Avaliação da contaminação dos Alimentos

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS - UFAM
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA - ICET
CURSO DE GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA SANITÁRIA
JANAINA DA FONSECA VIANA
 
AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE VEGETAIS MINIMAMENTE PROCESSADOS EM DIFERENTES SUPERMERCADOS DE UM MUNICÍPIO DO AMAZONAS.
ITACOATIARA-AM
2022
2
JANAINA DA FONSECA VIANA
AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE VEGETAIS MINIMAMENTE PROCESSADOS EM DIFERENTES SUPERMERCADOS DE UM MUNICÍPIO DO AMAZONAS.
Projeto de Trabalho de Conclusão de Curso de graduação apresentado ao Instituto de Ciências Exatas e Tecnologia da Universidade Federal do Amazonas como requisito parcial para a obtenção do título de Bacharel em Engenharia Sanitária.
Orientador: Prof. Flávio Nogueira da Costa
ITACOATIARA-AM
2022
JANAINA DA FONSECA VIANA
AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE VEGETAIS MINIMAMENTE PROCESSADOS EM DIFERENTES SUPERMERCADOS DE UM MUNICÍPIO DO AMAZONAS.
Projeto de Trabalho de Conclusão de Curso de graduação apresentado ao Instituto de Ciências Exatas e Tecnologia da Universidade Federal do Amazonas como requisito parcial para a obtenção do título de Bacharel em Engenharia Sanitária.
Aprovado ( ) Reprovado ( ) em: 01/ 09 / 2022.
BANCA EXAMINADORA
_____________________________
Prof. Flávio Nogueira da Costa
Universidade Federal do Amazonas
_____________________________
Prof. Aluízio Gonçalves Brasil Júnior 
Universidade Federal do Amazonas
_____________________________
Prof. Jean Michel dos Santos Menezes
Universidade Federal do Amazonas
RESUMO
Na expectativa de otimizar o tempo e qualidade de vida, houve um aumento na busca por alimentos que possam conferir praticidade e contribuir com uma boa nutrição. Para isso a melhor escolha para uma alimentação saudável é que esta seja a base de alimentos in natura ou minimamente processados. A escolha pelos alimentos minimamente processados vem crescendo em virtude da sua praticidade, contudo, é preciso uma atenção maior para as etapas de manipulação e embalagem, uma vez que pesquisas vem demostrando a ocorrência de microrganismo que causam contaminação durante esses processos e interferem diretamente na qualidade destes produtos. Para que esse alimento chegue ao consumidor final livre de ação microbiana, faz-se necessário passar por algumas etapas de processamento, desta feita, quando algumas dessas etapas são negligenciadas, o risco da contaminação iminente. O objetivo desse trabalho é avaliar a presença de microrganismos indicadores higiênico-sanitários em amostras de alimentos adquiridos em três supermercados do município de Itacoatiara - AM. Serão analisados um total de nove vegetais minimamente processados, quanto à presença de coliformes totais e termotolerantes, Salmonela sp., Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Com a execução do presente trabalho, espera-se determinar a presença ou ausência de contaminantes microbiológicos nas amostras dos vegetais minimamente processados.
Palavra-chave: alimentos; minimamente processados; microrganismos. 
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .........................................................................................................6
2 OBJETIVOS .............................................................................................................8
2.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................8
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................8
3. JUSTIFICATIVA ......................................................................................................9
4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................10
4.1 VEGETAIS MINIMAMENTE PROCESSADOS ....................................................10
4.2. CONTAMINAÇÃO DOS ALIMENTOS.................................................................11
4.3 MICRORGANISMOS INDICADORES .................................................................12
4.3.1COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES, ESCHERICHIA COLI .........13
4.3.1.1COLIFORMES TOTAIS...................................................................................13 4.3.1.2COLIFORMES TERMOTOLERANTES...........................................................13 4.3.1.3 ESCHERICHIA COLI .....................................................................................14 4.3.2STAPHYLOCOCCUS AUREUS ........................................................................15 4.3.3SALMONELLA SP. ............................................................................................16 5 MATERIAIS E MÉTODOS .....................................................................................17 5.1 CARACTERIZAÇÃO DA ÁREA DE ESTUDO......................................................17 5.2 PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS ............................................................17 5.2.1AQUISIÇÃO E TRANSPORTE DAS AMOSTRAS.............................................17 5.2.2 ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS .....................................................................18 5.2.2.1 IDENTIFICAÇÃO DE COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES .....18 5.2.2.2 IDENTIFICAÇÃO DE ESCHERICHIA COLI ..................................................18 5.2.2.3 IDENTIFICAÇÃO DA STAPHYLOCOCCUS AUREUS .................................19 5.2.2.4 IDENTIFICAÇÃO DE SALMONELLA SP.......................................................20 6 RESULTADOS ESPERADOS ...............................................................................21 7 CRONOGRAMA .....................................................................................................22 8 ORÇAMENTO ........................................................................................................23 REFERÊNCIAS..........................................................................................................25	 
