Livro Texto - Unidade I MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLINICA UNIP

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Autor: Prof. Flávio Buratti Gonçalves
Colaborador: Prof. Luiz Henrique Cruz de Mello
Microbiologia e 
Micologia Clínica
Professor conteudista: Flávio Buratti Gonçalves
Biomédico graduado pela Universidade de Mogi das Cruzes (1996), especialista em Diagnóstico Laboratorial de 
Doenças Tropicais pela FMUSP, especialista em Acupuntura Tradicional Chinesa, mestre em Saúde Pública pela Faculdade 
de Saúde Pública da USP (2000). Doutor em Patologia Ambiental e Experimental pela UNIP (2017). Habilitações nas 
áreas de Análises Clínicas, Microbiologia, Imunologia, Parasitologia, Saúde Pública e Acupuntura. Atualmente, é 
coordenador do curso de Biomedicina na modalidade semipresencial e docente da UNIP nas áreas de Microbiologia, 
Imunologia, Parasitologia, Bioquímica. Linhas de pesquisa: Patologia Ambiental e Experimental (Neuroimunopatologia), 
Microbiologia e Imunologia. É membro do Banco de Avaliadores (Basis) do Inep.
© Todos os direitos reservados. Nenhuma parte desta obra pode ser reproduzida ou transmitida por qualquer forma e/ou 
quaisquer meios (eletrônico, incluindo fotocópia e gravação) ou arquivada em qualquer sistema ou banco de dados sem 
permissão escrita da Universidade Paulista.
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
G635m Gonçalves, Flavio Buratti.
Microbiologia e Micologia Clínica / Flavio Buratti Gonçalves. – 
São Paulo: Editora Sol, 2021.
168 p., il.
Nota: este volume está publicado nos Cadernos de Estudos e 
Pesquisas da UNIP, Série Didática, ISSN 1517-9230.
1. Identificação. 2. Cultura. 3. Técnica. I. Título.
CDU 576.8
U512.65 – 21
Prof. Dr. João Carlos Di Genio
Reitor
Prof. Fábio Romeu de Carvalho
Vice-Reitor de Planejamento, Administração e Finanças
Profa. Melânia Dalla Torre
Vice-Reitora de Unidades Universitárias
Profa. Dra. Marília Ancona-Lopez
Vice-Reitora de Pós-Graduação e Pesquisa
Profa. Dra. Marília Ancona-Lopez
Vice-Reitora de Graduação
Unip Interativa – EaD
Profa. Elisabete Brihy 
Prof. Marcello Vannini
Prof. Dr. Luiz Felipe Scabar
Prof. Ivan Daliberto Frugoli
 Material Didático – EaD
 Comissão editorial: 
 Dra. Angélica L. Carlini (UNIP)
 Dr. Ivan Dias da Motta (CESUMAR)
 Dra. Kátia Mosorov Alonso (UFMT)
 Apoio:
 Profa. Cláudia Regina Baptista – EaD
 Profa. Deise Alcantara Carreiro – Comissão de Qualificação e Avaliação de Cursos
 Projeto gráfico:
 Prof. Alexandre Ponzetto
 Revisão:
 Bruno Barros
 Vera Saad
Sumário
Microbiologia e Micologia Clínica
 
APRESENTAÇÃO ......................................................................................................................................................7
INTRODUÇÃO ...........................................................................................................................................................7
 
Unidade I
1 INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA CLÍNICA ..............................................................................................9
1.1 Considerações gerais sobre a microbiologia no laboratório de análises 
clínicas – principais equipamentos e níveis de biossegurança ....................................................9
1.2 Principais métodos de coloração, meios de cultura e técnicas de 
semeadura aplicados na prática da microbiologia ........................................................................ 18
1.3 Automação no laboratório de microbiologia clínica ............................................................. 28
1.4 Introdução à coleta de material biológico para prática em 
microbiologia clínica .................................................................................................................................. 31
1.5 Resistência bacteriana aos antimicrobianos e microrganismos multirresistentes – 
condutas do laboratório de microbiologia clínica em infecções hospitalares.................... 35
2 IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM-POSITIVOS, NEISSERIAS E BACTÉRIAS ANAERÓBIAS ......................41
2.1 Identificação presuntiva dos estafilococos ................................................................................ 41
2.2 Identificação presuntiva dos estreptococos ............................................................................. 44
2.3 Identificação presuntiva de Neisserias ........................................................................................ 48
2.4 Identificação presuntiva de bactérias anaeróbias................................................................... 50
3 IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS; BACILOS GRAM-NEGATIVOS 
NÃO FERMENTADORES E BACILOS CURVOS (ESPIRALADOS) ........................................................... 55
3.1 Identificação presuntiva de enterobactérias ........................................................................... 55
3.2 Identificação presuntiva de bacilos Gram-negativos não fermentadores .................... 62
3.3 Identificação presuntiva de bacilos curvos (espiralados) ..................................................... 65
4 PROTOCOLOS ESPECIAIS NO DIAGNÓSTICO EM BACTERIOLOGIA CLÍNICA ............................. 67
4.1 Urocultura ............................................................................................................................................... 67
4.1.1 Tipos de amostra ..................................................................................................................................... 68
4.1.2 Procedimento ........................................................................................................................................... 69
4.1.3 Laminocultivo (sistema comercial) .................................................................................................. 72
4.2 Coprocultura .......................................................................................................................................... 73
4.2.1 Procedimento ........................................................................................................................................... 75
4.3 Hemocultura........................................................................................................................................... 77
4.3.1 Procedimento ........................................................................................................................................... 79
4.4 Culturas de secreções e feridas ...................................................................................................... 82
4.4.1 Cultura de secreção prostática, vaginal, cervical e uretral .................................................... 82
4.4.2 Cultura de secreções de oro e nasofaringe .................................................................................. 85
4.4.3 Cultura de escarro .................................................................................................................................. 86
4.4.4 Cultura de aspirado traqueal, lavado bronco alveolar (BAL) e escovado brônquico ...87
4.4.5 Cultura de secreção ocular e de ouvido ........................................................................................ 88
4.5 Cultura de ponta de catéter ............................................................................................................ 89
4.6 Culturas de liquor e de líquidos especiais ................................................................................. 91
4.6.1 Processamento da amostra e análise dos resultados da cultura de LCR ......................... 92
4.6.2 Coleta, processamento e análise da cultura de fluidos biológicos ..................................... 93
Unidade II
5 MICOLOGIA CLÍNICA ..................................................................................................................................... 99
5.1 Importância clinica dos fungos e aspectos fisiopatológicos gerais................................. 99
5.2 Características gerais das micoses .............................................................................................1035.2.1 Micoses superficiais e cutâneas .....................................................................................................103
5.2.2 Micoses subcutâneas ...........................................................................................................................105
5.2.3 Micoses sistêmicas ..............................................................................................................................105
5.2.4 Micoses oportunistas .........................................................................................................................107
5.3 Aspectos gerais do diagnóstico micológico ...........................................................................110
6 TÉCNICAS E PROTOCOLOS PARA ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS 
LEVEDURIFORMES E FILAMENTOSOS .......................................................................................................115
6.1 Identificação de fungos leveduriformes ...................................................................................115
6.2 Identificação de fungos filamentosos ......................................................................................118
6.3 Métodos moleculares e alternativos para identificação de 
fungos patogênicos .................................................................................................................................119
Unidade III
7 VIROLOGIA CLÍNICA .....................................................................................................................................125
7.1 Principais doenças virais de importância clínica .................................................................125
7.2 Prevenção de doenças virais – vacinas e drogas antivirais ...............................................134
8 DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES VIRAIS ..................................................................................................137
8.1 Técnicas clássicas em virologia .....................................................................................................138
8.2 Técnicas moleculares em virologia ..............................................................................................141
8.3 Técnicas imunosorológicas aplicadas em virologia .............................................................144
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APRESENTAÇÃO
Objetiva-se, com este livro-texto, apresentar os principais tópicos que norteiam a microbiologia clínica 
por meio do estudo da bacteriologia, micologia e virologia. O livro-texto apresenta as principais doenças 
de etiologia bacteriana, fúngica e viral, as principais formas de prevenção, tratamento e diagnóstico. São 
apresentados, também, os principais equipamentos utilizados em laboratório de microbiologia clínica 
e automação em microbiologia clínica. São vistos os conceitos básicos de biossegurança e conceitos 
importantes de infecção hospitalar e de como elas podem ser classificadas e identificadas. Discute-se, 
ainda, a problemática da resistência microbiana aos antibióticos, antifúngicos e antivirais. Objetiva-se, 
também, abordar de forma minuciosa os principais protocolos e métodos utilizados em microbiologia 
clínica para o diagnóstico das doenças de etiologia infecciosa, como urocultura, coprocultura, 
hemocultura, cultura de secreções, entre outras.
Serão abordados exemplos de infecções e de como proceder para a identificação do agente 
causal associado a partir de fluxogramas e sequências didáticas que irão favorecer uma conduta 
assertiva e eficaz. Também serão vistas, mais a fundo, as principais técnicas utilizadas no diagnóstico 
micológico e virológico, nesse caso, incluindo técnicas clássicas e as mais atuais relacionadas ao 
diagnóstico imunológico e de biologia molecular.
INTRODUÇÃO
Neste livro-texto, estudaremos os principais tópicos relacionados ao estudo da bacteriologia, 
micologia e virologia clínica, reconhecendo as formas como ocorre o desenvolvimento das principais 
doenças de origens bacterianas, fúngicas e virais, suas formas de prevenção, tratamento e de diagnóstico.
Este livro-texto destina-se a servir como instrumento da aprendizagem para os estudantes da área 
da saúde por meio de uma visão ampla da microbiologia clínica, buscando ser atrativo e didático.
