2010-MartaFreitasVasconcelos

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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA 
 
 
 
 
 
 
ESTUDO DA INFECÇÃO POR BABESIA SPP. EM CÃES 
DA REGIÃO PERIURBANA DE BRASÍLIA, DISTRITO 
FEDERAL 
 
 
 
 
 
MARTA FREITAS VASCONCELOS 
 
 
 
 
 
 
 
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO 
EM SAÚDE ANIMAL 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
BRASÍLIA/DF 
FEVEREIRO/2010 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
ESTUDO DA INFECÇÃO POR BABESIA SPP. EM CÃES DA REGIÃO PERIURBANA 
DE BRASÍLIA, DISTRITO FEDERAL 
 
 
 
MARTA FREITAS VASCONCELOS 
 
 
 
 
ORIENTADOR: GIANE REGINA PALUDO 
 
 
 
 
 
 
 
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO 
EM SAÚDE ANIMAL 
 
 
PUBLICAÇÃO: 022/2010 
 
 
 
 
 
BRASÍLIA/DF 
FEVEREIRO/2010 
 
 
 
 
UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA 
 
 
 
ESTUDO DA INFECÇÃO POR BABESIA SPP. EM CÃES DA ÁREA PERIURBANA 
DE BRASÍLIA, DISTRITO FEDERAL 
 
 
 
 
MARTA FREITAS VASCONCELOS 
 
 
 DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA 
 AO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM 
 SAÚDE ANIMAL, COMO PARTE DOS 
 REQUISITOS NECESSÁRIOS À OBTENÇÃO 
 DO GRAU DE MESTRE EM SAÚDE ANIMAL 
APROVADA POR: 
 
 
___________________________________________ 
GIANE REGINA PALUDO, MVD, PhD (Universidade de Brasília - UnB) 
(ORIENTADOR) 
 
 
___________________________________________ 
ARLETE DELL’PORTO, MVD, PhD (Universidade de Brasília - UnB) 
(EXAMINADOR INTERNO) 
 
 
___________________________________________ 
NÁDIA REGINA P. ALMOSNY, MVD, PhD (Universidade Federal Fluminense - UFF) 
(EXAMINADOR EXTERNO) 
 
 
 
 
 
BRASÍLIA/DF, 08 de FEVEREIRO de 2010 
 
 
 
 
 
 
 
 
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA E CATALOGAÇÃO 
 
 
 
VASCONCELOS, M.F. Estudo da infecção por Babesia spp. em cães da área 
periurbana de Brasília, Distrito Federal. Brasília:Faculdade de Agronomia e Medicina 
Veterinária, Universidade de Brasília, 2010, 63 p. Dissertação de Mestrado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FICHA CATALOGRÁFICA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Documento formal, autorizando reprodução 
desta dissertação de mestrado para 
empréstimo ou comercialização, 
exclusivamente para fins acadêmicos, foi 
passado pelo autor à Universidade de 
Brasília e acha-se arquivado na Secretaria 
do Programa. O autor reserva para si os 
outros direitos autorais, de publicação. 
Nenhuma parte desta dissertação de 
mestrado pode ser reproduzida sem a 
autorização por escrito do autor. Citações 
são estimuladas, desde que citada a fonte. 
 
 
 
 Vasconcelos, Marta Freitas 
Estudo da infecção por Babesia spp. em cães da área 
periurbana de Brasília, Distrito Federal / Marta Freitas 
Vasconcelos orientação de Giane Regina Paludo– 
Brasília, 2010. 85p.: il. 
 Dissertação de Mestrado (M) – Universidade de 
Brasília/Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 
2010. 
 1. Babesia spp. 2. Cães. 3. Hematologia. 
4. Bioquímica 5. PCR. 6. Sub-espécies I. Vasconcelos, 
M.F. II. Estudo da infecção por Babesia sp. em cães da 
área periurbana de Brasília, Distrito Federal. 
 
CDD ou CDU 
Agris / FAO 
 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
Inicio meus agradecimentos àquele que eu nuca vi, mas conheço bastante. Com ele, 
compartilhei meus momentos de solidão e tristeza, mas também, os de alegria e 
felicidade. Com ele, e muitas vezes só com ele, participei todos os piores e os melhores 
momentos da minha vida; e por isso eu te agradeço meu Deus. 
 
Aos meus pais, pelo apoio e confiança na minha capacidade, por estarem ao meu lado 
mesmo nos momentos mais difíceis. 
 
Às minhas irmãs, estrelas da minha vida! Pelos exemplos de vida e conquistas, por 
estarem ao meu lado incondicionalmente. 
 
À minha orientadora, Professora Dra. Giane Regina Paludo, por ser mãe e orientadora, 
pelo apoio, pela amizade e por estar do meu lado em todos os momentos durante esta 
caminhada. 
 
Ao meu noivo, Rodrigo Bittencourt, pela sua importância imensurável, pela paciência, 
compreensão; por estar ao meu lado compartilhando todos os momentos, pela amizade 
sincera, o olhar mais verdadeiro e o amor incondicional. 
 
À Aurelina, Francisco e Carmem por serem “anjos” da minha vida. 
 
Às meninas dos laboratórios e do Hvetinho, pelo apoio, amizade, lanches e almoços, 
idas à Fercal, por todos os momento vividos ao longo destes anos. 
 
Às minhas amigas – Tati, Fê, Anahí, Mirna, Vanessa, Cris e Karla - que sempre 
estiveram ao meu lado, pelas risadas, conselhos, amizade, por todos os momentos que 
passamos juntas. 
 
 
 
Aos meus cunhados, especialmente Henrique e Leonardo, por todo carinho, apoio e 
confiança depositada. 
 
À Salvina e seu Aurino, pelas comidinhas gostosas que preparam ao longos desses 
anos, pelo amor e atenção oferecida. 
 
Ao laboratório de Biologia Molecular da Pós-Graduação da Universidade Católica de 
Brasília pelos resultados de seqüenciamentos. 
 
Aos agentes comunitários e toda a população da Fercal e a Lívia, proprietária do abrigo 
de cães do Lago Oeste, que colaboraram com o estudo nos abrindo a porta sempre 
com boa vontade. Este trabalho não teria sido realizado sem vocês. 
 
Às minhas amigas e amigos, orientadas de PIBIC e estagiários: Fabíola, Fernanda, 
Maiana, Maia, Andréa, Ana Paula e Rodrigo pela amizade, ajuda incansável, conversas 
e risadas ao longo deste trabalho. 
 
Aos professores Dr. Márcio Botelho de Castro, Dra. Arlete Dell’Porto e Dra. Ângela 
Patrícia pelo carinho dispensado durante esses anos. 
 
À Professora Dra. Nádia R.P. Almosny pelo apoio e presença em minha avaliação. 
 
À Universidade de Brasília e Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária e todos 
os professores e funcionários que fizeram parte da minha vida ao longo desses anos. 
 
À Capes e FINATEC pelo apoio financeiro, sem o qual este trabalho não seria 
realizado. 
 
A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para este trabalho, os meus 
sinceros agradecimentos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Os meus sonhos nada mais são do que objetivos a 
serem alcançados. Alguns estão a um passo, outros, 
mais distantes, além do horizonte. Distância pela qual 
minhas pernas fortes me guiarão, com paciência e 
clareza. E se no caminho houver algo, que o tempo me 
obste atingir não tem problema. Meus sonhos são tão 
belos, que do meu ofego, farei descanso, e do meu 
suor, farei vitória.” 
 (Autor desconhecido) 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
 Página 
LISTA DE TABELAS ix 
LISTA DE FIGURAS xi 
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIAÇÕES xiii 
PREFÁCIO xiv 
RESUMO xv 
ABSTRACT xvi 
CAPÍTULO I 
Introdução 1 
Referencial Teórico 2 
Objetivos 11 
Referências 12 
CAPÍTULO II 
Título do Artigo 19 
Introdução 19 
Material e Métodos 20 
Resultados 29 
Discussão 48 
Conclusões 55 
Referências 56 
CAPÍTULO III 
Considerações Finais 62 
ANEXOS 64 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
 Página 
 
TABELA 1 Sequências de oligonucleotídeos utilizados para PCR 
 
23 
TABELA 2 Resultados esperados dos tamanhos dos fragmentos de DNA (pb) na PCR e 
restrição enzimática utilizando as enzimas TaqI e HinfI para cada espécie de 
Babesia 
 
25 
TABELA 3 Porcentagem de animais positivos e negativos na PCR (oligonucleotídeo 
455-479-F e 793-772-R) por local estudado 
 
30 
TABELA 4 Número total e porcentagem de animais positivos para Babesia spp no 
esfregaço sanguíneo e na PCR na região da Fercal e no abrigo do Lago 
Oeste 
 
31 
TABELA 5 Co-infecções dos animais positivos para Babesia spp 
 
31 
TABELA 6 Análise estatística dos hemogramas completos e das bioquímicas séricas 
dos animais positivos e negativos da Fercal e lago Oeste 
 
37 
TABELA 7 Valores médios e desvio padrão dos parâmetroshematológicos e bioquímico 
sérico nos cães positivos e negativos para a infecção por Babesia spp. do 
abrigo do Lago Oeste 
 
38 
TABELA 8 Valores médios e desvio padrão dos parâmetros hematológicos e bioquímico 
sérico apresentados pelos animais positivos e negativos para a infecção por 
Babesia spp. da Fercal 
 
