Recombinação VDJ - Imunidade Adaptativa

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Imunologia - Danilo Diôgo 
Resposta Imune Adaptativa/ Receptores Clonais: Recombinação/ Geração de diversidade 
Revisão 
Especificidade a mínima especificidade de um receptor pelo antígeno, mas existem afinidades 
diferentes, pela capacidade de conexão. A afinidade vai aumentando. 
 
Durante a ontogenia de células B, a junção do complexo μ, das cadeias substituas e cadeias 
acessórias Igα e Igβ, formam o pré-BCR. Os pré linfócitos B se proliferam inicialmente em formas 
de células pré-B grandes. Então elas param a expressão gênica da cadeia leve substituta e 
podem originar várias células pré-B pequenas, em repouso, que não se dividem e expressam uma 
cadeia pesada μ intracelularmente. Cada uma dessas células pré-B pequenas têm a capacidade 
de iniciar o rearranjo da cadeia leve e assim são originados vários clones com múltiplas 
especificidades e diversidades de BCRs. 
 
Desenvolvimento/Amadurecimento Linfocitário 
Nos órgãos Linfóides primários: MO (células B) e Timo (células T) 
 
Sequência de Eventos 
 
● Comprometimento dos progenitores em linhagem linfóide B ou T 
● Distribuição dos progenitores aos locais de amadurecimento nos órgãos linfóides primários 
● O rearranjo sequencial e ordenado dos genes dos receptores de Ag 
● Ocorrência de eventos de seleção para eliminar (1) células B ou T que não expressam 
receptores de Ags funcionais e (2) células B ou T auto reativas 
● Para linfócitos B: edição do receptor 
● Para linfócitos T: eventos epigenéticos para expressão de CD4 ou CD8 modificações da 
cromatina (silenciamento de CD4 ou CD8: estado inacessível) 
● Migração das células B ou T virgens para a periferia onde serão educadas pela imunidade 
inata 
 
 
Cada clone de linfócito B ou T apresenta uma única especificidade 
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Especificidade ​- capacidade de se ligar 
Maior ​afinidade​ é o que tem melhor especificidade. 
 
As pessoas possuem bilhões de anticorpos, que são muito importantes para o sistema imune. 
Para gerar esses bilhões de proteínas (anticorpos) com múltiplas especificidades deveriam existir 
bilhões de genes então, como elas são geradas se temos somente cerca de 20 mil genes 
diferentes no corpo humano? 
Isso é possível pela recombinação gênica V(D)J 
 
Organização dos ​loci ​de Igs humanas 
Os genes das Igs estão em componentes em diferentes cromossomos do organismo, que se 
juntam num processo chamado recombinação 
 
A região variável de uma cadeia leve é codificado por dois seguimentos de DNA separados: 
● Segmento gênico V ou Variável ​- 
○ maior parte; 
○ Existem, em média, 45 genes diferentes de porção variável 
 
● Segmento gênico J ou Junção 
A junção de V com J cria um éxon que codifica toda a região V da cadeia leve. A região J está 
separado da região C, logo, passa pelo processamento do RNA após a transcrição para uní-los. 
● Existem 6 genes diferentes de Junção 
 
Cadeia Pesada 
Codificada por 3 segmentos gênicos: 
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● Vh​ - existem cerca de 45 genes 
● Jh - ​até 10 genes. 
● Segmento de diversidade ou seguimento D (Dh), ​entre Vh e Jh. - aprox. 26 genes 
existentes 
Também existem os genes que vão gerar a cadeia constante, como a primeira cadeia μ (mi) que 
originará a IgM. 
 
Existem 9 genes diferentes para as ​porções Constantes ​Cμ, Cδ, Cγ3, Cγ1, Cα1, Cγ2, Cγ4, Cε1, 
Cα2. É o que define o isotipo das Igs. 
 
Dh se junta ao seguimento Jh, e então o seguimento Vh se liga ao 
DJh, produzindo um éxon completo da região Vh. O processamento 
do RNA junta as sequências reunidas da região V às sequências 
que codificam a região C vizinha. 
 
Existem 2 tipos de cadeias de imunoglobulinas - ​as cadeias 
pesadas e 2 cadeias leves, equivalente as cadeias ​κ ​e ​λ. 
 