Os conteúdos selecionados buscam atender de forma objetiva, clara e concisa os conceitos mais 
relevantes da patologia geral, patologia específica e da anatomia patológica. Com esse aprendizado, o 
estudante adquire as habilidades e competências necessárias à formação do biomédico, estando apto a 
reconhecer as alterações do estado de saúde, reconhecer e interpretar a evolução das doenças e elaborar 
um plano preventivo, além de propostas terapêuticas e de diagnóstico.
Bons estudos!
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MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Unidade I
1 INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA CLÍNICA
1.1 Considerações gerais sobre a microbiologia no laboratório de análises 
clínicas – principais equipamentos e níveis de biossegurança 
O laboratório é um espaço físico com parâmetros ambientais controlados, equipado com diversos 
instrumentos de medição que permitem a correta medida ou análise das grandezas físicas. Nele, 
realizam-se os procedimentos experimentais, cálculos, medições, análises químicas, físicas ou biológicas 
e demais funções que exijam controle e precisão alcançáveis apenas em ambiente planejado para tal. 
O objetivo do laboratório de microbiologia não é apenas apontar o responsável por um determinado 
estado infeccioso, mas, sim, indicar, através do monitoramento de populações microbianas, qual o perfil 
dos microrganismos que estão interagindo com o homem. Com essas informações, a equipe de saúde 
é capaz de definir quais microrganismos podem ser responsáveis pelo quadro clínico do paciente e, 
assim, propor um tratamento mais adequado. No entanto, para alcançar esses objetivos, os laboratórios 
de microbiologia devem possuir estrutura capaz de estabelecer informações sobre a melhor amostra 
biológica, reconhecer a microbiota normal e os contaminantes, identificar microrganismos cujo 
tratamento beneficia o paciente, identificar microrganismos com propósitos epidemiológicos, obter 
resultados rápidos em casos de emergência, racionalizar no uso de antimicrobianos, realizar o transporte 
rápido das amostras e o relato dos resultados e manter uma educação médica contínua em relação aos 
aspectos da infecção hospitalar.
Entre os equipamentos e vidrarias mais utilizados na prática da microbiologia clínica destacam-se: 
• Autoclave: é o equipamento responsável pela esterilização a partir do calor úmido, em que, 
através do vapor, promove a desnaturação de proteínas dos microrganismos. O equipamento 
consiste em uma câmara de vapor, com a temperatura de ebulição em torno de 121 °C. A autoclave 
é um equipamento indispensável ao laboratório de microbiologia, na esterilização de meios de 
cultura, água, suspensões, entre outros. O tempo de autoclavagem deve ser respeitado de acordo 
com o material a ser esterilizado. O equipamento deve ser aberto com cautela, quando a pressão 
chegar a zero, pois o vapor liberado é de alta temperatura. Recomenda-se a utilização de luvas de 
amianto para abrir a autoclave. 
• Estufas de esterilização (fornos de Pasteur): esse equipamento é utilizado para esterilização a 
seco, a temperatura de 170-200 °C por 1-2 horas, recomendado o uso para as vidrarias.
• Refrigerador: após o preparo de meio de culturas, para garantir a conservação dos microrganismos, 
recomenda-se deixá-los sob baixa temperatura.
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Unidade I
Figura 1 – Autoclave 
Disponível em: https://bit.ly/3y36m6a. Acesso em: 28 jun. 2021.
• Estufa bacteriológica: auxilia no crescimento dos microrganismos devido à incubação ser em 
temperatura ideal.
• Mesa agitadora (rumbeira): auxilia no crescimento de microrganismos aeróbios, pois a mesa 
agitadora, através dos movimentos rotatórios, dissolve o oxigênio do meio de cultura.
• Capela de fluxo laminar: câmara asséptica, dotada de exaustore lâmpada fluorescente, utilizada 
na repicagem de microrganismos.
• Fermentador: equipamento no qual ocorrem as fermentações, podendo ser dotado de sistemas 
de agitação, aeração e refrigeração.
• Placa de Petri: utilizado para o isolamento de fungos e bactérias, pois a placa de petri tem 
uma superfície de crescimento grande e possibilita o crescimento de diversos microrganismos na 
mesma placa.
Figura 2 – Placa de Petri
Fonte: Oliveira (2018).
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MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
• Alça de Drigalsky: é utilizada para espalhar microrganismos em meio de cultura sólido.
Figura 3 – Alça de Drigalski
• Cabo de Kolle: é utilizado como suporte para o fio de platina ou liga de níquel-cromo, esse 
material (cabo de Kolle + fio de platina) é usado para a inoculação de microrganismos.
Importante salientar que, antes de qualquer procedimento no laboratório, a bancada deve ser limpa 
com solução detergente seguida de uma solução com álcool a 70%. Vale ainda lembrar que cada material 
ou equipamento possui uma forma correta de ser tratado, a fim de garantir sua desinfecção e padrão 
de limpeza mínimos para a realização eficiente dos processos microbiológicos. 
 Observação
Toda vidraria utilizada no laboratório de microbiologia, antes de ser 
preparada para esterilização, deverá estar limpa e seca. O material deve 
ser acondicionado também de forma adequada e cada material dispõe de 
uma forma correta para tal, a fim de garantir a qualidade dos procedimentos 
que serão realizados.
Não obstante os equipamentos utilizados, quando no laboratório de microbiologia clínica, deve-se 
atentar a todas as normas de biossegurança. Quando se lida com microrganismos potencialmente 
patogênicos e de alto risco para desenvolvimento de doença, classificamos os níveis de biossegurança 
em quatro, designados como NB-1, NB-2, NB-3 e NB-4, em que NB é a sigla reconhecida para nível 
de biossegurança.
Os laboratórios classificados como nível de biossegurança NB-1 são projetados para trabalhos 
com agentes biológicos de classe de risco 1. São locais apropriados para o treinamento educacional ou 
para o treinamento de técnicos e de professores de técnicas laboratoriais.
A principal contenção, em um laboratório NB-1, é o conjunto de boas práticas de laboratório, o que 
inclui a especificação adequada do uso de EPI, como aventais de mangas compridas e luvas descartáveis, 
não sendo fundamental a existência de fluxo laminar.
12
Unidade I
No manual de boas práticas, deve constar a especificação dos desinfetantes e produtos de limpeza, 
com a respectiva concentração. As salas devem ser separadas da área de passagem de pessoas por portas 
simples, e os revestimentos devem ser feitos com materiais que facilitem a limpeza. Esses revestimentos 
devem ser laváveis e não podem ser porosos. O esgoto do laboratório pode ser descartado na rede pública.
Devem existir pias para limpeza das mãos, lava-olhos e um chuveiro de emergência. As bancadas não 
podem ter emendas na superfície e devem ser resistentes ao ataque de produtos químicos. Deve existir 
um local para armazenamento de produtos de uso imediato, e o espaço entre as bancadas deve permitir 
a circulação de pessoas.
O laboratório deve ter acesso a uma autoclave para a esterilização de vidrarias e instrumentos e 
possuir um local específico para a colocação de objetos pessoais e de aventais. Deve ser colocado o 
símbolo de risco biológico na porta do laboratório.
O nível de biossegurança 2 é semelhante ao primeiro e é adequado ao trabalho que envolva 
agentes de risco moderado para as pessoas e o meio ambiente. Difere do NB-1 nos seguintes aspectos: 
o pessoal de laboratório deverá ter um treinamento específico no manejo de agentes patogênicos e 
deve ser supervisionado por cientistas competentes; o acesso ao laboratório deve ser limitado durante 
os procedimentos operacionais; precauções extremas serão tomadas em relação a objetos cortantes 
infectados; e determinados procedimentos nos quais exista a possibilidade de formação de aerossóis e 
borrifos infecciosos devem ser conduzidos em cabines de segurança biológica ou em outros equipamentos 
de contenção física.
O nível de biossegurança 3 é aplicável para laboratórios clínicos, de diagnóstico, ensino e pesquisa 
ou de produção, em que o trabalho com agentes exóticos possa causar doenças sérias ou potencialmente 
fatais como resultado de exposição por inalação. A equipe laboratorial deve possuir treinamento 
específico no manejo de agentes patogênicos e potencialmente letais, devendo ser supervisionada 
por competentes cientistas que possuam vasta experiência com os agentes. Todos os procedimentos 
que envolverem a manipulação de materiais infecciosos devem ser conduzidos dentro de cabines de 
segurança biológica ou de outro dispositivo de contenção física. Os manipuladores devem usar roupas 
e equipamentos de proteção individual. 
Sabe-se, porém, que algumas instalações existentes podem não possuir todas as características 
recomendadas para um nível de biossegurança 3 (por exemplo, uma área de acesso com duas portas, 
selamento das entradas de ar). Nessas circunstâncias, um nível aceitável de segurança para a condução 
dos procedimentos de rotina (por exemplo, procedimentos para diagnósticos envolvendo a reprodução 
de um agente para identificação, tipagem, teste de susceptibilidade etc.) poderá ser conseguido com 
instalações do nível de biossegurança 2, garantindo-se que o ar liberado do laboratório seja jogado para 
fora da sala, a ventilação do laboratório seja equilibrada para proporcionar um fluxo de ar direcionado 
para dentro da sala, o acesso ao laboratório seja restrito quando o trabalho estiver sendo realizado e as 
práticas padrão de microbiologia, as práticas especiais e o equipamento de segurança necessários para o 
nível de biossegurança 3 sejam rigorosamente cumpridos. A decisão de implementar essas modificações 
das recomendações do nível de biossegurança 3 deve ser tomada somente pelo diretor do laboratório.
