Relatório 1 - Coloração de Gram e etc

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA
CAMPUS AVANÇADO GOVERNADOR VALADARES
INSTITUTO CIÊNCIAS DA VIDA
DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA
PRÁTICA 1: Apresentação do laboratório de microbiologia, técnica
asséptica, preparo de meios de cultura, esterilização, desinfecção, cultivo da
microbiota normal e técnica de coloração de Gram.
ANA CAROLINA RODRIGUES
JANETE HIGINO ALVES
LETÍCIA GUEDES MORAIS GONZAGA DE SOUZA
LUCAS FERREIRA ESCALA
THAIS DAIANE DE MORAIS SOUZA
GOVERNADOR VALADARES,
2022
1. INTRODUÇÃO
Preparo de meios de cultura / Técnica asséptica / Esterilização / Desinfecção / Cultivo da
microbiota normal
Para o crescimento de microrganismos em laboratório é necessário a oferta de
nutrientes, e isto é possível através do meio de cultura. É importante que o meio de cultura
contenha os nutrientes adequados para o microrganismo de interesse. A água e o pH são
fatores importantes que interferem no crescimento microbiano, portanto, devem estar em
quantidade suficiente e apropriado, respectivamente. A fim de garantir a esterilidade do meio
de cultura, a técnicas assépticas como a esterilização e a desinfecção devem ser empregadas
no preparo do meio. Deve-se atentar também a temperatura de incubação, pois, este é outro
fator que pode afetar o crescimento do microrganismo (TORTORA, FUNKE, CASE, 2012).
Técnica de coloração de Gram
O método de coloração de Gram é o mais empregado no diagnóstico presumível ou
confirmatório nos casos de suspeita de infecção bacteriana. Trata-se de uma técnica simples,
rápida e de custo baixo, considerando sua importância na triagem de pacientes. Desde de seu
surgimento, em 1884, o teste de Gram passou por modificações que resultaram numa técnica
mais segura e com melhor capacidade de diferenciar bactérias (TORTORA, FUNKE, CASE,
2012).
2. OBJETIVOS
O objetivo da aula prática foi preparar meios de cultura, com emprego de técnicas
assépticas, e cultivar microbiota normal.
3. MATERIAIS E METODOLOGIA
3.1. MATERIAIS
3.1.1. Água deionizada;
3.1.2. Alça bacteriológica;
3.1.3. Álcool 70°GL;
3.1.4. Algodão;
3.1.5. Autoclave;
3.1.6. Balança;
3.1.7. Bastão de vidro;
3.1.8. Bateria para coloração de Gram (cristal violeta, lugol, solução de
álcool-cetona e safranina ou fucsina);
3.1.9. Erlenmeyer;
3.1.10. Lâminas de vidro;
3.1.11. Lamparina;
3.1.12. Luvas para procedimentos e para material quente;
3.1.13. Meio de cultura (Ágar sangue, TSA ou Mueller-Hinton);
3.1.14. Microscópio óptico;
3.1.15. Óleo de imersão;
3.1.16. pHmetro;
3.1.17. Pipeta de Pasteur;
3.1.18. Placas de Petri;
3.1.19. Seringas com agulha;
3.1.20. Soluções de KOH e de HCl;
3.1.21. Swabs;
3.1.22. Tubos contendo anticoagulante Citrato.
3.2. METODOLOGIA
A partir do rótulo do frasco do TSA, fez-se o preparo do meio de cultura em ágar TSA
e ágar sangue. Realizou-se a técnica asséptica, como limpeza de bancadas e desinfecção.
Após secagem dos meios de cultura preparados, semeou-se, com o auxílio de swabs, o
material de diferentes sítios anatômicos nas placas de ágar TSA. Decorridos sete dias, fez-se
a coloração Gram dos microrganismos crescidos. Para tal, preparou-se o esfregaço na lâmina
e deixou-se secar. Em seguida, fixou-se pelo calor, passando a lâmina três vezes na chama da
lamparina. Adicionou-se o cristal violeta ao esfregaço durante dois minutos e lavou-se com
água. Posteriormente, adicionou-se o lugol e deixou-se por dois minutos, descorando-o em
seguida com álcool-cetona entre dez a 20 segundos. Lavou-se com água e adicionou-se um
contracorante ao esfregaço, safranina ou fucsina, durante um minuto. Lavou-se com água,
aguardou-se a secagem. Após, fez a leitura do esfregaço em microscópio com objetiva de
100x em imersão.
4. RESULTADOS
Ao final dos setes dias decorridos da realização dos inóculos de diferentes partes
anatômicas, pode-se observar o crescimento de microrganismos por toda placa sobre o meio
de cultura, através da formação de colônias.
Inicialmente, realizou-se uma análise macroscópica, observando-se os tamanhos das
colônias, bem como, aspectos e quantidade. Nas imagens abaixo, nota-se as colônias obtidas
pelos integrantes do grupo. Destaca-se que a grande maioria se encontra em tamanho
mediano com aspecto cintilante e brilhante, ainda, identificou-se a presença de algumas
colônias com cores: amarelo, rosa claro e esverdeada.
Figura 1. Amostra: Couro Cabeludo/Mão - Thais
Figura 2. Amostra: Unha/Cabelo - Janete
Figura 3. Amostra: Boca/Couro Cabeludo - Ana
Figura 4. Amostra: Unha/Nariz - Letícia
Figura 5. Amostra: Barba/Orelha - Lucas
Posteriormente à análise macroscópica, preparou-se lâminas coradas com Gram para
assim, dar início à análise microscópica das colônias. Após a obtenção de um campo bom e
limpo para visualização, determinou-se o tipo de bactéria presente na colônia selecionada.
