de meio 2xYT, transferidas para 
um microtubo de 1,5 mL e incubadas por 45 min, a 37 ºC, sob agitação constante de 
180 rpm. Posteriormente, 75 L da cultura foram semeados em ágar 2xYT 25 
suplementado com ampicilina (100 g/mL) e as placas foram incubadas em estufa a 
37 ºC por 18 h. 
 Além da eletroporação com o plasmídeo recombinante, o mesmo 
procedimento foi realizado utilizando o plasmídeo pUC18 sem inserto, a fim de 
comprovar a eficiência das células (controle positivo), bem como também sem 30 
adicionar qualquer amostra de DNA, permitindo detectar contaminações que possam 
ocorrer no procedimento (controle negativo). 
30 
 
3.3.3) Extração plasmidial 
Após o cultivo dos microrganismos submetidos à eletroporação, as colônias 
que se cresceram no meio provavelmente haviam sido transformadas com o 
plasmídeo recombinante. A partir destas colônias, um novo cultivo desses 
microrganismos foi realizado para a sua purificação plasmidial em pequena escala 5 
(miniprep). 
 Uma colônia isolada foi transferida para um tubo cônico de 15 mL estéril 
contendo 10 mL de meio 2xYT suplementado com ampicilina (100 g/mL) e 
incubado a 37ºC, por 18h a 180 rpm. Como controle negativo, para se detectar 
contaminações, um tubo cônico contendo apenas meio de cultura suplementado 10 
com ampicilina foi incubado nas mesmas condições anteriores. Após este período, 
as células foram sedimentadas através de centrifugação a 18.000g por 10 min e o 
DNA plasmidial foi extraído usando o kit comercial PureLink Quick Plasmid Miniprep 
Kit (Invitrogen, EUA) de acordo com o protocolo fornecido pela fabricante. 
O produto da extração foi quantificado por espectrofotometria utilizando o 15 
NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, EUA). O comprimento de onda para 
dosagem de DNA foi de 260 nm. Além disso, foram utilizadas as razões 260/280 e 
260/230 para a avaliação de contaminação do DNA com proteínas e contaminantes