13
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
O nível de biossegurança 4 é indicado para o trabalho que envolve agentes exóticos e perigosos 
que exponham o indivíduo a um alto risco de contaminação de infecções, que podem ser fatais, além de 
apresentarem um potencial elevado de transmissão por aerossóis. Os agentes com uma relação antigênica 
próxima ou idêntica à dos agentes incluídos no nível de biossegurança 4 deverão ser manipulados nesse 
nível até que se consigam dados suficientes para confirmação do trabalho, seja para esse nível ou nível 
inferior. A equipe do laboratório deverá ter um treinamento específico e completo, direcionado para a 
manipulação de agentes infecciosos extremamente perigosos, e deverá ser capaz de entender as funções 
da contenção primária e secundária das práticas padrão específicas, do equipamento de contenção e 
das características do planejamento do laboratório. 
Os trabalhadores deverão ser supervisionados por cientistas competentes, treinados e com vasta 
experiência no manuseio dos agentes. O acesso ao laboratório deverá ser rigorosamente controlado 
pelo diretor. 
A instalação deverá ser em um edifício separado ou em uma área controlada dentro do edifício que 
seja totalmente isolada de todas as outras. Um manual de operações específico para as instalações deverá 
ser preparado ou adotado. Dentro do ambiente de trabalho, todas as atividades deverão permanecer 
restritas às cabines de segurança biológica classes III ou II, usadas com roupas de proteção com pressão 
positiva e ventiladas por sistema de suporte de vida. 
O laboratório do nível de biossegurança 4 deverá possuir características específicas quanto ao projeto 
e à engenharia, para prevenção da disseminação de microrganismos no meio ambiente.
O quadro a seguir apresenta de forma resumida os padrões e práticas especiais, bem como os 
equipamentos de segurança e as instalações que deverão ser aplicados aos agentes designados aos 
níveis de biossegurança 1, 2, 3 e 4, respectivamente.
Quadro1 – Níveis de biossegurança recomendados para agentes infecciosos
NB Agentes Práticas 
Equipamentos de 
segurança (barreiras 
primárias) 
Instalações (barreiras 
secundárias)
1
Que não são conhecidos 
por causarem doenças em 
adultos sadios
Práticas padrão de 
microbiologia Não são necessários
Bancadas abertas com pias 
próximas
2
Associados com doenças 
humanas, risco de lesão 
percutânea, ingestão, 
exposição da membrana 
e mucos
Prática de NB-1 e acesso 
limitado, avisos de risco 
biológico, precauções com 
objetos perfurocortantes, 
manual de biossegurança 
que defina qualquer 
descontaminação de 
dejetos ou normas de 
vigilância médica
Barreiras primárias: 
cabines de classe I ou II 
ou outros dispositivos de 
contenção física usados 
para todas as manipulações 
de agentes que provoquem 
aerossóis ou vazamento 
de materiais infecciosos; 
procedimentos especiais 
como o uso de aventais, 
luvas e proteção para o 
rosto, quando necessário
NB-1 mais: autoclave 
disponível
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Unidade I
NB Agentes Práticas 
Equipamentos de 
segurança (barreiras 
primárias) 
Instalações (barreiras 
secundárias)
3
Agentes exóticos com 
potencial para transmissão 
via aerossol; a doença pode 
trazer consequências sérias 
ou até fatais
Práticas de NB-2 e 
acesso controlado, 
descontaminação de todo 
o lixo, descontaminação da 
roupa usada no laboratório 
antes de ser lavada, 
amostra sorológica
Barreiras primárias: cabines 
de classe I ou II ou outros 
dispositivos de contenção 
usados para todas as 
manipulações abertas de 
agentes; uso de aventais, 
luvas e proteção respiratória, 
quando necessário
NB-2 mais: separação 
física dos corredores de 
acesso, portas de acesso 
dupla com fechamento 
automático, ar de exaustão 
não recirculante, fluxo de 
ar negativo dentro 
do laboratório
4
Agentes exóticos ou 
perigosos de alto risco de 
doenças que ameaçam a 
vida, infecções laboratoriais 
transmitidas via aerossol 
ou relacionadas a agentes 
com risco desconhecido de 
transmissão
Prática de NB-3 e mudança 
de roupa antes de entrar, 
banho de ducha na 
saída, todo o material 
descontaminado na saída 
das instalações
Barreiras primárias: 
todos os procedimentos 
conduzidos em cabines 
de classe III, I ou II, 
juntamente com macacão 
de pressão positiva com 
suprimento de ar
NB-3 mais: edifício 
separado ou área isolada, 
sistemas de abastecimento 
e escape a vácuo e de 
descontaminação, outros 
requisitos sublinhados 
no texto
Adaptado de: Ministério da Saúde (2006).
Entendemos, portanto, que a biossegurança se resume ao conjunto de medidas e ações importantes 
e que devem necessariamente ser implementadas para a segurança do profissional e para a qualidade 
dos ensaios que são realizados. Além do que apresentamos sobre quatro níveis de biossegurança, faz-se 
importante relembrar conceitos básicos, os quais também podem ser encontrados de forma resumida 
no quadro anterior.
Quanto à vestimenta, é necessário utilizar roupas adequadas ao trabalho laboratorial, dessa forma, 
o profissional deve usar sempre calça comprida, visto que bermuda, shorts ou saias são incompatíveis 
com o ambiente; deve-se usar camisa ou camiseta, não sendo permitido o uso de camisetas regatas. Os 
sapatos devem ser fechados, não sendo permitido o uso de chinelos e sandálias. Deve-se usar jaleco de 
algodão, preferencialmente de mangas compridas, até a altura dos pulsos. O seu uso é restrito apenas 
ao laboratório. Ao sair do laboratório, deve-se tirar o jaleco e deixá-lo em local apropriado.
Quanto aos hábitos de higiene pessoal, em relação aos cabelos, eles devem ser mantidos sempre 
presos e, em alguns casos, a depender do tipo de procedimento, o uso de touca é essencial. O uso de 
cosméticos é incompatível com o trabalho realizado no laboratório. Não se deve, portanto, utilizar 
maquiagem. Deve-se, ainda, evitar o uso de unhas postiças. Manter as unhas naturais, curtas e sem 
esmaltes. Não usar adornos como anéis, pulseiras, relógios, entre outros.
Ao sair do laboratório, é necessário sempre lavar as mãos, pois durante todo o trabalho desenvolvido 
no ambiente laboratorial, serão manuseados diversos materiais biológicos, os quais podem conter 
microrganismos com diferente potencial de virulência e/ou patogenicidade, sem contar substâncias 
que podem trazer agravos de ordem química ou física. A limpeza das mãos tem como objetivo garantir que 
o profissional não leve consigo resíduo de reagentes ou agentes patogênicos, os quais podem causar 
irritação por contato em parte específicos do corpo, como olhos, nariz, orelha e boca, ou ainda infectar 
o indivíduo sendo causa de doença. 
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MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
A)
D)
G)
B)
E)
H)
C)
F)
I)
Figura 4 – Passo a passo da lavagem de mãos: 1° passo – palmas (A); 2° passo – dorso (B); 3° passo – entre os dedos (C); 4° passo – 
polegares (D); 5° passo – articulação (E); 6° passo – ponta dos dedos, unhas (F); 7° passo – punhos (G); 8º passo – enxaguar as mãos 
iniciando pelos dedos e seguindo para os punhos (H); 9º passo – secar as mãos e os punhos com papel toalha descartável (I)
A lavagem das mãos, como demostrado no esquema anterior, é um processo que deve ser realizado 
pragmaticamente, a fim de garantir a segurança do profissional de laboratório. Para tal, alguns cuidados 
devem ser observados, como retirar todos os acessórios, como anéis, pulseiras e relógio, fechar a torneira 
com papel toalha, caso ela possua contato manual para fechamento e, para prevenir que a pele resseque, 
é necessário evitar lavar as mãos com água muito quente ou muito fria.
 Lembrete
Lavar as mãos já foi comprovadamente considerada uma das formas 
mais eficazes de evitar a propagação de doenças infecciosas.
A seguir, seguem algumas normas, as quais constituem importante fator para a segurança individual 
e coletiva de quem trabalha em laboratório de análises clínicas. Sendo recomendado que todos os 
profissionais a sigam no desempenho de suas atividades laborais, são elas:
I – É necessário trabalhar com método, atenção e calma.
II – O uso do avental no laboratório é obrigatório, de preferência confeccionado com algodão e de 
manga comprida.
16
Unidade I
III – Acidentes de qualquer natureza devem ser comunicados ao instrutor.
IV – Durante a permanência no laboratório, deve-se evitar passar os dedos na boca, nos olhos ou no 
nariz. Ao sair, deve-se lavar as mãos.
V – Se algum ácido ou qualquer outro produto químico for derramado, o local deve ser lavado 
imediatamente com bastante água.
VI – Antes de utilizar um reagente, deve-se ler com atenção o rótulo do frasco. O frasco de reagente 
sempre deve ser segurado com o rótulo voltado para a palma da mão.
VII – Antes de realizar uma experiência de laboratório, deve-se ler com atenção o procedimento 
operacional padrão (POP) do método a ser realizado. 
VIII – Quando necessário, devem ser utilizados equipamentos de proteção individual (EPIs).
IX – Quando for realizado trabalho com reagentes que liberem vapor, gases venenosos ou irritantes, 
a capela deve ser utilizada.
X – Não se deve fumar e comer no laboratório.
XI – Devem-se jogar todos os sólidos e pedaços de papel usado em coletores especificados.
XII – Deve-se manter limpo o local de trabalho.
Além dos cuidados abordados em muitos procedimentos em microbiologia clínica, faz-se necessária 
a utilização dos EPIs, sendo preciso observar em cada atividade a ser realizada a necessidade específica 
de cada item e de seu uso.