1 Introdução
Na sociedade moderna, a gestão de tempo e a necessidade de se ter qualidade de vida, nota-se a busca de hábitos saudáveis na alimentação, como a introdução de frutas, legumes e vegetais no cardápio da população. Isso explica o crescente consumo por Vegetais Minimamente Processados(GERMANO; GERMANO, 2019.No ano de 2014, foi publicado o Guia Alimentar para a População Brasileira, o qual define os alimentos minimamente processados como sendo provenientes de alimentos in natura, contudo, sofrem processos mínimos, sem agregação de substâncias ao alimento. Os AMMP, tem como objetivo, trazer um alimento semelhante ao fresco, com mais tempo de prateleira e preservando a qualidade nutritiva e presencial (CENCI, 2011).
Os AMMP precisam passar por várias etapas de processamento, para um controle efetivo de agentes contaminantes e assegurar sua qualidade. Durante a fase de manipulação, a qualidade da água é crucial para que as etapas de limpeza e desinfecção sejam efetivas. A limpeza correta dos utensílios ,do local de manipulação, e a higiene pessoal dos manipuladores são aspectos fundamentais no controle de qualidade de microrganismos em alimentos (OLIVEIRA, SANTOS, 2015), pois é na falta dessas boas práticas , que acontece a contaminação do alimento por patógenos, que podem causar as doenças transmitidas por alimentos (DTA).
No Brasil, a comercialização dos AMMP, se deu a partir da década de 90 quando a demanda por estes produtos aumentara, e as empresas se adequaram a esse novo tipo de comercio, fazendo com que o setor agroindustrial investisse nessa nova modalidade (NASCIMENTO, 2019).Contudo, as condições higiênico-sanitárias do manipulador, dos equipamentos, utensílios e do ambiente são capazes de influenciar a qualidade microbiológica do produto final atrelado a isso, alguns fatores comprometem a vida útil do AMMP, dentre esses fatores a presença de microrganismos deteriorantestem grande impacto econômico, fazendo com que o alimento desenvolva uma alteração sensorial e tenha sua vida de prateleira reduzida. (VANETTI, 2004).
Para garantir a qualidade dos vegetais minimamente processados, é necessário que as empresas que os produzem, tenham o Manual de Boas Práticas em concordância com a RCD da Agencia Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) n.331/2019 e IN 60/2019, e unido a esses fatores, as embalagens destes produtos devem estar de acordo coma legislação vigente (GERMANO; GERMANO, 2019). 
2. OBJETIVOS
2.1	OBJETIVO GERAL
Avaliar a qualidade dos vegetais minimamente processados por meio de metodologias convencionais.
2.2	OBJETIVOS ESPECÍFICOS
· Analisar se há contaminação nos vegetais MMP
· Identificar e isolar os microrganismos presentes nos vegetais obtidos.
· Descrever o método de detecção dos principais microrganismos presentes nos vegetais.
3. JUSTIFICATIVA
Os supermercados são os principais locais de distribuição de alimentos que passam por etapas mínimas de processamento. Observa-se que um grande número de alimentos manipulados nestes estabelecimentos não seguem adequadamente todas estas etapas de processamento, devido os altos índices de contaminação, como pode ser visto no Brasil, de acordo com dados da SVS, DE 2007 a 2016, foram registrados 6.632 surtos, com uma faixa de 38,9% dos casos (GERMANO; GERMANO,2019).
Em virtude dos grandes impactos causados pela contaminação destes vegetais MMPs para a economia, a qualidade de vida e a saúde da população, principalmente para o município de Itacoatiara, localizado no interior do amazonas, que se faz necessária a investigação da qualidade destes alimentos e a indicação de ações de Controle e vigilância de produtos alimentícios em supermercados, além de propor medidas profiláticas de contaminação e infecção. 
A escolha de alimentos que tragam praticidade ao dia a dia da população está agregada a falta de tempo em decorrência de rotinas intensas de trabalho, estudos, entre outras atividades, e com isso a compra dos alimentos minimamente processados (AMMP) vem se tornando cada vez mais comum. Com a realização deste estudo procura-se obter dados qualitativos e quantitativos para apresentar como pesquisa científica para fins acadêmicos, despertando novos projetos relacionados a área de vigilância sanitária dos alimentos. Além de contribuir com informações que possam auxiliar os órgãos da vigilância sanitária quanto a fiscalização dos processos de manipulação e armazenamento. 
O presente trabalho visa analisar se há contaminação microbiológica nos vegetais minimamente processados comercializados em Itacoatiara - AM, tendo em vista, que os principais agentes etiológicos de toxinfecções alimentares são a Salmonella spp.,Stapylococcus aureus, Clostridium perfringens, envolvendo cerca de 50% de surtos diagnosticados, e em ordem de importância, seguem o Bacillus cereus e a Escherichia coli. Buscando avaliar a qualidade do produto que chega até o consumidor final , que esse estudo será realizado.
4. 	REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
4.1 VEGETAIS MINIMAMENTE PROCESSADOS
Na busca constante por um estilo de vida mais saudável, a população tem recorrido a mudanças nos hábitos alimentares, evitando cada vez mais os alimentos processados e ultraprocessados, optando em contrapartida por alimentos com alto índice de valor nutricional e de fácil preparo (MARTINS et al., 2020). Contudo, em virtude da rotina da população, a busca de alternativas que facilitem o dia-a-dia, faz com que estratégias comercias sejam adquiridas. 
