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Disciplina de Mét. Purif. e Anál. Proteínas 
 
Curso de Ciências Biológicas 
 
 
Métodos de Purificação de 
Proteínas Nativas 
 
Prof. Marcos Túlio de Oliveira 
mtoliveira@fcav.unesp.br 
 
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal 
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” 
mailto:mtoliveira@fcav.unesp.br
Disciplina de Mét. Purif. e Anál. Proteínas 
 
Curso de Ciências Biológicas 
 
 
Agradecimentos ao Prof. João Pizauro 
(Depto. Tecnologia) pelos slides 
 
 
Prof. Marcos Túlio de Oliveira 
mtoliveira@fcav.unesp.br 
 
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal 
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” 
mailto:mtoliveira@fcav.unesp.br
As células são constituídas de proteínas 
codificadas por diferentes gene. 
 
Executam uma função específica 
 
Para caracterizar bioquimicamente uma 
proteína, o ideal é extrair e purificá-la 
mantendo sua estrutura e função originais 
Introdução 
A purificação permite a caracterização 
estrutural e funcional da proteína, já que 
encontram-se “livres” de contaminantes 
Rompimento das células – obtenção do 
extrato proteico bruto 
SEMPRE, SEMPRE e SEMPRE trabalhar com 
proteínas em baixa temperaturas (0 a 4ºC)!!! 
 
Usar tampão correto (pH, cofatores, 
estabilizadores, etc.) 
Bactérias: Bactérias normais são rompidas ou 
choque osmótico, já as com parede celular 
espessa necessitam de outros tratamentos 
 
 
Animal: Tecidos de animais como eritrócitos, 
fígado e cérebro são fáceis de serem rompidos; 
já tecidos ricos em colágeno como vasos 
sanguíneos e músculo liso são mais difíceis 
 
 
Vegetal: Células são mais difíceis de serem 
rompidas porque contém celulose e fenóis 
Método mecânico mais simples e mais barato para se 
obter extrato de tecido ou célula 
 
Esse método é utilizado na homogeneização de células 
bacterianas e vegetais em pequenas quantidades 
 
 
 
 
Almofariz (cadinho) 
Material Duro 
Agitação com pequenas partículas (beads) 
 
Utiliza-se agitador para proporcionar agitação violenta de uma suspensão de 
células com partículas de material resistente capaz de se desintegrar pelo 
choque 
 
Usado para obtenção de extratos livres de células de levedura 
 
 Resfriamento prévio do material e 
 imediatamente após ruptura são 
 fundamentais nesse processo! 
 
 
Material Duro 
 Rompe células microbianas forçando a passagem das mesmas por um 
 orifício muito pequeno a uma alta pressão 
 
 A diferença de pressão em ambos lados do orifício e o atrito fazem as células 
 romperem 
 
 Aplicada em várias preparações 
French Press 
Material Duro 
Ultrassom 
 
São empregados no rompimento 
de parede celular. As vibrações 
sônicas e ultra-sônicas quebram 
as células por cavitação. 
 
É produzida pela alternância de 
ondas de baixa pressão em que 
as bolhas crescem até atingirem 
alta pressão na qual são 
comprimidas e implodem. 
Material Duro 
 Heteropolissacarideo 
constituído por dois tipos 
de monossacarídeos : 
N-Acetil- ß-D-
glucosamina e ácido N-
acetilmurâmico 
A parede celular das 
bactérias consiste de 
uma estrutura em rede 
que envolve 
completamente a célula. 
Lisozima 
Material Duro 
Material Mole 
 
Choque osmótico 
Transferência rápida de uma solução 
isotônica para uma solução hipotônica. 
Devido a osmose as células ficam túrgidas 
provocando a lise da membrana. 
 
Ruptura por tratamento químico 
Usa-se solvente orgânico ou detergente para 
romper diferentes tipos de tecidos, células e 
organelas. Ex: álcalis, solventes, detergentes 
e ácidos. 
Material Mole 
Material Mole 
Centrifugação diferencial é usada 
para separar organelas, pedaços de 
membranas e citosol (fração solúvel 
do citoplasma) do extrato celular. 
 