Esses equipamentos devem ser utilizados em situações que oferecem riscos, sobretudo aos olhos e 
sistema respiratório. Os EPIs são de uso obrigatório e exigidos quando a atividade a ser desenvolvida 
oferecer riscos. As empresas costumam disponibilizar EPIs, como sapatos, luvas, óculos, protetor auricular 
e avental, para que, dessa forma, os colaboradores exerçam suas atividades com a máxima tranquilidade 
e segurança. A seguir, são mostrados tipos de EPIs utilizados em laboratório de microbiologia clínica.• Máscara, óculos e visor: esses equipamentos são considerados individuais de proteção (EPIs), 
que devem ser utilizados em situações que oferecem riscos aos olhos e sistema respiratório. Os 
óculos de segurança são utilizados para a proteção dos olhos. Os óculos escuros são indicados 
para proteção contra radiação UVA e UVB.
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MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Figura 5 – Óculos de segurança comum e de sol
• Máscara para poeira: esse equipamento é muito utilizado contra poeiras e particulados ou em 
situações para proteção de respingos da fala. Não indicado contra poeiras toxicas, gases etc.
Figura 6 – Máscaras para poeira
• Máscara N95: esse equipamento é utilizado durante a manipulação de amostras de isolamento 
respiratório (PBK).
• Visor (protetor facial ou face shield): esse equipamento protege a face contra respingos 
provenientes de reações químicas, ou provenientes da fala. 
Figura 7 – Visor (protetor facial)
• Jaleco ou avental: o uso desse item é obrigatório dentro do laboratório, pois protege a parte 
superior do corpo contra possíveis derramamentos de soluções, reagentes etc. O jaleco deve 
permanecer no laboratório após sua utilização. Deve ser usado, preferencialmente, jaleco feito de 
algodão, impermeável.
18
Unidade I
• Luvas de segurança: esse equipamento protege as mãos durante o manuseio de soluções, deve-se 
ter cautela no uso quando próximo da chama do bico de Bunsen ou de qualquer outro material 
inflamável ou que produza chama. Os tipos mais comuns são: de PVC, látex e luva nitrílica. Alguns 
cuidados são necessários para que o uso das luvas de segurança se torne correto e adequado. 
 Saiba mais
Os ambientes de trabalho, em especial na área da saúde, oferecem 
riscos para seus trabalhadores, uma vez que frequentemente os expõem 
a condições que possam resultar em acidentes e processos patológicos 
quando medidas de proteção individual e coletiva não são adotadas. Para 
conhecer mais sobre o uso correto de EPI e o quanto o uso é priorizado por 
profissionais da saúde, leia:
LIMA, R. Agentes biológicos e equipamentos de proteção individual e 
coletiva: conhecimento e utilização entre profissionais. Revista Prevenção 
de Infecção e Saúde, v. 3, n. 3, 2017. Disponível em: https://bit.ly/3x04bAd. 
Acesso em: 29 jun. 2021.
1.2 Principais métodos de coloração, meios de cultura e técnicas de semeadura 
aplicados na prática da microbiologia 
Os microrganismos e as estruturas celulares geralmente são transparentes, no entanto com o 
emprego de um microscópio óptico e técnicas de coloração ou exame a fresco, é possível visualizar 
essas estruturas. Confecção de lâminas a fresco, em que o material é colocado entre lâminas e lamínulas 
com uma gota de solução fisiológica ou solução de KOH a 10%, é muito utilizada, visto que permite a 
visualização de estruturas celulares e microrganismos, principalmente para pesquisa de fungos. 
O emprego de corantes é muito comum e eficaz na microscopia em microbiologia. Corantes, 
como tinta da China, são utilizados principalmente em amostras de liquor cefalorraquidiano para a 
pesquisa de Cryptococcus neoformans. Azul de metileno pode ser utilizado em algumas pesquisas, como 
identificação de grânulos metacromáticos de Corynebacterium diphtheriae. 
O uso de corantes para a microscopia também pode ser utilizado em técnicas de colorações 
diferencias, as mais utilizadas são a técnica de coloração de Gram e a técnica de coloração de Ziehl 
Neelsen, que veremos detalhadamente a seguir.
A técnica de Gram, como pode ser observada na figura a seguir, permite uma visualização aprimorada 
das estruturas de bactérias, fungos, leucócitos e outros elementos. Permite obter informações essenciais 
para o início do tratamento. A visualização de amostras após a coloração de Gram proporciona adquirir 
informações úteis sobre os processos infecciosos, visto que as informações da cultura são demoradas. 
Essas informações, em conjunto com o conhecimento de quais microrganismos geralmente infectam 
19
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
certos sítios, possibilitam indicar a antiobioticoterapia inicial, até os resultados da cultura e teste de 
sensibilidade ficarem prontos. Em alguns casos, os microrganismos não apresentam nenhum crescimento 
nos meios geralmente utilizados na microbiologia, ficando a cargo da bacterioscopia o diagnóstico final.
I – Cobrir a lâmina pingando gotas de cristal de violeta e aguardar um minuto. Em seguida, desprezar 
o corante, lavar a lâmina com um filete de água.
II – Cobrir a lâmina com lugol, aguardar um minuto e desprezar o corante. Lavar a lâmina com um 
filete de água.
III – Aplicar álcool etílico ou cetona para descorar a lâmina por 30 segundos e, em seguida, lavar a 
lâmina em água corrente.
IV – Cobrir a lâmina com fucsina e deixar agir por 30 segundos, e, em seguida, lavar a lâmina em um 
filete de água.
V – Secar a lâmina com auxílio de um papel limpo ou deixá-la secar ao ar livre.
VI – Para visualização do microrganismo, deve ser aplicada uma gota de óleo de imersão sobre a 
lâmina e, em seguida, observá-la no microscópio com objetiva de 100 X.
Aplicação de 
cristal violeta 
(corante púrpura)
1 32 4Aplicação 
de iodo 
(mordente)
Lavagem 
com álcool 
(descoloração)
Aplicação 
de safranina 
(contracorante)
Gram-positiva
Gram-negativa
Cocos (gram-positivos)
Basotonete 
(gram-negativo)
Álcool
Safranina
Iodo
Cristal 
violeta
Legenda
B)A) LM 5 µm
Figura 8 – Representação esquemática da técnica de coloração de Gram. Procedimento técnico da coloração de Gram (A). Análise ao 
microscópio da técnica, resultando em bactérias coradas em azul (Gram-positivas) e em rosa (Gram-negativas) (B)
Fonte: Tortora, Funke e Case (2017, p. 65).
O resultado da técnica consiste em visualizar, esquematizar e descrever a morfologia, classificando as 
bactérias existentes nas lâminas de acordo com a reação diante dos corantes utilizados na técnica de Gram.
As bactérias Gram-positivas têm a parede celular composta por mureína e, após a descoloração 
com o álcool etílico, a bactéria mantém a coloração do corante primário (roxo). Já as bactérias 
Gram-negativas, com parede celular composta por ácidos graxos, são incapazes de reter o cristal de 
violeta, assumindo, assim, a cor do corante de fundo (vermelho). 
20
Unidade I
A) B)
Figura 9 – Exemplos de bactérias Gram: Gram-positivas Staphylococcus spp. (A) e de Gram-negativa Escherichia coli (B) 
O princípio da coloração de Ziehl-Neelsen se fundamenta no fato de que a parede celular, sobretudo 
de micobactérias, é formada por vários lipídeos e ácidos micólicos, e não apresenta peptidoglicano. 
Nesse caso, a conjugação de diversos desses lipídeos com a fucsina gera agrupamentos que são 
responsáveis pelo caráter tintorial de preservação à descoloração por soluções álcool-ácidas. Esse 
grupo de bactérias é denominado como bacilos álcool-ácido resistentes (Baar).
Diversas amostras podem ser coradas pela técnica de Ziehl-Neelsen. Entre elas, estão as biópsias de 
fragmentos, líquidos cavitários, urina, secreções purulentas e principalmente escarro. Os cuidados para o 
preparo do material a ser corado são extremamente importantes, considerando o grau de virulência dos 
agentes associados. A seguir, de forma resumida, os principais cuidados no preparo do material biológico 
a ser corado:
I – O preparo do esfregaço deve ocorrer de preferência na capela de segurança biológica e, 
obrigatoriamente, utilizando EPI (avental, máscara N95, luvas e óculos de proteção). Caso não tenha 
capela de segurança biológica, a lâmina deve ser preparada próxima ao bico de Bunsen. 
II – Identificar a lâmina com nome do paciente e números de identificação.
III – Utilizar sempre lâminas novas e limpas com álcool. 
IV – Abrir o recipiente minuciosamente, impedindo a produção de aerossóis.
V – Utilizando um palito de madeira, separar a fração mais purulenta do material. 
VI – Colocar a fração separada na lâmina de vidro. Com palito, estender o material até a extremidade 
opostada lâmina. Deslocar o palito de uma extremidade a outra até conseguir um esfregaço homogêneo, 
que ocupe 2/3 da lâmina. 
VII – Desprezar o palito em recipiente plástico firme, que deverá ser descontaminado na autoclave.
VIII – Posicionar a lâmina para cima e aguardar secagem em temperatura ambiente. 
IX – Após a secagem, passar a lâmina rapidamente por 3 vezes sobre a chama do bico de Bunsen.
X – Colocar a lâmina no suporte e aguardar que esfrie. 
21
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Tomados os devidos cuidados, o procedimento da coloração de Ziehl-Neelsen segue como 
descrito a seguir:
I – Cobrir todo o esfregaço da lâmina com corante fucsina de Ziehl filtrada.
II – Percorrer chama lentamente por baixo das lâminas até que comece a exalar vapores. Remover a 
chama rapidamente para impedir que a fucsina ferva. 
III – Cronometrar 5 minutos assim que começar a surgir o vapor e repetir o processo por mais 2 vezes 
nesse período de 5 minutos. 