39 
TABELA 9 Valores médios e desvio padrão dos parâmetros do hemograma completo e 
da bioquímica sérica apresentados por todos os animais positivos e 
negativos para a infecção por Babesia sp. das duas localidades 
 
40 
TABELA 10 Valores médios e desvio padrão dos parâmetros do hemograma completo e 
da bioquímica sérica apresentados pelos animais positivos somente para 
Babesia sp. sem co-infecções (G1), animais positivos para Babesia sp. com 
co-infecções (G2) e dos animais negativos para Babesia sp. (G3) do abrigo 
do Lago Oeste 
 
41 
TABELA 11 Valores médios e desvio padrão dos parâmetros hematológicos e bioquímico 
sérico apresentados pelos animais positivos somente para Babesia sp. sem 
co-infecções (G1), animais positivos para Babeisa sp. com co-infecções 
(G2) e dos animais negativos para Babesia sp. (G3) da Fercal 
 
42 
TABELA 12 Valores médios e desvio padrão dos parâmetros hematológicos e bioquímico 
sérico apresentados pelos animais positivos somente para Babesia sp. sem 
co-infecções (G1), animais positivos para Babesia sp. com co-infecções 
(G2) e dos animais negativos para Babesia sp. (G3) nas duas localidades 
 
43 
TABELA 13 Freqüência das alterações hematológicas e bioquímicas dos animais 
infectados somente com Babesia spp. sem co-infecção com Hepatozoon, 
Ehrlichia e Leishmania (G1) 
44 
 
 
TABELA 14 Número total e porcentagem de animais positivos para Babesia canis vogeli 
e Babesia canis rossi 
 
45 
TABELA 15 Número total e porcentagem de animais positivos Babesia canis vogeli e 
Babesia canis rossi na região da Fercal e no abrigo do Lago Oeste 
 
45 
TABELA 16 Valores médios e desvio padrão dos parâmetros do hemograma completo e 
da bioquímica sérica apresentados nos animais infectados com Babesia 
canis vogeli e Babesia canis rossi 
 
46 
TABELA 17 Frequência das alterações hematológicas e bioquímicas dos animais 
infectados Babesia canis vogeli e Babesia canis 
47 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
 Página 
FIGURA 1 Babesia spp. em eritrócito de cão (aumento de 100X-coloração 
panótico) 
 
29 
FIGURA 2 Resultado da PCR para o gênero Babesia sp., utlizando os 
oligonucleotídeos 455-479-F e 793-772-R. Legenda: 1: marcador de 
peso molecular (100pb ,Invitrogen ®); 2: controle negativo (água); 3 a 
7: animais positivos e 8: animal negativo. Gel de agarose a 1,5% (p/v) 
corado com brometo de etídeo a 0,01% (p/v) 
 
30 
FIGURA 3 Gel resultante da eletroforese da PCR para o gênero Hepatozoon sp. 
utilizando os oligonucleotídeos Hep-F e Hep-R. Legenda: 1: marcador 
de peso molecular (100pb, Invitrogen ®); 2: controle positivo; 3: 
controle negativo (água); 4: animal positivo e 5: animal negativo. Gel de 
agarose a 1% corado com brometo de etídeo a 0,01% (p/v) 
 
32 
FIGURA 4 Resultado da PCR para o gênero Ehrlichia sp. utlizando os 
oligonucleotídeos DSB 330 e DSB 728 em amostras de sangue total. 
Legenda: 1: marcador de peso molecular (100 pb, Invitrogen ®); 2: 
controle negativo(água); 3 e 4: animais negativos; 5, 6: animais 
positivos; 7: controle positivo. Gel de agarose a 1,5% (p/v) corado com 
brometo de etídeo a 0,01% (p/v) 
 
32 
FIGURA 5 Resultado da PCR para o gênero Leishmania sp. utilizando-se os 
oligonucleotídeos LFW e LBW1 e 2. Legenda: 1: marcador de peso 
molecular (100pb, Invitrogen ®); 2: controle negativo (água) 3: controle 
positivo; 4 e 5: animais positivos. Gel de agarose 2% (p/v) corado com 
brometo de etídeo a 0.01% (p/v) 
 
33 
FIGURA 6 Resultado da PCR para o gênero Babesia sp. utlizando-se os 
oligonucleotídeos PIRO A e PIRO B. Legenda: 1: marcador de peso 
molecular (100pb, Invitrogen ®); 2: controle positivo; 3,4,5,6,7: animais 
positivos; 8: controle negativo (água). Gel de agarose a 1% (p/v) 
corado com brometo de etídeo a 0,01% (p/v) 
 
34 
FIGURA 7 Resultado da digestão enzimática com as enzimas Taq I e Hinf I, dos 
produtos da PCR (oligonucleotídeos 445-479-F e 793-772-R). 
Legenda: Superior: Digestão enzimática com a enzima Taq I, 1: 
marcador de peso molecular (100pb, Invitrogen ®); 2: controle positivo 
para Babesia canis vogeli 3,4,5,6 e 7: animais positivos para digestão 
enzimática. Inferior: Digestão enzimática negativa para a enzima Hinf I, 
1A: marcador de peso molecular (100pb, Invitrogen ®); 2A: controle 
positivo; 3A,4A,5A,6A e 7A: animais positivos para Babesia canis 
vogeli. Gel de agarose a 2% (p/v) corado com brometo de etídeo a 
0,01% (p/v) 
 
34 
FIGURA 8 Resultado da digestão enzimática com as enzimas Taq I e Hinf I, dos 35 
 
 
produtos da PCR (oligonucleotídeos 445-479-F e 793-772-R). 
Legenda: Á esquerda, digestão enzimática negativa para enzima Taq I, 
1: marcador de peso molecular (100pb, Invitrogen ®); 2,3,e 4: amostras 
negativas para enzima Taq I. À direita, digestão enzimática positiva 
com a enzima Hinf I, 1: marcador de peso molecular (100pb, Invitrogen 
®); 2,3 e 4: amostras positivas para a enzima Hinf I, compatível com o 
diagnóstico de Babesia cani rossi. Gel de agarose a 2% (p/v) corado 
com brometo de etídeo a 0,01% (p/v) 
 
FIGURA 9 Resultado da PCR para o gênero Babesia spp., B. canis vogeli e B. 
canis rossi utlizando-se os oligonucleotídeos 445-479-F e 793-772-R, 
BCV-F e 793-772-R, BCR-F e793-772-R, respectivamente. Legenda: 1: 
controle negativo (água); 2: Amostra positiva para Babesia spp.; 3: 
amostra positiva para B. canis vogeli; 4: amostra positiva para B. canis 
rossi; 5: marcador de peso molecular (100pb, Invitrogen ®); Gel de 
agarose a 2% (p/v) com brometo de etídeo a 0,01% (p/v) 
 
36 
FIGURA 10 Resultado da PCR para o gene da enzima GAPDH, utilizando os 
primers GAPDH-F e GAPDH-R. Legenda: 1: controle positivo; 2: 
controle negativo (água); 3 a 7: animais positivos; 8:Ladder 100pb 
(Invitrogen ®). Gel de agarose a 1,5%(p/v) com brometo de etídeo a 
0,01% (p/v) 
36 
 
 
 
 
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIAÇÕES 
 
 
A/G Albumina/Globulina 
ALT Alanino aminotransferase 
AST Aspartato aminotransferase 
ºC Graus Celcius 
CHCM Concentração de hemoglobina corpusculas média 
DNA Ácido desoxirrinonucléico 
dNTP Trifosfatos de desoxirribonucleosídeos 
Dr. Doutor 
Dra. Doutora 
EDTA Ácido etileno diamino tetracético 
FA Fosfatase Alcalina 
GAPDH Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase 
g/dL Gramas por decilitro 
HCL Ácido Clorídrico 
HCM Hemglobina corpuscular média 
M Molar 
µL Microlitros 
PPT Proteína plasmática total 
PT Proteína sérica 
rRNA Ácido ribonucléico ribossômico 
VCM Volume corpuscular médio 
VG Volume globular 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PREFÁCIO 
 
 
 O trabalho foi realizado com o intuito de aprofundar o conhecimento sobre a 
ocorrência da infecção por Babesia spp. e suas alterações laboratoriais em cães da 
região periurbana de Brasília (Fercal e Lago Oeste). Essa doença é transmitida pela 
picada do carrapato e acomete cães de todo o mundo ocasionando principalmente 
febre, anorexia e icterícia. 
 O capítulo I mostra uma breve revisão do conhecimento atual sobre a doença e 
seus principais agentes. Procura explorar a descoberta de novas espécies envolvidas 
na afecção, com importante ênfase no diagnóstico. 
 O capítulo II tem por objetivo relatar o experimento realizado, os resultados 
encontrados, bem como a relevância do estudo para o conhecimento da doença, dos 
diferentes agentes e das técnicas diagnósticas atuais. 
 O capítulo III levanta a relevância do presente trabalho e perspectivas futuras. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMO 
 
 
A babesiose canina é uma doença endêmica no Brasil, transmitida pelo carrapato 
Rhipicephalus sanguineus. O presente trabalho teve por objetivos determinar a 
ocorrência da infecção por Babesia spp., identificaras sub-espécies infectantes, 
caracterizar as principais alterações hematológicas e bioquímicas, assim como verificar 
a freqüência de co-infecções com outros hemoparasitas em cães da região periurbana 
de Brasília (Fercal e Lago Oeste), Distrito Federal. Foram utilizadas 187 amostras 
sanguíneas de cães sendo 124 pertencentes a região da Fercal e 63 de um abrigo de 
cães no Lago Oeste. Os animais foram divididos em três grupos: G1 (cães infectados 
apenas por Babesia spp.), G2 (cães infectados por Babesia spp. e com co-infecções 
por Hepatozoon sp., Ehrlichia sp. e Leishmania sp.) e G3 (cães negativos para Babesia 
spp.). A ocorrência observada de infecção por Babesia spp. foi 22,99%. Foram 
identificadas B. canis vogeli e B. canis Rossi como as duas sub-espécies que 
acometem cães desta região, sendo que esta última, até o presente momento não 
haviam relatos no Brasil. As principais alterações hematológicas e bioquímicas nos 
cães infectados foram: anemia (65,78%), monocitose (89,47%), trombocitopenia 
(60,52%), hiperproteinemia (68,42%), hipoalbuminemia (60,52%) e diminuição da 
relação albumina/globulina. O presente estudo permitiu concluir que a babesiose canina 
é endêmica nas regiões periurbanas de Brasília, duas sub-espécies (B. canis vogeli e 
B. canis rossi) infectam os cães desta região e a infecção por B. canis rossi está 
presente na região de Brasília. 
 