Os segmentos gênicos que codificam ​κ e λ ​e a cadeia pesada, estão 
em​ 3 ​loci ​genéticos, ​em cromossomos diferentes. 
 
 
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Orientação do rearranjo (resumo) 
Com a cadeia leve: 
● Não tem o segmento D. 
● Só faz um round de recombinação somática; 
● Ocorre a recombinação de V e J 
● Gera o Transcrito primário 
● splicing ​retira região não codificadora 
● Gera o transcrito final que será traduzido para originar o receptor final 
 
 
Começando com a cadeia pesada: 
● O primeiro rearranjo/recombinação gênica se dá entre o segmento D e J, havendo a 
junção. 
● As regiões intrónicas entre esses segmentos, são removidos por enzimas do complexo 
RAGs. 
● Segmento DJ, agora unido. 
● A remoção da região intrônica entre V e DJ. Criando o segmento VDJ. 
● A cadeia constante C e segmentos recombinados (VDJ), podem ser agora transcritos. 
● Esse transcrito primário sofre ​splicing ​para retirar partes não codificantes 
● É gerado o transcrito final, que será traduzido para dar origem ao receptor final 
 
 
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Regiões Hipervariáveis das Igs: Diferentes Especificidades 
● CDR3 é a de maior variabilidade. 
● Pois CDR1 e CDR2 se encontram no segmento V. 
● Já CDR3 é fruto da união entre V e J ou J. Gera uma maior diversidade nessa região, 
quando comparada às outras. 
 
 
 
 
Os rearranjos de DNA são orientados por sequências de DNA não codificadas e conservadas, são 
as chamadas ​-Sequências sinais de recombinação (RSSs); 
● RSS contém um bloco de 7 nucleotídeos (​heptâmero)​, sempre contínuo a sequência 
codificadora. 
● RSS é seguido por um ​espaçador ​- região não conservada, que possui 12 ou 23 pares de 
bases (pb) 
● O ​espaçador ​é seguido por um seguido por um bloco conservado de 9 nucleotídeos 
(​nonâmero) 
● essa sequência ​heptâmero-espaçador-nonâmero - a RSS - ​é diretamente adjacente a 
sequência codificadora de V, D ou J. 
 
Um segmento gênico associado a um espaçador de 12 pb, só poderá se unir a um gene 
flanqueado por um espaçador RSS de 23 pb. É a ​Regra 12/23​. 
Assim, um segmento Dh pode se unir a um Jh, e Vh a um Dh. Mas Vh não podem se unir 
diretamente entre si, pois ambos são flanqueados por espaçadores de 12 pb. 
 
 
 
 
 
 
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Na cadeia leve. 
● A recombinação é dependente da 
presença Segmentos Sinais de Reconhecimento 
(RSS); 
● Proteínas Rag-1+ Rag-2, reconhecem 
especificamente essas RSS e alinham as duas 
RSS. 
● Ocorre a recombinação de V e J que são 
reconhecidas aleatoriamente 
● A RAG junta esses segmentos gênicos 
para serem combinados, fazendo uma espécie 
de “dobra” que os aproxima. 
● Elas clivam o DNA, exatamente na junção 
desses segmentos com o RSS. 
● Essa clivagem cria um grampo de DNA no 
final do segmentos gênicos da região 
codificadora. 
● As extremidades cegas são unidas por 
uma DNA-ligase e se soltam do complexo, 
formando a “junção sinalizadora” 
● A extremidade do DNA contendo os grampos são unidos pela Ku - que forma um anel ao 
redor do DNA e se associa a enzimas catalíticas DNA-PKcs (proteína kinase dependente 
de DNA). 
● A enzima ​Arthemis ​é uma nuclease que abre esse grampo cortando apenas uma das ffitas 
de DNA, esse corte pode ser em pontos aleatórios ao longo do grampo, o que gera 
variabilidade. 
● A enzima linfóide específica ​TdT​, é recrutada e adiciona nucleotídeos ao acaso as 
extremidades da fita simples. 
● Os ​nucleotídeos P são adicionados complementarmente na sequência codificadora da fita 
simples, no local onde foi clivado. 
● Os ​nucleotídeos N ​são adicionados nas extremidades, antes de serem religados. As 
enzimas de reparo retiram qualquer base não pareada. 
●Por fim, a ​DNA-ligase IV ​liga as extremidades processadas, reconstituindo o cromossomo 
que possui os genes rearranjados. 
 