IV – Enxaguar as lâminas cuidadosamente com água corrente retirando todo corante. 
V – Cobrir toda a lâmina com álcool-ácido e aguardar 1 minuto. 
VI – Enxaguar as lâminas com água corrente. 
VII – Observar se as lâminas ficaram descoradas (se estiver levemente rosada, refazer o item V).
VIII – Cobrir as lâminas com azul de metileno filtrado. 
IX – Esperar 30 segundos. 
X – Lavar a lâmina, retirando o azul de metileno. Esperar secar e estará pronta para leitura 
ao microscópio.
Na interpretação da lâmina de escarro, é necessário observar 100 campos úteis de microscópio, ou 
seja, campos em que sejam encontradas células provenientes do pulmão. Para baciloscopia de outras 
amostras clínicas, após concentração ou não, o esfregaço deve ser oval e é necessário ser observada toda 
a região com material. 
Seguindo alguns critérios, podemos quantificar o grau de positividade da lâmina analisada.
Quadro 2 – Critérios para leitura e interpretação 
dos resultados da baciloscopia de escarro
Resultado Observação 
Negativas Não foram encontrados Baar em cem campos observados
Quantificado 1 a 9 Baar em cem campos observados
Positivo + Presença de 10 a 99 Baar em 100 campos observados
Positivo ++ Média de 1 a 10 Baar por campo, nos primeiros 50 campos observados
Positivo +++ Média de mais de 10 Baar por campo, nos primeiros 20 campos observados
22
Unidade I
 Saiba mais
Apesar de ser uma doença antiga, com diagnóstico clínico-laboratorial 
simples e de tratamento barato (gratuito no nosso país) e eficaz, a 
tuberculose pulmonar ainda é um grave problema de saúde pública no 
Brasil e no mundo. Para saber mais sobre o diagnóstico, em especial a 
coloração de Ziehl-Neelsen, leia:
COSTA, R. R.; SILVA, M. R.; GONÇALVES, I. C. Diagnóstico laboratorial da 
tuberculose: revisão de literatura. Revista Médica de Minas Gerais, v. 28, n. 5, 
2018. Disponível em: https://bit.ly/3llpJnM. Acesso em: 2 ago. 2021.
Além das técnicas de coloração apresentadas na prática da microbiologia clínica, temos que estar 
constantemente atentos com os meios de cultura que serão utilizados para a execução de cada protocolo, 
pois disso depende a qualidade e assertividade do resultado a ser fornecido. Nesse sentido, devemos 
relembrar algumas informações acerca do tema.
Meio de cultura é o material nutritivo preparado para o desenvolvimento de microrganismos. 
Algumas bactérias podem crescer normalmente em qualquer tipo de meio, outras bactérias exigem 
meio de cultura específico. Existem também aquelas que não se desenvolvem em nenhum tipo de meio 
de cultura já desenvolvido.
O tipo de meio utilizado para os microrganismos se desenvolverem depende de vários fatores:
• origem do material a ser analisado;
• espécie que deseja obter na amostra;
• necessidades nutricionais dos organismos.
A especificidade dos meios de cultura é muito importante, nomeadamente no isolamento e 
identificação de certos microrganismos, como isolamento de microrganismos do solo ou na análise 
microbiológica de águas, alimentos, entre outros. Para o desenvolvimento de microrganismos em 
laboratório, há uma grande variedade de meios de cultura.
Os meios de cultura são classificados quanto ao estado físico: sólidos, quando há ágar na 
concentração de 1 a 2,0%; semissólidos, quando a quantidade de ágar e/ou gelatina é de até 0,5%; 
líquidos, sem agentes solidificantes, apresentando-se como um caldo.
A consistência do meio de cultura é influenciada pela presença do ágar, que consiste de um 
polissacarídeo complexo obtido a partir de algas marinhas, que vem sendo bastante utilizado na 
23
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
microbiologia. Os meios podem ser classificados quanto a sua composição (simples ou quimicamente 
definidos, básicos ou complexos), também podem ser classificados quanto a seu estado físico 
(líquidos, semissólidos e sólidos) e também em função de sua aplicação (seletivos, diferenciais, de 
pré-enriquecimento ou de enriquecimento). 
• Meios quimicamente definidos: sua composição química exata é conhecida. Esses meios são 
utilizados sobretudo em pesquisa, a fim de avaliar comportamentos nutricionais e processos 
metabólicos de microrganismos específicos.
• Meios de cultura básicos: permitem o crescimento bacteriano, sem satisfazer nenhuma exigência 
em especial.
• Meios de cultura complexos: são compostos de nutrientes, como extratos de levedura, carne, 
plantas ou produtos proteicos de outras fontes. Tais extratos fornecem as vitaminas e os outros 
fatores de crescimento orgânico, como os extratos de levedura, que são extremamente ricos em 
vitaminas B.
• Meios líquidos: os nutrientes estão dissolvidos em uma solução aquosa.
• Meios semissólidos: além de possuir nutrientes em sua composição, apresentam ágar em 
pequena quantidade.
• Meios sólidos: possuem em sua composição nutriente e ágar.
• Meios seletivos: elaborados com o objetivo de favorecer o crescimento de outras bactérias. O 
ágar sulfeto de bismuto, por exemplo, é um dos meios de cultura utilizados para isolamento de 
bactéria causadora do tifo, a bactéria gram-negativa Salmonella typhi, a partir das fezes. Exemplo 
de meios eletivo: meio ágar Sabouraud é um meio que contém nutrientes que favorecem o 
crescimento de diversos fungos.
• O meio diferencial: utilizado para fácil identificação de bactéria de interesse específico, pois 
geralmente outras bactérias crescem na mesma placa de meio de cultura. Em alguns casos, as 
características dos meios seletivos e diferenciais podem estar combinadas no mesmo meio de cultivo. 
Pode-se obter um meio diferencial, por exemplo, incorporando-se, a um meio básico, 5% de sangue 
de carneiro. Dessa forma, torna-se um meio de cultura complexo e, ao mesmo tempo, diferencial, pois, 
dessa forma, pode-se observar três tipos de hemólise, uma observação fundamental, por exemplo, para 
a caracterização de bactérias tanto do gênero estreptococos como estafilococos. A título de informação 
adicional, os três tipos de hemólise conhecidas são:
• Alfa-hemólise: ocorre lise parcial das hemácias. É possível visualizar uma área de coloração 
esverdeada ao redor das colônias bacterianas. 
• Beta-hemólise: ocorre lise total das hemácias. Formará áreas claras em torno das colônias 
bacterianas. 
24
Unidade I
• Gama-hemólise: não ocorre lise das hemácias. 
• Meios de pré-enriquecimento: utilizado para recuperar os microrganismos danificados por 
algum tipo de tratamento (térmico ou químico), água peptonada e caldo lactosado.
• Meio de enriquecimento: utilizado para separar bactérias presentes em pequenas quantidades 
de outras, presentes em grandes quantidades. Geralmente, esse meio é utilizado em amostras de 
fezes e solos. Exemplo: caldo tetrationato e selenito-cistina para cultivo de salmonelas (líquidos), 
e caldo tioglicolato para Clostridium perfringens.
A diversidade dos meios de cultura é essencial para processo de identificação dos microrganismos. 
Compreender o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adaptar ao perfil bacteriano contribui 
muito no processode diagnóstico microbiológico. 
O quadro a seguir apresenta alguns dos principais meios de cultura utilizados no laboratório de 
microbiologia clínica e sua finalidade. 
Quadro 3 – Principais meios de cultura e sua finalidade na prática clínica
Meio de cultura Finalidade
Ágar chocolate Isolamento de Haemophilus spp.,Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella spp. em amostras clínicas
Ágar MacConkey É um meio seletivo (pela presença de sais biliares, cristal de violeta e NaCl) para isolamento de bacilos Gram-negativos, enterobactérias e não fermentadores
Ágar Mueller-Hünton Utilizado para realização do teste de avaliação da resistência aos antimicrobianos pelo método de difusão em disco (Kirby-Bauer) para bactérias de crescimento rápido
Ágar sangue
Meio utilizado para a maioria dos materiais clínicos, permite o crescimento de grande 
parte dos patógenos não fastidiosos ou que requerem incubação especial. Verificação de 
hemólise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp.
Caldo tioglicolato Meio liquido enriquecedor
Agar cystine lactose electrolyte 
deficient (Cled)
Usado para isolamento, identificação de microrganismos presentes em amostra de urina. 
A deficiência de eletrólitos inibe o véu de cepas de Proteus spp.
Ágar Salmonella-Shigella (SS) Meio para isolamento de Salmonella sp. e Shigella sp. Permite diferenciar bactérias lactose positivas e negativas, além de detectar a produção de H2S
Ágar dnase Verificar se bactéria possui a enzima desoxiribonuclease, a qual degrada DNA
Ágar citrato de simmons Verificar a capacidade do microrganismo em utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono. Auxilia na identificação das enterobactérias
Ágar chromoagar Identificar e isolamento da maioria das espécies de Candida spp.
Ágar Sabouraud (AS) Verificar o crescimento de espécies de Candida e fungos filamentosos
 Observação
Apesar de existirem muitos meios vendidos prontos comercialmente, 
a habilidade de preparar um meio de cultura e saber reconhecer qual o 
melhor meio para a obtenção do melhor isolamento bacteriano é função 
básica e primordial de todo profissional da área de análises clínicas.
25
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Vale salientar, nesse momento, os principais cuidados no preparo e armazenamento dos meios de 
cultura, ponto crítico para a qualidade do resultado da amostra biológica avaliada.
