Biologia molecular e biotecnologia - questões da atividade avaliativa 3

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Biologia molecular e biotecnologia - questões da atividade avaliativa 3
1. Qual a diferença entre Knockout e Knockdown de um gene em um organismo/célula?
Cite um método utilizado para realizar cada um destes tipos de alteração gênica.
A diferença entre os dois é que enquanto no Knockout um gene específico é inibido de
se expressar, substituindo o mesmo por uma versão modificada sua, no Knockdown a
expressão de um ou mais genes é reduzida devido à inserção de pequenos fragmentos de DNA
ou RNA a partir de uma sequência complementar de um gene ativo ou transcrito pelo RNAm.
Um método que pode ser utilizado para realizar essas categorias de alteração gênica é o
CRISPR/Cas9, que fará a edição do genoma através da clivagem do DNA pela Cas9.
2. No sistema de RNA de interferência o que faz a enzima DICER e o complexo RISC?
A enzima DICER é responsável pela clivagem de RNAi de dupla hélice, formando
miRNA ou siRNA que serão posteriormente incorporados no complexo RISC. Este, no que lhe
concerne, atua controlando a expressão gênica, inibindo a tradução ou degradando o mRNA.
3. No sistema CRISPR qual a função do RNA guia e o que faz a CAS9?
O RNA guia é responsável por indicar à enzima Cas9 qual o trecho de DNA que deverá
ser cortado, e a enzima, por sua vez, é a responsável pelo corte do DNA, sendo a principal
utilizada para este caso.
4. Proposta de Pesquisa - “Como a utilização da técnica CRISPR/Cas9 para edição gênica
pode ocasionar mutações não intencionais (off target) em humanos e a importância do
aprimoramento da técnica para evitar o desenvolvimento de novas doenças”
4.1 Resumo
A área da biotecnologia tem passado por grandes transformações e inovações desde a
descoberta da dupla hélice do DNA, o que possibilita que tecnologias antes vistas como
futuristas, como a edição gênica proposta pelo filme GATTACA em 1997, sejam hoje possíveis
de serem realizadas precisa e eficientemente. Muitas técnicas de aprimoramento e edição
genética já estão sendo colocadas em prática em diversas áreas, especialmente na agricultura,
como em plantas com inseticidas naturais feitos a partir da toxina Bt, por exemplo. Na área da
medicina, a prática num geral ainda está no início, justamente porque envolve a alteração do
genoma humano, então as questões que serão postas em prática devem ser analisadas antes
para que os princípios bioéticos não sejam feridos. Paralelamente, estudos continuam sendo
feitos e alguns como a técnica CRISPR/Cas9, por exemplo, já estão começando os seus testes
clínicos.
O sistema CRISPR/Cas9 funciona como um editor genético que pode ser utilizado tanto em
plantas quanto em animais, promovendo a alteração ou exclusão de genes que possam causar
mutações e estejam associados à manifestação de doenças através da clivagem do DNA por
uma enzima endonuclease (Cas9) guiada por uma sequência de RNA, possibilitando, desta
forma, a exclusão completa ou o silenciamento de genes deletérios. Nos últimos anos, esse
sistema teve um avanço no aprimoramento de suas técnicas de edição genômica e está
começando a ser utilizado clinicamente no tratamento de doenças severas, e os resultados
obtidos têm sido surpreendentes. Por ser uma técnica relativamente recente e muito versátil,
ainda não se tem certeza de todos os efeitos que a utilização desse sistema pode causar em
diferentes aplicações. Um exemplo de caso que pode conferir grandes problemas ao indivíduo é
durante a edição genética de determinado gene visado (on target) que pode levar a alguma
mutação simultânea inesperada em outra parte do genoma, chamada mutação indesejada (off
target).
A mutação off target ocorre devido à ação inespecífica da enzima Cas9, de forma não
intencional, visto que os primers precisam de poucos pares de base, o que proporciona um risco
maior de ele se emparelhar com outros genes e gerar mutações a partir disso, podendo chegar
a ocorrer a uma frequência de ~ 50% dos casos, o que pode causar instabilidade genômica e
atrapalhar a funcionalidade de genes normais, sendo por este motivo tão preocupante para as
aplicações clínicas terapêuticas. Essa categoria de mutação é difícil de ser detectada quando
comparada à mutação on target, porque não se sabe quantas ou onde ela se encontra no
genoma. O gRNA ainda está sendo estudado para servir como um indicador da localização e
identificador da atividade dos genes off target baseado em como estes podem se manifestar.
Isso porque o gRNA consegue realizar uma seleção cuidadosa e com uma variante de nuclease
apropriada pode reduzir significativamente o risco de mutações off target. Mesmo que o sistema
CRISPR/Cas9 seja altamente específico, ainda é necessário avaliar experimentalmente os
gRNAs candidatos para garantir que seu funcionamento seja adequado para atender ao objetivo
sem apresentar riscos ao paciente.
5. Objetivo específico
5.1 Objetivo: Apresentar o principal efeito reverso causado pela utilização da técnica de
edição gênica CRISPR/Cas9, a mutação off target em genes não-alvo em humanos e a
importância de sua detecção utilizando gRNAs e do aprimoramento da técnica de forma
adequada a sua aplicação em humanos com uma frequência de erros de mutação reduzidos.
6. Referencial teórico
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