Aula Prática - Espectrofotometria, Curva de calibração, Det TP e albumina

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Professor Rogério Argeri
https://www.youtube.com/watch?v=ZEyqo2XaKes
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ANÁLISES CLÍNICAS I
Introdução à espectrofotometria. Curva de calibração
Determinação de proteínas e albumina.
Blackboard (Disponível: biblioteca virtual)
 Livro disponível no blackboard (Disponível: biblioteca virtual):
 McPherson RA, Diagnósticos clínicos e tratamento por métodos laboratoriais de Henry. 21ª ed. 
 Análise: princípios de instrumentação → (Páginas: 37 a 45)
 Análise: automação do laboratório clínico → (Página: 65 )
Objetivos da aula:
1. Compreender o PRINCÍPIO DA ESPECTROFOTOMETRIA (video 1 e 2)
2. Identificar os componentes do espectrofotômetro
3. Compreender a importância clínica do exame de Proteínas Totais e Frações
4. Realizar o preparo da reação de PROTEÍNAS TOTAIS
5. Realizar a leitura espectrofotométrica da reação de proteínas totais
ITERVALO
1. Realizar o preparo da reação de ALBUMINA
2. Realizar a leitura espectrofotométrica da reação de de albumina
3. INTERPRETAR OS RESULTADOS obtidos, em ambas reações, bem como, discutir o
significado clínico de resultados anormais
4. Compreender a importância da utilização da CURVA DE CALIBRAÇÃO.
Princípio da Espectrofotometria
Distância da luz 
percorrida no 
interior da cubeta.
Concentração da 
amostra no 
interior da cubeta.
❑ A quantidade de luz absorvida (ou a cor da solução), é
proporcional à concentração da substância corada em solução.
✓ a concentração de uma substância é diretamente
proporcional à intensidade de luz absorvida ou
✓ inversamente proporcional ao logaritmo negativo da
luz transmitida.
Quantifica a CONCENTRAÇÃO
✓ dos substratos consumidos ou
✓ dos produtos formados.
Aplicação da Espectrofotometria (UV-VISÍVEL) 
UV → Soluções incolores: o produto final é incolor. Mede a luz absorvida pelos
nucleotídeos NAD+ e NADH nas formas oxidadas e reduzidas, respectivamente, na
região ultravioleta (UV) (λ 340 nm).
✓ Exemplos são os métodos de dosagem das enzimas: TGO, LDH e CK.
Visível → Soluções coradas: o produto final é corado. Mede a luz absorvida pela
solução na região visível (λ 400-750 nm).
✓ Exemplos são os métodos para dosagem de glicose, ácido úrico e triglicerídeos.
100-400 nm
✓ A luz, fornecida por uma LÂMPADA, é fracionada pelo PRISMA ou rede de
difração (monocromador) nos comprimentos de onda que a compõem (luzes
monocromáticas).
✓ O comprimento de onda selecionado (FENDA DE SAÍDA) é dirigido para a solução
contida em um recipiente transparente (CUBETA).
✓ Parte da luz é absorvida e parte é transmitida.
✓ A redução da intensidade luminosa é medida pelo DETECTOR (célula fotelétrica). O
sinal elétrico amplificado é visualizado no galvanômetro em números, e lido como
uma absorbância, que é proporcional à concentração da substância absorvente
existente na cubeta.
Componentes do Espectrofotômetro 
❖ Quando se realiza uma medida fotométrica deve-se utilizar uma faixa do espectro
na qual a energia radiante seja absorvida ao máximo ou aproximadamente ao
máximo a fim de se obter o mais alto grau de sensibilidade.
❖ Uma solução azul absorve o vermelho com maior intensidade e, portanto, deve ser
escolhida a porção vermelha para medida de solução azul.
❖ Na maioria das determinações colorimétricas utiliza-se sempre uma faixa espectral
cuja COR É COMPLEMENTAR à da solução a ser medida.
Seleção da Região Espectral 
Vídeo 1
Vídeo 2
Reagente de Biureto: sulfato de cobre 
+ hidróxido de sódio (530-550nm)
Reagente : Verde de Bromocresol
(600-640nm)
Importância clínica: exame Proteínas Totais e Frações
✓ O laboratório de bioquímica quantifica rotineiramente as concentrações
de “PROTEÍNAS TOTAIS” e de “ALBUMINA”.
✓ A fração de globulina é relatada nos laudos fazendo a diferença entre:
[Proteínas Totais] – [Albumina] = Globulinas plasmáticas
Importância clínica: exame Proteínas Totais e Frações
Importância clínica: exame Proteínas Totais e Frações
A eletroforese de proteínas separa e
quantifica, além da albumina, quatro
ou mais grupos de globulinas.