 
1. Babesia spp. 2. Cães. 3. Hematologia 4. Bioquímica 5.PCR. 6.Sub-espécies.
 
 
 
ABSTRACT 
 
 
 
Canine babesiosis is endemic in Brazil, and transmitted by the tick Rhipicephalus 
sanguineus. This study aims to determine the occurrence of infection by Babesia spp., 
identify the infective sub-species, characterize the main hematological and biochemical 
changes, and determine the frequency of co-infections with other hemoparasites in the 
peri-urban region of Brasília ( Fercal and Lago Oeste), Distrito Federal. We used 187 
blood samples from dogs, being 124 from Fercal and 63 from a rescue shelter in Lago 
Oeste. The animals were divided into three groups: G1 (dogs only infected by Babesia 
spp.), G2 (dogs infected with Babesia spp. and co-infections with Hepatozoon sp., 
Ehrlichia sp. and Leishmania sp.) and G3 (dogs negatives for Babesia spp.). The 
occurrence of Babesia spp. infection was found 22.99%. B. canis vogeli and B. canis 
rossi were identified as the causative agents of babesiosis in this regions, the latter until 
now had not been reported in Brazil. We observed the following hematological and 
biochemical changes in infected dogs anemia (65.78%), monocytosis (89.47%), 
thrombocytopenia (60.52%), hyperprotein (68.42%), hypoalbumin (60.52%) and 
decreased albumin / globulin. This study concluded that canine babesiosis is endemic in 
peri-urban areas of Brasilia, two sub-species (B. canis vogeli e B. canis rossi) infect 
dogs in this region, and infection with B. canis rossi is present in the region of Brasilia. 
 
1. Babesia spp. 2. Dogs. 3. Hematology. 4. Biochemistry 5. PCR. 6. Sub-species 
 
 
 
CAPÍTULO I 
 
 
INTRODUÇÃO 
 
 
Protozoários do gênero Babesia são parasitos intraeritrocitários transmitidos por 
carrapatos e que infectam vários hospedeiros vertebrados, podendo causar doença 
severa em animais domésticos, silvestres e no homem (Ristic, 1988). 
A babesiose canina é endêmica no Brasil, causada pela Babesia canis e Babesia 
gibsoni, ambas transmitidas principalmente pelo carrapato Rhipicephalus sanguineus 
(Dantas-Torres e Figueredo, 2006). Casos de babesiose canina têm sido reportados em 
vários estados do Brasil, ocasionando diversos sinais clínicos como desidratação, febre, 
apatia, anorexia, esplenomegalia, linfadenomegalia e icterícia (Furlanello et al., 2005). 
Historicamente, a infecção por Babesia vem sendo identificada por meio da 
microscopia óptica que possibilita a visualização do piroplasma no interior do eritrócito 
no esfregaço sanguíneo (Boozer e Macintire, 2003). A distinção entre as duas espécies 
de Babesia, nos cães, era baseada na especificidade do hospedeiro e na morfologia 
das formas intraeritrocitárias, já que apresentam uma considerável diferença de 
tamanho. Dessa forma, grandes Babesias (4-5µm) eram consideradas como Babesia 
canis e pequenas Babesias (1-2,5µm), como Babesia gibsoni. Esse critério de 
caracterização era fundamentado na hipótese que nenhuma outra espécie de Babesia 
infectava os cães (Hauschild et al., 1995; Cacciò et al., 2002). 
Nos últimos anos, com o advento da biologia molecular, foi questionada a 
caracterização dos isolados de Babesia canis oriundos de diferentes regiões 
geográficas. O diagnóstico molecular da Babesia spp. tem demonstrado que a 
especificidade de piroplasmídeos pelos hospedeiros é menor do que se supunha 
 
 
anteriormente e somente o uso de técnicas sensíveis de diagnóstico poderiam 
caracterizar com precisão as espécies (Jefferies et al., 2003). 
Diante do exposto, o estudo da infecção por Babesia em cães de áreas 
periurbanas de Brasília se faz necessário para verificarmos a freqüência e importância 
da infecção nesses animais e assegurar se realmente existe apenas uma única espécie 
de Babesia parasitando os cães, já que a diferenciação específica de Babesia não tem 
apenas interesse acadêmico, mas também, em relação a sintomatologia, prognóstico, 
tratamento e vacinação. 
 
 
REFERENCIAL TEÓRICO 
 
 
Taxonomia 
 
A babesiose canina é uma doença causada pelo protozoário intraeritrocitário 
Babesia sp., classificado no Filo Apicomplexa, Classe Sporozoasida, Subclasse 
Coccidiasina, Ordem Piroplasmorida, Família Babesiidae e Gênero Babesia (O´Dwyer & 
Massard, 2002; Vial & Gorenflot, 2006). O Filo Apicomplexa, caracteriza-se pela 
presença de um complexo apical e citoesqueleto único e distinto de outros eucariotas 
(Gordon e Sibley, 2005). 
Desde a primeira descrição em 1910, todos os cães infectados por pequenas 
Babesias eram considerados como infectados por Babesia gibsoni. Zahler et al. (2000), 
descreveram uma pequena Babesia isolada em cães na Alemanha que são 
genotipicamente distintas da B. gibsoni isolada nos cães da Califórnia,este parasita foi 
relatado como a Babesia microti. 
Atualmente são reconhecidas três sub-espécies de Babesia canis: Babesia canis 
canis, transmitida por Dermacentor reticulatus; Babesia canis vogeli, transmitida pelo 
Rhipicephalus sanguineus e Babesia canis rossi (Carret et al., 1999). 
Novas espécies de Babesia estão sendo isoladas de hospedeiros vertebrados. 
Entre as Babesias recentemente descobertas estão incluídas: B. venatorum sp., 
Babesia sp. EU1, Babesia sp. MO-1 e B. china BQ1, consideradas zoonoses (Guan et 
 
 
al., 2002; Liu et al., 2007). Além dessas espécies, muitas outras já foram descritas há 
muito tempo, mas informações biológicas, nomenclaturas, identificação dos vetores e 
dados moleculares ainda são escassos (Uilenberg, 2006). 
Etiologia 
 
Tradicionalmente, a identificação das espécies tem sido baseada na 
especificidade do hospedeiro e morfologia do piroplasma intraeritrocítico. Baseado 
nisto, piroplasmas caninos têm sido organizados como duas espécies distintas: as 
grandes Babesias (4-5µm) – Babesia canis e as pequenas Babesias (1-2,5µm) – 
Babesia gibsoni (Hauschild et al., 1995). 
A Babesia canis e Babesia gibsoni são consideradas as duas espécies que 
causam a babesiose canina, doença hemolítica de relevâcia na clínica de cães (Lobetti, 
1998). 
A Babesia canis é uma grande Babesia, cujas formas piriformes variam de 2,61 a 
5,22 µm de comprimento. Além das formas piriformes, predominam parasitos redondos, 
ovais, alongados ou amebóides. Hemácias podem ser parasitadas com quatro, oito ou 
mais trofozoítos. Também é freqüente o encontro de formas livres no plasma, bem 
como hemácias fagocitadas no interior de monócitos (O´Dwyer et al., 1997). Análises 
moleculares têm demonstrado três sub-espécies distintas de Babesia canis: B.canis 
rossi, B. canis canis e B. canis vogeli. As três sub-espécies são morfologicamente 
indistintas e demonstram enorme variação nos sinais clínicos, distribuição geográfica e 
especificidade do vetor (Cacciò et al., 2002). 
Por outro lado, a Babesia gibsoni é um pequeno hemoprotozoário que causa 
anemia hemolítica em cães. Os parasitas são pleomórficos, possuem 1 a 2,5µm de 
diâmetro e comumente aparecem como uma forma simples nas hemácias (Macintire et 
al., 2002). 
 
Distribuição geográfica 
 
A babesiose foi descrita pela primeira vez em 1888, na Romênia, quando Victor 
Babés observou um parasita em hemácias de sangue bovino (Barreira et al., 2005). 
 
