2017-tcc-imbvasconcelos

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ 
CENTRO DE CIENCIAS 
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA 
 
 
 
 
 
IVNA MARIA BASTOS VASCONCELOS 
 
 
 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTITUMORAL DE EXTRATOS OBTIDOS DE 
ACTINOMICETOS RECUPERADOS DE SEDIMENTOS DO LITORAL DO CEARÁ, 
BRASIL 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FORTALEZA 
2017 
 
 
 
IVNA MARIA BASTOS VASCONCELOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTITUMORAL DE EXTRATOS OBTIDOS DE 
ACTINOMICETOS RECUPERADOS DE SEDIMENTOS DO LITORAL DO CEARÁ, 
BRASIL. 
 
 
 
 
 
 
Monografia apresentada à coordenação do 
curso de Ciências Biológicas do Departamento 
de Biologia da Universidade Federal do Ceará, 
como requisito para obtenção de título de 
Bacharel em Ciências Biológicas. 
 
 
Orientador: Prof. Dr. Diego Veras Wilke. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FORTALEZA 
2017 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
50
 
 
IVNA MARIA BASTOS VASCONCELOS 
 
 
 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTITUMORAL DE EXTRATOS OBTIDOS DE 
ACTINOMICETOS RECUPERADOS DE SEDIMENTOS DO LITORAL DO CEARÁ, 
BRASIL. 
 
 
 
 
 
 
Monografia apresentada à coordenação do 
curso de Ciências Biológicas do Departamento 
de Biologia da Universidade Federal do Ceará, 
como requisito parcial para obtenção de título 
de Bacharel em Ciências Biológicas. 
 
 
Orientador: Prof. Dr. Diego Veras Wilke. 
 
Aprovada em: ___/___/______. 
 
 
BANCA EXAMINADORA 
 
 
________________________________________ 
Prof. Dr. Diego Veras Wilke (Orientador) 
Universidade Federal do Ceará (UFC) 
 
 
_________________________________________ 
Profa. Dra. Erika Freitas Mota 
Universidade Federal do Ceará (UFC) 
 
 
_________________________________________ 
Profa. Dra. Denise Cavalcante Hissa 
Universidade Federal do Ceará (UFC) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
À minha avó, Sônia, pelo exemplo de 
mansidão, carisma e generosidade. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
 
À Profa Dra Letícia Veras Costa Lotufo, por todo o aprendizado, por ter me inserido 
no mundo dos produtos naturais e por ser uma grande admiração como pessoa, professora e 
pesquisadora. 
 
Ao Prof. Dr. Diego Veras Wilke, pelo entusiasmo em ensinar, pela gentil orientação, 
paciência, simpatia, disponibilidade e apoio dado para a realização desse trabalho. 
 
À Profa Dra Paula Christine Jimenez, com quem orgulhosamente divido uns genes, 
é inegável minha admiração e inspiração, pelo incentivo, conversas e ensinamentos 
acadêmicos e de vida. 
 
À banca examinadora composta por Profa. Dra. Erika Freitas Mota, de quem fui 
aluna e tenho grande apreço, e Profa. Dra. Denise Cavalcante Hissa, pelo tempo, pelas 
valiosas colaborações, reflexões, críticas. 
 
Ao pessoal do ECOTOX, por terem me acolhido nos meus primeiros passos: Karine, 
Bianca, Evila, Evelyne, Alysson, Arenice, Isabelle, Paula Abreu, Rafael, Andressa, Luana, 
Marcionilia, Lívia, Renan, especialmente ao Elthon e a Larissa, por toda amizade e apoio 
contaste, pela dedicação em me ensinar e me acompanhar tão carinhosamente. 
 
À Profa Dra Otilia Pessoa, à Ceiça, Paty, Alison, Chaguinha, do LAFIPLAM, pelo 
disponibilidade e auxílio na realização de extrações, técnicas e análises químicas. 
 
Às meninas do LaBBMar, Luciana, Erlania, Kayanny, Andrea, Alexia, Thais, 
Katharine, Carol, Giovanna e Heitor, pelo convívio harmonioso, amizade e momentos de 
confraternização. 
 
A todos os amigos que o curso de Ciências Biológicas me deu, pessoas que 
certamente vou levar para a vida; especialmente a turma de 2011.1, que superamos a cada 
semestre mais unidos. Aos professores, servidores e funcionários da UFC, pessoas que 
contribuíram de alguma forma para a lapidação desse curso e de novos profissionais. 
 
 
Aos amigos do Colégio Batista, os quais não se deixaram distanciar pelos anos que se 
passaram, especialmente as meninas do GS; à Anna, Lara e Amanda, tenho muito a 
agradecer pelo carinho, conselhos, histórias, farras e momentos de alegria. 
 
Às amigas Fernanda Nóbrega, Nathalia, Nayara, pessoas por quais tenho muita 
consideração e afeto, pelos momentos de descontração e saídas. 
 
Ao Léo, que não me deixa notar a distância física, por ser meu cúmplice e topar 
comigo as ideias mais doidas, pelo companheirismo, incentivo, carinho e cuidado; e por toda 
a sua família, pelo acolhimento que recebo e por serem pessoas tão iluminadas. 
 
Aos meu avós, Terezinha e Almir, Sônia e Haroldo (in memoriam), pelos 
ensinamentos de vida, a tia Roselita, aos tios Haroldo Jorge, Almir Filho, Marco e Elis, e 
primos. 
 
Aos meus pais, Haroldo e Rosamir, por todo o amor, incentivo e cuidado depositados 
em mim. Minha gratidão a vocês é imensurável. Ao César e Raissa, com quem dividi minha 
infância e o resto dos dias. 
 
A todos os demais familiares e amigos, que sempre me acolhem com muito carinho e 
torcem pelo meu sucesso. 
 
Aos órgãos CNPq e CAPES, pelas bolsas de Iniciação Científica, concedidas para a 
realização desse trabalho e a oportunidade do intercambio pelo programa Ciência sem 
Fronteiras, me proporcionando crescimento acadêmico e pessoal. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMO 
 
Produtos naturais têm um importante papel na descoberta de novas drogas para o tratamento 
de neoplasias malignas. A diversidade de organismos no ambiente marinho tem inspirado 
pesquisadores há algumas décadas para identificar novos produtos naturais que poderiam 
eventualmente ser desenvolvidos em medicamentos. As actinobactérias, também presentes 
nesse ambiente, apresentam uma capacidade incomparável de produzir diversos compostos 
bioativos. O litoral do Ceará tem sido prospectado para o potencial farmacológico encontrado 
em invertebrados marinhos, mas há poucos dados sobre os microrganismos desse ambiente. 
Este estudo objetivou a avaliação da citotoxicidade de extratos orgânicos derivados de 
actinomicetos isolados de sedimentos da costa do Ceará. Os sedimentos foram coletados em 4 
praias do litoral cearense. Em condições estéreis, as amostras foram tratadas para favorecer o 
crescimento de actinomicetos e as colônias com fenótipos desse grupo de bactérias foram 
isoladas. Confirmada a pureza, os isolados foram cultivados em meio líquido, de onde foi 
preparado o extrato bruto com acetato de etila (EtOAc). Em seguida, o potencial antitumoral 
foi avaliado através da atividade citotóxica in vitro dos extratos - utilizando o ensaio de MTT 
em uma linhagem de tumor coloretal (HCT-116), inicialmente em uma única concentração 
(50μg/mL), para uma avaliação qualitativa inicial. Os extratos que inibiram em mais de 75% 
o crescimento celular, foram considerados ativos e tiveram os valores da concentração 
inibitória média (CI50) determinados novamente através do ensaio de MTT utilizando-se de 
múltiplas concentrações. Um total de 96 estirpes foram isoladas. Dentre estas, 68 foram 
avaliados quanto à citotoxicidade. Na primeira análise, 31 extratos foram considerados ativos 
e 40% destes apresentaram CI50 menores que 1,0 μg/mL. Os extratos provenientes de estirpes 
BRA-028 e BRA-011 apresentaram as menores CI50, com valores de 20 ng/mL e 44 ng/mL, 
respectivamente. Das 12 estirpes que foram identificados, 9 pertencem ao gênero 
Streptomyces, 3 ao gênero Micromonospora. Estes resultados destacam o potencial 
farmacológico de microrganismos marinhos, além de serem fortes indícios de que o litoral do 
Ceará reserva imenso potencial para a exploração sustentável de compostos naturais com 
relevância biomédica. 
 
Palavras-chave: Actinomicetos; Antitumoral; Citotoxicidade; Litoral do Ceará. 
 
