Aula _ Transcrição em procariotos e eucariotos

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SÍNTESE DE RNA
Processo de transcrição
TRANSCRIÇÃO EM PROCARITOS
SÍNTESE DE RNA – TRANSCRIÇÃO - procariotos
Transcrição é o processo pelo qual uma molécula de RNA é sintetizada a partir de um molde de DNA. 
Através da transcrição, são sintetizados todos os tipos de RNAs da célula.
Os RNA são divididos em duas classes:
3
As classes de RNAs – duas classes:
Informação genética - o RNA mensageiro (mRNA) 
RNA funcionais:
 
 o RNA ribossômico (rRNA)
 o RNA transportador (tRNA)
 RNAs nucleares (snRNA) – processa dos transcritos nas células eucarióticas
 Micro RNA ( miRNA) – papel na regulação da quantidade de proteínas eucarióticas produzidas
 RNA interferência (siRNA) – se liga ao mRNA, silenciando-o. Em plantas, praticamente qualquer gene pode ser desligado dessa maneira
RNA longos não codificantes (Inc RNA) são importantes na regulação da expressão gênica e na inibição de elementos de transposição
Fonte: Zaha, A.  Ferreira, H B. Biologia Molecular Básica. ed. Armed
A presença de operons é típica de genomas de procariotos, e o número de operons em um genoma.
O número de operons varia de espécie para espécie
Ribozima – é o termo usado para a molécula de RNA que possui a capacidade de catalisar reações biológicas. 
A RNA polimerase:
 - São enzimas que catalisam a síntese de RNA tendo como molde uma fita de DNA. Esse processo é chamado de transcrição.
 - São moléculas complexas formadas por múltiplas cadeias polipeptídicas
Capaz de iniciar uma nova cadeia de RNA
Não precisa de um iniciador (primer)
Em procariotos há uma RNA polimerase
Em eucariotos há 3 tipos de RNA polimerase
Transcrição em procariotos – E. coli
- O processo de transcrição é baseado na complementariedade de bases. 
A síntese do RNA ocorre dentro de uma bolha de transcrição (+/- 18 pb) que são temporariamente aberta durante a síntese
É principalmente durante a transcrição que a célula exerce o controle da expressão gênica. 
O processo de transcrição é regulado por proteínas.
Núcleo (core ou cerne) da enzima

’





Fator sigma
RNA polimerase de procariotos
O núcleo ou cerne enzimático da RNA polimerase de E. coli, contém quatro tipos de subunidade , alfa () que está duplicada, beta (), beta’ (’) e ômega ()
A holoenzima completa:
 - Núcleo (cerne ou core) da enzima + fator sigma () responsável para reconhecer o local de início da transcrição
O complexo (2  ’ )é definido como o complexo central (núcleo, core ou cerne) das bacRNAPs. Esse complexo plenamente funcional é denominado holoenzima.
 - Na maioria dos casos, o principal ponto de regulação da atividade de um gene é a decisão de iniciar ou não a sua transcrição. 
 - Dependendo da necessidade da célula, o mesmo gene pode ser transcrito incontáveis vezes até que a demanda seja suprida. 
Mecanismos de transcrição:
 - A transcrição ocorre a partir da informação contida na seqüência de nucleotídeos de uma molécula de DNA fita dupla
 - Sempre no sentido 5'  3’. 
- Apenas uma das fitas do DNA, chamada de fita molde, é utilizada durante a síntese, que segue as mesmas regras de complementaridade e antiparalelismo, exceto pelo pareamento de uracil (U), ao invés de timina (T), com adenina (A). 
A fita de DNA molde ou anti-senso é a 3'  5’
 A outra fita de DNA (5'  3') que tem a seqüência idêntica ao do RNA transcrito, exceto por T (timina) no lugar do U (uracila) é chamada de fita codificadora ou senso. 
5'
5'
3'
3'
Molde ou anti-senso
Codificadora ou senso
A enzima responsável pela transcrição é a RNA-polimerase (RNAP). 