Centrifugação diferencial 
Etapas de separação 
Etapas de separação 
Placa óssea 
Fração solúvel 
NH2 
Enzimas 
associadas 
à membrana 
+ 
Matriz óssea 
Centrifugação 
diferencial 
Placa óssea 
Fração solúvel 
NH2 
Enzimas 
associadas 
à membrana 
+ 
Matriz óssea 
Centrifugação 
diferencial 
NH2 
Enzimas 
associadas 
à membrana 
Detergente 
NH2 
Enzimas 
associadas 
à membrana 
NH2 
Fosfatase alcalina 
Pirofosfatase e ATPase 
PIPLC 
Extração de proteínas de membranas 
Estratégia Geral para Obtenção da 
Proteína Purificada 
• Extração 
Isolamento 
1. Material de Partida ------ 
Extrato Bruto 
2. Desintegração celular 
 
Fracionamento 
•Solubilidade 
•Tamanho 
•Carga 
•Afinidade Ligação 
Separação 
Diálise 
Ultra filtração 
Coluna 
Cromatografica 
Precipitação de proteínas 
• Utilização de diferenças nas 
solubilidades das proteínas 
– Concentração salina 
• A adição de um sal na quantidade 
correta pode precipitar algumas 
proteínas e manter outras em solução 
– (NH4)2SO4 
• O sal tem muita solubilidade e estabiliza 
a estrutura nativa das proteínas 
 
• Salting in 
– Muitas proteínas tornam-se mais solúveis com 
aumento da concentração de sal 
• Salting out 
– Quando as concentrações de sal atingem 
valores muito elevados, a solubilidade diminui 
Ultra Filtração 
• Princípio: Uma membrana semipermeável permite 
a separação das moléculas menores (solventes, 
íons, etc) das moléculas grandes ( peptídeos, 
protéicas), pois apenas as moléculas pequenas 
podem penetrar na membrana quando a pressão 
osmótica é excedida 
• O processo de ultra filtração é empregado para 
concentração, dessalinização e fracionamento 
Diálise 
• Procedimento que separa as proteínas dos 
solventes beneficiando-se do tamanho maior 
das proteínas 
Cromatografia em coluna 
Gel-Filtração 
• A separação é feita de acordo com o tamanho molecular 
Cromatografia de 
troca iônica 
Cromatografia de 
Afinidade 
 Pequenas proteínas 
são ligadas aos 
suportes e a mistura 
complexa de 
proteínas é aplicada 
 
 Proteínas ligadas 
podem ser eluídas 
com moléculas 
pequenas ou 
reagentes 
Exemplos de Colunas Cromatográficas 
DNA-celulose 
 
Heparina 
 
Fosfocelulose 
 
Blue-sepharose 
 
 
HPLC - Cromatografia Líquida de Alta Pressão 
Como analisar o resultado da 
purificação? 
(como visualizar proteínas e determinar a 
pureza da amostra? 
Absorbância 
280nm 
 
 
SDS-PAGE 
 
 
A280 
A280 
SDS-PAGE 
(Eletroforese em Gel de Poliacrilamida-
SDS) 
Ação do SDS 
 
SDS-PAGE 
S 
S 
S 
S 
-S-S- 
-S-S- 
+ SDS + 2-mercaptoetanol 
4 
SH 
SH 
Ação do -mercaptoetanol 
SDS-PAGE 
1 2 3 
Adição de SDS 
β - Mercaptoetanol 
Fervura 
Amostra 
Amostra 
Amostra 
SDS-PAGE 
o Eletroforese: Separação e visualização das proteínas no Gel 
•Prata 
•Azul de Comassie 
SDS-PAGE 
Blue-Sepharose 
C+ Ind S FT W1 
0.25 M NaSCN Gradient 0.4-1.2 M NaSCN 1.5 M NaSCN 
Fosfocelulose 
S FT W1 W2 
Gradient 60-100 mM KPO4 150 mM KPO4 
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Disciplina de Métodos Purif. e Anál. de Proteínas 
 
Curso de Ciências Biológicas 
 
 
 
 
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Recombinantes