No preparo de um meio básico confeccionado in house, de forma caseira, como chamamos, e a título 
de exemplificação, inicialmente devemos ligar o pHmetro meia hora antes do uso e, após esse período, 
calibrá-lo com soluções padrões. Em seguida, deve-se definir a quantidade de meio a ser preparado e 
pesar a quantidade necessária de ágar e sacarose. 
Colocar 40% do volume de água destilada em recipiente apropriado ao volume final a ser preparado. 
Pipetar as soluções, dissolver a sacarose e completar com água a metade do volume final. Ajustar o pH, 
sendo o valor final em torno de 5.8. 
Em outro recipiente, deve-se colocar ágar e a outra metade da água e, em seguida, dissolver no 
micro-ondas em potência alta ou sobre a chama do bico de Bunsen, agitando de vez em quando. O meio 
estará pronto quando estiver transparente, começando a ferver. 
Deve-se misturar as partes e distribuí-las nos tubos de ensaio (ou placa petri), tampar os tubos com 
papel alumínio ou tampa plástica e levar para a autoclave por cerca de 20 minutos.
Após o preparo dos meios, eles devem ser colocados em recipientes (tubos de ensaio ou placa petri). 
Devem ficar sobre a bancada até atingir a temperatura ambiente e devem ser armazenados em geladeira 
por, no máximo, sete dias.
 Saiba mais
Meios de cultura são essenciais para qualquer procedimento em 
microbiologia clínica, sobretudo em bacteriologia e micologia, e saber 
reconhecer sua composição, especificidade e aplicações é tarefa importante 
a todo profissional de laboratório. Portanto, para saber mais sobre meios de 
cultura, faça a leitura do manual da Anvisa:
ANVISA. Descrição dos meios de cultura empregados nos exames 
microbiológicos. [s.l.], [s.d.]. Disponível em: https://bit.ly/2UKOkal. Acesso 
em: 29 jun. 2021.
Após compreendermos sobre os principais métodos de coloração e meios de cultura, é importante 
salientar a importância das diferentes técnicas de semeadura de material biológico, as quais 
servem para qualificar e quantificar o crescimento microbiano. A utilização dessas técnicas, além 
de importante para evitar a contaminação dos meios de cultura no momento de executá-las, 
estabelece um padrão necessário para a execução de cada protocolo. Para tanto, deve-se tomar 
inicialmente alguns cuidados: 
26
Unidade I
• Flambar a alça níquel cromo ou o fio de platina antes e depois de qualquer técnica de semeadura.
• Flambar a boca dos tubos de ensaio quando a técnica for realizada neles.
• Semeaduras realizadas em placa de Petri deverão ser próximas ao bico de Bunsen, para evitar 
contaminação com o ar. 
Para a semeadura adequada dos diferentes tipos de material biológico em razão dos diferentes 
protocolos a serem realizados, são utilizadas metodologias distintas, a saber:
• Técnica de esgotamento: a metodologia de semeadura por esgotamento pode ser aplicada 
para o crescimento de colônias isoladas, avaliar a capacidade de crescimento ou não no meio 
de cultura, isolamento de organismos presentes em grandes números relativos à população 
microbiana. Para realizar a técnica de esgotamento, é necessário semear o microrganismo com a 
alça níquel suavemente sobre o meio de cultura, fazendo um zigue-zague, em sentido único, em 
toda a extensão da placa de Petri. Assim que finalizar a técnica, a placa deve ser guardada em 
temperatura adequada e permanecer por tempo suficiente até o desenvolvimento de colônias.
Figura 10 – Técnica de esgotamento na placa de Petri 
• Técnica em estrias: a metodologia de semeadura por estrias pode ser aplicada para estocar 
material, estudar o metabolismo dos organismos na bioquímica e avaliar a capacidade de 
crescimento ou não no meio de cultura. Para realizar a técnica de estrias, é necessário semear o 
microrganismo com a alça de níquel, fazendo estrias na superfície de um meio de cultura sólido.
Figura 11 – Técnica em estrias na placa de Petri 
27
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
• Técnica quantitativa: a metodologia de semeadura quantitativa é recomendada para a 
semeadura de líquidos, com o objetivo de obter o crescimento de colônias isoladas, a quantidade 
de colônias e avaliar a capacidade de crescimento ou não no meio de cultura. Para realizar a 
técnica quantitativa, é necessário coletar, com alça calibrada, um material clínico. Deve-se realizar, 
com a alça, o estriamento de uma ponta outra, em linha reta, por toda a superfície do ágar. Em 
seguida, deve-se fazer uma linha perpendicular à estria inicial.
Figura 12 – Técnica quantitativa na placa de Petri 
• Técnica em picada: a metodologia de semeadura em picada é recomendada para a semeadura 
em tubos de ensaio e tem como objetivo verificar a agilidade do microrganismo no ágar. Para 
realizar a técnica em picada, é necessário semear o microrganismo com auxílio de uma agulha de 
níquel cromo, fazendo uma picada no centro do meio de cultura, no tubo de ensaio, e penetrar 
agulha até a metade do tubo. Verificar os resultados após o período de incubação.
Figura 13 – Técnica de picada em tubo 
As diferentes formas de se semear o material clínico fazem parte de processos estabelecidos em 
procedimentos operacionais padrões, a fim de garantir a qualidade e reprodutibilidade dos testes e 
ensaios realizados.
Após o preparo do meio de cultura e semeadura do material biológico, parte-se para o processo de 
identificação do patógeno, o qual se inicia com a observação a olho nu, com lupa ou microscópio, das 
colônias isoladas. No estudo das colônias, deve ser observada a forma do microrganismo, bem como seu 
28
Unidade I
tamanho, superfície, estrutura e pigmentação. As principais características observadas no líquidosão o 
tipo de crescimento na superfície, a opacidade (ou turvação), cheiro, sedimento e pigmentação.
Após o crescimento das colônias isoladas no meio de cultura, podemos identificar suas características. 
Essas peculiaridades são de grande valia para selecionar as provas bioquímicas necessárias para 
completar o processo de identificação.
Puntiforme
Forma
Elevação
Margem
Plana
Inteira
Elevada
Ondulada
Convexa
Lobulada
Crateriforme
Filamentosa
Papilada
Espiral
Circular Filamentosa Irregular Rizoide Fusiforme
Figura 14 – Morfologia das colônias
Fonte: Câmara (2013).
1.3 Automação no laboratório de microbiologia clínica 
Em 1881, Robert Koch relatou sua primeira descoberta a respeito da bacteriologia, descrevendo 
“gelatinas” como fontes de nutrientes para bactérias. Após tantas décadas, as placas de Petri contendo 
meios de cultura, com nutrientes, continuam sendo a base para os laboratórios de microbiologia. A 
rotina nos exames de microbiologia clínica é baseada no cultivo e isolamento de colônias puras dos 
microrganismos, identificação fenotípica e testes de sensibilidade aos antimicrobianos utilizados para 
o tratamento, mas é notório que a microbiologia vem avançando de maneira importante, o que tem 
conduzindo a migração para a automação também para esse setor, a exemplo do que ocorre em outros 
setores do laboratório clínico. 
O fluxo de trabalho na microbiologia vem aumentado significativamente, desafiando os 
microbiologistas a escolherem a automação mais adequada, com baixo custo e alta especificidade. Outro 
fator relevante a ser considerado é o surgimento de novos mecanismos de resistência e a necessidade de 
investigações epidemiológicas decorrentes do aumento do número de microrganismos multirresistentes, 
o que é, sem dúvidas, um dos maiores desafios na rotina dos serviços da microbiologia.
O setor de microbiologia clínica é historicamente considerado low-tech, ou seja, baixo grau de 
automação ou tecnologia associada quando comparado ao elevado grau de automação encontrado no 
laboratório de forma geral, como no setor de bioquímica clínica.
29
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
De maneira geral, as automações disponíveis para o laboratório de microbiologia clínica permitem 
a identificação de diversos microrganismos em um período entre 16-24 horas de incubação. O teste 
de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA) pode ser realizado concomitantemente à identificação e 
liberado no mesmo prazo. O TSA, quando automatizado, é liberado como sensível, intermediário ou 
resistente, seguido da concentração inibitória mínima (CIM ou MIC) de cada fármaco testado.
Os principais mecanismos de resistência bacteriana de interesse clínico, como a produção de 
beta-lactamases de espectro estendido (ESBL) por bactérias Gram-negativas, ou a resistência à meticilina 
ou à vancomicina em bactérias Gram-positivas, são detectados e reportados por laudo microbiológico 
gerado nessas plataformas.
Desde o lançamento da automação AutoMicrobic System, projetado no final dos anos 1960 pela 
McDonnell Douglas a pedido da Nasa, uma infinidade de produtos tem surgido no mercado mundial. 
Os principais equipamentos atualmente disponíveis nesse campo são: o sistema automatizado Phoenix 
(lançado pela Becton Dickinson em 2003), o sistema MicroScan WalkAway (fabricado por Dade Behring 
INC., EUA), o sistema Vitek (introduzido pela bioMérieux em 1997) e o sistema Maldi-TOF-MS (Matrix 
Associated Laser Desorption-Ionization – Time of Flight – Mass Spectrometry), que se baseia na técnica 
de espectrometria de massa (MS) para identificar microrganismos.