 
 
 
 
ABSTRACT 
 
Natural products play an important role in the discovery of new drugs for the treatment of 
malignant neoplasms. The diversity of organisms in the marine environment has inspired 
researchers for decades to identifynew natural products that could eventually be developed 
into drugs. Actinobacteria, also present in this environment, have an incomparable ability to 
produce various bioactive compounds. The coast of Ceará has been prospected for the 
pharmacological potential in marine invertebrates, but few data are available on the 
microorganisms in that environment. This study focused on the evaluation of the cytotoxicity 
from derived organic extracts isolated from actinomycetes in sediment from the Coast of 
Ceará. Sediments were collected in 4 beaches from Ceará. Under sterile conditions, samples 
were treated to favor the growth of actinomycetes and the colonies with phenotypes of this 
group were isolated. Confirmed the purity, the isolates were cultured in liquid medium, from 
which the crude extract was prepared with ethyl acetate (EtOAc). Then, the antitumor 
potential was assessed by the in vitro cytotoxic activity of the extracts - using the MTT assay 
in a colorectal tumor line (HCT-116), initially in a single concentration (50 μg / mL), for an 
initial qualitative analysis. The extracts that reduced cell growth by more than 75% were 
considered active and had the mean inhibitory concentration (IC50) values determined again 
by MTT assay using multiple concentrations. A total of 96 strains were isolated. Of these, 68 
strains were evaluated for cytotoxicity. In the first analysis, 31 extracts were considered active 
and 40% of them had IC50 lower than 1.0 μg / mL. The extracts from the BRA-028 and BRA-
011 strains had the lowest IC50, with values of 20 ng / mL and 44ng / mL, respectively. Of the 
12 strains that were identified, 9 belong to the genus Streptomyces, 3 to the genus 
Micromonospora. These results highlight the pharmacological potential of marine 
microorganisms, as well as strong indications that the coast of Ceará reserves immense 
potential for the sustainable exploitation of natural compounds with biomedical relevance. 
 
 
 
Keywords: Actinomycetes; Antitumor; Cytotoxicity; Coast of Ceará. 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1 - Desenho esquemático do planejamento experimental do presente estudo 
mostrando as etapas em sequência................................................................. 
 
Figura 2 -
 
Mapa do litoral do Estado do Ceará (parcialmente mostrado), 
indicando os locais de coleta (pontos vermelhos).......................................... 
 
Figura 3 -
 
Desenho esquemático dos métodos de pré-tratamento das amostras de 
sedimento.................................................................................................. 
 
Figura 4 -
 
Desenho esquemático do método de obtenção dos extratos brutos das 
bactérias recuperadas dos sedimentos das praias do Ceará............................. 
 
Figura 5 -
 
Distribuição das 96 estirpes isoladas quanto ao método de pré-tratamento da 
amostra do sedimento marinho e em relação ao meio de cultura em que 
foram crescidos na etapa inicial. M1, método I, sedimento seco foi 
carimbado em placa de cultura; M2, método 2, porção do sedimento foi 
diluído em água do mar estéril e aquecido a 55ºC e estriado em placas de 
ágar. SCA, amido-caseína, SWA, água do mar, TMA, ágar minerais traços.. 
 
Figura 6 - 
 
Citotoxicidade dos extratos das bactérias isoladas do sedimento das praias 
de Pecém, Taíba, Paracuru, Mucuripe e do sedimento dragado do Mucuripe, 
em células tumorais HCT-116, pelo ensaio do MTT, por 72h. Os dados 
correspondem a média ± erro padrão da média experimento em duplicata..... 
Figura 7 – Gráfico da proporção de extratos brutos ativos de acordo com a 
concentração inibitória média (CI50) menor que 1,00µg/mL.......................... 
 
 
 
 
 
 
22 
23 
31 
24 
26 
29 
33 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1 - Moléculas de fontes marinhas aprovadas para o uso clínico ou em fase de 
testes para o tratamento de diversas doenças (GERWICK et al, 2013)............ 16 
Tabela 2 - Relação da quantidade de estirpes isoladas de cada localidade de acordo com 
o método de processamento e ao tipo de meio de cultura.................................. 
29 
Tabela 3 - 
 
Potência da atividade citotóxica dos extratos obtidos de actinomicetos 
recuperados dos sedimentos das praias de Pecém, Taíba, Mucuripe e Paracuru, 
e do sedimento dragado do Mucuripe. Estão apresentados os valores de 
concentração inibitória média (CI50) e intervalo de confiança de 95% (IC 
95%) obtidos a partir da 2 experimentos independentes em duplicata, 
determinado por regressão não-linear no programa GraphPad Prism 6.0. 
(N.D.: Não determinado).................................................................................. 
 
 
 
32 
 
Tabela 4 - Identificação taxonômica de acordo com amplificação e sequenciamento de 
16S rDNA das amostras selecionadas e respectivos valores de concentração 
inibitória média (CI50)...................................................................................... 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
34 
 
 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 
 
AcOEt Acetato de etila 
BLAST 
CI50 
DMSO 
DNA 
DOX 
Basic Local Alignment Search Tool (Programa) 
Concentração inibitória média 
Dimetilsufóxido 
Desoxyribonucleic Acid 
Doxorrubicina 
HCT-116 
IC 
MTT 
NaCl 
Human Colon Tumor (Linhagem Celular) 
Intervalo de confiança 
3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil brometo de tetrazolio 
Cloreto de sódio 
NB-1 
PCR 
RNA 
RPMI 
Nível de Biossegurança-1 
Polymerase Chain Reaction 
Ribonucleic acid 
Roswell Park Memorial Institute (Meio de cultura de celulas) 
SCA 
SWA 
TMA 
Starch casein agar 
Seawater agar 
Agar trace minerals 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 14 
2 OBJETIVOS.......................................................................................................... 21 
 2.1 Objetivo geral................................................................................................. 21 
 2.2 Objetivos específicos...................................................................................... 21 
3 MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................. 21 
 3.1 Planejamento experimental............................................................................ 21 
 3.2 Coleta do material........................................................................................... 22 
 3.3 Processamento das amostras.......................................................................... 23 
 3.3.1 Método do carimbo (M1).................................................................. 24 
 3.3.2 Método de diluição(M2).................................................................... 24 
 3.4 Isolamento e manutenção dos microrganismos............................................ 25 
 3.7 Manutenção da cultura celular...................................................................... 26 
 3.8 Teste de atividade citotóxica (Ensaio do MTT)............................................ 27 
 3.9 Análise dos dados............................................................................................ 27 
 3.10 Identificação molecular dos microrganismos selecionados....................... 28 
4 RESULTADOS...................................................................................................... 28 
 4.1Isolamento dos microrganismos..................................................................... 28 
 4.2 Avaliação da atividade citotóxica in vitro dos extratos................................ 30 
 4.3 Identificação molecular dos microrganismos selecionados......................... 33 
5 DISCUSSÃO......................................................................................................... 34 
6 CONCLUSÃO.......................................................................................................39 
 REFERÊNCIAS................................................................................................... 40 
 ANEXO I- Composição dos meios de cultura para microrganismos............... 48 
 ANEXO II – Fotografia de colônias isoladas em meio de cultura sólido......... 50 
 
 
 
14 
1. INTRODUÇÃO 
 
As neoplasias malignas, segundo a Organização Mundial da Saúde, estão entre as 
enfermidades que mais causam óbitos no mundo. Em 2012, foram responsáveis por 8,2 
milhões de mortes, e até 2030, estima-se 27 milhões de novos casos. O câncer é caracterizado 
como um conjunto de mais de 100 doenças, podendo afetar quaisquer células do corpo, que 
têm em comum o crescimento desordenado e cuja manifestação é bastante variável (INCA, 
2016). 
O objetivo primário da quimioterapia é destruir as células cancerosas, preservando as 
normais. Agentes antineoplásicos que têm como característica o desencadeamento da morte 
por apoptose das células tumorais são chamados de citotóxicos. O principal efeito desses 
quimioterápicos é exercido sobre a divisão celular, na qual atuam em diversos alvos, 
com interferência direta no metabolismo celular, seja na duplicação do DNA, na síntese de 
RNA, na síntese proteica ou nas fases do ciclo celular, como também na consequente parada 
de vias metabólicas. Compostos que atuem interferindo diretamente no ciclo celular, 
bloqueando uma sequência metabólica e, com isto, impedindo a divisão ou amadurecimento 
celular levando a célula à morte possuem potencial anticâncer (MADIGAN et al, 2010; 
ALMEIDA et al, 2005). 
Apesar de haver uma grande quantidade de fármacos disponíveis para o tratamento 
dos cânceres, e da possível cura, a elevada taxa de mortalidade pode ser justificada pela 
dificuldade de detecção nos estágios iniciais, o que aumenta a probabilidade de cura, bem 
como a inexistência de fármacos que sejam totalmente efetivos em todos os pacientes. 
Portanto, a busca por compostos ideais que apresentem altas seletividade e potência 
terapêutica, aliados a mínimo efeitos colaterais e baixo índice de resistência faz-se 
imprescindível para avanços no tratamento oncológico. 
Do período de 1981 a 2014, compostos antitumorais foram a classe mais explorada, 
como maior número de produtos naturais isolados. Aproximadamente 60% de todos os 
quimioterápicos aprovados atualmente para o tratamento do câncer possuem, em alguma 
instância, origem em fontes naturais (NEWMAN & CRAGG, 2014). 
A grande diversidade de organismos existentes na natureza, tais como plantas, 
animais, fungos e microrganismos, é responsável pela grande variedade de estruturas 
químicas encontradas. Isso é impacto da evolução na seleção e conservação de mecanismos 
de defesa para repelir ou destruir predadores. Além das clássicas fontes terrestres como as 
plantas e microrganismos, a prospecção de compostos com atividade biológica oriundas do 
 