Diante deste cenário, surgem os alimentos minimamente processados e com eles , toda a praticidade e facilidade que o consumidor procura, pois são alimentos que passam por processos, como remoção de partes não comestíveis e/ou indesejadas, acondicionamento em embalagens a vácuo entre outros processos que não envolvam adição de substancias como sal e gorduras, e minimizem o tempo de preparo e consumo (MONTEIRO et al., 2016). 
As frutas e hortaliças são consumidas diariamente e se fazem presentes na dieta do brasileiro, o que beneficia o desenvolvimento do agronegócio. A venda de frutas e hortaliças é um trabalho que vem crescendo nos últimos anos, em virtude disso, o ramo dos alimentos minimamente processados vem seguindo o ritmo de desenvolvimento (DO NASCIMENTO et al., 2014). 
O processamento mínimo é estabelecido como toda alteração física, provocada em frutos ou hortaliças, mas que mantém a qualidade nutricional, microbiológica e sensorial do produto fresco (CENCI, 2011). Tem por finalidade possibilitar ao consumidor um produto prático e vantajoso, que tenham características inalteradas de frescor, e que mantenham a qualidade sensorial de forma a garantir a segurança dos mesmo no que se refere a saúde pública (GIANNONI et al.,2021). 
Em contrapartida, o processamento mínimo pode causar a quebra de enzimas e substratos provocando o aumento das atividades enzimáticas encarregadas pela oxidação e no desenvolvimento de sabores e odores ruins da taxa respiratória, da evolução de etileno e de compostos fenólicos solúveis e totais (SANCHES et al., 2017).
Os AMMP, possuem vida útil reduzida, devidos aos processos de corte e manipulação, de acordo com Chakraborty, Rao e Mishra (2015), o acelerado escurecimento da polpa, é ocasionado pela produção de polímeros de coloração marrom e melaninas, provenientes de reações catalisadas por enzimas, como a peroxidase e a polifenoloxidase. 
Os AMMP são subordinados a vários processos antes da comercialização. Entre os quais, estão a seleção, que somente os alimentos com sua integridade mantida devem ser selecionados; higienização, pré-lavagem onde são removidas as sujidades presentes no alimento; sanitização, onde o alimento é mantido submerso em água contendo hipoclorito de sódio na concentração de 200ppm pelo tempo de quinze minutos; enxágue, onde o alimento é colocado sob água corrente potável para retirada dos resíduos de hipoclorito de sódio e, corte, etapa em que o alimento é convertido em partes menores, quando necessário. Concluídos todos estes procedimentos, o alimento deve ser embalado em recipientes seguros, e mantidos em refrigeração. Por último, acontece a distribuição do alimento até que chegue ao consumidor final (GUERRA et al., 2007; CARVALHO et al.,2016).
Se fazem necessários os procedimentos de pré-preparo e preparo (seleção, higienização, sanitização e enxágue, corte e embalagem), afim de garantir a segurança do alimento, levando em consideração que as frutas, hortaliças e vegetais podem ser transportes de microrganismos em razão a exposição destes alimentos após a colheita, no processo de distribuição por fornecedores e armazenamento. As saladas MMP tem tendências a serem consumidas cruas e existindo a presença de microrganismos patogênicos, são capazes de acarretar ao consumidor toxinfecções e intoxicações alimentares (MARCHI et al., 2011; LEAO, 2018).
4.2.CONTAMINAÇÃO DOS ALIMENTOS 
A preparação de um alimento livre de perigos pode ser comprometida em todas as etapas de produção. Desde as etapas de extração da matéria-prima, distribuição e armazenamento até as etapas finais de manipulação, preparo e consumo, em decorrência, principalmente, por riscos físicos, como pedras e pregos, riscos químicos, como venenos, ou riscos biológicos, caracterizados pelos microrganismos (FORSYTHE, 2013; CUNHA; AMICHI, 2014). 
Estando sujeitos a natureza, concentração, intensidade e fator de exposição, estes riscos são capazes de conduzir a ocorrência de Doenças Transmitidas pelos Alimentos (DTAs), ocasionadas a partir do consumo de alimentos e/ou água contaminados, que configuram ameaças à saúde do consumidor (SILVA JUNIOR, 1995; BALCHIUNAS, 2014; ABERC, 2015; BRINQUES, 2015).
Os índices de surtos alimentares que acontecem, frequentemente ultrapassam o número de notificações, tendo em vista que, as pessoas em sua grande maioria, não relacionam os sintomas ao consumo de alimentos contaminados, ou não procuram assistênciamédica. Ao mais, é corriqueiro o preenchimento incorreto de fichas de notificações de surtos alimentares por agentes sanitários (GOULART; LACERDA; DIAS, 2016).
A manipulação é uma das principais origens de contaminação dos alimentos, pois através dela permite a propagação de agentes biológicos que causam danos à saúde, devido, principalmente omissão ou falha no processo de higienização do manipulador, adicionados a condições e locais inapropriados. CUNHA; AMICHI, 2014). 
O efeito de lavar a mãos de modo correto é a técnica mais eficaz existente para reduzir a contaminação dos alimentos pelos microrganismos, com a eliminação desses agentes biológicos (BELELA-ANACLETO,2016). De acordo com a RDC N° 216/2004, os manipuladores de alimentos devem higienizar as mãos ao chegar ao trabalho, antes e após a manipulação, após usar os banheiros e sempre que houver necessidade.Para mais, necessitam ser executadas, de forma regular, análises microbiológicas, tanto dos manipuladores de alimentos quanto dos locais em que os mesmos são produzidos, com a finalidade de determinar padrões de controle higiênico-sanitários nos serviços de alimentação e nutrição (SCHUMANN et al., 2017).
	