Na cadeia pesada 
● Ocorre a recombinação entre DJ, que depois se recombina com V. 
● Quando isso for ocorrer, o segmento DJ é “puxado” e fica de cabeça para baixo para se 
conectar ao segmento V. 
● Dessa forma, pode haver o pareamento entre as regiões das RSS. 
● Formando esse “grampo”. 
● As RAG identificam as RSS e clivam essas sequências, deixando apenas um pequeno 
“grampo de cabelo (​hairpin​)”, conectado ao segmento V e D. 
● Outras enzimas vão clivar esse “grampo” e TdT pode se ligar adicionando P e N 
nucleotídeos. 
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● Essa clivagem do grampo permite que a reorganização desses segmentos numa estrutura 
que possa ser traduzida. 
 
 
 
P nucleotídeos e N nucleotídeos 
Quando o sítio de 
clivagem do grampo é 
clivado, de forma 
aleatória, são abertos 
diversos quadros abertos 
de leitura. 
 
Isso, em geral, não gera 
quadros complementares 
entre as os grampos 
clivados. 
 
Outras enzimas do 
complexos (Tdt) elas 
adicionam ​nucleotídeos 
P​, de forma 
complementar. 
Além disso, há adição 
aleatória dos 
nucleotídeos N. 
Essas adições aleatórias está relacionada com a incrível variabilidade dos TCR/BCR que podem 
ser transcritos. 
 
● Diversidade Combinatória ⇉​ É a combinação dos diversos genes, dado as suas 
possibilidades pelos números que são expressos no genoma 
● Diversidade Juncional ⇉ ​É a adição aleatória de nucleotídeos, que vão gerar uma 
série de possibilidades proteicas 
 
Enzimas envolvidas na recombinação V(D)J 
● União das duas RSSs ocorre quando proteínas reconhecem o comprimento do espaçador, 
seguindo a regra 12/23, para recombinação. 
● A molécula do DNA é clivada em dois locais e religada em outra conformação. 
● As extremidades do heptâmero são unidos para formar a ​junção sinalizadora. 
● Se tiverem mesma orientação, essa junção de forma circular, fora do cromossomo. 
● O segmentos V e J, que permanecem no cromossomo, se unem e formam a junção 
codificadora. 
 
Complexo de enzimas para gerar a recombinação somática, é denominado ​Recombinase V(D)J. 
● RAG-1 e RAG-2 
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● São codificadas por genes ativadores de recombinação (RAGs, do inglês 
recombination-activating genes​) 
● RAG-1 e RAG-2 reconhecem e alinham as duas RSSs que são os alvos da reação de 
clivagem. 
● RAG-1 reconhece o nonamero da RSS e cliva as duas fitas simples de DNA, e é criado um 
“grampo” de DNA no final ao segmento gênico da região codificadora. 
● Enzimas de reparo do DNA do complexo modificam os grampos abertos, removendo 
nucleotídeos e adicionando nucleotídeos ao acaso. 
● Adição/deleção sem ordem = aumento da diversidade 
 
Mutações em RAG1 ou RAG2 resultam em atividade parcial da recombinase V(D)J, causando 
uma doença hereditária chamada ​síndrome de Omenn​. Causa ausência de linfócitos B 
circulantes e infiltração cutânea de linfócitos T ativados. 
 
 
Organização dos loci de TCRs humanos 
Existem ​TCRs alfa-beta​ e TCRs gama delta. 
 
● 
● A cadeia beta, é tipo as pesadas do BCR. V​β, Dβ e Jβ. 
● A cadeia alfa, é tipo a leve, somente com Vα e Jα, sem cadeia D. 
 