15 
ambiente marinho vem ganhando destaque (CRAGG et al, 1997; FAULKNER, 2000; 
AMADOR et al, 2003; MOLINSKY et al, 2009). 
Os mares e oceanos representam 2/3 do planeta, cobrindo a maior parte da superfície 
terrestre. Este ambiente abriga representantes de 34 dos 36 filos existentes, reunindo cerca de 
300.000 espécies descritas entre plantas e invertebrados, sem contar os milhões de 
microrganismos, sendo alguns estritamente marinhos (DONIA & HAMANN, 2003; 
SOARES-GOMES & FIGUEIREDO, 2009). A mistura complexa de sais; a enorme variedade 
de organismos vivos liberando seus metabólitos ao meio e a imensa vastidão, com uma média 
de profundidade de 4000 m, justificam esse ecossistema como fonte favorável de compostos 
bioativos. Além do que, a comunicação entre os organismos através de substâncias químicas 
com alta solubilidade em água assume fundamental importância ecológica (HESTER & 
HARRISON, 2000; BHAKUNI & HAWAT, 2005). 
Devido ao difícil acesso, o ambiente marinho foi por muito tempo inexplorado. Com o 
avanço de técnicas e equipamentos, por volta das décadas de 50 e 70, foi dado início às 
pesquisas com produtos naturais com importância farmacológica oriundos do ambiente 
marinho (COSTA-LOTUFO et al., 2009). O marco inicial da prospecção desse ambiente foi o 
isolamento de arabinonucleosídeos, espongotimidina e espongouridina, obtidos da esponja 
caribenha Cryptotethya crypta (Tethyidae) por Bergman e colaboradores em 1951. Esses 
nucleosídeos serviram de protótipo para o desenvolvimento de uma nova classe de análogos - 
Ara-A e Ara-C – utilizados hoje na clínica, respectivamente como antiviral e anticâncer 
(KÖNING & WRIGHT, 1996; SCHWARTSMANN et al., 2001). 
Nas décadas seguintes, os estudos de bioprospecção de produtos naturais marinhos 
progrediram exponencialmente. Até o ano de 2013, cerca de 22.000 novas moléculas foram 
isoladas de organismos marinhos. Além dos arabinonucleosideos já citados, atualmente 
também o antitumoral trabectedina (Yondelis®) e o analgésico neuropático ziconotídeo 
(Prialt®) encontram-se em uso clínico e, juntamente com outros na fase de estudos clínicos, 
são mostrados na Tabela 1 (GERWICK et al, 2013). 
 
 
 
 
 
 
 
16 
 
 
 
 
Produtos naturais marinhos possuem uma extraordinária diversidade de alvos 
moleculares com seletividade marcante, o que aumenta o potencial farmacológico e 
terapêutico dessas moléculas. A grande maioria dos alvos identificados apresenta-se como 
relevantes no tratamento do câncer e é exatamente no estudo e na terapêutica dessa doença 
que se pode visualizar o maior impacto das substâncias de origem marinha (HAEFNER, 
2003). 
Apesar de toda essa riqueza química e propriedades farmacológicas encontradas nos 
produtos marinhos, o verdadeiro produtor das moléculas identificadas ainda não é nitidamente 
esclarecida (NEWMAN & CRAGG, 2004). Contudo, sabe-se que estes possuem relevância 
nas funções de defesa química dos organismos hospedeiros, visto que foram encontradas 
abundantemente em organismos sésseis ou com capacidade restrita de locomoção; animais de 
corpo mole e carentes de estruturas físicas de defesa. Dessa forma, as esponjas, juntamente 
com ascídias, moluscos, briozoários, cnidários e algas têm seus potenciais bastante 
explorados. Mesmo diante de todo potencial relatado, vale ressaltar que menos de 3% do total 
estimado de organismos marinhos já tenha sido estudado (BURKHARD, 2003; NAGLE et al, 
Composto Origem Uso Composto Origem Uso 
Citarabina* Esponja Antitumoral Zalypsis Molusco Antitumoral 
Vidarabina* Esponja Antiviral SGN-75 Molusco Antitumoral 
Trabectedina* Ascidia Antitumoral ASG-5ME Molusco Antitumoral 
Ziconotídeo* Molusco Analgésico Elisidepsina Molusco Antitumoral 
Mes. Eribulina* Esponja Antitumoral Glembatumumab v. Molusco Antitumoral 
Etilesteres o-3* Peixe Hipertriglicerid. E7974 Esponja Antitumoral 
Brentuximab v.* Molusco Antitumoral PM01183 Ascidia Antitumoral 
Soblidodina Bacteria Antitumoral Sintadotina Bacteria Antitumoral 
Aplidina Ascidia Antitumoral Mariozomib Bactéria Antitumoral 
DMXBA Verme Esquizofrenia Briostatina 1 Briozoário Antitumoral 
Alzheirmer 
Plinabulina Fungo Antitumoral Pseudopterosina Coral Cicatrização 
Tabela 1- Moléculas de fontes marinhas aprovadas para o uso clínico ou em fase de testes para o 
tratamento de diversas doenças. 
*Compostos aprovados para uso clínico. Fonte: Adaptado de GERWICK et al, 2013. 
 
17 
2004; THAKUR & MÜLLER, 2004). 
Embora vários estudos mostrem que tais grupos de invertebrados são uma importante 
fonte de novos compostos de interesse da biomedicina, é comprovado ser bastante 
dispendioso a obtenção de suprimentos adequados quantitativamente e, principalmente, 
renováveis destes compostos a partir da natureza. Além disso, a complexidade estrutural dos 
produtos marinhos, muitas vezes, tem inviabilizado a sua síntese química, seja para fins 
experimentais ou comerciais (JENSEN & FENICAL, 2000). 
 A maioria dos invertebrados não exibe um padrão característico de metabólitossecundários. Há fortes indícios de que a maior parte destes metabólitos são oriundos de 
produtos do metabolismo dos microrganismos a eles associados ou que foram obtidos na 
dieta. Isso, portanto, tem levado a uma significativa expansão das pesquisas com 
microrganismos do ambiente marinho (KELECON, 2002; PEREIRA, 2008 ). 
Embora se estime que apenas 1 a 2% da microbiota associada seja cultivável, ainda 
assim, tem-se uma grande significância histórica dos microrganismos como fonte de 
fármacos. A descoberta da penicilina, por Alexander Fleming em 1929, culminou na busca de 
microrganismos terrestres produtores de metabólitos secundários com propriedades 
farmacológicas. Nos últimos 60 anos, entre 30.000 e 50.000 produtos naturais foram 
descobertos a partir de microrganismos; mais de 10.000 destes compostos apresentam 
atividade biológica e mais de 80% destas moléculas apresentam atividade antitumoral e 
antibiótica (FENICAL, 1993; FENICAL & JENSEN, 2006). Atualmente, cerca de 120 entre 
os mais importantes medicamentos utilizados são derivados de microrganismos (DEMAIN, 
2006; JENSEN & FENICAL, 2000). 
Os microrganismos marinhos desenvolveram um metabolismo único e capacidades 
fisiológicas que não apenas garantiram sua sobrevivência em ambientes extremos, mas 
também proporcionaram potencial para a produção de metabólitos nunca antes observados em 
organismos terrestres (FENICAL, 1993; ZHANG et al., 2000). Visto que um espécime pode 
ser capaz de excretar uma gama de compostos bioativos diferentes, quando submetida a 
condições químicas e físicas adversas, e aliado ao avanço de técnicas genômicas e de análise 
de vias metabólicas, faz-se imensurável o seu valor biotecnológico. Amplamente distribuídos 
por todo o ambiente marinho, estima-se que são encontrados 106 microrganismos/mL na água 
do mar e 109 microrganismos/mL no sedimento marinho, tornando os oceanos um ambiente 
microbiológico bastante complexo (FENICAL & JENSEN, 2006). 
 