4.3 MICRORGANISMOS INDICADORES
	A presença de microrganismo em alimentos nem sempre está associada a qualidade do produto, uma vez que uma pequena porcentagem dos microorganismos existem são causadores de doença. Algumas bactérias e fungos são importantes aliados no processo industrial de produção de alimentos e bebidas. Quando identificado a presença de microrganismos em alimentos, não podemos dizer que tal trará malefícios para o consumidor, ou que esse alimento seja de baixa qualidade. Excluindo os poucos produtos que são submetidos à esterilização comercial, os alimentos em sua grande maioria podem conter bolores, leveduras, bactérias e outros microrganismos. Esses alimentos tornam-se perigosos para consumo, quando seus princípios de sanitização e higiene não são cumpridos (SILVA,2002). Caso o alimento permaneça exposto a condições que permitiria a entrada e/ou crescimento de agentes infecciosos ou toxigênicos, pode ser considerado que o mesmo se torne um veiculo de transmissão de doenças (ICMSF,1984).
Segundo Franco (2005), microrganismos indicadores são grupos ou espécies que , quando presentes em um alimento, podem fornecer informações sobre a ocorrência de contaminação de origem fecal, sobre a provável variável presença de patógenos ou sobre a deterioração potencial do alimento, além de poderem indicar condições sanitárias inadequadas durante o processamento, produção ou armazenamento.
	A ICMSF (International Commison on Microbiological Specifications fot Foods), classifica os microrganismos indicadores como:
1. Microrganismos que não oferecem risco direto à saúde: contagem padrão de mésofilos, contagem de psicrotróficos e termófilos, contagem de bolores e leveduras.
2. Microrganismos que oferecem risco baixo ou indireto à saúde: coliformes totais, coliformes fecais, esterobactérias totais, Escherichia coli.
A prática de analisar nos alimentos microrganismos indicadores, tem-se tornado cada vez mais comun, tendo em vista o alto índice de contaminação. No Brasil, de acordo com dados da SVS, DE 2007 a 2016, foram registrados 6.632 surtos, e que 13,2% aconteceram na região Centro Oeste e Norte, e que os local de ocorrência com maior índice, foi nas próprias residências, com uma faixa de 38,9% dos casos. Quando isolados os agentes etiológicos, revelou-se uma incidência que de 7,5% das ocorrências foram por Salmonella ssp., Escherichia coli (7,2%), Staphylococcus aureus (5,8%), Bacillus cereus (2,6%), e Coliformes (1,8%)(GERMANO; GERMANO,2019).
4.3.1Coliformes totais, coliformes termotolerantes e Escherichia coli
	Várias técnicas têm sido utilizadas para identificar coliformes, a fermentação da lactose é um meio e o primeiro requerimento para um microrganismo ser considerado um coliforme. A Food and Drug Administrations, sugere o uso do método Contagens de microrganismos pelo Número Mais Provável (NMP), o qual permite avaliar estatisticamente a quantidade de microrganismos presentes em uma amostra e estimar a proporção viável metabolicamente ativa, pela inoculação de tubos com caldo Lauri Sulfato Triptose (LST), sendo esta técnica mais utilizada para contagem de bactérias do grupo coliforme. A análise dos resultados dá-se via uso de uma tabela de NPM com intervalo de confiança de 95% de probabilidade, para as variadas combinações de tubos positivos nas séries de três ou cinco tubos (BANWART,1998; SILVA et al.,1997). 
Coliformes totais, coliformes fecais e Escherichia coli, são definidos por três passos sucessivos na metodologia determinativa (ICMSF,1984).
4.3.1.1Coliformes totais
	Fazem parte deste grupo os gêneros bacterianos Escherichia, Enterobacter, Klebsiella e Citrobacter, abrangendo por volta de 20 espécies, dentre as quais tendo origem do trato intestinal de humano e outros animais de sangue quente, como também de vários gênero e espécies de bactérias não entéricas. Portanto, sua presença em meio aquoso e alimentos é menos representativa, como indicação de contaminação fecal, tendo em vista a enumeração de coliformes fecais ou E. coli (SILVA et al.,1997).
	A fundamental razão para que sejam agrupadas, se dar por suas muitas características comuns. Todas são Gram negativos, não formadores de esporos, em sua grande maioria se comportam como motéis, anaeróbios facultativos, resistentes a vários agentes surfactantes e fermentam lactose produzindo ácido e gás em 48h a 32° (leite) ou 35-37°C (RAY,1996).
4.3.1.2Coliformes termotolerantes
	A mesma definição pode ser empregada para coliformes termotolerantes, mas, restringindo-se aos membros capazes de fermentar lactose com produção de gás em 24-48h a 44,5-45,5°C ; (SILVA et al,.1997; SIQUEIRA,1995).
	Está análise é realizada, buscando-se a determinação de coliformes de origem gastrintestinal, contudo sabe-se que cepas de Enterobacter e Klebsiella incluídas neste grupo podem apresentar origem não fecal, podendo ser elas de origem da água, solo e vegetais (SILVA,2002).
4.3.1.3Escherichia coli
	A E. coli faz parte da família Enterobacteriaceae, gênero bacteriano com apenas uma espécie, e com cerca de mil tipos antigênicos, é encontrada normalmente nos intestinos dos animais e do homem, representa 80% da flora intestinal aeróbia , sendo excretada nas fezes , o que propicia a contaminação do solo e das águas (GERMANO; GERMANO,2019).
	Tem como característica ser uma enterobactéria Gram-negativa, catalase positiva e oxidase negativa não esporogênica. É um mesófilo singular apto para se desenvolver entre uma temperatura de 7 e 46°C, sendo 37° a temperatura excelente, apesar que existam cepas que possam se multiplicar em 4°C (GERMANO; GERMANO,2019).
Quando encontrada em alimentos crus, é considerada um fator de contaminação fecal, podendo ser direta ou indireta. A contaminação direta acontece durante o preparo de matérias-primas de origem animal e devido a falta de higiene pessoal dos manipuladores, já a contaminação indireta ocorre através de águas poluídas e de esgoto. Em alimentos que passam por tratamentos térmicos, a presença de E. coli é vista com grande preocupação (RAY,1996).
Legumes e hortaliças minimamente processadas são procurados em virtude da sua praticidade para o preparo e pela necessidade de se adotar uma alimentação mais saudável por parte da população, contudo a os coliformes termotolerantes e E. coli são patógenos comuns nesses alimentos, provocando alterações sensoriais , por causa das elevadas contagens microbianas, afetando a qualidade nutricional dos vegetais (GERMANO; GERMANO,2019).
	 