Para a maior parte dos integrantes deste grupo, observou-se a presença de cocos gram
positivos, alguns apresentados em forma de filas ou filamentos e outros em formatos de
cachos. Destaca-se que em uma das placas, identificou-se tanto na análise macroscópica,
quanto na microscópica a presença de fungos, provavelmente provenientes de uma micose de
unha de uma das integrantes.
Figura 6. Microscopia - Barba
Figuras 7 e 8. Microscopia - Boca e Couro Cabeludo
Visando confirmar o tipo de microrganismo presente nessas placas, realizou-se ainda,
o teste de catalase, onde adicionou-se pequenas quantidades de uma colônia em uma gota de
H2O2 (Água Oxigenada 10 volumes) e observou-se uma reação de bolhas ou fervura,
indicando que a colônia é positiva para estafilococos. Em seguida, realizou-se o teste da
coagulase, a fim de determinar a espécie desse microrganismos presente nas amostra, assim,
adicionou-se uma gota plasma de coelho ressuspenso em água à uma porção de colônia,
observando-se uma aglomeração do microrganismo, sendo sinal de positivo, para
Staphylococcus aureus.
5. CONCLUSÃO
A execução desta prática nos proporcionou a aprendizagem de preparo de meios de cultura
seguindo técnicas assépticas, bem como a inoculação de micro-organismos nestes,
aprendemos também como é feita a coloração de Gram, nos possibilitou a visualização da
morfologia dos micro-organismos e o conhecimento de testes confirmatórios para
determinados tipos de bactérias, e todos esses procedimentos foram de grande valia para nós,
pois são técnicas que fazem parte da rotina laboratorial.
6. QUESTIONÁRIO
1. Observar e descrever as diferentes formas bacterianas e a sua disposição.
R.: Nas lâminas preparadas foram observadas estruturas em formato de esferas, coradas de
azul após o processo de coloração de Gram, indicando presença de cocos Gram-positivos.
Este grupo de microrganismos são frequentemente encontrados em amostras biológicas de
seres humanos e em situações de desequilíbrio no organismo podem ser patológicas, mesmo
aquelas que fazem parte da microbiota residente do paciente, como exemplo, o gênero
Staphylococcus, bastante conhecido na clínica.
As bactérias Gram-positivas podem se apresentar em dois formatos diferentes: cocos
ou bacilos, sendo que os cocos podem ser divididos em duas famílias: Micrococaceae e
Streptococaceae. Ao observar a disposição dos cocos nas lâminas, é possível dizer que fazem
parte da família Micrococaceae, gênero Staphylococcus, confirmado pelo teste adicional da
catalase, que foi positivo.
2. Desenhar as formas encontradas.
Esquema representativo de estafilococos - cocos Gram positivos visto em microscópio
3. Descrever o princípio e a importância prática do método de coloração de Gram.
R.: A coloração de Gram trata-se de uma técnica utilizada para diferenciar bactérias a partir
da morfologia e das diferentes colorações obtidas mediante adição dos agentes químicos
específicos do método (violeta de genciana, lugol, etanol-acetona e fucsina). Essa diferença
de coloração se dá devido à estrutura da parede celular do microrganismo. Dessa forma, a
técnica em questão é capaz de dividir as bactériasem dois grupos: Gram positivo (que se
coram de azul) e Gram negativo (que se coram de vermelho).
Cada agente químico possui sua função. Primeiramente, é adicionado o corante violeta de
genciana e em sequência o lugol, que é um fixador. Neste momento, todas as bactérias
presentes absorvem o corante e se coram de azul, porém, ao adicionar o etanol (solvente
orgânico) a membrana das bactérias Gram negativas se dissolvem, uma vez que a camada de
peptidoglicano é mais fina, e consequentemente ocorre a saída do complexo violeta-iodo e ao
adicionar o corante secundário fucsina (coloração avermelhada), se coram de vermelho. Em
contrapartida, as Gram positivas permanecem azuis, já que o etanol não dissolve a membrana
e não remove o complexo anterior.
É possível dizer que a técnica de coloração de Gram é bastante utilizada na prática clínica
devido sua acessibilidade e possui grande importância no monitoramento de pacientes com
suspeita de infecção bacteriana, uma vez que as culturas necessitam de um tempo de
incubação maior para crescimento e avaliação dos agentes, ocasionando um atraso no
tratamento. Ao realizar o Gram, com esfregaços de fluidos orgânicos / outros, é possível
iniciar um tratamento prévio até que o resultado da cultura seja obtido para determinar o
tratamento mais adequado.
REFERÊNCIAS
BRASIL. Ministério da Saúde. Técnica de coloração de Gram. Brasília. 2001. Disponível
em: <https://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/115_03gram.pdf>. Acesso em: 06 jan.
2022.
LABORCLIN. Coloração de Gram. 2018. Disponível em:
<https://www.laborclin.com.br/wp-content/uploads/2019/05/coloracao_de_gram_620520_62
0521_620181_621000_620511_620511_621218_621219_620515.pdf>. Acesso em: 06 jan.
2022.
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 10ª ed. Porto Alegre:
Artmed, 2012.
https://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/115_03gram.pdf