 
18 
Desde quando começaram a ser exploradas, na década de 50, bactérias da ordem 
Actinomycetales têm se destacado na bioprospecção de compostos com atividade 
farmacológica, observando-se que aproximadamente 40% dos metabólitos bioativos isolados 
de microrganismos até 2010 são provenientes desse grupo (BERDY, 2012). 
Apesar da uma grande variedade morfológica, as actinobactérias terrestres e marinhas 
têm um padrão de crescimento comum, apresentando-se filamentosas e com produção de 
esporos que aparecem na superfície da colônia (BULL, 1992). Este grupo de bactérias gram-
positivas constituem uma proporção considerável dos microrganismos do solo (104 – 106 
esporos de actinomicetos por grama de solo) e abundantemente distribuída nos mais diversos 
ambientes, como solos, água doce ou salgada, associados a organismos ou dispersos no 
sedimento (CLAESSEN et al., 2006). 
No meio marinho, são distinguidas duas localidades: a zona litorânea e costeira, e 
sedimentos de profundidade. Weyland (1969) observou que a população de actinobactérias 
assim como outros microrganismos é mais densa no mar raso do que em águas profundas. 
Também, Bull e colaboradores (2005) descobriram que as actinobactérias costumam 
representar até 9% nos sedimentos marinhos. 
As actinobactérias apresentam alto teor de guanina e citosina compondo o DNA. Uma 
incomparável capacidade de produzir diversos metabólitos secundários é bem característica 
desse grupo (DAS et al., 2008). Em 2001, Watve e colaboradores estimaram que desde o 
descobrimento da estreptotricina em 1942 e da estreptomicina dois anos depois, a ordem 
Actinomicetales tem aproximadamente 3000 compostos antibióticos conhecidos (90% destes 
provenientes do gênero Streptomyces). Dois terços dos antibióticos disponíveis 
comercialmente foram originalmente isolados de espécies desse gênero (GUIMARÃES et al., 
2010). O grupo tem um enorme potencial biossintético que permanece incontestado entre 
outros grupos microbianos. A imensa diversidade, juntamente com a sua notabilidade, é a 
razão fundamental para atrair pesquisadores para descobrir novos metabólitos 
(MANIVASAGAN, 2013). 
Na quimioterapia antineoplásica, esse grupo contribui com a produção de antibióticos 
anticancerígenos como bleomicina B2, actinomicina D, antraciclina (como a daunorubicina e 
doxorrubicina) e pentostatina, largamente empregadas no tratamento de diversos tipos de 
tumores (PUPO et al, 2006). Outro exemplo de antraciclina, a retamicina, mostrou-se 
promissora como agente quimioterápico, devido à menor toxicidade e uma forte inibição de 
carcinomas e sarcomas, reduzindo entre 76% e 79% o crescimento desses tipos de tumores 
(PAMBOUKIAN, 2003). Outra novidade é apresentada pelo antibiótico antitumoral 
 
19 
mitomicina, pois, ao ser absorvido sistemicamente, ocorre pouca ou nenhuma toxicidade 
sistêmica (KATZUNG, 2006). 
Como no meio ambiente marinho as condições são extremamente diferentes das 
terrestres, os actinomicetos marinhos têm diferentes características daqueles homólogos 
terrestres e, portanto, podem produzir diferentes tipos de compostos bioativos (LAM, 2006). 
Um resultado marcante na bioprospecção de produtos naturais marinhos foi a descoberta da 
molécula salinosporamida A, isolada a partir do actinomiceto de gênero Salinispora, 
restritamente marinho. Tal composto classifica-se como beta-lactona e atua como um potente 
inibidor seletivo e irreversível do proteassomo 20S. Rapidamente entrou em testes clínicos 
contra linfoma e mieloma múltiplo, levando apenas 3 anos após sua descoberta - o que 
normalmente pode levar de 10 a 15 anos (FENICAL et at 2009). 
O Brasil possui uma costa contínua de litoral com uma extensão de 8.500 km. A área 
oceânica é de aproximados 3,6 milhões de km²- os quais, somados aos cerca de 900mil km² 
de extensão que o Brasil reivindica - totalizam cerca de 4,5 milhões de km², o que representa 
quase metade da parte terrestre do território nacional. Devido à importância estratégica e à 
necessidade de desvendar a diversidade biológica, o potencial biotecnológico e os 
incalculáveis bens naturais, este território recebeu a denominação de “Amazônia Azul”, por 
ser comparável à “Amazônia Legal Brasileira”. Contudo, ainda são poucos ainda os estudos 
relacionados ao ambiente marinho brasileiro (MARINHA DO BRASIL, 2016). 
A costa cearense encontra-se em uma posição bastante favorável à prospecção de 
compostos de interesse biomédicos, pois o estado se encontra na região nordestina. A 
proximidade com a linha do Equador permite ao estado uma localização favorável a maior 
diversidade de organismos e, consequentemente, uma maior concentração de metabólitos 
secundários do que os que vivem em latitudes mais altas (BLACKBURN & GASTON,1996; 
ROHDE, 1992). No litoral do Ceará, existem diferentes ecossistemas costeiros os quais se 
encontram sujeitos a amplas variações de fatores ambientais, como temperatura do ar e da 
água, exposição ao sol, intensidade e frequência dos ventos, taxas de oxigênio intersticial, 
granulométrica do substrato, declive do terreno e ação das ondas. A faixa litorânea cearense é 
considerada heterogênea, variando de acordo com a hidrodinâmica local (MATTHEWS-
CASCON & LOTUFO, 2006). Suas praias são amplamente utilizadas como áreas de lazer, 
pesca e zonas portuárias, gerando impactos ambientais, direta e indiretamente, ao longo da 
zona costeira. 
 
 
20 
Somente no ano de 2003, estudos de bioprospecção de produtos naturais marinhos 
foram introduzidos no estado do Ceará, a partir de uma triagem dos extratos das espécies de 
ascídias mais abundantes da costa cearense, em que Jimenez e colaboradores revelaram que 
seis das dez espécies testadas apresentaram-se promissoras como fonte de compostos com 
atividade citotóxica. A partir do extrato do zoantídeo Protopalythoa variabilis, coletado na 
Praia de Paracuru, Wilke e colaboradores (2009) isolaram α-aminoacidos lipídicos com 
potenteatividade citotóxica em quatro linhagens de células tumorais testadas. Ainda no 
estudo de invertebrados marinhos, no ano de 2011, a partir do extrato obtido da esponja 
Monanchora arbuscula, por Ferreira e colaboradores, foram isolados alcalóides que 
apresentaram forte atividade citotóxica contra a linhagem de célula tumoral de leucemia 
promielocítica, levando estas células a morte por apoptose. Este estudo mostrou que o extrato 
de nove das vinte e duas espécies de esponjas coletadas no parque estadual marinho Pedra da 
Risca do Meio, na capital cearense, apresentava interessante atividade citotóxica, enquanto o 
extrato de dezenove destas inibiram a divisão de ovos de ouriço-do-mar. 
A identificação de derivados e estaurosporinas, substância tipicamente relacionada ao 
metabolismo secundário de actinomicetos, isolados de extratos da ascidia Eudistoma 
vanammei, coletada na praia da Taíba, motivou os estudos prospectivos de sua microbiota 
associada (JIMENEZ et al, 2013). O isolamento de microrganismos associados à ascídia, com 
a avaliação da atividade citotóxica em três linhagens celulares tumorais, levou a identificação 
de um actinomiceto do gênero Streptomyces, em cujo extrato, com melhor resultado, 
demonstrou a presença de estaurosporina. O fracionamento bioguiado desse extrato, 
entretanto, levou ao isolamento de ditiolpirolona, com potente atividade citotóxica, 
bloqueando a citocinese de células metastáticas de próstata, com consequente apoptose destas 
(ABREU et al, 2013). Numa segunda investida em 2012, da microbiota associada a outro 
exemplar da ascídia, foi recuperada um estirpe pertencente ao gênero Micromonospora, em 
cujo extrato foram encontrados 4 novos derivados de antraciclinas, moléculas conhecidas pelo 
seu potencial anticâncer (SOUZA et al, 2012). 
Estudos com invertebrados marinhos presentes no litoral do Ceará, apesar de 
mostrarem uma fonte de novos compostos de interesse farmacológico, enfrentam como maior 
dificuldade o baixo rendimento. Isto tem implicações negativas, tanto na limitação para a 
determinação e caracterização das substâncias e nos estudos de atividade biológica, como na 
quantidade de organismos retirados do ambiente natural, gerando um déficit na população da 
espécie e em suas respectivas relações ecológicas. Vale ressaltar, portanto, que estudos com 
microrganismos presentes no sedimento são uma rota alternativa para tentar suprimir tais 
 
21 
limitações, pela perspectiva de sustentabilidade que está associada à possibilidade de 
fermentação para produção de material suficiente para as etapas do desenvolvimento de 
fármacos (LOTUFO et al, 2009). 
Vendo que esse é um campo ainda pouco conhecido, mas muito promissor, o presente 
trabalho propõe o desenvolvimento da pesquisa em produtos naturais marinhos, no sentido de 
promover a avaliação do potencial anticâncer de actinomicetos presentes no sedimento de 
praias da costa do Ceará. Os estudos nesta área são considerados estratégicos por envolver o 
conhecimento da biodiversidade num sentido amplo, além de fontes renováveis de substâncias 
com importância biomédica. 
 
 
2 OBJETIVOS 
 
 
2.1 Objetivo geral 
Avaliar a atividade citotóxica de extratos obtidos de linhagens de actinomicetos 
isolados do sedimento de 4 praias do estado do Ceará. 
2.2 Objetivos específicos 
 Isolamento e cultivo de linhagens de actinomicetos presentes no sedimento de praias 
do litoral cearense. 
 Avaliação do potencial citotóxico in vitro de extratos orgânicos obtidos das bactérias 
isoladas contra uma linhagem de câncer de colorretal. 
 Determinação da concentração inibitória media dos extratos que forem considerados 
ativos. 
 Identificação a nível molecular das bactérias selecionadas. 
 