4.3.2 Staphylococcus aureus
	O S. aureus é uma bactéria esférica (coco) Gram-positivo, e podem ser vistas em pares, em cadeias pequenas ou em cachos, similares aos de uva. São mais resistentes do grupo das bactérias patogênicas não formadoras de esporo, sendo um organismo coagulase positivo, catalase positivo, oxidasse negativo, e anaeróbio facultativo. Atemperatura para sua é entre 7 e 48°C, sendo 37° a temperatura excelente para o seu desenvolvimento. A enterotoxina é produzida entre uma temperatura de 10 e 48°C, porém a faixa de 40 a 45°C é considerada excelente para sua produção. (GERMANO; GERMANO,2019).
Os humanos e animais são os principais reservatórios, e são encontradas na pele, membranas mucosas, trato respiratório e do intestino do ser humano, responsável por consideráveis proporções de infecções humanas, principalmente âmbito hospitalar. Contudo estão presentes no ar, na poeira, no esgoto, na água, no leite, e nos alimentos ou equipamentos de processamento de alimentos e nas superfícies expostas. (GERMAN; GERMANO, 2019; FORSYTHE ,2002).
Em termos de saúde pública, especialmente na área de vigilância sanitária dos alimentos, o S. aureus é considerado um dos principais fatores de surtos de toxinfecção, em virtude do importante papel desempenhado dos manipuladores durante as várias etapas do processamento dos alimentos incluído aos riscos de contaminação das matérias-primas e com cuja temperatura de conservação seja inadequada, como é comum em saladas e recheios de sanduiches (GERMANO; GERMANO,2019).
4.3.3Salmonella sp.
	A Salmonella é um gênero da família Enterobacteriaceae, Gram-negativas, não formam esporos, anaeróbias facultativas, e tem bastonetes curtos (1 a 2 µm). Como não forma esporos, são um tanto termossensíveis, por isso são capazes de serem destruídas a 60°C, em média a 15 a 20 minutos. Caracterizam por não serem organismos exigentes, podendo se multiplicar em várias condições ambientais externas aos seres vivos, e desenvolvem de forma fácil em alimentos, em águas contaminadas com sobras de alimento ou fezes. Multiplicam-se entre 7 e 49°C, sendo 37°C a temperatura excelente para o desenvolvimento. São localizadas inicialmente no trato gastrointestinal das aves em geral, de mamíferos tanto domésticos como silvestres, também em répteis, sem causar na maioria das espécies hospedeiras aparição de sintomas (GERMANO; GERMANO,2019).
	A contaminação do alimento ocorre com todos aqueles com alto teor de umidade e alta porcentagem de proteínas, como produtos lácteos, ovos, carnes, e seus derivados. Em produtos de origem vegetal, como verduras e frutas, a contaminação acontece durante as diversas etapas de cultivo, em virtude das práticas agrícolas ineficientes ou erradas, principalmente as concernentes à adubação com fezes não tratados e aguas servidas (GERMANO; GERMANO,2019). A contaminação do alimento também pode ocorrer por causa de controle inadequada da temperatura, de práticas de manipulação ou por contaminação cruzada de alimentos crus com alimentos processados. Em virtude do microrganismo se multiplicar no alimento até atingir a dose infecciosa (FORSYTHE, 2002).
5	MATERIAIS E MÉTODOS
5.1	Caracterização da área de estudo
O município de Itacoatiara, fica localizado na região metropolitana de Manaus, o qual faz parte do estado do Amazonas. O mesmo fica a uma distância aproximada de 175 km da Capital Manaus, com população estimada no ano de 2021 de 104.046 pessoas, abrangendo uma área da unidade territorial de 8.892 km2 (IBGE,2022).
5.2	Procedimentos Metodológicos
A metodologia de pesquisa utilizada neste trabalho é fundamentada em uma abordagem observacional com caráter descritivo. A pesquisa observacional consiste na coleta de informações a partir da aquisição dos vegetais minimamente processados para obtenção de dados científico ao presente trabalho. A pesquisa observacional transversal, que visa registrar informações sobre as amostras sem manipular ou interferir em seu ambiente, e comparar as diferentes amostras afim de avaliar os microrganismos presentes em cada uma delas. Todas as amostras serão adquiridas nos supermercados do município de Itacoatiara – AM, onde serão analisadas.
5.2.1	Aquisição e transporte das amostras
Serão coletadas três amostras de vegetais minimamente processados (couve, cenoura e repolho,) em três estabelecimentos comerciais do município de Itacoatiara-AM. 
Durante aquisição dos vegetais, o transporte ocorrerá nas embalagens disponibilizadas pelos supermercados, conforme as amostras forem adquiridas, será feito a identificação, contendo as informações do local de aquisição, horário e data da compra. As amostras coletadas serão transportadas imediatamente ao Laboratório de Microbiologia do Instituto de Ciências Exatas e Tecnologia, onde serão analisadas, contando com apoio do Laboratório de Farmácia VIII,110 – piso 1, bloco D, laboratório de Microbiologia de alimentos, Parasitologia e imunologia, e com o laboratório de Autoclave, sala 103 – piso 1,bloco D, sala quente, ICET- Itacoatiara – AM.
Os vegetais minimamente processados serão sujeitos a análise por metodologias convencionais, e serão realizadas três repetições analíticas para cada alimento, totalizando 27 amostras de alimentos analisados.
5.2.2 Análises microbiológicas
	Com o intuito de investigar a presença de microrganismo de interesse, será realizada a técnica de diluição seriada. A qual será utilizada 25g de amostras para 225mL de solução salina peptonada 1%, como solução estoque, e serão realizadas as diluições até a diluição 104 .(ARAUJO et al., 2020).	
5.2.2.2 Identificação de coliformes totais e termotolerantes 
	
