ag2013-3-sequenc-dna-cmartins

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1
Sequenciamento de genomas: 
princípios e métodos
clássicos
Cesar Martins (cmartins@ibb.unesp.br)
Departamento de Morfologia
Instituto de Biociências , UNESP Universidade Estadual Paulista
Botucatu, SP
Sequenciamento de DNA e de genomas: 
Determinar a sequência de nucleotídeos ao longo da cadeia de DNA
...AGCAATTGTGAGTCCCTGACTTTTTGCTTA
Análise genômica 2013 
2
Estudo de genes
Diagnóstico forense e clínico
Identificação de indivíduos
Estudos comparativos
Evolução, Fisiologia, Ecologia, ...
Conhecimento do genoma
Aplicações
Análise genômica 2013 
Genomas sequenciados
Primeiro genoma sequenciado: Fago X174, 5.375 pb (9 genes)
Sanger et al. 1977, Nature 265: 687-695
Primeiro eucarionte sequenciado: Saccharomyces cerevisae, 13 milhões pb
Goffeau et al. 1996, Science 274: 546, 563-567
Primeiro animal sequenciado: Caenorhabditis elegans, 100 milhões pb
C elegans Sequencing Consortium 1998, Science 282: 2012-2018
Primeira planta sequenciada: Arabidopsis thaliana, 157 milhões pb
Arabidopsis Genome Initiative 2000, Nature 408: 796-815
Genoma humano: 3 bilhões pb
International Human Genome Sequencing Consortium 2001, Nature: 409: 860-921; 
Venter et al. 2001, Science 291: 1304-1351
Análise genômica 2013 
3
Genomas sequenciados
1000 genomes available
Source: NCBI, May 07/2013
Análise genômica 2013 
Princípios e Métodos Clássicos
Método químico
Maxam & Gilbert 1977
Método dideoxi ou de terminalização
Sanger et al. 1977
Análise genômica 2013 
4
Método químico
Análise genômica 2013 
Walter Gilbert 
Prêmio Nobel em 
Bioquímica (1980)
Método químico
Análise genômica 2013 
5
Arranjo dos nucleotídeos na molécula de 
ácido nucléico
Nucleotídeo
Nucleotídeo
Nucleotídeo
Ligação 
fosfodiéster
Ligação 
fosfodiéster
fosfato
Base
açúcar
Análise genômica 2013 
Análise genômica 2013 
Arranjo dos nucleotídeos
na molécula de ácido
nucléico
6
Clivagem preferencial do DNA em
nucleotídeos específicos
Análise genômica 2013 
Dimetilfulfato
Piperidina
Análise genômica 2013 
Clivagem preferencial do DNA em
nucleotídeos específicos
7
Análise genômica 2013 
Marcar os finais da dupla fita de DNA com 32P
Desnaturar o DNA para separar as fitas
Análise genômica 2013 
8
Método químico
Análise genômica 2013 
Método químico
Análise genômica 2013 
9
Método químico
Análise genômica 2013 
Análise genômica 2013 
Método químico
10
Método químico
A>G G>A C 
C+T
el
et
ro
fo
re
se
Análise genômica 2013 
Método químico
Análise genômica 2013 
11
Método químico
Análise genômica 2013 
Método dideoxi ou de terminalização
Análise genômica 2013 
12
Análise genômica 2013 
Frederick Sanger
Dois prêmios Nobel em Bioquímica
Sanger Institute, Cambridge, England
*Método dideoxi de sequenciamento
*Sequenciamento Shotgun
Método dideoxi ou de terminalização
Arranjo dos nucleotídeos na molécula de 
ácido nucléico
Nucleotídeo
Nucleotídeo
Nucleotídeo
Ligação 
fosfodiéster
Ligação 
fosfodiéster
fosfato
base
açúcar
Análise genômica 2013 
13
Fita contínua
Fita descontínua
Primers
Duplicação do DNA
Análise genômica 2013 
Duplicação do DNA
DNA polimerase requer 
adicionar próximo nucleotídeo
Análise genômica 2013 
14
Método dideoxi ou de terminalização
Dideoxinucleotídeo
Nucleotídeo sem 
grupo OH no 
carbono 3 do açucar
Nucleotídeo normal
Deoxinucleotídeo
Análise genômica 2013 
Método dideoxi ou de terminalização
Dideoxinucleotídeos
(nucleotídeos alterados)