As RNAPs desempenham todas as atividades necessárias para a transcrição:
1) reconhecem e ligam-se a sequências específicas de DNA;
2) desnaturam o DNA, expondo a seqüência de nucleotídeos a ser copiada;
3) mantêm as fitas de DNA separadas na região de síntese;
4) mantêm estável o duplex DNA:RNA na região de síntese;
5) restauram o DNA na região imediatamente posterior à da síntese; e
6) sozinhas ou com auxílio de proteínas específicas, terminam a síntese do RNA.
O primeiro nucleotídeo da sequência do DNA, copiado no RNA, é denominado sítio de início da transcrição e demarcado como +1
O primeiro par de bases do segmento de DNA que será transcrito é chamado de sítio de início e recebe o valor +1. 
Sequências anteriores ao sítio de início são chamadas upstream (montante) sendo que as bases progridem negativamente (-1, -2, -3...) a partir do +1.
Sequências localizadas após o sítio de início são chamadas dowstream (jusante), e progridem positivamente (+2, +3, +4...).
As sequencias específicas na molécula de DNA, que determinam o local de formação dos complexos e iniciam a transcrição, são denominadas promotores.
A região promotora em E. coli se estende entre as posições -70 e +30. Em um promotor há 4 características conservadas mostradas na figura a seguir:
ATCCG TTGACA TA......AGTGT...TAAATT GTGC TATAAT GGTGTGCTC A GTCA
TAGGC AACTGT AT.......TCACA...ATTTAA CACG ATATTA CCAGACGAG T CAGT
+1
-10
-35
Região promotora de E. coli.
As sequências reguladoras da transcrição podem ser divididas em dois tipos: promotores e elementos reforçadores (enhancers). 
Os promotores para transcrição no DNA:
A região –10 recebe, também, as denominações TATA box ou Pribnow box, sequencia consenso (TATAAT)
Sequencia -35 Sequencia de nucleotídeos consenso (5’ TTGACA3’)
Fonte: Zaha, A.  Ferreira, H B. Biologia Molecular Básica. ed. Armed
Processo de transcrição tem 3 fases:
1 – Início
2 – Alongamento
3 - Terminação
Iniciação:
1- O fator  reconhece a região promotora
2- E o restante da holoenzima (cerne ou núcleo) se une ao fator  ( formação do complexo). O cerne é responsável pela transcrição. 
Fonte: Griffiths, A.J.F. et al. Introdução à genética ed. Guanabara
3- O DNA dupla fita é aberto, formando a bolha de transcrição. A abertura da fita é exatamente na região –10, pois é rica em AT ( AT é mais fácil de ser rompida, por ter 2 ligações de hidrogênio). 
Fonte: Griffiths, A.J.F. et al. Introdução à genética ed. Guanabara
Alongamento:
4- Com o desligamento do fator sígma do complexo termina a fase abortiva permitindo que a RNAP comece a se deslocar pela fita de DNA para sintetizar a fita de RNA.
Fonte: Griffiths, A.J.F. et al. Introdução à genética ed. Guanabara
Um duplex híbrido DNA-RNA forma-se dentro da bolha à medida que o RNA é sintetizado. 
Os erros na seqüência da cadeia produzidos nesta etapa são cuidadosamente corrigidos pela RNA polimerase (função de correção de erro).
A bolha é fechada atrás de si, após ter usado a fita de DNA como molde para a transcrição. 
 Terminação:
Muito pouco se conhece sobre o término da transcrição, mas em E. coli há 2 tipos de término do da transcrição: terminação independente de rho () ou a dependente de rho ().
 
Na terminação independente de rho (), que ocorre em 90% dos casos, sabe-se que a RNAP terminam a síntese em regiões consenso. Neste tipo de terminação, existe uma seqüência invertida repetida seguida por uma seqüência de adeninas (A) na fita molde. 