Estudos comparativos entre essas metodologias têm sido descritos na literatura mundial. Em 
laboratórios de análises clínicas, quando há alta demanda de amostras que serão submetidas ao setor 
de microbiologia, essas tecnologias podem ser aplicadas principalmente para diagnóstico de infecções 
hospitalares ou como metodologia padrão em laboratórios de referência, uma vez que a necessidade da 
automação se faz indispensável para dar suporte à procura, apesar de o custo inicial ser alto. A automação 
se mostra consideravelmente vantajosa nesse setor das análises clínicas, proporcionando uma maior 
agilidade na obtenção dos resultados finais e melhor precisão na identificação de diversas espécies de 
microrganismos, os quais são aspectos importantes na rotina do laboratório clínico e microbiológico, 
minimizando o tempo para a realização de diagnósticos convencionais e otimizando, por exemplo, a 
terapia antimicrobiana. É importante salientar que os métodos automatizados contribuem muito para 
a otimização de um exame microbiológico, embora não seja possível, às vezes, mensurar seu impacto 
clínico por conta da dificuldade de realização desses estudos clínico-laboratoriais. De qualquer forma, 
vale ressaltar que, ao acelerarmos os resultados microbiológicos, como isolamento e identificação 
dos principais microrganismos epidemiologicamente relevantes, estamos proporcionando ao médico 
assistente as escolhas mais apropriadas de antibioticoterapia. Assim, os pacientes podem reagir mais 
rápido e ter alta em menos tempo, minimizando sua permanência no hospital e, assim, diminuindo a 
emergência de infecções hospitalares, especialmente por bactérias mais resistentes.
As automações, no entanto, também apresentam limitações, e muitas vezes é necessário recorrer 
a testes off-line para conseguir resultados confiáveis. A liberação da CIM da polimixina, por exemplo, 
tem sido alvo de diversos debates nos últimos anos. A padronização da liberação da polimixina B 
por microdiluição não automatizada in house limitou a realização do teste pelas plataformas 
atualmente disponíveis.
30
Unidade I
A identificação microbiológica de fungos e bactérias patogênicos tem sido realizada classicamente 
por métodos que envolvem cultura e, depois, testes fenotípicos, explorando as diferenças metabólicas 
que existem entre as várias espécies. Culturas são métodos extremamente poderosos de recuperação 
de patógenos: teoricamente, um único patógeno viável em meio adequado se multiplica em escala 
logarítmica, amplificando, assim, o sinal a partir de amostras com pouquíssimos agentes. Entretanto, 
culturas demoram. Dependendo do patógeno, culturas podem ser positivas tão precocemente como 
quatro a seis horas ou tão demoradas como semanas, e os testes fenotípicos podem demorar mais 
24 ou 48 horas. Em algumas circunstâncias, como bacteremias, a identificação e o tratamento adequado 
são aspectos críticos e mostram claramente que, a cada hora de demora no tratamento adequado de 
uma septicemia, a mortalidade aumenta de 10 a 20%. O tempo de hospitalização e o preço de uma 
internação igualmente diminuem com a identificação precoce da etiologia de uma sepse. Novos métodos 
diagnósticos, que não dependam do crescimento da bactéria ou fungo e que inclusive sejam efetivos 
quando os patógenos não estão viáveis, têm sido desenvolvidos. Os que utilizam ácidos nucleicos já 
estão em uso clínico, mas, apesar de serem mais rápidos que culturas, demandam tempo de técnico e 
pelo menos 6 a 8 horas de trabalho, com profissional dedicado. Um grande progresso é o uso de estudos 
proteômicos para diagnóstico rápido – tão rápido como 5 a 15 minutos – na etiologia de infecções. 
Maldi-TOF consiste num sistema no qual o material biológico (uma colônia ou um concentrado 
de hemocultura) é colocado em uma placa em que há a matriz polimérica. Isso é irradiado com um 
laser que vaporiza a amostra e há ionização de várias moléculas, que são aspiradas num tubo de vácuo 
e levadas a um detector: conforme a molécula, o tempo de chegada ao detector (time of flight) é 
diferente. Isso é colocado em gráfico, dando vários picos e, para cada espécie bacteriana ou fúngica, 
obtém-se um gráfico específico. Uma base de dados computadorizada interpreta e fornece o resultado 
– tudo com muita rapidez. Trata-se, portanto, de uma aplicação da espectrometria de massa. Essa 
técnica permite diagnósticos microbiológicoscomplexos, como a especiação correta dos estafilococos 
coagulase negativos ou a sorologicamente lenta e sujeita a erros definição dos vários sorovariantes da 
Salmonella entérica. 
O diagnóstico de fungos de importância médica e de micobactérias é possível. À medida que o uso 
dessa técnica aumenta, os bancos de dados ficam mais completos, e a identificação, melhor. Os bancos 
de dados são proprietários, o que é uma desvantagem quando comparados aos bancos de dados de 
ácidos nucleicos, como o blast, que são públicos e de uso livre, mas sujeitos de depósitos errados e 
alterações. Já os bancos de dados proteômicos, por ora, são mais cuidados.
O sistema WalkAway inclui software projetado para simplificar o fluxo de trabalho e minimizar a 
interação do tecnólogo enquanto hospeda diferentes ambientes regionais e institucionais por meio de 
recursos de personalização extensivos. O sistema, em resumo: 
• Processa painéis de identificação rápida e especialidade para redução de velocidade quando a 
velocidade é importante.
• Fornece uma precisão de padrão ouro para a identificação de microrganismos e testes de susceptibilidade.
31
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
• Permite o processamento simultâneo de painéis convencionais, rápidos e especiais em uma única 
plataforma automatizada. 
• Fornece uma detecção de resistência emergente precisa para os agentes patogênicos mais difíceis, 
incluindo ESBL, Visa, VRSA e MRSA.
O sistema AutoSCAN-4 faz parte do Sistema de Microbiologia MicroScan, simplificando a 
identificação e testes de susceptibilidade aos antibióticos (ID/AST) enquanto padronizam os resultados 
ao processar painéis em segundos. O sistema autoSCAN-4 inclui projetado para simplificar o fluxo 
de trabalho, ao mesmo tempo que possui diferentes ambientes regionais e institucionais por meio de 
recursos de personalização extensivos:
• A operação é fácil de aprender e usar, com treinamento mínimo.
• Automação econômica para baixos volumes.
• Processa painéis convencionais com concentrações inibitórias mínimas (MICs) diretas e não 
identificadas (ID) para ajudá-lo a entrar na resistência emergente.
• Processa os painéis de ID especiais para uma reviravolta reduzida quando a velocidade importa.
• Os diagnósticos remotos opcionais fornecem um nível adicional de capacidade de resposta 
do serviço.
 Observação
Apesar de os métodos automatizados estarem se difundindo de forma 
bastante importante em razão da demanda por resultados em menor prazo, 
o conhecimento do profissional continuará sendo essencial até mesmo 
para a programação da automação, bem como análise dos resultados 
por ela fornecidos.
1.4 Introdução à coleta de material biológico para prática em microbiologia clínica
Será abordado breve resumo sobre os principais aspectos inerentes à coleta de material biológico na 
prática da microbiologia clínica, salientando que, mais adiante, aos descrever os principais protocolos 
adotados no diagnóstico, iremos aprofundar a discussão sobre os critérios e qualidade da amostra para 
realização de cada procedimento de forma específica.
A coleta e o transporte das amostras representam um ponto crítico na microbiologia, pois a qualidade 
desses serviços pode, ou não, alterar nos resultados. Se a instituição não recebe a amostra de forma 
adequada, a informação repassada, em muitos casos, pode confundir ou desviar do verdadeiro resultado. 
32
Unidade I
Fatores que podem comprometer o exame microbiológico: hipótese diagnóstica mal elaborada, 
informações mal colhidas, incompletas ou não devidamente interpretadas etc.; requisição inadequada da 
análise laboratorial; coleta, conservação e transporte inadequados; falhas técnicas no processamento 
da análise; demora na liberação de resultado; má interpretação dos resultados. 
As informações básicas que devem constar da requisição médica são: 
• identificação clara do paciente: nome e sobrenome; 
• registro no hospital ou serviço; 
• data de nascimento (evitar confusão com homônimos e informações importantes relacionadas à 
faixa etária); 
• sexo (por exemplo, a interpretação de bacteriúria pode ser diferente para a mulher); clínica, leito 
ou ambulatório; 
• espaço para identificação do exame (número da análise microbiológica e seção do laboratório). 
São informações relevantes para o diagnóstico do processo infeccioso: 
• Dados gerais sobre o paciente.
• Hipótese diagnóstica.
• Dados clínicos (descrever objetivamente os achados clínicos mais significativos, lesões cutâneas 
ou de mucosas, local e características do sítio de infecção etc.).
• Dados epidemiológicos relevantes (viagem ou excursão, se vive em área endêmica de alguma 
doença infecciosa - malária, riquetsioses, cólera etc.), doença ocupacional (contato com animais, 
por exemplo), acidentes (mordida, trauma, picada de carrapato, enchentes etc.), envolvimento em 
surto de infecção hospitalar etc.
• Dados laboratoriais que evidenciem o sítio do processo infeccioso (RX, tomografia, urina rotina, 
hemograma etc.);
• Provável origem do processo infeccioso comunitário ou hospitalar. Se hospitalar: relacionado 
a procedimento invasivo (sonda vesical, cateter, traqueostomia, diálise, alimentação parenteral, 
cirurgia). 
• Existência de infecção em outra topografia? Qual? Uso de antibióticos nos últimos 10 dias (por 
que e quais?).
33
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
• Paciente com comprometimento imunológico ou com algum fator predisponente à infecção 
oportunista (prematuridade, transplante de órgãos, uso de droga imunossupressora, diabetes, 
câncer, aids, leucemia, anemia falciforme, talassemia, hemofilia, esplenectomia, cirrose etc.) 
Suspeita de doença oportunista. Qual? 
• Paciente transferido ou de alta nos últimos 30 dias de outro hospital? É colonizado ou infectado 
ou portador de bactérias multirresistentes? 
• Data do pedido médico, nome legível do médico, carimbo e/ou ramal de contato (facilita a 
comunicação para situações emergenciais como isolamento de M. tuberculosis, isolamento de 
nova cepa multirresistente etc.). 