Para indicar a presença de coliformes totais e termotolerantes nas amostras, será usada a técnica de tubos múltiplos, que é utilizada na estimativa da densidade de bactérias do grupo coliforme por número mais provável (NMP) (CETESB, 2018). 
A princípio, será utilizado o caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) como meio de cultura presuntivo. Para este fim, será transferido 1 mL, com auxílio de uma pipeta graduada estéril, de cada diluição que será realizada, e em seguida será e acondicionada em tubos em ensaio contendo o caldo LST com tubo invertido, e estes, serão mantidos em estufa de cultura por 24 - 48h à 36°C ± 1. Após esse tempo, será analisada a presença de turbidez no meio de cultura e a presença de gás no tubo invertido. Após a analise a fim de identificar e quantificar a presença de coliformes totais, alíquotas de 1 mL do caldo LST que indicarem a presença de coliformes serão transferidas para tubos de ensaio contendo o caldo Verde Brilhante (VB) e tubo invertido. Estes tubos serão mantidos em estufa de cultura por 24 – 48h à 36°C ± 1 (ARAUJO et al., 2020).
As mesmas amostras com indicativo de coliformes, no caldo LST, serão semeadas em caldo EC-Broth (EC) para identificação e quantificação de coliformes termotolerantes. Para isso, serão realizados os mesmos procedimentos, onde, será retirado 1 mL do caldo LST e transferidos para tubos com caldo EC e tubo invertido, em seu interior. Essas amostras serão mantidas em banho-maria por 24 – 48h à 44,5°C ± 1. A identificação da presenta de coliformes totais e de coliformes termotolerantes, em todos os meios de cultura utilizados será realizado através da observação da turbidez do meio de cultura, que é um indicativo de crescimento microbiológico, e a presença de gás no interior no tubo invertido, que será resultante da fermentação da lactose contida no meio de cultura (ARAUJO et al., 2020).
5.2.2.3 Identificação de Escherichia coli
	Para confirmação da presença de E.coli, com auxílio de uma alça de platina calibrada, será retirada uma alíquota de cada amostra com a presença de coliformes termotolerantes, evidenciado pela análise do caldo EC e semeado por esgotamento em uma placa de Petri contendo Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB). Após 48h à 36°C ± 1 em estufa de cultura, será possível observar o resultado (ARAUJO et al., 2020).
O EMB é um meio seletivo e diferencial, ou seja, é possível selecionar o microrganismo de interesse através de alguma mudança específica no meio, sendo a presença de E.coli é evidenciada por colônias pretas em reflexos verde metálicos e um meio de cultura de coloração púrpura (CETESB, 2018).
5.2.2.4 Identificação da Staphylococcus aureus 
A inoculação das diluições desejadas das amostras será feita em ágar Baird-Parker, cuja composiçãoevidencia a habilidade desse microrganismo de crescer na presença de 0,01 a 0,05% de telurito de potássio em combinação com 0,2 a 0,5 % de cloreto de lítio e 0,12 a 1,26% de glicina. O Staphylococcus aureus reduz anaeróbia e aerobiamente o telurito de potássio, produzindo colônias negras. (ARAUJO et al., 2020).
O ágar Baird-Parker suplementado com solução de gema de ovo possibilita a verificação das atividades proteolítica e lipolítica do Staphylococcus aureus, por meio do aparecimento de um halo de transparência e um de precipitação ao redor da colônia, respectivamente. Dessa forma,será retirada, com auxílio de uma alça de platina calibrada, uma amostra de cada diluição que será realizada em solução salina peptonada 1% (10-1 – 10-4 ) e será transferida por esgotamento para uma placa de Petri contendo o meio Baird Parker. Esta será incubada em estufa de cultura por 48h à 37°C ± 1 (ARAUJO et al., 2020).