 
Mas a primeira observação da babesiose canina causada por B. canis deve-se, em 
1895, a Piana e Galli-Valerio, na Itália (O´Dwyer et al., 1997). 
Babesia gibsoni foi descrita pela primeira vez na Índia, por Patton (1910), 
parasitando cães (Zahler et al., 2000). A B. gibsoni tem sido encontrada na Ásia, 
América do Norte, norte e leste da África (Kjemtrup et al., 2006), Europa (Casapulla et 
al., 1998) e, recentemente, no Brasil (Trapp et al., 2006). 
A B. canis está distribuída mundialmente, sendo descrita na África, Américas, 
Ásia e Europa (Abdullahi et al., 1990). 
As sub-espécies de B. canis ocorrem em diferentes regiões: B. canis. rossi é 
encontrada no sul da África (Uilenberg et al., 1989) e no Sudão (Oyamada et al., 2005); 
B. canis. canis é encontrada na Europa (Uilenberg et al., 1989; Cacciò et al., 2002; 
Criado-Fornelio et al., 2003; Foldvari et al., 2005) e B. canis vogeli, no norte e sul da 
África (Matjila et al., 2004), na América do Norte (Uilenberg et al., 1989), na Europa 
(Cacciò et al., 2002; Criado-Fornelio et al., 2003), na Austrália (Jefferies et al., 2003), no 
Sudão (Oyamada et al., 2005), na Turquia (Gülanber et al., 2006) e no Brasil (Passos et 
al., 2005, Duarte et al., 2008). 
A babesiose canina tem sido descrita no Brasil desde o início do século XX 
(Regendanz e Muniz, 1936). Casos de babesiose canina tem sido reportadas em 
muitos estados do Brasil, como o Rio Grande do Sul (Braccini et al., 1992), São Paulo 
(Dell´Porto et al., 1993), Pernambuco (Dantas-Torres et al., 2006), Rio de Janeiro 
(Guimarães et al., 2004), Minas Gerais (Bastos et al., 2004), Paraná (Trapp et al., 
2006), Bahia (Ungar de Sá et. al., 2007), Goiás (Duarte et al., 2008) e Distrito Federal 
(Vasconcelos et al., 2008). 
A incidência da doença parece ser maior entre os cães adultos, embora cães 
jovens com histórico recente de visitas a praia e primeira exposição aos carrapatos 
também são altamente suscetíveis à infecção (Guimarães et al., 2004; Trapp et al., 
2006). De acordo com os casos descritos, aparentemente não há predileções quanto a 
raça e sexo (Bastos et al., 2004). 
 
Transmissão 
 
 
 
No Brasil, o agente etiológico da babesiose canina é a B. canis, transmitida pela 
picada do Riphicephalus sanguineus, também conhecido como carrapato marrom do 
cão (Labruna e Pereira, 2001). O Riphicephalus sanguineus é a principal espécie 
envolvida na transmissão da B. canis vogeli para o cão; enquanto que a Babesia canis 
canis tem como vetor o carrapato Dermacentor reticulatus e B. canis rossi é transmitida 
pelo carrapato Haemophysalis leach (Uilenberg et al., 1989). A transmissão pode 
ocorrer de duas formas: transmissão transestadial ou horizontal e a transmissão 
transovariana ou vertical. Na transmissão transestadial ou horizontal os carrapatos 
adquirem Babesia como larva ou ninfa e a transmitem no estágio seguinte. A 
transmissão transovariana ocorre quando a fêmea infectada transmite o parasito para 
seus descendentes, com as larvas já eclodindo infectadas. Todos os estágios podem 
transmitir B. canis, sendo as ninfas e os adultos mais eficientes na transmissão 
(O´Dwyer & Massard, 2002; Trapp et al., 2006). 
Uma característica comum de transmissão dos parasitas apicomplexas é a 
existência de estágios específicos envolvidos na sua transmissão entre hospedeiros 
vertebrados e vetores. Estes estágios de transmissão são pouco conhecidos (Chauvin 
et al., 2009). 
 
Ciclo Biológico 
 
Os hospedeiros vertebrados são infectados por meio da picada do carrapato que 
introduz a saliva contendo esporozoítos. Os esporozoítos penetram diretamente as 
células vermelhas do sangue onde desenvolvem as fases parasitárias. No interior do 
eritrócito, o parasita produz dois merozoítos por fissão binária e após a lise deste, cada 
merozoíto infecta outro eritrócito, ocorrendo numerosas divisões e novas infecções. A 
multiplicação ocorre de forma assíncrona e vários estágios divisionários do parasita 
podem ser visualizados na corrente sanguínea ao mesmo tempo. O tamanho e a 
localização dos merozoítos dependem tanto da Babesia quanto da espécie hospedeira 
(Adachi et al., 1993; Chauvin et al., 2009). 
Os carrapatos se contaminam por ingestão do sangue infectado do hospedeiro 
vertebrado. Nas células intestinais do carrapato, ocorre a reprodução assexuada, 
 
 
denominada esporogonia, que origina os esporocinetos. Estes invadem a hemolinfa do 
artrópode e migram para outros órgãos do carrapato, incluindo glândula salivar e 
ovários, infectando-os. Na glândula salivar, os esporocinetos originam os esporozoítas 
infectantes. Os esporocinetos, presentes nos ovários da fêmea, atingirão os ovos, 
infectando as larvas que nascem contaminadas (Ewing, 1965; O´Dwyer et al., 1997; 
O´Dwyer e Massard, 2002; Vidotto & Trapp, 2004). 
É importante salientar que, quando os eritrócitos infectados por Babesia são 
ingeridos pelos carrapatos, a maioria dos parasitas são destruídos. No entanto, 
algumas fases específicas do parasita sobrevivem e originam gametócitos. Poucas 
horas depois da ingestão os organismos começam a ser visualizados na corrente 
sanguínea pela microscopia (Mehlhorn e Schein, 1984). 
 
Patogenia 
 
A patogenia da babesiose está relacionada com a ação hemolítica intra e 
extravascular, podendo variar de acordo com a espécie ou sub-espécie envolvida na 
infecção, imunidade e idade do hospedeiro (O´Dwyer & Massard, 2002; Boozer & 
Macintire, 2003). 
A resposta imunológica desempenha o papel mais importante da patogenia da 
babesiose canina. A Babesia inicia um mecanismo de destruição citotóxica de 
eritrócitos circulantes mediada por anticorpos (Pedersen, 1999; Irwin, 2005). Isso faz 
com que ocorra a hemólise intravascular e extravascular que leva a anemia e 
hemoglobinemia. Eritrócitos com anticorpos são destruídos pelos macrófagos do baço e 
do fígado (hemólise extravascular). A hemólise intravascular é resultado da reação do 
complemento antígeno-anticorpo de superfície (Day, 1999). 
 
Sinais clínicos 
 
Os sinais clínicos da babesiose canina podem variar de acordo com a espécie de 
Babesia envolvida, a imunidade do hospedeiro, idade, doenças concomitantes e 
localização geográfica (refletindo a distribuição de diferentes espécies de Babesia e/ou 
 
 
sorotipos). A babesiose canina pode ser classificada clinicamente como leve ou severa, 
ou pode ser classificada como hiperaguda, aguda, crônica ou subclínica. Na babesiose 
leve, os sinais clínicos são anemia hemolítica, febre, taquipnéia, taquicardia, 
esplenomegalia, icterícia e depressão. A babesiose severa é caracterizada por 
insuficiência renal, hepatopatia, desconforto respiratório, lesões no miocárdio e sistema 
nervoso central (que podem estar relacionados com a babesiose cerebral e sinais 
neurológicos derivados da hipoglicemia) (Lobetti et al., 2002). 
A identificação das espécies e sub-espécies de Babesia é importante para 
determinar a virulência, prognóstico e resposta a drogas anti-babesia, pois cada 
organismo responde de forma diferente de acordo com a sub-espécie envolvida na 
infecção (Kocan et al., 2001). 
Existe similaridade morfológica entre as sub-espécies de Babesia canis. Estudos 
revelaram, no entanto, uma patogenicidade maior para Babesiacanis rossi em relação 
a Babesia canis canis e Babesia canis vogeli, com quadros geralmente fatais (Schetters 
et al., 1997). Comumente há quadros de anemia hemolítica, febre e letargia, anorexia, 
hematúria e esplenomegalia, sendo a patogenia relacionada principalmente à 
multiplicação destes parasitos nas hemácias dos hospedeiros (Murase et al., 1993). 
A infecção por Babesia canis rossi é descrita como a mais virulenta das sub-
espécies causando anemia hemolítica ou até uma resposta inflamatória aguda (Reyers 
et al., 1998). Por outro lado, a infecção por Babesia canis canis é capaz de causar uma 
gama de sinais clínicos como letargia, anorexia, febre, icterícia, anemia e 
trombocitopenia (Boozer & Macintire, 2003). A Babesia canis vogeli ocasiona uma 
doença relativamente suave, muitas vezes sem evidência de sinais clínicos (Cacciò et 
al., 2002). Desta maneira, apenas as técnicas de biologia molecular podem distinguir 
estas sub-espécies morfologicamente similares (Bourdoiseau, 2006). 
 