• Data e hora da coleta e nome de quem colheu o material (permite reavaliação de procedimentos 
e reciclagem, por exemplo, quando se detecta excesso de contaminação em uroculturas etc.). 
• Comentários, quando necessários, sobre o procedimento de coleta. Por exemplo, acidentes ou 
dificuldades para obtenção do material, condições do paciente, quantidade etc. No caso de 
suspeita de infecção urinária, informar se o paciente é sintomático ou não.
O profissional responsável pela coleta será também responsável por identificar de forma legível e correta 
o material a ser encaminhado ao laboratório de microbiologia. Na amostra, devem estar identificados: 
• nome e registro do paciente; 
• leito ou ambulatório e especialidade; 
• material colhido; 
• data, hora e quem realizou a coleta; quem colhe o material deve ser devidamente treinado e 
periodicamente reciclado nessa atividade. 
Deve-se lembrar que o envolvimento do médico com o laboratório de microbiologia pode, com 
frequência, ser muito útil para ambos, propiciando melhor orientação técnica, mais objetividade, 
facilitando a interpretação de resultados etc. A importância do relacionamento médico e laboratório 
deve-se ao fato de que a microbiologia envolve etapas interpretativas para muitos exames, como aqueles 
que envolvem microbiota (mucosas) ou no caso de agentes específicos em que são fundamentais escolha 
de meios seletivos, uso de meios enriquecedores, uso de suplementos, ampliação do tempo de cultivo, 
variação na temperatura de incubação, adição de novos testes etc. 
A coleta de todo tipo de material biológico, visando a sua análise, deve ser realizada seguindo 
minimamente os critérios a seguir: 
• Evitar a contaminação com microrganismos ao redor da área/sítio de coleta. 
34
Unidade I
• Selecionar a área correta de onde se quer obter as amostras e utilizar a técnica apropriada.
• Coletar o volume necessário para análise, pois, caso a quantidade seja insuficiente,os resultados 
podem ser prejudicados.
• Identificar a amostra com a data de coleta, local, quem coletou e a quantidade coletada.
• Colocar a amostra em recipiente apropriado.
• Evitar derramar a amostra, com a finalidade de garantir um resultado seguro.
• Imediatamente após a coleta, as amostras devem ser colocadas ao abrigo de luz solar e 
acondicionadas, normalmente, em refrigeração.
A coleta de amostras biológicas inclui sangue, fezes, urina, secreções, entre outras. Para a coleta 
de sangue, é necessário realizar uma punção arterial, capilar ou venosa; em alguns casos, é necessário 
estar em jejum. Conforme o sítio anatômico e a amostra a ser coletada, será preciso utilizar uma 
técnica e material específicos para cada procedimento. O profissional deve estar ciente que diversos 
fatores podem afetar diretamente o resultado ou a eficácia do tratamento que será dado ao paciente 
e, portanto, é fundamental conhecer esses fatores, por exemplo, evitar a contaminação da amostra, 
coletando material diretamente do sítio real da infecção. 
Bactérias da microbiota normal humana podem ser coletadas equivocadamente, gerando um 
resultado errôneo com consequente indicação incorreta de tratamento, em alguns casos, podendo 
acarretar danos ao paciente.
Quando possível, o material deve ser coletado no momento ideal, visto que, em uma determinada 
fase do processo infeccioso, existe aumento populacional microbiano. O que pode aumentar as chances 
de detecção do microrganismo, mas, para que se encontre o momento ideal, é necessário entender o 
desenvolvimento da doença. 
O número de amostras contínuas pode maximizar o resultado. Por exemplo: amostras de escarro nas 
primeiras horas do dia, por três dias consecutivos, ampliam o número de casos positivos na pesquisa 
de tuberculose.
Deve-se colher de preferência as amostras antes do início da administração de antibióticos, uma 
vez que a antibioticoterapia diminuirá o número de microrganismos, provocando um resultado 
falso negativo.
Para particularidades no procedimento, como na coleta da urina, é necessário que haja assepsia 
do local antes da micção, e que seja desprezado o primeiro jato, para que não haja interferência nos 
resultados. Para a coleta de secreções, é necessário utilizar swab, agulha ou outro tipo de coletor. Esses 
pontos são essências para identificação correta dos microrganismos.
35
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
A grande dificuldade na etapa de transporte é manter a condição natural da amostra. Com esse 
propósito, é necessário evitar que a amostra fique exposta ao frio e/ou ao calor excessivo. Deve seguir as 
especificações para cada tipo de amostra, por exemplo, frasco com escarro não precisa de refrigeração 
se for brevemente processado. Amostras de urina devem ser transportadas o quanto antes, uma vez que 
há degradação e fácil contaminação.
Amostras devem ser bem embaladas para evitar o vazamento. Deve ser utilizado o recipiente ideal 
para determinado tipo de amostra, de acordo com o exame que será realizado. Meios de transporte 
permitem manter a integridade da amostra por mais tempo, os mais utilizados são Stuart, Amies e 
Carey-Blair.
Transportar as amostras imediatamente ao laboratório para: 
• assegurar a sobrevivência e isolamento do microrganismo, pois o laboratório de microbiologia 
trabalha basicamente em função da viabilidade dos microrganismos; 
• evitar o contato prolongado dos microrganismos com anestésicos utilizados durante a coleta, pois 
eles poderão exercer atividade bactericida;
• evitar erros de interpretação nas culturas quantitativas, principalmente urina e lavado 
bronco alveolar. 
1.5 Resistência bacteriana aos antimicrobianos e microrganismos multirresistentes 
– condutas do laboratório de microbiologia clínica em infecções hospitalares 
O conhecimento do fenômeno de resistência bacteriana data do início da era microbiana. Com 
a introdução das primeiras substâncias químicas com finalidades terapêuticas, observou-se que 
determinadas populações bacterianas expostas a diferentes agentes sobreviviam a essa exposição. 
As espécies bacterianas podem apresentar duas formas de resistência, a natural ou intrínseca 
e a adquirida. A resistência adquirida é, sem dúvidas, a forma mais preocupante. Ela é descrita em 
praticamente todas as espécies de bactérias e já são conhecidos muitos dos mecanismos envolvidos 
nesses processos. Sabe-se, também, que a capacidade de as bactérias serem resistentes a diferentes 
antibacterianos não é uma propriedade nova ou particular de determinada espécie. Fatores como uso 
empírico de antibacterianos contribuem de forma considerável para o surgimento desses fenômenos 
de resistência. As bactérias têm a capacidade de se comunicar entre indivíduos da mesma espécie e 
ou de espécies diferentes e, por meio dessa interação procariota, ocorre a transferência de elementos 
genéticos móveis capazes de modificar tanto a sua estrutura celular como levá-la a produzir substâncias 
capazes de neutralizar a ação dos antibacterianos.
Vários são os mecanismos de resistência desenvolvidos, entre eles, destacam-se: a capacidade de 
reduzir purinas, impedindo a penetração do fármaco na célula bacteriana; a superexpressão de bomba 
de efluxo, promovendo a expulsão do fármaco da célula bacteriana; a modificação de estruturas 
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Unidade I
responsáveis pela formação da parede celular, como as proteínas ligadoras de penicilina (PBPs) e a 
produção de enzimas capazes de promover a hidrólise dos fármacos, como as betalactamases. 
Existem quatro técnicas recomendadas para a avaliação do perfil de sensibilidade bacteriano, 
são elas: 
• técnicas de microdiluição;
• técnicas de macrodiluição; 
• etest;
• difusão em ágar. 
As técnicas de macrodiluição, microdiluição e etest têm como princípio e objetivo determinar a 
concentração inibitória mínima (CIM) do fármaco capaz de destruir e/ou de impedir o crescimento 
bacteriano. A técnica de disco-difusão em ágar, também conhecida como técnica de disco-difusão 
de Kirby-Bauer, fornece um resultado qualitativo do potencial antibacteriano por meio da ausência, 
presença ou presença reduzida de um halo de inibição de crescimento. 
No método de Kirby-Bauer, com o auxílio de uma alça bacteriológica, toca-se a superfície de 
4 a 5 colônias bacterianas de aspecto similar, a fim de obtenção do inóculo. Após a realização desse 
processo, transfere-se esse inóculo para um tubo contendo 5 ml de solução salina estéril, ajustando a 
turvação para 0,5 da escala McFarland, que corresponde a uma quantidade de 108 UFC/ml. Submergir 
a essa suspensão um swab, também conhecido como ceconete, eliminar todo o excesso de líquido, 
pressionando-o contra a parede interna do tubo. Em seguida, realiza-se um semeio do tipo distensão 
na placa de ágar Muller-Hünton, de modo a cobrir todo o espaço da superfície do ágar com a 
suspensão bacteriana.
Passado esse procedimento, recolocar a tampa da placa e deixar em repouso por 5 minutos para 
a secagem do ágar, antes da colocação dos discos de antibióticos. A escolha do antibacteriano 
deverá obedecer às recomendações do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Os discos 
de antibióticos devem ser colocados de forma manual sobre a superfície do meio, com auxílio de 
pinça estéril, respeitando um distanciamento de 20 mm um do outro. Feito isso, os discos devem 
ser pressionados à superfície do meio com a ponta da pinça. Após essa etapa, as placas devem ser 
incubadas em estufa bacteriológica em temperatura de 35 °C por um período de 18 h. Passado o 
período de incubação, faz-se a medição do diâmetro da zona de inibição do crescimento bacteriano 
ao redor de cada disco de antibiótico, caso ela seja formada, como pode ser observada a seguir.
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MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Figura 15 – Teste de disco-difusão de Kirby Bauer, indicando pela seta como é realizada a medição do halo
Adaptada de: Rodrigues (2014). 
A seguir, uma relação de alguns antibacterianos recomendados para teste pela técnica