 
3 MATERIAIS E MÉTODOS 
 
3.1 Planejamento experimental 
 
Inicialmente, as amostras de sedimento de 5 localidades, em 4 praias do litoral 
cearense, foram coletadas, devidamente armazenadas, e preparadas para processamento no 
Laboratório de Ecotoxicologia Marinha (Fig. 1). O plaqueamento foi realizado com o objetivo 
 
22 
de isolar os actinomicetos. Confirmada a pureza, foram então cultivados em meio líquido para 
a preparação do extrato bruto. Em seguida, a atividade citotóxica dos extratos em células 
tumorais in vitro foi avaliada. Finalmente foram determinados os valores da concentração 
inibitória média (CI50) dos extratos ativos na triagem inicial. Algumas estirpes que foram 
ativas, tiveram o DNA extraído para a identificação molecular. 
 
 
3.2 Coleta do material 
 
Uma amostra de cerca de 20g de sedimento marinho foi coletada, com o auxílio de 
uma espátula estéril, em 5 pontos do litoral cearense, transportadas em um tubo Falcon estéril, 
e conservado a -20ºC até o seu devido processamento, no Laboratório de Ecotoxicologia 
Marinha (ECOTOX), no Instituto de Ciências do Mar. 
As coletas foram realizadas manualmente por mergulho autônomo na Praia da Pedra 
Rachada (03º23’S 39º54’O), pertencente ao município de Paracuru; Praia da Taíba 
(03º30'21,23''S; 38º53' 40,16''O), Praia do Pecém (3°32'2''S; 38°47'58''O), ambas pertence ao 
Figura 1 - Desenho esquemático do planejamento experimental do presente estudo 
mostrando as etapas em sequência. 
Fonte: elaborado pelo autor. 
 
23 
município de São Gonçalo do Amarante; e no Mucuripe, na capital Fortaleza, em dois pontos 
de coleta, na praia (3°43'23.4"S 38°29'24.6"W) e uma amostra foi retirada do sedimento 
dragado do Porto do Mucuripe (03°43'17.70''S; 38°29'23.84''W). As localidades são mostradas 
no mapa a seguir (Fig. 2). 
 
Figura 2 - Mapa do litoral do Estado do Ceará (parcialmente mostrado), indicando os 
locais de coleta (pontos vermelhos). 
 
 
 
3.3 Processamento das amostras 
 
Para garantir a esterilidade, os sedimentos coletados foram processados em câmara de 
fluxo laminar unidirecional (NB-1). Foram submetidos a dois tratamentos distintos com o 
objetivo de selecionar as cepas de bactérias actinomicetos, como descrito na Figura 3. 
 
 
 
 
Figura 3 - Desenho esquemático dos métodos de pré-tratamento das amostras de sedimento. 
Fonte: elaborado pelo autor. 
 
24 
Figura 3 - Desenho esquemático dos métodos de pré-tratamento das amostras de sedimento. 
 
 
3.3.1- Método do carimbo (M1) 
 
Esse método tem como princípio selecionar as bactérias resistentes a desidratação, 
onde uma fina camada dos sedimentos coletados foi espalhada em placas de Petri estéreis e 
mantidas em capela de fluxo laminar por 48h com o fluxo ligado. Após esse período, com o 
auxílio de uma esponja previamente esterilizada, o sedimento foi homogeneizado e carimbado 
em placas de Petri contendo os meios de cultura sólidos utilizados para o isolamento de 
bactérias SWA (água do mar e ágar), TMA (água do mar, solução de metais traços e ágar) e 
SCA (amido-caseína e ágar); todos os meios utilizados foram produzidos com água do mar 
filtrada e a estes foram adicionados antifúngico (cicloheximida) na concentração de 
100µg/mL. 
 
3.3.2- Método de diluição (M2) 
 
No segundo método, os sedimentos previamente decantados foram diluídos em água 
do mar sintética na proporção de 1:5 (m/v). O volume de 1mL dessa solução foi aquecido em 
banho-maria a 55°C por 10 min. Após essa etapa, com o auxílio de uma pequena alça, o 
homogeneizado foi estriado em placas de Petri contendo os meios de cultura SWA, TMA e 
Fonte: elaborado pelo autor. 
 
25 
SCA utilizados para o isolamento das bactérias e adicionados na mesma forma do método 
anterior. Essa segunda metodologia objetivou selecionar as estirpes mais resistentes ao 
aquecimento. 
Após o plaqueamento das amostras, as placas foram armazenadas em estufa B.O.D. a 
28ºC por 7 dias, podendo lá permanecer por até 90 dias. 
 
3.4 Isolamento e manutenção dos microrganismos 
 
A seleção das linhagens de bactérias foi realizada por suas características fenotípicas 
(cor, brilho, forma, textura, etc), típicas de actinomicetos.A morfologia macroscópica de 
colônias desse grupo é bem descrita na literatura, que, em meio de cultivo sólido, apresenta-se 
em aspecto opaco, não-leitoso, com superfícies e bordas irregulares, ou não, e, 
principalmente, a esporulação, podendo apresentar pigmentos (BALDACCI et al, 1953). 
Linhagens com as respectivas características de actinobactérias foram inoculadas em 
uma nova placa contendo um meio mais rico (A1), composto por água do mar, peptona, 
amído e extrato de levedura e ágar. O isolamento foi feito a partir da técnica de estrias por 
esgotamento. As placas sofreram repiques sucessivos até que as estirpes estivessem 
completamente puras. 
Confirmada a pureza, foram crescidas em meio A1 líquido. Deste, retirou-se 10mL e 
adicionou-se ao mesmo volume de solução glicerol 50%, diluído em água destilada 
previamente autoclavada para a criopreservação das estirpes puras. Em seguida, a solução foi 
aliquotada em frascos criogênicos de 2mL e estocados em freezer a temperatura de -80ºC. 
Nesse momento, as cepas congeladas em congelador a -80ºC foram nomeadas com o 
código BRA- seguido pela numeração subsequente do banco de microrganismos do 
Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia Marinha (LaBBMar), no Núcleo de 
Desenvolvimento de Medicamentos, vinculado à Universidade Federal do Ceará. Em seguida, 
as bactérias também foram catalogadas no inventário eletrônico do LaBBMar. 
 
3.5 Obtenção dos extratos brutos 
 
Para a obtenção dos extratos brutos, cepas de bactérias purificadas foram inoculadas 
em erlenmeyers de 500mL contendo 100mL de meio de cultura A1 líquido. As culturas foram 
mantidas sob agitação a 200rpm, 28ºC por 7 dias. 
Após o crescimento no meio líquido, os caldos de cultura oriundos das bactérias foram 
 
26 
extraídos com acetato de etila (EtOAc), na proporção de 1:1, sob agitação por um período de 
duas horas. Em um funil de separação, o conteúdo de cada erlenmeyer foi filtrado e a 
biomassa resultante foi descartada. 
Em seguida, os extratos líquidos foram concentrados em evaporador rotativo para a 
eliminação do solvente e a obtenção do extrato bruto. Após a secagem em estufa, estiveram 
prontos para os testes de rastreamento de atividade citotóxica. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3.6 Manutenção da cultura celular 
 
 As células da linhagem HCT-116 (carcinoma de cólon humano) foram adquiridas do 
Banco de Células do Rio de Janeiro e cultivadas em recipientes de plásticos para culturas 
(Corning, 25cm2, volume de 50mL), contendo 5mL de meio de cultura RPMI 1640 (Gibco), 
suplementado com soro fetal bovino (10%). A cada 3 dias, foram feitas passagens para novo 
recipiente contendo novo meio RPMI 1640. Para a soltura das células, utilizou-se 1mL de 
Tripsina 1X. As culturas foram mantidas em incubadoras a 37ºC e atmosfera de 5% de CO2. 
 
 
Figura 4 - Desenho esquemático do método de obtenção dos extratos brutos das bactérias 
recuperadas dos sedimentos das praias do Ceará. 
Fonte: elaborado pelo autor. 
 
27 
3.7 Teste de atividade citotóxica (Ensaio do MTT) 
 
O teste do MTT foi usado para a avaliação da atividade citotóxica. Seu princípio 
consiste na análise colorimétrica que quantifica indiretamente as células viáveis, baseada na 
conversão do sal 3-(4,5-dimetiltiazol-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H tetrazolina bromida (MTT), 
um composto de cor amarela, em formazan, um composto insolúvel de coloração púrpura. 
Essa reação ocorre pela atividade da enzima succinil-desidrogenase presente nas mitocôndrias 
ativas das células vivas (MOSMANN, 1983). 
Para uma análise qualitativa inicial, os extratos foram avaliados quanto ao efeito 
antiproliferativo na linhagem celular tumoral de câncer coloretal humano – HCT-116. Vinte e 
quatro horas antes da realização dos ensaios, as células tumorais foram incubadas em placas 
com 96 cavidades a um inóculo de 5,0 x 104 células/mL. Os extratos brutos foram diluídos em 
solvente DMSO, dimetilsufóxido, e então inseridos nos poços, em duplicatas, em 
concentração única de 50µg/mL. Como controle positivo, utilizou-se o quimioterápico 
doxirrubicina. Após 72h de incubação a 37ºC e 5% de CO2, o sobrenadante foi descartado e 
150µL da solução de MTT 10% em meio RPMI 1640 foi adicionado a cada poço e reincubado 
por mais 3h. Após esse período, adicionou-se 150µL de DMSO e foi agitado até a completa 
solubilização do MTT. A leitura da absorbância foi feita no espectrofotômetro, no 
comprimento de onda de 565nm. 
Os extratos que inibiram o crescimento celular em mais de 75% foram considerados 
ativos e submetidos a uma análise quantitativa, para a obtenção das respectivas concentrações 
inibitórias médias (CI50) frente a células da linhagem HCT-116, no ensaio de MTT, a 
concentrações seriadas entre 0,016 e 50μg/mL. 
 