Terminação independente de rho () 
A região assimétrica permite ao RNA nascente formar uma estrutura de alça (grampo de terminação) que ocasiona uma longa pausa no alongamento da cadeia.
Na região da alça há uma desestabilização no híbrido DNA-RNA. 
O desligamento do RNA do sistema provoca uma ruptura do complexo de transcrição e as fitas de DNA são renaturadas novamente.
Fonte: Griffiths, A.J.F. et al. Introdução à genética ed. Guanabara
Fonte: Griffiths, A.J.F. et al. Introdução à genética ed. Guanabara
Terminação dependente de rho ().
Esta proteína na presença de ATP se liga ao RNA nascente simples fita, percorrendo a fita de RNA até encontrar o ponto de término, desestabilizando o híbrido DNA:RNA, separando o RNA e terminando assim a transcrição.
Fonte: Berg. J.H; Tyinoczko, J.L; Stryer , l. Bioquímica. Editora: Guanabara
OBS: 
Nos procariotos a transcrição e a tradução são acopladas. 
Imediatamenteapós a liberação das primeiras regiões do RNA sintetizado na bolha de transcrição, os ribossomos se ligam a ele e iniciam a síntese de proteínas.
Fonte: Berg. J.H; Tyinoczko, J.L; Stryer , l. Bioquímica. Editora: Guanabara
TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS
Os organismos eucariotos possuem núcleo e citoplasma
A transcrição ocorre no núcleo das células
As sequencias reguladoras ou codificadoras de genes de eucariotos, em geral, possuem estruturas mais complexas que as de genes procarióticos
Portanto, tem maior complexidade determina refinamentos funcionais que explicam, pelo menos em parte, o maior grau de sofisticação de células e organismos eucarióticos.
Promotores eucarióticos
Os promotores eucarióticos são variados no que diz respeito ao número e os tipos de sequencia consenso que podem ocorrer em cada um deles.
OBS: Não são todos os promotores eucarióticos que contém o TATA box
Fonte: Zaha, A.  Ferreira, H B. Biologia Molecular Básica. ed. Armed
Modelo esquemático de organização de um promotor de eucariotos
Fonte: Zaha, A.  Ferreira, H B. Biologia Molecular Básica. ed. Armed
Modelo esquemático de organização de um promotor de eucariotos
As porções dos genes envolvidas na regulação transcricional são constituídas por duas regiões distintas, o promotor principal e as regiões regulatórias (enhancer, silenciador, ativador).
Enhancers - são promotores distais ou reforçadores ou acentuadores e podem estimular a transcrição em pontos de início a milhares de bases de distância.
Região de sítio de início - +1 ou IT
Inc – iniciador
TSS – sítio de término
Nos organismos eucarióticos definir as sequencias comuns aos diferentes promotores é mais complexa devido a maior diversidade de genes;
Maior complexidade no processo de controle da expressão devido a diversidade dos organismos eucarióticos (mamíferos, plantas, insetos, fungos entre outros)
Existe 3 RNAs polimerases que atuam na transcrição de classes diferentes de RNA.
É mais complexa que a RNAP procariótica, sendo formada por 12 subunidades, sendo que algumas subunidades são comuns entre elas.
Os RNAs das células eucarióticas são sintetizados por 3 tipos de RNA polimerase.
 - RNA polimerase I – sintetiza 3 tipos de RNAr (28S, 18S, 5,8S)
 RNA polimerase II – Transcreve o mRNA , precursores de microRNA e IncRNA
 RNA polimerase III – Sintetiza o RNAr 5S, tRNA e uma grande variedade snRNA
RNA polimerase eucariótica
A RNA polimerase de eucarioto precisa de fatores de transcrição ou fatores gerais de transcrição (GTFs) para se ligar na região promotora.
O papel do GTFs é de atrair a RNA polimerase e posicioná-la no local correto onde deverá iniciar a transcrição.
Os GTFs ( TFIIA, TFIIB, TFIIF...) unidos à RNA polimerase constituem o chamado complexo de pré-iniciação (complexo multiproteico).