 
Patologia Clínica 
 
Alterações hematológicas 
 
 
 
Estudos realizados em diferentes regiões do Brasil tem demonstrado grande 
diversidade de alterações hematológicas decorrentes da babesiose canina. Dentre as 
alterações, podem-se verificar com maior freqüência anemia normocítica normocrômica, 
policromasia, anisocitose, leucocitose por neutrofilia, monocitose, linfopenia e 
trombocitopenia (Schetters et al., 1997; Guimarães et al., 2004; Furlanello et al.,2005). 
A anemia inicialmente é leve, normocítica normocrômica e pode ser observada 
na fase aguda da doença, quando os piroplasmas são mais facilmente visualizados no 
esfregaço sanguíneo ou na borda de orelha, porém ainda sem tempo de resposta 
medular levando a característica arregenerativa e momentânea da anemia 
(Vasconcelos et al., 2008) e com a progressão da doença, torna-se então macrocítica 
hipocrômica e regenerativa (Furlanello et al., 2005). Estas variações podem ser 
decorrentes do estágio da doença, da espécie e sub-espécie de Babesia que acomete 
cada animal (Thrall et. al., 2007; Zygner et al., 2007). 
Alterações leucocitárias são observadas de formas variadas, mas incluem 
leucopenia, leucocitose, neutrofilia ou neutropenia, linfocitose e eosinofilia (Vercammen 
et al., 1997). Estudos realizados por Zygner et al. (2007) indicam que há o aumento do 
número de bastonetes, comumente observado em infecções agudas e pode ser 
causado por doença imunomediada. Ainda foi relatado aumento do número total de 
monócitos por Guimarães et al. (2004). 
Em estudo recente foi verificado que a trombocitopenia moderada e severa é 
comum na babesiose canina independente da sub-espécie envolvida (Lobetti et al., 
2002). A trombocitopenia tem sido atribuída mais comumente à ocorrência de 
coagulação intravascular disseminada (CID) que pode ter como causas predisponentes 
hemólise, vasculite, acidose, hipóxia, dentre outros, sendo estas alterações clínicas 
comuns na babesiose (Campos et.al., 2002). 
 
Alterações bioquímicas 
 
As alterações bioquímicas causadas pela infecção por B. canis estão 
relacionadas à gravidade da doença e ao grau de hipóxia. Achados comuns são 
aumento da atividade sérica da aspartato amino-transferase (AST) e alanina 
 
 
aminotransferase (ALT), hiperbilirrubinemia, hipoalbuminemia, anormalidades 
eletrolíticas e distúrbios ácido-base (hipocalcemia, hipercloremia e acidose metabólica) 
(Pagès et al., 1990; Bourdeau e Guelfi, 1995; Vercammen et al., 1997; Lobetti, 2000). 
Babesia canis causa doença caracterizada em sua forma aguda por anemia 
hemolítica regenerativa, febre e hemoglobinúria, havendo, na forma severa da 
enfermidade, queda nos níveis séricos de proteínas e albumina (Furlanello et al. 2005). 
Há relatos de aumento dos níveis séricos de uréia, creatinina, elevação da atividade de 
AST (Scally et al. 2006), aumento da atividade de ALT e FA, hipergamaglobulinemia 
moderada. Contudo, na forma branda da doença os valores séricos são encontrados 
dentro da normalidade (Irizarry- Rovira et al. 2001). 
 
 
Diagnóstico 
 
Apesar dos estudos realizados, pouco se sabe sobre a epidemiologia da doença 
em cães residentes no país. Além disso, à alta morbidade, causada pela babesiose, 
vem trazendo grande preocupação aos criadores de cães, tanto pelo aspecto afetivo, 
quanto pelo impacto negativo na comercialização dos animais (Ungar de Sá et al., 
2007). 
As formas de diagnóstico da babesiose canina incluem os achados clínicos, 
diagnóstico parasitológico, testes sorológicos e moleculares (O´Dwyer & Massard, 
2002). 
O diagnóstico definitivo da babesiose canina, bem como a diferenciação das 
espécies de piroplasmas pode ser difícil para os clínicos. Historicamente, o exame 
microscópico em esfregaço sanguíneo e a sorologia tornaram-se o principal meio de 
diagnóstico da babesiose em cães. 
O exame microscópico direto do esfregaço sanguíneo é o método 
convencionalmente empregado para o diagnóstico diferencial entre B. canis e B. 
gibsoni, tendo como base as características morfométricas de referência para cada 
espécie (Kjemtrup et al., 2006). Usualmente, o diagnóstico é feito de acordo com a 
aparência morfológica e o tamanho das formas intra eritrocitárias no esfregaço de 
 
 
sangue periférico. Entretanto, as parasitemias são normalmente muito baixas ou os 
parasitas não são detectados nos esfregaços sanguíneos, então o sorodiagnóstico é 
uma opção muito boa para estudos epidemiológicos. Contudo, há relatos de cães 
infectados por Babesia sp. em que os piroplasmas não foram visualizados ao exame 
microscópico e/ou em que a sorologia obteve resultado falso-negativo (Birkenheuer et 
al., 1999; Macintire et al., 2002). 
A sorologia e o exame microscópico em esfregaço sanguíneo além de resultarem 
muitas vezes em diagnósticos falso-negativos, não permitem a diferenciação entre sub-
espécies, para isso tem sido aplicada a metodologia com base em biologia molecular 
(Carret et al., 1999; Duarte et al., 2008). 
Métodos moleculares como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), 
apresenta maior sensibilidade e especificidade que a pesquisa em esfregaço sanguíneo 
para detectar a infecção por Babesia sp. no sangue periférico e pode diferenciar 
espécies morfologicamente que não são diferenciadas pelo método do esfregaço 
sanguíneo (Criado-Fornelio et al., 2003). 
A combinação da análise da sequência gênica à PCR pode aumentar as 
informações sobre sub-espécies, apresentando uma vantagem em estudos 
epidemiológicos com métodos moleculares (Inokuma et al., 2004). 
 
 
Tratamento 
 
O tratamento tem sido feito principalmente com derivados de diamidinas e 
imidocarb. Cães de áreas onde ocorrem a Babesia canis ou que viajam para áreas 
endêmicas podem ser tratados profilaticamente com imidocarb e doxiciclina (Urquhart et 
al, 1998). 
O imidocarb, por sua vez, é uma carbanilida, cuja ação baseia-se na alteração 
morfológica e funcional do núcleo e do citoplasma do parasito. Seu emprego no 
tratamento desta enfermidade é recomendado por alguns autores e desaconselhado 
por outros. Quando utilizado por longos períodos, os resíduos metabólicos deste 
fármaco são depositados no fígado e rim (Andrade & Santarém, 2002). 
 
 
O prognóstico é bom, porém muitos animais tratados permanecem como 
portadores da doença, podendo dessa forma ocorrer recidivas (Jones et al., 2000). 
O modo principal de prevenção é o controle do carrapato vetor, visto haver 
necessidade de pelo menos 3 dias para que ocorra a transmissão do parasita (Ettinger 
& Feldman, 1995). 
 
 
 
 
OBJETIVOS 
 
O presente trabalho teve por objetivos: 
 Verificar a ocorrência da infecção por Babesia sp. na região periurbana de 
Brasília (Fercal e Lago Oeste), Distrito Federal. 
 Identificar as sub-espécies de Babesia sp. que acometem os cães em 
região periurbana de Brasília. 
 Caracterizar as principais alterações hematológicas e bioquímicas dainfecção por Babesia sp. 
 Verificar a ocorrência de co-infecção de Babesia sp., com outros 
hemoparasitas como: Hepatozoon sp., Ehrlichia sp. e Leishmania sp.. 
 
 
 
 
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CAPÍTULO II 
 
 
ESTUDO DA INFECÇÃO POR BABESIA SPP. EM CÃES DA ÁREA 
PERIURBANA DE BRASÍLIA, DISTRITO FEDERAL 
 
 
INTRODUÇÃO 
 
A babesiose é uma hemoparasitose de distribuição mundial que acomete muitas 
espécies de mamíferos e é causada pela multiplicação intraeritrocitária de 
aplicomplexas do gênero Babesia. O sucesso da evolução deste parasita é atestado 
pelo grande número de espécies descritas (mais de 100 espécies, com algumas que 
ainda não foram descobertas e/ou descritas) (Hunfeld et al., 2008). 
O agente da doença é um protozoário da ordem Piroplasmidae, gênero Babesia 
e no cão são conhecidas duas espécies Babesia canis e Babesia gibsoni (Farwell et al., 
1982; Ristic, 1988). 
O diagnóstico da babesiose canina é usualmente baseado na presença de sinais 
clínicos tais como: apatia, febre, anorexia, perda de peso, palidez das mucosas; e 
histórico do paciente. A infecção por Babesia sp. é confirmada pela visualização do 
piroplasma no esfregaço sanguíneo (Dantas-Torres, 2008). 
O uso do diagnóstico molecular, principalmente a reação em cadeia da 
polimerase (PCR), aliado ao seqüenciamento genético, tem revelado grande 
diversidade genética dos piroplasmídeos (Criado-Fornelio et al., 2003). A PCR através 
da caracterização dos genes da unidade 18S do DNA, é capaz de identificar diferentes 
espécies e sub-espécies de Babesia spp. antes indistinguíveis, devido a similaridade 
 
 
morfológica dos parasitas (Birkenheuer et al., 2004; Duh et al., 2004; Matjila et al., 
2004; Sá et al., 2006). 
Estudos moleculares realizados no Brasil apontam Babesia canis vogeli (Passos 
et al., 2005; Sá et al., 2006) e Babesia gibsoni (Trapp et al., 2006) como sendo as 
espécies envolvidas na infecção da babesiose canina. São escassos os estudos 
relacionados à caracterização molecular destes piroplasmídeos nas diferentes regiões 
do Brasil. 
Os objetivos deste trabalho foram: avaliar a frequência de infecção por Babesia 
sp., as alterações hematológicas e bioquímicas de cães naturalmente infectados da 
região periurbana de Brasília (Fercal e Lago Oeste); Identificar as sub-espécies de 
Babesia sp. que acometem os cães nesta região, assim como verificar a ocorrência de 
co-infecção de Babesia sp. com outros hemoparasitas como: Hepatozoon sp., Ehrlichia 
sp. e Leishmania sp. 
 