3.8 Análise dos dados 
 
Para as amostras testadas em duplicatas de concentração única, o valor do percentual 
de inibição do crescimento celular foi obtido a partir da normalização dos valores de 
absorbância, relativas ao controle. 
O cálculo da CI50 e dos respectivos intervalos de confiança (IC 95%) foi realizado a 
partir da regressão não-linear dos dados normatizados utilizando o programa GraphPad Prism 
(GraphPad Software versão 6.0). 
 
 
 
28 
3.9 Identificação molecular dos microrganismos selecionados 
 
As estirpes selecionadas foram crescidas em erlenmeyers contendo 50mL do meio de 
cultura A1, e, em seguida, sua biomassa foi concentrada para a extração do DNA de cada 
amostra de acordo com kit comercial para extração de DNA total DNeasy® da Qiagen, 
segundo o protocolo do fabricante. Para a confirmação da extração de DNA e de sua pureza, o 
material genético extraído foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1%, coradas com 
brometo de etídeo e visualizadas em transluminador. 
A amplificação parcial da região da subunidade ribossômica 16S do DNA foi realizada 
através de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando-se primers universais para 
identificação taxonômica para o domínio Bacteria (Foward: F243 {5'-
GGATGAGCCCGCGGCCTA-3'} e Reverse: R513 {5'-CCGCGGCTGCTGGCACGTA-3'}). 
Os produtos obtidos da PCR foram utilizados para o sequenciamento parcial do rDNA 16S. 
Uma vez obtidas as sequências de DNA, estas foram comparadas em banco genético 
utilizando-se o programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). A busca no BLAST 
alinha as sequências de rDNA 16S obtidas numa base de dados de sequências conhecidas a 
fim de encontrar o pareamento taxonômico mais aproximado (ALTSCHUL et al, 1997). Este 
programa encontra-se disponível na página web para o Centro Nacional para Informações em 
Biotecnologia dos Estados Unidos (National Center for Biotechnology Information), no 
endereço eletrônico http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. 
 
 
4 RESULTADOS 
 
4.1 Isolamento dos microrganismos 
 
Um total de 96 estirpes foram isoladas com base em suas características semelhantes 
às de actinomicetos, a partir das amostras dos sedimentos das 4 praias do litoral cearense, 
sendo 10 provenientes do sedimento da praia da Taíba; 11 do Pecém; 26 de Paracuru; 17 da 
praia do Mucuripe e 32 do sedimento dragado do Porto do Mucuripe. 
Na Tabela 2, observa-se a relação da quantidade de estirpes isoladas de acordo com a 
praia referindo-se ao método que foi processado e ao meio de cultura em que foi recuperado. 
 
 
 
29 
 
 
 
 
 
Mucuripe-Draga Mucuripe-Praia Pecém Taíba Paracuru 
M1 M2 M1 M2 M1 M2 M1 M2 M1 M2 
SWA 4 5 5 7 - 5 - 8 4 3 
SCA 5 9 - 2 4 2 - - 1 10 
TMA 3 6 2 1 - - 1 1 3 5 
 
 
As amostras de sedimento marinho coletadas nesse estudo foram submetidas a dois 
métodos de pré-tratamento. O método da diluição, M2, baseado no aquecimento a 55ºC das 
amostras, foi o mais eficiente no isolamento das bactérias. Promoveu o isolamento de 67% 
das linhagens, correspondendo ao total de 64 microrganismos. O M1, em que as amostras 
foram desidratadas, mantidaspor 48h secando, rendeu o isolamento de 32 das 96 estirpes. 
O meio de cultura Sea Water Agar, composto apenas de água do mar filtrada e diluída 
e ágar, se mostrou mais favorável ao isolamento dos microrganismos, com mais de 42% do 
total, um valor de 41 estrias. Seguido pelo meio SCA com 33 estirpes isoladas (34%) e pelo 
TMA com 22 (22%), de um total de 96, como mostrado na Figura 5. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5 – Distribuição das 96 estirpes isoladas quanto ao método de pré-tratamento da 
amostra do sedimento marinho e em relação ao meio de cultura em que foram crescidos. 
M1, método 1; M2, método 2. SCA, amido-caseína, SWA, água do mar, TMA, ágar 
minerais traços. 
Tabela 2 - Relação da quantidade de estirpes isoladas de cada localidade de acordo com o 
método de processamento e ao tipo de meio de cultura. 
Fonte: elaborado pelo autor. 
Fonte: elaborado pelo autor. 
 
30 
 
4.2 Avaliação da atividade citotóxica in vitro dos extratos 
 
Das 96 estirpes isoladas, 68 amostras foram escolhidas aleatoriamente e então 
cultivadas em meios líquidos, extraídas com EtOAc e avaliadas quanto à sua citotoxicidade. 
Destes, 31 inibiram o crescimento celular em pelo menos 75%, e foram consideradas ativas, 
conforme mostrado na Figura 6. 
 
 
 
 
31 
 
Figura 6 - Citotoxicidade dos extratos das bactérias isoladas do sedimento das praias de 
Pecém, Taíba, Paracuru, Mucuripe e do sedimento dragado do Mucuripe, em células tumorais 
HCT-116, pelo ensaio do MTT, por 72h. Os dados correspondem a média ± erro padrão da 
média do experimento em duplicata. 
Fonte: elaborado pelo autor. 
 
32 
Na Tabela 3, são mostrados os valores de CI50 para os 31 extratos ativos variaram de 
0,02 a 42,13µg/mL, sendo o extrato proveniente da linhagem BRA-028, do sedimento 
dragado do Mucuripe, o mais citotóxico, seguidos pelos extratos das BRA-011 e BRA-148, 
com CI50 de 0,04 e 0,066µg/mL, respectivamente. 12 extratos apresentaram CI50 menores que 
1,0µg/mL, como mostrado na Figura 7. 
 
AMOSTRA CI50 
IC (95%) 
R2 AMOSTRA CI50 
IC (95%) 
R2 
BRA-011 0,04 
(0,02-0,09) 
0,7340 BRA-149 14,99 
(12,92-17,38) 
0,9880 
BRA-016 22,13 
(15,71-31,18) 
0,9068 BRA-152 >50 N.D. 
BRA-018 0,98 
(0,508-1,89) 
0,8413 BRA-220 12,54 
(8,333-18,86) 
0,9503 
BRA-021 0,30 
(0,12-0,86) 
0,9645 BRA-222 >50 N.D. 
BRA-022 30,51 
(11,74-79,28) 
0,7301 BRA-227 0,8873 
(0,474-1,66) 
0,9271 
BRA-024 7,80 
(5,71-10,62) 
0,9311 BRA-228 0,14 
(0,06-0,33) 
0,9179 
BRA-028 0,02 
(0,0037-0,13) 
0,6190 BRA-230 0,33 
(0,06-1,74) 
0,5989 
BRA-029 3,149 
(1,654-5,995) 
0,8568 BRA-231 2,94 
(1,69-5,14) 
0,8621 
BRA-040 0,9223 
(0,105-8,09) 
0,4881 BRA-232 26,53 
(9,38-75,06) 
0,5641 
BRA-031 32,50 
(21,73-44,28) 
0,8367 BRA-233 23,70 
(11,96-46,97) 
0,5520 
BRA-068 0,3149 
(0,235-0,423) 
0,9584 BRA-234 3,283 
(2,114-5,1) 
0,9570 
BRA-090 0,19 
(0,08-0,45) 
0,8809 BRA-235 1,20 
(0,35-4,18) 
0,8638 
BRA-092 0,2481 
(15,61-39,43) 
0,8081 BRA-244 10,77 
(5,002-23,17) 
0,8781 
BRA-094 33,76 
(1,99-63,36) 
0,9486 BRA-280 >50 N.D. 
Tabela 3 - Potência da atividade citotóxica dos extratos obtidos de actinomicetos recuperados 
dos sedimentos das praias de Pecém, Taíba, Mucuripe e Paracuru , e do sedimento dragado do 
Mucuripe. Estão apresentados os valores de concentração inibitória média (CI50) e intervalo de 
confiança de 95% (IC 95%) obtidos a partir de 2 experimentos independentes em duplicata, 
determinado por regressão não-linear no programa GraphPad Prism 6.0. 
(N.D.: Não determinado) 
 
33 
BRA-147 11,71 
(10,23-13,42) 
0,9873 BRA-286 33,12 
(22,54-48,68) 
0,8472 
BRA-148 0,066 
(0,025-0,176) 
0,8112 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4.3 Identificação molecular dos microrganismos selecionados 
 
 Quando selecionados, os microrganismos isolados foram identificados a nível de 
gênero, através de uma abordagem molecular envolvendo amplificação parcial de seus 16S 
rDNA com primers universais, sequenciamento da região amplificada e posterior comparação 
das sequências na base de dados BLAST. Das 12 estirpes que foram identificadas 
aleatoriamente, 9 pertencem ao gênero Streptomyces e 3 ao gênero Micromonospora, como 
mostrado na tabela abaixo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: elaborado pelo autor. 
Fonte: elaborado pelo autor. 
Figura 7 – Gráfico da proporção de extratos brutos 
ativos de acordo com a concentração inibitória 
média (CI50) menor que 1,00µg/mL. 
 