Deoxinucleotídeos
normais
T
G
C
A
T G C A
Análise genômica 2013 
15
Método dideoxi ou de terminalização
** IMPORTANTE!!
primer ou um dos nucleotídeos marcados radioativamente!
Seqüenciamento 
manual
Análise genômica 2013 
Análise genômica 2013 
Seqüenciamento manual
Método dideoxi ou de terminalização
http://www.youtube.com/watch?v=UT9wqaVCH5s
http://www.youtube.com/watch?v=UT9wqaVCH5s
16
Seqüenciamento manual by
C Martins (1999)
Método dideoxi ou de terminalização
Análise genômica 2013 
Gilbert X Sanger
Gilbert
Requer grande quantidade de DNA purificado e muitos passos
de purificação;
Digestões enzimáticas;
Produz curtas leituras;
Encontrou aplicação em footprinting
Não requer clonagem;
Automatização não disponível.
Sanger
Requer clonagem do fragmento de interesse;
Requer muito pouco DNA;
Não necessita de digestões;
Desenvolvimento de automação.
Análise genômica 2013 
17
Desenvolvimento de 
sequenciamento automatizado
Método dideoxi ou de terminalização
1986: Leroy E. Hood's laboratory at the California Institute of 
Technology announce the first semi-automated DNA sequencing machine. 
1987: Applied Biosystems markets first automated sequencing machine, 
the model ABI 370.
Análise genômica 2013 
Análise genômica 2013 
Seqüenciamento automático versão I
T
G
C
A
T G C A
A
AGCTTA
AGCTTACGA
AGCTTACGAA
AGCTTACGAATGCGTCCA
AGCTTACGAATGCGTCCACA
AGCTTACGAATGCGTCCACAA
AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCTA
AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCTACA
AG
AGCTTACG
AGCTTACGAATG
AGCTTACGAATGCG
AGCTTACGAATGCGTCCACAACG
AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCTACAG
AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCTACAGG
AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCTACAGGTG
AGC
AGCTTAC
AGCTTACGAATGC
AGCTTACGAATGCGTC
AGCTTACGAATGCGTCC
AGCTTACGAATGCGTCCAC
AGCTTACGAATGCGTCCACAAC
AGCTTACGAATGCGTCCACAACGC
AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCTAC
AGCT
AGCTT
AGCTTACGAAT
AGCTTACGAATGCGT
AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCT
AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCTACAGGT
A
G
C
T
A
G
C
T
18
Sequenciamento automático
Leroy Hood
18/ 03/ 12 08:17Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis
gina 1 de 1http:/ / www.nature.com/ nature/ journal/ v321/ n6071/ abs/ 321674a0.html
nature.com about npg news@nature.com naturejobs natureevents help site index
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Nature 321, 674 - 679 (12 June 1986); doi:10.1038/321674a0
Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis
LLOYD M. SMITH, JANE Z. SANDERS, ROBERT J. KAISER, PETER HUGHES, CHRIS DODD, CHARLES R. CONNELL*, CHERYL HEINER*,
STEPHEN B. H. KENT & LEROY E. HOOD
Division of Biology, California Institute of Technology, Pasadena, California 91125, USA
*Applied Biosystems, Inc., Foster City, California 94404, USA
We have developed a method for the partial automation of DNA sequence analysis. Fluorescence detection of the
DNA fragments is accomplished by means of a fluorophore covalently attached to the oligonucleotide primer used
in enzymatic DNA sequence analysis. A different coloured fluorophore is used for each of the reactions specific
for the bases A, C, G and T. The reaction mixtures are combined and co-electrophoresed down a single
polyacrylamide gel tube, the separated fluorescent bands of DNA are detected near the bottom of the tube, and
the sequence information is acquired directly by computer.