 Para cada placa que apresentar crescimento de colônias típicas, serão repicadas as colônias típicas para o meio de cultura contendo Ágar Manitol Salgado, para diferenciar entre bactérias fermentadoras e não fermentadoras do manitol, e esta será mantida em estufa de cultura por 48 à 36°C ± 1 O S. aureus fermentará o manitol produzindo ácido láctico, isso fará com que o pH do meio diminua. Esse meio possui indicadores de pH que, em pH ácido, evidencia uma coloração amarela do meio (ARAUJO et al., 2020).
5.2.2.5 Identificação de Salmonella sp.
Para identificação de Salmonella sp. será pipetado uma alíquota de 1mL com auxílio de pipeta graduada esterilizada, da solução estoque e da primeira diluição (10-1 ), em caldo tetrationato, que será acondicionado em tubos de ensaio. Os tubos com este caldo serão colocados em estufa de cultura a 36°C por 24h. Após esse período serão retirado uma alíquota, com auxílio de uma alça de platina calibrada, e semeada por esgotamento em placas de Petri com Ágar Verde Brilhante e Ágar Salmonella-Shigella (SS) (ARAUJO et al., 2020).
Estes meios serão acondicionados em estufa de cultura por 48 h à 36°C ± 1. O resultado obtido em ambos os meios de cultura serão observados e comparados conforme indicação do fabricante. Caso possuam colônias indicativas de Salmonella sp., será retirada uma alíquota, com auxílio de agulha de platina e inoculada em Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI). Os tubos contendo Agar TSI serão acondicionados em estufa de cultura por 24h à 35°C ± 1. O resultado será observado de acordo com a coloração obtida na base e na porção inclinada do meio (ARAUJO et al., 2020).
6 	RESULTADOS ESPERADOS
Diante dos métodos e propostas citados acima, espera-se que após a execução do presente trabalho obtenha-se a determinação da presença contaminantes microbiológicos nos vegetais minimamente processados através das metodologias convencionais adotadas.
Em virtude da RDC n° 331/2019 não descrever em sua legislação vigente valores para coliformes totais em vegetais minimente processados, espera-se fazer comparação com resultados apontados pela técnica de tubos múltiplos.
Para os coliformes termotolerantes, espera-se que as amostras adquiridas nos estabelecimentos sigam os padrões estabelecidos pela Agencia Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), descrito na resolução – RDC N° 12 DE 2001, no qual determina que as hortaliças, legumes e similares sigam um padrão microbiológico de no máximo 102 a 45°C/g, tendo em vista a RDC vigente de n° 331/2019 não descrever em sua legislação vigente valores para coliformes termotolerantes em vegetais minimente processados.
	A IN 0/2019 especifica a contaminação por Escherichia coli com limites de n=5, c=2, m=10, M=102 e Salmonella n=10, c=0, m=Aus,M=-, espera-se especificar a contaminação de cada um desses microrganismos nos alimentos através das metodologias convencionais adotadas.
Referente aos vegetais MMP que serão analisados para identificação de contaminação por Staphylococcus aureus, espera-se que os testes sejam positivos para esse microrganismo, e o resultado será comparado com o padrão permitido pela ANVISA (RDC N° 12 DE 2001), que estabelece ausência de Salmonella sp./25g, já que na RDC vigente de n° 331/2019 não descrever em sua legislação vigente valores para Staphylococcus aureus em vegetais minimente processados.
Com execução do presente projeto, espera-se o estimulo aos supermercados à adoção dos padrões estabelecidos pela ANVISA, e que se use as ferramentas de segurança alimentar como as Boas Práticas de Fabricação, para uso de etapas de monitoramento de prevenção, redução, ou eliminação total dos riscos presentes no ambiente e no produto, garantindo a melhoria dos produtos e dos processos de segurança alimentar.
7	CRONOGRAMA
Quadro 01: Cronograma da pesquisa
	ATIVIDADES
	03/2023
	04/2023
	05/2023
	06/2023
	07/2023
	Caracterização das
Amostras
	