34 
Tabela 4 - Identificação taxonômica de acordo com amplificação e sequenciamento de 16S 
rDNA das amostras selecionadas e respectivos valores de concentração inibitória média (CI50). 
 
AMOSTRA IDENTIFICAÇÃO CI50 LOCAL DE COLETA 
BRA-011 Streptomyces sp. 0,50 Mucuripe 
BRA-012 Streptomyces sp. 22,13 Mucuripe 
BRA-016 Streptomyces sp. 22,13 Mucuripe 
BRA-018 Micromonospora 
sagamiensis 
0,98 Mucuripe 
BRA-021 Streptomyces sp. 0,30 Pecém 
BRA-022 Micromonospora sp. 30,51 Pecém 
BRA-024 Micromonospora 
echinospora. 
7,80 Pecém 
BRA-028 Streptomyces sp. 0,02 Mucuripe-Draga 
BRA-029 Streptomyces sp. 3,15 Mucuripe-Draga 
BRA-031 Streptomyces sp. 32,50 Mucuripe-Draga 
BRA-090 Streptomyces sp. 0,19 Paracuru 
BRA-148 Streptomyces sp. 0,21 Paracuru 
 
 
 
5. DISCUSSÃO 
 
 A busca por compostos com potencial farmacológico provenientes do ambiente 
marinho vem ganhando foco em pesquisas em todo o mundo, e a prospecção é a etapa inicial 
desse processo. A relevância de actinomicetos marinhos nesse aspecto é relativamente recente, 
contudo já tem mostrado resultados bastante promissores. Estudos com microrganismos 
marinhos do litoral cearense, visando a bioprospecção de substâncias citotóxicas, são ainda 
iniciais. Nessa perspectiva, o presente trabalho se desenvolveu a partir da triagem para a 
atividade antitumoral de extratos de actinomicetos isolados dos sedimentos provenientes das 
praias de Taíba, Pecém, Paracuru, Mucuripe e do sedimento dragado do Porto do Mucuripe. 
As 96 estirpes isoladas foram selecionadas por meio de suas características fenotípicas 
de actinomicetos que apresentavam, baseado no estudo de Shirling e Gottlieb (1966). A 
morfologia macroscópica de colônias desse grupo é bem descrita na literatura, que, em meio 
de cultivo sólido, apresenta-se em aspecto opaco, não-leitoso, superfícies e bordas irregulares, 
ou não, e principalmente a esporulação, podendo apresentar pigmentos (BALDACCI et al, 
1953). 
A aplicação de pressões seletivas adequadas durante o processamento de amostras para 
o isolamento de grupos de actinomicetos, sejam estas sedimentos, tecidos de organismos ou 
Fonte: elaborado pelo autor. 
 
35 
fluidos, tem como objetivo reduzir a ocorrência de microrganismos indesejáveis e assim 
viabilizar placas com culturas menos contaminadas. Da mesma forma, a adição de 
antifúngicos aos meios de isolamento aumenta a seleção de membros da ordem 
Actinomycetales, por diminuir as possíveis interações interespecíficas, bem como a 
competição por recursos, além de garantir tempo e espaço necessários para o seu crescimento 
(GOODFELLOW e WILLIAM, 1983; GONTANG et al, 2007). Esse tipo de abordagem, 
entretanto, é limitado aos microrganismos que podem ser cultivados. 
A aplicação de técnicas de pré-tratamento, como dessecação e exposição ao calor seco, 
favorecem significativamente o crescimento de bactérias do grupo actinomicetos, que são em 
sua maioria formadores de esporos bastante resistentes (SUBRAMANI e ALBERSBERG, 
2013). A utilização do tratamento térmico dificulta o crescimento de bactérias Gram-
negativas, podendo ser justificado pela estrutura da parede celular destas, que possui uma 
delgada camada de peptideoglicano. Ao contrário de Gram-positivas, como actinomicetos, 
além da presença de esporos, possuem uma camada espessa, composta quase que 
completamente por peptidioglicano, responsável pela manutenção da célula e sua rigidez, as 
Gram-negativas são menos resistentes e mais suceptíveis ao calor (MADIGANet al, 2010). 
A elevada proporção de 2:1, em relação ao método do aquecimento, pode ser 
interpretada devido ao favorecimento do crescimento de actinomicetos, Gram-positivos, 
produtores de esporos, serem mais resistentes ao calor que as espécies gram-negativas, 
reduzindo a competição entre estas (EMBLEY, 1994). Também, a alta razão de guanina e 
citosina compondo o DNA desse grupo de bactérias lhes confere maior termoestabilidade do 
material genético. Por isso, este método é bastante adotado para otimizar o isolamento de 
estirpes desse grupo (OZCAN et al, 2013). 
Estudos recentes dependentes do cultivo e metagenômicos sugerem que os 
actinomicetos são membros nativos do ambiente marinho. O nutriente marinho específico 
para os microrganismos marinhos obrigatórios, incluindo os actinomicetos, como os membros 
de Salinispora, é o sódio (MALDONADO et al, 2005). Portanto, a composição dos três meios 
de culturas utilizados na etapa inicial do trabalho foi preparada com água do mar filtrada. 
O isolamento pelo meio SWA era esperado, uma vez que possui concentrações 
relativamente baixas de nutrientes que, em geral, favorecem o isolamento de actinomicetos, 
também por reduzirem naturalmente o crescimento de outros tipos de bactérias menos 
resistentes ao estresse nutricional e que fugiam ao interesse deste trabalho. Em geral, para o 
isolamento de actinomicetos marinhos obrigatórios de diferentes fontes marinhas, os meios de 
nutrientes pobres funcionam melhor do que os meios ricos em nutrientes, além de 
 
36 
desfavorecerem o crescimento de outros grupos de microrganismos que são dependentes de 
meios com nutrientes mais abundantes (OLSON et al, 2000; JENSEN et al, 2005 e 
GONTANG et al, 2007). 
Dentre os 6 tipos de combinação possíveis de meio de cultura com método de pré-
tratamento, a combinação do método M2 de aquecimento, com o meio de cultivo SWA foi 
responsável pelo maior número de estirpes recuperadas, sendo 27 das 96, aproximadamente 
28%. O estudo de Jesen e colaboradores (2005) mostra que, quando aplicados métodos em 
combinação, por exemplo “secagem/carimbo” e “diluição/aquecimento” (um seguido do outro 
para a mesma placa), a proporção de actinomicetos isolado quase duplica (JENSEN et al, 
2005). 
Foram avaliados 5 pontos que ilustram o perfil da costa cearense em relação aos 
impactos ambientais, de natureza e intensidades diferentes, a que são submetidos. A praia do 
Mucuripe, dentre as praias analisadas nesse trabalho, é a que mais sofre ação antrópica direta 
por conta da intensa rede hoteleira e a presença do Porto no local, com qualidade da água bem 
poluída. Nesta localidade, foram recuperados 17 estirpes de actinomicetos. As praias de 
Pecém, Taíba e Paracuru, menos alteradas que as da capital, foram isoladas 11, 10 e 26 
estipes, respectivamente. 
O sedimento dragado do Porto do Mucuripe, de onde vieram 32 das bactérias 
recuperadas, a maioria destes, correspondendo a quase 34% do total, é o que apresenta 
características mais peculiares. As áreas portuárias sofrem forte influência antropogênica, com 
a geração de resíduos e poluentes. A alteração de fatores físicos e químicos, como 
temperatura, pH, salinidade, substratos orgânicos e os elementos tóxicos interferem na 
comunidade microbiana. Um dos fatores que pode ter influenciado a maior disponibilidade de 
actinomicetos nesse ponto é a leve acidificação nas águas de lastro. A água do mar é 
ligeiramente alcalina, com pH entre 7,4 e 8,5. O valor de pH ótimo para o crescimento do 
grupo de bactérias desejado varia entre 6,0 e 8,0 (ARAÚJO, 2007). Além de alterar a 
diversidade de outros grupos, um leve decaimento do pH não influencia negativamente o 
crescimento de actinomicetos. Mais estudos, entretanto, são necessários para melhores 
conclusões. 
Também, estudos com a microbiota do solo mostram que a aplicação de pesticidas, 
produtos químicos e poluentes no solo tem ocasionado mudanças na diversidade de 
microrganismos, podendo ocasionar benefícios ou prejuízos, dependendo da composição da 
molécula e da sua persistência (ARAÚJO, 2007; MONTEIRO et al, 2006). Por exemplo, em 
um trabalho avaliando o efeito do glifosato sobre a microbiota do solo, Araújo et al (2003) 
 