References
1. Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A. R. Proc. natn. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463 5467 (1977). | ChemPort |
2. Smith, A. J. H. Meth. Enzym. 65, 560 580 (1980). | Article | PubMed | ChemPort |
3. Maxam, A. M. & Gilbert, W. Meth. Enzym. 65, 499 559 (1980). | Article | PubMed | ChemPort |
4. Smith, L. M., Fung, S., Hunkapiller, M. W., Hunkapiller, T. J. & Hood, L. E. Nucleic Acids Res. 13, 2399 2412
(1985). | PubMed | ISI | ChemPort |
5. Smith, L. M., Kaiser, R. J., Sanders, J. Z. & Hood, L. E. Meth. Enzym. (in the press).
6. Atkinson, T. & Smith, M. Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (ed. Gait, M. J.) 35 81 (IRL, Oxford, 1984).
7. Forster, A. C., McInnes, J. L., Skingle, D. C. & Symons, R. H. Nucleic Acids Res. 13, 745 761
(1985). | PubMed | ISI | ChemPort |
8. Chuvpilo, S. A. & Kravchenko, V. V. Sov. J. bioorg. Chem. 9, 1694 1697 (1983).
9. Rosenthal, A., Schwertner, S., Hahn, V. & Hunger, H. NucleicAcids Res. 13, 1173 1184 (1985). | PubMed | ISI | ChemPort |
 1986 Nature Publishing Group
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Análise genômica 2013 
Seqüenciamento automático versão II
A C G T : dideoxi nucleotídeos marcados 
com compostos fluorescentes
DNA
Primer
Nucleotídeos normais (A, C, G, T)
Dideoxinucleotídeo
DNA polimerase
tampão
T
G
C
A
A C G T
Análise genômica 2013 
19
Seqüenciamento automático versão II
Análise genômica 2013 
Seqüenciamento automático versão II
Análise genômica 2013 
20
Análise genômica 2013 
Seqüenciamento automático versão II
Cromatograma
Seqüenciamento automático versão II
http://www.dnalc.org/resources/animations/cycseq.html
Análise genômica 2013 
http://www.dnalc.org/resources/animations/cycseq.html
21
Seqüenciamento automático versão II
Análise genômica 2013 
Seqüenciamento automático versão III (capilar)
Análise genômica 2013 
22
Seqüenciamento automático versão III (capilar)
Análise genômica 2013 
Seqüenciamento automático versão III (capilar)
Análise genômica 2013 
23
Análise genômica 2013 
Seqüenciamento automático versão III (capilar)
http://www.wellcome.ac.uk/Education-resources/Teaching-and-
education/Animations/DNA/WTDV026689.htm
Seq capilar por Sanger
Análise genômica 2013 
24
AMOSTRAS PARA 
SEQUENCIAMENTO
Plasmidio
PCR
Seqüenciamento automático
Análise genômica 2013 
AMOSTRAS PARA 
SEQUENCIAMENTOPlasmidio
Seqüenciamento automático
Análise genômica 2013 
25
Análise genômica 2013 
Sequenciamento de genomas inteiros
Sequenciamento total de genomas
H
ie
ra
rc
h
ic
a
l 
s
h
o
tg
u
n
 s
e
q
u
e
n
c
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g W
h
o
le
 g
e
n
o
m
e
 
s
h
o
tg
u
n
 s
e
q
u
e
n
c
in
g
Análise genômica 2013 
26
Desvendando a complexidade dos genomas
Mapa físico da seqüência nucleotídica
HGP Celera
Análise genômica 2013 
Sequenciamento clássico por
-Vantagens
-Limitações
Análise genômica 2013 
27
Análise genômica 2013
08-11 de Julho de 2013
Instituto de Biociências, UNESP, 
Botucatu, SP
Curso de Férias