 
MATERIAL E MÉTODOS 
Foram colhidas 187 amostras de sangue de cães oriundos da região periurbana 
de Brasília (Fercal e Lago Oeste), Distrito Federal. Foram incluídos nessa amostragem 
cães domésticos pertencentes a um grupo de risco para infecçãopor babesiose canina, 
ou seja, animais de qualquer idade, raça ou sexo, apresentando ou não sintomatologia 
de babesiose canina, e com presença de ectoparasitas. Dos animais analisados, 124 
cães eram residentes de domicílios na Fercal (Sobradinho II) e 63 cães pertenciam a 
um abrigo de cães, localizado no Lago Oeste. 
Todos os animais foram submetidos a exame físico para análise de coloração de 
mucosa oral, conjuntiva ocular e estado geral. 
 
Colheita de sangue e Análise Hematológica 
 
 
 
Foram colhidas amostras sanguíneas de todos os animais por punção da veia 
cefálica ou jugular e acondicionadas em tubos com e sem EDTA (ácido etilenodiamino 
tetra-acético), para realização do hemograma completo e testes bioquímicos para 
avaliar o perfil renal e hepático desses animais. Neste momento foram também 
preparados esfregaços sanguíneos da borda de orelha, que posteriormente foram 
corados com panótico rápido (Interlab®). 
No laboratório de Patologia Clínica do Hospital de Pequenos Animais da 
Universidade de Brasília (Hospital Veterinário - UnB), todas as amostras com EDTA 
foram processadas imediatamente para a realização de hemogramas completos. Com o 
auxílio de um contador semi-automático de células para uso veterinário (modelo CELM - 
CC550) foi determinado o número total de hemácias e leucócitos e a concentração de 
hemoglobina. O volume corpuscular médio (VCM), concentração de hemoglobina 
corpuscular média (CHCM) e hemoglobina corpuscular média (HCM) foram 
determinadas por cálculo padrão. O hematócrito (VG) foi determinado pela técnica do 
micro-hematócrito. As proteínas plasmáticas totais (PPT) foram determinadas com o 
auxílio do refratômetro. Foram preparados esfregaços de sangue total e capa de 
leucócitos corados com panótico e May Grunwald Giemsa (MGG) para a realização do 
diferencial leucocitário, observação morfológica das células sangüíneas e pesquisa de 
hemoparasitos. As plaquetas foram diluídas em solução de Brecher (oxalato de amônio 
a 1%) e a contagem foi realizada em câmara de Neubauer Improved®. 
 
Análise Bioquímica 
 
Para avaliação do perfil renal e hepático dos animais, foram colhidas amostras 
sanguíneas e acondicionadas em tubos sem anticoagulante. O soro foi obtido após a 
completa coagulação sanguínea, à temperatura ambiente. A seguir, as amostras foram 
centrifugadas a 3.000 rpm (rotações por minuto) por 10 minutos e o soro foi separado e 
armazenada em microtubos tipo eppendorf® . O soro foi utilizado para a determinação 
das concentrações séricas das proteínas totais (PT), albumina, globulinas, alanina 
aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), fosfatase alcalina (FA), 
uréia e creatinina. 
 
 
Foram utilizados kits bioquímicos específicos (Labtest®), seguindo 
recomendações do fabricante e a leitura foi realizada em um analisador bioquímico 
semi-automático (Bio2000 – Bioplus). 
 
 
 
 
 
Extração do DNA 
 
Após realização do hemograma, o restante das amostras com EDTA foi 
congelado para posterior extração do DNA e realização da reação de polimerização em 
cadeia (PCR). O DNA foi extraído, no laboratório de Microbiologia Molecular e 
Biotecnologia (MMB), com a utilização de kits comerciais (QIAamp DNA blood mini kit - 
Qiagen®), seguindo-se as recomendações do fabricante. As amostras de DNA foram 
mantidas a -20°C até o momento da realização da PCR. 
 
 
PCR 
 
Todas as reações foram realizadas no Laboratório de Microbiologia Molecular e 
Biotecnologia (MMB) da UnB. Foi utilizada a água destilada como controle negativo 
para verificar se houve a contaminação de qualquer reagente, assim como o sangue de 
cão susceptível e não infectado, para verificar a especificidade da reação; como 
controle positivo foi utilizado sangue de um animal infectado com visualização do 
piroplasma de Babesia sp. em esfregaço sanguíneo. As sequências de 
oligonucleotídeos utilizados neste trabalho podem ser verificadas na Tabela1. 
Todas as reações foram realizadas no mesmo termociclador (Biorad®). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabela 1. Sequências de oligonucleotídeos utilizados para PCR no referido trabalho. 
Primer Sequência (5´-3´) Reação utilizada 
455-479 F GTCTTGTAATTGGAATGATGGTGAC Babesia spp. 
793-772 R ATGCCCCCAACCGTTCCTATTA Babesia spp. 
BCV-F GTTCGAGTTTGCCATTCGTT B. canis vogeli 
BCR-F GCTTGGCGGTTTGTTGC B. canis rossi 
PIRO A AATACCCAATCCTGACACAGGG Babesia spp. 
PIRO B TTAAATACGAATGCCCCCAAC Babesia spp. 
GAPDH F CCTTCATTGACCTCAACTACAT Inibidores da PCR 
GAPDH R CCAAAGTTGTCATGGATGACC Inibidores da PCR 
DSB 370 F GATGATGTCTGAAGATATGAA ACA AAT Ehrlichia sp. 
DSB 729 R CTGCTCGTCTATTTACTTCTTAAAGT Ehrlichia sp. 
LFW CCTCTGGCTATAGGAAATTG Leishmania sp. 
LBW1 GGAGTGCTTAACGCGTTAG Leishmania sp. 
LBW2 CCG CCC CTATTT TAC ACC AAC CCC Leishmania sp. 
HEP F ATACATGAGCAAAATCTCAAC Hepatozoon sp. 
HEP R CTTATTATTCCATGCTGCAG Hepatozoon sp. 
 
 
 
Identificação das amostras positivas para Babesia sp. 
 
 
 
Para identificação de sequências específicas do gene 18S rRNA de Babesia sp. 
foram utilizados os oligonucleotídeos 455-479F e 793-772R, resultando em um produto 
de 340 pares de bases (pb), descritos por Birkenheuer et al. (2003). Foram adicionados 
os seguintes componentes a mistura da PCR: 12,5 pmoles de cada oligonucleotídeo, 
1X tampão da Taq polimerase (Invitrogen®), 2 mM MgCl2 (Invitrogen®), 0,2mM de dNTP 
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP - Invitrogen®), 0,8 U de Taq DNA polimerase (Taq platinum 
- Invitrogen®) e 5 µL de DNA de cada amostra, para um volume final de 25µL. As 
condições de amplificação utilizadas foram: desnaturação inicial a 95°C por 5 minutos, 
seguidos de 50 ciclos: 95ºC por 45 segundos, 58ºC por 45 segundos e 72ºC por 45 
segundos e extensão final a 72°C por 5 minutos. Produtos da PCR foram submetidos à 
eletroforese em gel de agarose 1,5%, corados com brometo de etídio e visualizados 
sob luz ultravioleta. 
 
Digestão Enzimática 
 
Das amostras positivas para Babesia sp. com os oligonucleotídeos 455-479F e 
793-772R, foi realizada uma segunda PCR utilizando-se os oligonucleotídeos PIRO A e 
PIRO B (Carret et al., 1999). Foram adicionados os seguintes componentes à mistura 
da PCR: 10pmol de cada oligonucleotídeo, 1X tampão da Taq polimerase (Invitrogen®), 
2,5mM de MgCl2 (Invitrogen®), 0,2mM de dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP - 
Invitrogen®), 0,8 U de Taq DNA polimerase (Taq platinum - Invitrogen®) e 2,0µL do 
DNA da amostra, para um volume final de 25µL. Os ciclos de amplificação foram: 
desnaturação inicial a 94°C por 5 minutos, seguidos por 30 ciclos repetitivos de 94ºC 
por 1 minuto, 55ºC por 1 minuto e 72ºC por minuto, e uma extensão final de 72ºC por 5 
minutos. Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1%, 
corados com brometo de etídio e visualizados em luz ultravioleta revelando um produto 
de 400pb. 
 Para caracterização molecular das amostras amplificadas com os 
oligonucleotídeos PIRO A e PIRO B, os produtos da PCR foram submetidos à digestão 
enzimática utilizando as enzimas Taq I e Hinf I (Solano-Gallego et al., 2008). O seguinte 
 
 
protocolo foi utilizado: 5 µl de produto amplificado da PCR foi utlilizado para digestão 
com 10U das enzimas Taq I e Hinf I, utilizando tampão apropriado de cada enzima, 
ajustados para um volume final de 15 µl. As misturas foram incubadas em banho Maria 
a 65ºC e 37°C, respectivamente, por 2 horas. Após término da incubação os produtos 
digeridos foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 2%, corados com brometo 
de etídio e visualizados em transiluminador ultravioleta. Os produtos digeridos foram 
analisados conforme Tabela 2. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabela 2: Resultados esperados dos tamanhos dos fragmentos de DNA (pb) na PCR e restrição 
enzimática utilizando as enzimas Taq I e Hinf I para cada espécie de Babesia. 
 