Fonte: Griffiths, A.J.F. et al. Introdução à genética ed. Guanabara
Fonte: Griffiths, A.J.F. et al. Introdução à genética ed. Guanabara
A RNA polimerase II possui uma calda proteica chamada de CTD ( calda carboxi –terminal) localizada no local onde emerge o RNA recém- sintetizado.
A calda CTD – é muito importante para outra fase deste processo, como síntese e amadurecimento do mRNA 
O alongamento ocorre dentro da bolha de transcrição.
O RNA recém-formado de eucariotos precisa ser processado antes de ser traduzido
O processamento inclui:
1 – Adição do revestimento CAP na posição 5’ do transcrito, ou seja, o cap consiste em uma 7-metilguanosina ligada ao transcrito por 3 grupos fosfato.
 CAP possui 2 funções:
 - Proteger o RNA da degradação
 - CAP é necessário será necessário para o processo de tradução
Fonte: Griffiths, A.J.F. et al. Introdução à genética ed. Guanabara
Splincing (recomposição) do RNA 
Essas codificações que ocorrem no RNA primário são chamadas do co-transcricionais, pois ocorrem imediatamente e simultaneamente à transcrição do mRNA
Remoção dos íntrons – os íntrons são removidos do transcrito primário ainda enquanto o RNA ainda está sendo transcrito e após o cap ter sido adicionado .
Os íntrons devem ser removidos com precisão e os éxons corretamente unidos.
Para o splincing ou reposição é necessária a atuação da porção CTD da RNA polimerase com ribonucleotídeos nucleares ( snRNP ) formados por 5 snRNA (RNAs nucleares (U1, U2, U4, U5 e U6) e proteínas que fazem parte do spliceossomo.
Fonte: Griffiths, A.J.F. et al. Introdução à genética ed. Guanabara
Há nucleotídeos conservados que participam dos splicing GU na 5’ e AG na 3’.
Sítio de ramificação que é a A (adenina) entre 15 45 nucleotídeo antes do sítio de corte 
Fonte: Griffiths, A.J.F. et al. Introdução à genética ed. Guanabara
Fonte: Watson, J. D, et al. Biologia Molecular do gene. Editora; Artmed.
Através da atividade de ribozima dos snRNA, o spliceossomo cliva (quebra) a extremidade do íntron formando um laço;
Um íntron é removido por meio de duas reações sucessivas de transesterificação
Fonte: Griffiths, A.J.F. et al. Introdução à genética ed. Guanabara
O alongamento do RNA continua até seja reconhecida uma sequencia AAUAAA ou AUUAAA perto da ponta 3’, por uma enzima que corta o RNA aproximadamente 20 bases depois.
É adicionado a essa ponta 3’ aproximadamente de 150 a 200 nucleotídeo Adenina (A) que é chamada de calda poli A (poliadenilação).
Fonte: Berg. J.H; Tyinoczko, J.L; Stryer , l. Bioquímica. Editora: Guanabara
Fonte: Berg. J.H; Tyinoczko, J.L; Stryer , l. Bioquímica. Editora: Guanabara
A transcrição ocorre no núcleo das células
A síntese de proteínas ocorre no citoplasma das células
Splicing (recomposição alternativa)
É estimado 21.000 genes nos seres humanos , porém temos números maiores de proteínas , isso indica que um gene pode codificar a informação genética para mais de uma proteína.
Esse mesmo transcrito primário pode ter splicing (recomposição) alternativo, produzindo assim mRNA diferentes, ou seja, com combinações de éxons diferentes e consequentemente proteínas diferentes.
Em plantas a recomposição é rara
Em humanos 70% dos genes são recompostos de maneira alternativa.. Geralmente as proteínas produzidas por esse processo alternativo, são relacionadas, ou seja, geralmente são subgrupos dos mesmos éxons do transcrito primário, e são usadas em tipos diferentes de células ou em estágio diferentes do desenvolvimento.