X
	
	
	
	
	Aquisição das
Amostras
	
	
X
	
	
	
	Preparo das amostras e meios de cultura
	
	
X
	
	
	
	Identificação de coliformes totais
	
	
X
	
	
	
	Identificação de coliformes termotolerantes
	
	
X
	
	
	
	Identificação de Escherichia coli
	
	
X
	
	
	
	Identificação da Staphylococcus aureus
	
	
X
	
	
	
	Identificação de Salmonella sp.
	
	
X
	
	
	
	
Revisão Final do TCC
	
	
	
X
	X
	
	
Defesa do TCC
	
	
	
	
	
X
	Submissão do TCC na Biblioteca e do artigo científico
	
	
	
	
	
X
Fonte: Autor, 2022.
8	ORÇAMENTO
Na elaboração do presente trabalho há a necessidade da realização do orçamento para identificar os serviços e produtos utilizados em sua realização, para que seja possível estimular um valor aproximado na execução da pesquisa. 
Tabela 01: Estimativa de gastos na execução da pesquisa.
	Descrição
	Quantidade
	Unidade
	Valor unitário (R$)
	Valor total
(R$)
	Serviço/Produto
	
	
	
	
	Máscara descartável branca
	
45
	
Unidade
	
2,00
	
90,00
	Álcool em gel Antisséptico Desodorante 70º INPM (500 ml)
	
4
	
Unidade
	
15,00
	
60,00
	Transporte (Aplicativo, Moto-taxi)
	
-
	
Serviço
	
-
	
150,00
	Jaleco
	2
	Unidade
	129,00
	258,00
	Bota
	1
	Unidade
	130,00
	130,00
	Caldo Lauril Triptose (LST) -500g
	
1
	
Unidade
	
490,21
	
490,21
	Caldo verde verde brilhante (VB)- 500g
	
1
	
Unidade
	
727,87
	
727,87
	caldo EC-Broth (EC)- 500g
	
1
	
Unidade
	
722,80
	
722,80
	Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB)- 500g
	
1
	Unidade
	
728,16
	
728,16
	Ágar Baird-Parker – 500g
	
1
	
Unidade
	
680,73
	
680,73
	Ágar Mantinol Salgado – 500g
	
1
	
Unidade
	
229,09
	
229,09
	Caldo tetrationado – 500g
	
1
	
Unidade
	
400,74
	
400,74
	Ágar verde brilhante – 500g
	
1
	
Unidade
	
414,07
	
414,07
	Ágar Salmonella-Shigella (SS) – 500g
	
1
	
Unidade
	
521,97
	
521,97
	Ágar Triplice Açúcar Ferro (TSI) – 500g
	
1
	
Unidade
	
510,86
	
510,86
	TOTAL
	
	
	
	6.112,13
Fonte: Autor, 2022.
REFERÊNCIAS
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