Cadeias do tipo β e δ ⇉ V D J 
Cadeias do tipo α e γ ⇉ V J 
 
Cadeia do tipo β 
● locus está localizado no cromossomo 7 
● Possuem porções V, D e J 
 
● Porção V (variável) 
● Vβ1,... Vβn são genes das porções variáveis da Cadeia β 
○ Existem, em média, 50 genes diferentes de porção variável 
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○ Esses genes são espaçados por íntrons (que não serão codificados), de cerca de 
2.000kb 
 
● Porção D (diversidade) 
○ Dβ são genes das porções diversidade da Cadeia β 
○ Existem 2 genes diferentes de Diversidade 
 
●​ Porção J (junção) 
○ Jβ são genes das porções junção da Cadeia β 
○ Existem 6 genes diferentes de Junção em Jβ1 e 6 genes 
em Jβ2 
 
● Existem 2 genes diferentes para as porções Constantes 
○ Cβ1 e Cβ2 
 
Cadeia do tipo α 
● locus está localizado no cromossomo 14 
● Possuem porções V e J 
 
● Porção V (variável) 
○ Vα1,... Vαn são genes das porções variáveis da Cadeia α 
■ Existem, em média, 45 genes diferentes de porção variável 
■ Esses genes são espaçados por íntrons (que não serão codificados), de cerca de 
2.000kb 
 
● Porção J (junção) 
○ Jα são genes das porções junção da Cadeia α 
○ Existem 50 genes diferentes de Junção 
● Existem 1 gene para a porção Constante 
○ Cα 
 
A recombinação da cadeia ​β ​por meio de V, D e J, é similar a cadeia pesada dos BCR. 
Os segmentos gênicos são flanqueados por espaçadores de 12 e 23 pb das RSSs e são 
reconhecidos pelas mesmas enzimas. Primeiro se recombina DJ, depois VDJ. Uma vez 
recombinados, é gerado uma estrutura que será transcrita. Um processo de ​Splicing retira as 
regiões não codificantes. Chegando no produto final da cadeia beta. 
 
A recombinação da cadeia ​alfa ​por meio de V e J 
Haverá a recombinação de VJ, sendo transcrito numa região não codificadora que é removida por 
splicing. Ocorre a união de VJ com a cadeia constante, gerando a cadeia alfa, dos receptores 
TCR. 
 
A maior variabilidade se encontra do CDR3 (alças de hipervariabilidade). CDR1 e CDR2 estão 
mais periféricos e se encontram no segmentos gênicos V. Enquanto CDR3 é mais central e está 
nos segmentos D e J. 
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Como CDR1 e CDR2 são mais periféricos e menos variáveis, farão mais contato com a molécula 
de MHC. Já o CDR3, mais central e altamente variável, farão mais o reconhecimento com o 
peptídeo antigênico. 
 
 
Mudança de Isotipo: na periferia durante as respostas imunológica 
● A função das imunoglobulinas depende de sua cadeia constante. 
● Todas as classes de imunoglobulinas produzidas por um clone de células B possuem a 
mesma região V básica. 
● Inicialmente as células B virgens utilizam somentes dois genes Cμ (C mi) e Cδ (C delta), 
expressando então, ou cadeia Mi ou cadeia delta, que formam IgM ou IgD, 
respectivamente. 
● Por isso IgM e IgD são as primeiras a serem formadas. 
● Durante a resposta dos anticorpos, por ocorrer a ​troca de classe. 
● IgG, IgE e IgA só são expressos após mudança de isotipo que ocorrem nos órgãos 
linfóides periféricos. 
 
 
● Os segmentos VDJ da cadeia pesada que já sofreram recombinação, estão upstream (quer 
dizer anteriormente ao local de transcrição) aos genes que codificam as subunidades da 
cadeia constante, mi, delta, gama... (olhe a imagem acima). 
● A expressão de IgD e IgM é regulada pela processamento de RNA (splicing) que origina as 
cadeias pesadas. 
● A troca de isotipo ocorre quando IgM está ‘quebrando’ um galho, mas o IgG (ou outro) é a 
melhor resposta. 
● Ela é dependente de células T auxiliares, que produzem citocinas para o início do processo 
e a presença de um ligante. 
● Os genes que codificam os outros isotipos ​(C gama, C alfa....), estão localizados após a 
região do IgM e IgD. 
● Quando a especificidade está boa mas outro isotipo é melhor na resposta, os linfócitos B 
recebem sinais (citocinas e IFN-y) que sinalizam a alteração da porção FC. 
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● Esses sinais ativam vias de sinalização que leva a retirada de segmentos gênicos 
aproximando outros segmentos que estavam após Cμ e Cδ, para perto de VDJ. 
● Agora é possível que a transcrição (​splicing) se inicie com a mesma região variável VDJ, 
mas com diferente parte constante. 
 
 
 
 
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