 
Espécies de 
Babesia 
Tamanho do 
fragmento de 
DNA (pb)-PCR 
PCR – Restrição enzimáticaCaracterísticas da 
restrição enzimática 
Taq I (pb) Hinf I (pb) 
B. canis canis 408 408 408 TaqI ( - ) Hinf ( - ) 
B. canis vogeli 407 20 + 175 + 210 407 TaqI ( + ) Hinf ( - ) 
B. canis rossi 408 408 175 + 230 TaqI ( - ) Hinf ( + ) 
B. gibsoni 406 406 200 + 205 TaqI ( - ) Hinf ( + ) 
Theilleria annae 440 50 + 390 70 + 370 TaqI ( + ) Hinf ( + ) 
*Solano-Gallego et al., 2008. (+) ocorre clivagem, ( - ) não ocorre clivagem 
 
 
Identificação das sub-espécies 
 
Para identificação das amostras positivas para B. canis vogeli e B. canis rossi, 
foram realizadas reações de PCR utilizando-se oligonucleotídeos específicos para os 
gene 18S rRNA da B. canis vogeli e B. canis rossi descritos por Birkenheuer et al.,2003. 
 
 
Para realização da PCR foram utilizados os seguintes reagentes: 12,5 pmoles de 
cada oligonucleotídeo, 1X tampão da Taq polimerase (Invitrogen®), 2 mM MgCl2 
(Invitrogen®), 0,2mM de dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP - Invitrogen®), 0,8 U de Taq 
DNA polimerase (Taq platinum - Invitrogen®) e 5 µL de DNA de cada amostra, para um 
volume final de 25µL. As condições de amplificação utilizadas foram: desnaturação 
inicial a 95°C por 5 minutos, seguidos de 50 ciclos: 95ºC por 45 segundos, 58ºC por 45 
segundos e 72ºC por 45 segundos e extensão final a 72°C por 5 minutos. Os produtos 
da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 2%, corados com brometo 
de etídio e visualizados sob luz ultravioleta resultando em um produto de 192pb (B. 
canis vogeli) e 197pb (B. canis rossi) nos animais positivos. 
 
 
 
 
Identificação de co-infecção dos animais positivos para Babesia spp., com 
Ehrlichia sp., Hepatozoon sp. e Leishmania sp. 
 
Todas as amostras positivas para Babesia spp., foram submetidas a análise 
através da PCR para diagnosticar possíveis co-infecções com outros hemoparasitas. 
 
Hepatozoon sp. 
 
Foram utilizados os oligonucleotídeos Hep-F e Hep-R (tabela 1), que anelam no 
gene 18S rRNA de Hepatozoon sp., resultando em um produto de 666 pb (Inokuma et 
al., 2002). Foram adicionados os seguintes componentes na mistura de PCR: 5 pmol de 
cada oligonucleotídeo, 1X tampão da Taq polimerase (Invitrogen®), 2,5mM de MgCl2 
(Invitrogen®), 0,4mM de dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP - Invitrogen®), 0,8 U de Taq 
DNA polimerase (Taq platinum - Invitrogen®) e 2,0µL do DNA da amostra, para um 
volume final de 25µL. Os ciclos de amplificação foram: desnaturação inicial a 95°C por 
5 minutos, 40 ciclos repetitivos de 30 segundos em 95ºC, 30 segundos em 52ºC e 90 
segundos em 72ºC, seguidos de 5 minutos de extensão final em 72ºC. Os produtos de 
 
 
PCR foram visualizados em gel de agarose a 1% corado com brometo de etídio, sendo 
fotografados em transluminador sob luz UV. 
 
Leishmania sp. 
 
Para Leishmania sp. foram utilizados 3 oligonucleotídeos (LFW e uma mistura de 
1:1 de oligonucleotídeos LBW1/LBW2) que anelam na origem de replicação de ambas 
as fitas da molécula do minicírculo de kDNA do parasita e amplifica uma região 
conservada de 120 pb (Disch et al., 2003). Foram adicionados os seguintes 
componentes na mistura de PCR: 13pmol de cada oligonucleotídeo, 1X tampão da Taq 
polimerase (Invitrogen®), 3,3mM de MgCl2 (Invitrogen®), 0,4mM de dNTP (dATP, dCTP, 
dGTP, dTTP - Invitrogen®), 1,2U de Taq DNA polimerase (Taq platinum - Invitrogen®) e 
2,0µL do DNA da amostra, em um volume final de 25µL. Os ciclos de amplificação 
foram: desnaturação inicial a 94°C por 5 minutos, 40 ciclos de amplificação 
(desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 63°C por 30 segundos, extensão 
a 72°C por 10 segundos) e extensão final a 72°C por 5 minutos. Produtos de PCR 
foram visualizados em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio, sendo 
fotografados em transluminador sob luz UV. 
 
Ehrlichia sp. 
 
Para verificar a ocorrência de co-infecção com Ehrlichia sp foram utilizados os 
oligonucleotídeos Dsb-330 e Dsb-728 que anelam no gene 16S rRNA e resultam em 
um produto de aproximadamente 400 pb (411-421pb dependendo da espécie) (Doyle et 
al., 2005). Foram adicionados os seguintes componentes na mistura de PCR: 10pmol 
de cada oligonucleotídeo, 1X tampão da Taq polimerase (Invitrogen®), 5mM de MgCl2 
(Invitrogen®), 0,4mM de dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP - Invitrogen®), 0,4U de Taq 
DNA polimerase (Taq platinum - Invitrogen®) e 5,0µL do DNA da amostra, em um 
volume final de 25µL. Os ciclos de amplificação foram: desnaturação inicial a 95°C por 
2 minutos, 50 ciclos de amplificação (desnaturação a 95°C por 15 segundos, 
anelamento a 58°C por 30segundos, extensão a 72°C por 30 segundos) e extensão 
 
 
final a 72°C por 5 minutos. Produtos de PCR foram visualizados em gel de agarose a 
1,5% corado com brometo de etídio, sendo fotografados em transluminador sob luz UV. 
 
Avaliação da qualidade do DNA das amostras utilizadas 
 
Para verificar a qualidade das amostras de DNA utilizadas foi realizado uma PCR 
para detectar a presença de inibidores da PCR em amostras de DNA que apresentaram 
resultados negativos na PCR. As amostras negativas na PCR foram submetidas a uma 
segunda reação, utilizando-se oligonucleotídeos específicos para o gene da enzima 
GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase) e resulta em um produto de 400pb. 
Foram adicionados os seguintes componentes na mistura de PCR: 10pmol de cada 
oligonucleotídeo, 1X de tampão da Taq polimerase (Invitrogen®), 2mM MgCl2, 0,2µl de 
dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP - Invitrogen®), 0,8U de Taq DNA polymerase (Taq 
platinum - Invitrogen®) e 2,0µl do DNA da amostra, em um volume total de 25µl. Os 
ciclos de amplificação foram: desnaturação inicial a 95°C por 5 minutos, 40 ciclos de 
amplificação (desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 52°C por 1 minuto, 
extensão a 72°C por 1 minuto) e extensão final a 72°C por 5 minutos. Os produtos da 
PCR foram visualizados em gel de agarose a 1,5% corado com brometo de etídio, 
sendo fotografados em transluminador sob luz UV. 
 
Análise Estatística 
 
Para análise estatística, as amostras foram separadas primeiramente em animais 
positivos e negativos para a infecção por Babesia spp., de acordo com as localidades 
(Fercal e Lago Oeste) e em uma segunda análise estes grupos foram separados nas 
mesmas categorias, sem considerar a localidade (Fercal e Lago Oeste). 
Após a identificação das co-infecções, os animais foram divididos em três 
grupos: G1, grupo dos animais positivos somente para Babesia spp., sem co-infecções 
com Ehrlichia sp., Hepatozoon sp., e Leishmania sp.; G2, grupo dos animais positivos 
para Babesia spp. apresentando co-infecções, com Ehrlichia sp., Hepatozoon sp.e 
Leishmania sp. e G3, grupo dos animais negativos para Babesia sp. Estes grupos 
 
 
foram separados por localidade (Fercal e Lago Oeste) e em uma segunda análise foram 
agrupados seguindo as mesmas categorias anteriores, sem considerar o efeito local. 
As variáveis, VG, número de hemácias, VCM, CHCM, número de 
leucócitos, bastonetes, segmentados, linfócitos, monócitos, eosinófilos, 
basófilos, PPT, número de plaquetas, ALT, AST, FA, uréia, creatinina, proteína total 
sérica, albumina, globulina, razão A/G foram comparados, 
nos diferentes grupos (positivos e negativos e G1 e G2 e G3), por meio do PROC GLM, 
utilizando-se o teste de Duncan, com intervalo de confiança de 95%.
 
 
 
RESULTADOS 
 
Foram utilizadas 187 amostras de sangue de cães, sem raça definida, 
independente do sexo e idade. Destes animais, 124 pertenciam a região da Fercal e 63 
a um abrigo de cães no Lago Oeste. 
Na pesquisa de hemoparasitas nos esfregaços sanguíneos dos animais da 
Fercal foram encontradas 3 amostras no positivas no esfregaço sanguíneo (2,41%) 
para Babesia spp. (Figura 1), enquanto que no Lago Oeste nenhuma amostra positiva 
foi encontrada. Nas amostras positivas da Fercal os piroplasmas foram visualizados 
tanto nos esfregaços sanguíneos quanto nas bordas de orelha, contudonos esfregaços 
sanguíneos foram visualizados poucos piroplasmas, indicando baixa parasitemia. 
 
Figura 1. Babesia spp. em eritrócito de cão (aumento de 100X-coloração panótico). 
 