37 
observaram que, com a aplicação do produto, houve aumento do número de fungos e 
actinomicetos, enquanto outros grupos de bactérias não foram afetados. É provável que tal 
resultado possa ser extrapolado para áreas portuárias, onde há uma elevada concentração de 
poluentes. Entranto, há a carência de mais estudos sobre essa relação com a microbiota 
marinha. 
O sedimento da praia do Paracuru também rendeu um considerável número de estirpes 
isoladas. Entretanto, dentre todas as praias, nesta os esforços empregados na recuperação 
foram mais acentuados. Os estudos nessa praia foram continuados por Guimarães (2013) para 
os resultados serem avaliados em sua dissertação. Também, por ter sido trabalhada 
posteriormente às demais praias, as técnicas de processamento e isolamento já eram mais bem 
dominadas no laboratório. 
O câncer colorretal é um tumor maligno gastrointestinal bem frequente no Brasil, e o 
terceiro mais comumente diagnosticado no mundo em ambos os sexos (PARKIN et al, 2015). 
A linhagem de células HCT-116, proveniente desse tipo de carcinoma, é altamente 
proliferativa, ocupando rapidamente a superfície de crescimento. Apresenta morfologia do 
tipo epitelial e suas populações são descritas por Brattain (1981) como “células poligonais de 
forma compacta”. São amplamente utilizadas em estudos para a avaliação de citotoxicidade 
devido à elevada sensibilidade aos efeitos quimioterápicos (RAJPUT et al, 2008). 
Dos 68 extratos preparados com acetato de etila a partir dos caldos de cultura das 
estirpes isoladas, 31 foram considerados ativos por inibirem o crescimento das células HCT-
116 em mais de 75%. Quando estes foram submetidos a uma análise quantitativa, para a 
obtenção das respectivas concentrações inibitórias médias frente à mesma linhagem de 
células, no ensaio de MTT, apresentaram valores de CI50 que variaram de 0,02 a 42,13µg/mL. 
Dentre os extratos ativos, 40% se destacam pela alta potência que pode ser 
reconhecida pelas CI50 menores que 1,00µg/mL em escalas de nanogramas/mL. O extrato da 
estirpe BRA-028, proveniente do sedimento dragado do Mucuripe, foi o mais citotóxico, com 
valor de 0,02µg/mL, seguidos pelos extratos das BRA-011 e BRA-148, com CI50 de 0,04 e 
0,066µg/mL, respectivamente. 
Extratos brutos aqui testados são preparações onde há um pool de moléculas diversas 
com concentrações variadas, proveniente do metabolismo celular de bactérias, retiradas a 
partir de um solvente. Como os resultados mostrados foram bastante promissores, outros 
pesquisadores do grupo trabalharam paralelamente na identificação e isolamento de 
compostos ativos presentes no extrato bruto de bactérias isoladas neste estudo. Guimarães 
(2013), em sua dissertação, desrreplicou o extrato da BRA-090, recuperada da praia do 
 
38 
Paracuru. Foram identificadas moléculas do grupo de cromomicinas. Esses compostos são 
bastante conhecidos por sua ação antibiótica antitumoral, sendo algumas classes utilizadas 
como quimioterápicos contra diversas linhagens de células tumorais. Nesse estudo, foi 
mostrado a indução de alterações no ciclo celular, possivelmente, autofagia e morte celular 
em células de melanoma metastático. As células tumorais cujas vias de apoptose foram 
suprimidas, por exemplo, se tornam mais resistentes a morte celular. Portanto, o processo de 
autofagia, quando intensificado, acaba sendo uma estratégia interessante para destruir células 
mais resistentes a apoptose (GUIMARAES, 2013). A produção de cromonicinas tem sido 
relatada para vários actinomicetos terrestres e marinhos do gênero Streptomyces 
(MENENDEZ et al, 2006; XIONG, 2012). 
Em ambas BRA-021 e BRA-028, recuperadas da praia do Pecém e do sedimento 
dragadodo porto do Mucuripe, respectivamente, foi encontrado uma substância citotóxica 
bastante conhecida, piericidina, cujo mecanismo de ação está relacionado com a interferência 
no transporte de elétrons através da membrana interna de mitocôndrias, especificamente 
bloqueando a atividade do complexo I. Muitos casos de isolamentos de diversas formas de 
piericidinas, produzidas também por espécies de Streptomyces, foram relatados 
(TAKAHASHI E TAMURA, 1966; FENICAL E JESEN, 1993). Também, estaurosporinas 
foram encontradas no extrato da BRA-148, na Praia de Paracuru. Estes compostos são 
alcaloides que possuem alta afinidade com o receptor ATP-ligante, sendo um potente inibidor 
da Proteína Quinase-C. São amplamente empregadas como ferramenta de pesquisa e foram 
isoladas pela primeira vez a partir do caldo de fermentação de uma Streptomyces (JIMENEZ, 
2009). Os dados do nosso grupo ainda não foram publicados. 
Como observado na identificação taxonômica das respectivas estirpes BRA-021, 
BRA-028, BRA-090 e BRA-148, em cujos extratos já foram isolados compostos ativos 
purificados, todas são pertencentes ao gênero Streptomyces. 
As actinobactérias são componentes ativos de comunidades microbianas marinhas e 
formam uma população estável e persistente em vários ecossistemas marinhos 
(MANIVASAGAN, 2013). Têm um papel significativo no ambiente marinho, além da 
produção de antibióticos. São relatados por contribuir para a degradação e reciclagem de 
compostos orgânicos (GOODFELLOW e HAYNES, 1984). Além disso, desempenham 
função na mineralização de matéria orgânica, imobilização de nutrientes minerais, fixação de 
nitrogênio, melhoria dos parâmetros físicos e proteção ambiental (DAS et al, 2006). 
O gênero Streptomyces é representado na natureza pelo maior número de espécies 
entre todos os gêneros de actinomicetos e com mais de 500 espécies descritas (MADIGAN, 
 
39 
2010). Estudos independentes da cultura têm demonstrado que membros dos generos Dietzia, 
Rhodococcus, Micromonospora (HELMKE e WEYLAND, 1984; HEALD et al, 2001), 
Streptomyces (MORAN et al, 1995) certamente existem nos oceanos (WARD e BORA, 2006). 
Através do desenvolvimento de conjuntos de iniciadores seletivos para amplificação por PCR 
de 16S rRNA das famílias Actinomycetales, Micromonosporaceae, Streptomycetaceae, 
Streptosporangiaceae e Thermomonosporaceae e do gênero Dactylosporangium, a aplicação 
desses primers em amostras ambientais mostrou a ocorrência frequente desses grupos de 
actinobactérias e também revelou sequências que podem ser atribuídas a novos grupos de 
actinobactérias (MONCIARDINI et al, 2002). 
Actinobactérias do gênero Micromonospora, também encontradas nesse estudo, 
ocorrem como saprófagas abundantes no solo e na água. Espécies de Micromonospora são 
mais conhecidas por sintetizar antibióticos, especialmente aminoglicosídeos. Seu impacto na 
medicina é considerável, e de fato Streptomyces e Micromonospora produzem muitos dos 
antibióticos conhecidos. Também desse gênero são produzidos antibióticos antitumorais 
(lomaiviticinas A e B, tetrocarcina A, complexo LL-E33288, etc) e antibióticos de 
antraciclina. Outras moléculas biologicamente ativas sintetizadas por espécies de 
Micromonospora são a vitamina B12 e compostos antifúngicos. O antimicrobiano alcalóide, 
diazepinomicina, foi identificado de uma espécie marinha (HIRSCH, 2009). 
Ambas as famílias Streptomycetaceae e Micromonosporaceae já haviam sido 
encontradas na costa cearense através de estudos da microbiota associadas a invertebrados 
marinhos, mais especificamente na espécie da ascídia Eudistoma vanammei, coletada na Praia 
da Taíba. Nos extratos provenientes dessas bactérias foram isolados compostos bem descritos 
por suas atividades anticâncer, estaurosporinas e dictiopirolona, e antraciclinas, 
respectivamente (JIMENEZ et al, 2012; ABREU et al, 2013; SOUZA et al, 2012). 
 
6 CONCLUSÃO 
 
 Os actinomicetos da costa do Ceará são uma profícua fonte de substâncias com 
potencial anticâncer. Dentre os extratos ativos, 40% se destacam pela alta potência que pode 
ser reconhecida pelas CI50 menores que 1,00µg/mL. Em 4 estirpes recuperadas, foram 
identificados compostos ativos com ação antitumoral. Estes resultados destacam o potencial 
farmacológico de microrganismos marinhos que o litoral do Ceará reserva e imenso potencial 
entre os microrganismos para a exploração sustentável de compostos naturais com relevância 
biomédica e biotecnológica. 
 
40 
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