 
Na PCR, quando se utilizou os oligonucleotídeos 455-479-F e 793-772-R foram 
observados produtos no tamanho de 340 pb, conforme o local de anelamento destes 
oligonucleotídeos no gene 18S rRNA da Babesia spp. (Figura 2). Para confirmar a 
especifidade da reação, uma amostra foi enviada para o sequenciamento genético e a 
sequência de bases obtida foi comparada com aquelas de outros genes no Genbank 
utilizando-se o programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) disponível em 
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, resultando em 99% de similaridade com vários genótipos 
de Babesia canis. 
 
 
 
Figura 2. Resultado da PCR para o gênero Babesia sp., utlizando os oligonucleotídeos 455-479-F e 
793-772-R. Legenda: 1: marcador de peso molecular (100pb ,Invitrogen ®); 2: controle negativo 
(água); 3 a 7: animais positivos e 8: animal negativo. Gel de agarose a 1,5% (p/v) corado com 
brometo de etídeo a 0,01% (p/v). 
 
 
Os resultados dos animais positivos e negativos em ambos os locais estão 
apresentados na Tabela 3. Todos os animais positivos no esfregaço sanguíneo foram 
positivos também na PCR. 
 
 
 
Tabela 3. Porcentagem de animais positivos e negativos na PCR para o gênero Babesia spp. 
(oligonucleotídeo 455-479-F e 793-772-R) por local estudado (Fercal e Lago Oeste). 
 
 
Animais 
Fercal Lago Oeste 
Número/Total % Número/Total % 
 
Positivos 
 
21/124 
 
16,93 
 
22/63 
 
34,92 
Negativos 103/124 83,07 41/63 65,08 
 
 
 
Conforme pode ser observado na Tabela 4, a PCR se mostrou quatorze vezes 
mais sensível que a pesquisa de hemoparasita no esfregaço sanguíneo. 
 
 
 
 
Tabela 4. Número total e porcentagem de animais positivos para Babesia spp no esfregaço 
sanguíneo, borda de orelha e na PCR na região da Fercal e no abrigo do Lago Oeste. 
 
Técnica Animais positivos/Total de 
animais estudados 
% 
Esfregaço Sanguíneo 3/187 1,60 
Borda de orelha 3/187 1,60 
PCR 43/187 22,99 
 
 
 
As co-infecções observadas nos animais positivos estão apresentadas na Tabela 
5 e Figuras 3, 4 e 5. 
 
 
 
Tabela 5. Co-infecções dos animais positivos para Babesia spp. 
 
 
Co-infecções 
Fercal Lago Oeste 
Número/Total % Número/Total % 
 
Leishmania spp. 
 
15/21 
 
71,42 
 
11/22 
 
50,00 
Hepatozoon sp. 3/21 14,28 16/22 72,72 
Ehrlichia sp. 4/21 19,04 14/22 63,63 
 
 
 
 
 
Figura 3. Gel resultante da eletroforese da PCR para o gênero Hepatozoon sp. utilizando os 
oligonucleotídeos Hep-F e Hep-R. Legenda: 1: marcador de peso molecular (100pb, Invitrogen ®); 
2: controle positivo; 3: controle negativo (água); 4: animal positivo e 5: animal negativo. Gel de 
agarose a 1% corado com brometo de etídeo a 0,01% (p/v). 
 
 
 
 
Figura 4. Resultado da PCR para o gênero Ehrlichia sp. utlizando os oligonucleotídeos DSB 330 e 
DSB 728 em amostras de sangue total. Legenda: 1: marcador de peso molecular (100 pb, 
Invitrogen ®); 2: controle negativo(água); 3 e 4: animais negativos; 5, 6: animais positivos; 7: 
controle positivo. Gel de agarose a 1,5% (p/v) corado com brometo de etídeo a 0,01% (p/v). 
 
 
 
 
Figura 2. Resultado da PCR para o gênero Leishmania sp. utilizando-se os oligonucleotídeos LFW 
e LBW1 e 2. Legenda: 1: marcador de peso molecular (100pb, Invitrogen ®); 2: controle negativo 
(água) 3: controle positivo; 4 e 5: animais positivos. Gel de agarose 2% (p/v) corado com brometo 
de etídeo a 0.01% (p/v). 
 
 
Todas as amostras dos cães que foram positivas (43) com o primeiro conjunto de 
oligonucleotídeos utilizado (455-479-F e 793-772-R) também foram positivas com o 
segundo conjunto de oligonucleotídeos (PIRO A e PIRO B). 
Os produtos resultantes da PCR utilizando-se os oligonucleotídeos PIRO A e 
PIRO B (Figura 6), do Lago Oeste e Fercal, submetidos à digestão enzimática com as 
enzimas Taq I e Hinf I foram digeridos em dois sítios diferentes, resultando em 
fragmentos de produtos de 175 pb e 210 pb , para enzima Taq I e em um fragmento de 
407 pb para a enzima Hinf I (Figura 7), conforme o esperado para Babesia canis vogeli; 
enquanto que cinco amostras apresentaram um padrão de digestão enzimática 
diferente, apresentando produtos de 408 pb para a enzima Taq I e produtos de 175 pb 
e 230 pb para a enzima Hinf I (Figura 8), conforme esperado para Babesia canis rossi. 
 
 
 
 
 
Figura 3. Resultado da PCR para o gênero Babesia sp. utlizando-se os oligonucleotídeos PIRO A e 
PIRO B. Legenda: 1: marcador de peso molecular (100pb, Invitrogen ®); 2: controle positivo; 
3,4,5,6,7: animais positivos; 8: controle negativo (água). Gel de agarose a 1% (p/v) corado com 
brometo de etídeo a 0,01% (p/v). 
 
 
 
Figura 7. Resultado da digestão enzimática com as enzimas Taq I e Hinf I, dos produtos da PCR 
(oligonucleotídeos 445-479-F e 793-772-R). Legenda: Superior: Digestão enzimática com a enzima 
Taq I, 1: marcador de peso molecular (100pb, Invitrogen ®); 2: controle positivo para Babesia 
canis vogeli 3,4,5,6 e 7: animais positivos para digestão enzimática. Inferior: Digestão enzimática 
negativa para a enzima Hinf I, 1A: marcador de peso molecular (100pb, Invitrogen ®); 2A: controle 
 
 
positivo; 3A,4A,5A,6A e 7A: animais positivos para Babesia canis vogeli. Gel de agarose a 2% (p/v) 
corado com brometo de etídeo a 0,01% (p/v). 
 
 
 
 
Figura 8. Resultado da digestão enzimática com as enzimas Taq I e Hinf I, dos produtos da PCR 
(oligonucleotídeos 445-479-F e 793-772-R). Legenda: Á esquerda, digestão enzimática negativa 
para enzima Taq I, 1: marcador de peso molecular (100pb, Invitrogen ®); 2,3,e 4: amostras 
negativas para enzima Taq I. À direita, digestão enzimática positiva com a enzima Hinf I, 1: 
marcador de peso molecular (100pb, Invitrogen ®); 2,3 e 4: amostras positivas para a enzima Hinf 
I, compatível com o diagnóstico de Babesia canis rossi. Gel de agarose a 2% (p/v) corado com 
brometo de etídeo a 0,01% (p/v). 
 
 
 
As amostras positivas para B. canis vogeli na digestão enzimática, foram 
confirmadas em uma nova PCR utilizando oligonucleotídeos específicos (BCV-F e 793-
772-R), assim como as amostras positivas para B. canis rossi na digestão enzimática, 
foram confirmadas através de uma nova PCR utilizando oligonucleotídeos específicos 
(BCR-F e 793-772-R), conforme Figura 9. 
 
 
 
 
 
Figura 9. Resultado da PCR para o gênero Babesia spp., B. canis vogeli e B. canis rossi utlizando-
se os oligonucleotídeos 445-479-F e 793-772-R, BCV-F e 793-772-R, BCR-F e793-772-R, 
respectivamente. Legenda: 1: controle negativo (água); 2: Amostra positiva para Babesia spp.; 3: 
amostra positiva para B. canis vogeli; 4: amostra positiva para B. canis rossi; 5: marcador de peso 
molecular (100pb, Invitrogen ®); Gel de agarose a 2% (p/v) corado com brometo de etídeo a 0,01% 
(p/v). 
 
 
Todas as amostras negativas para Babesia spp. que foram testadas com os 
oligonucleotídeos GAPDH-F e GAPDH-R, que amplificam uma parte do gene da enzima 
gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, apresentaram uma banda de 400 pb, indicando 
êxito nas extrações de DNA (Figura 10). 
 
 
 
 
 
Figura 10. Resultado da PCR para o gene da enzima GAPDH, utilizando os oligonucleotídeos 
GAPDH-F e GAPDH-R. Legenda: 1: controle positivo; 2: controle negativo (água); 3 a 7: animais 
positivos; 8:Ladder 100pb (Invitrogen ®). Gel de agarose a 1,5%(p/v) corado com brometo de 
etídeo a 0,01% (p/v). 
 
Os resultados das análises estatísticas dos hemogramas e análises bioquímicas 
dos animais negativos e positivos estão apresentados na Tabela 6. 
 
Tabela 6. Análise estatística dos hemogramas completos e das bioquímicas séricas de todos os 
animais positivos e negativos para Babesia spp. da Fercal e Lago Oeste. 
 POSXNEG Média R2 Coef. de 
variação 
Valores de 
Referência 
Grupo Local Grupo 
x 
Local 
H
em
og
ra
m
a 
VG (%)