Globulinas: têm funções no transporte
de metais, lipídeos e bilirrubina;
também refletem a resposta
imunitária e inflamatória.
Prática: Realização do exame de Proteínas Totais
Reagente de cor
Padrão
Cálculos: Proteínas totais
Utilizando a Regra de três:
• Concentração Padrão (descrito na bula) = 4,0 g/dl
• Absorbância do Padrão = 0,1
• Absorbância da Amostra = 0,23
Abs. g/dl
Padrão 0,1 4,0
Amostra 0,23 X
→ 0,1X = 0,23 x 4,0
X= 0,92/0,1
X= 9,2 g/dl de Proteínas totais
Utilizando Fator:
Fator = Concentração do Padrão 
Absorbância do Padrão
Fator = 4,0 = 40
0,1
Fator x Absorbância Amostra
→ 40 x 0,23 = 9,2 g/dl de Proteínas totais
Prática: Realização do exame de Albumina
Reagente de cor
Padrão
Cálculos: Albumina
Utilizando a Regra de três:
• Concentração Padrão (descrito na bula) = 3,8 g/dl
• Absorbância do Padrão = 0,43
• Absorbância da Amostra = 0,4
Abs. g/dl
Padrão 0,43 3,8
Amostra 0,4 X
→ 0,43X = 0,4 x 3,8
X= 1,52/0,43
X= 3,53 g/dl de Albumina
Utilizando Fator:
Fator = Concentração do Padrão 
Absorbância do Padrão
Fator = 3,8 = 8,83
0,43
Fator x Absorbância Amostra
→ 8,83 x 0,4 = 3,53 g/dl de Albumina
Cálculo de globulinas:
• Concentração de Proteínas Totais = 9,2 g/dl
• Concentração de Albumina = 3,53 g/dl
Globulinas = [Proteínas Totais] – [Albumina]
Globulinas = 9,2 - 3,53
Globulinas = 5,67 g/dl
Cálculos: Globulinas
Tipo de reação: ponto final 
1. Descreva o princípio metodológico de cada exame realizado (fornecidos
nas bulas dos reagentes)
2. Descreva os valores de referência dos exames realizados (fornecidos nas
bulas dos reagentes).
3. Realize a interpretação clínica dos resultados obtidos.
4. Proteínas totais – (menos) albumina = ?outras proteínas séricas? Descrever
estas outras proteínas e o valor de referência.
5. Discuta a importância de dosar outras proteínas além da albumina.
6. Relacione (sugerir) os exames complementares que poderiam ser
solicitados/realizados para identificar as demais proteínas.
7. Descrever como pode ser interpretado um exame de eletroforese de
proteínas.
Discussão da atividade
Curva de calibração
Frequentemente existe uma relação LINEAR até uma determinada [ ] ou absorbância.
✓ Neste caso, a reação obedece a Lei de Beer até este ponto.
✓ Sendo assim, um FATOR DE CALIBRAÇÃO pode ser usado para calcular a
[amostra] desconhecida pela comparação com um calibrador.
25 50 100
Concentração de Glicose em mg/dl
Abs Padrão
[ ] Padrão
Abs amostra x Fator
Curva de calibração na prática laboratorial
Com a CURVA DE CALIBRAÇÃO, em qualquer
ponto, o fator será sempre o mesmo:
4/0,3 = 13,33
2/0,15 = 13,33
1/0,075 = 13,33
0,5/0,0375 = 13,33
Logo:
Fator x Abs amostra paciente
13,33 x 0,439 = 5,85 g/dl
Curva de calibração na prática laboratorial
Absorbância
[g/dl]
Com a EQUAÇÃO DA RETA, podemos calcular
a [amostra] a partir de uma absorbância:
y = 0,0887x - 0,0081
x = y + 0,0081
0,0887
Substituindo y (Abs amostra paciente)
x = 0,439 + 0,081
0,0887
x = 5,86 g/dl
eixo X
eixo Y
Controle da Qualidade
“Utilizado para avaliar se o sistema analítico está operando 
dentro dos limites de tolerância pré-definidos”.
Valor alvo
Limite superior do 
desvio aceitável
Limite inferior do 
desvio aceitável
“Não olhe para trás e lamente o passado por não existir mais, e não se aflita porque o futuro ainda está por vir.
Viva no presente, e o torne tão bonito que valerá a pena ser relembrado.”
Ida W. Scott Taylor
MUITO OBRIGADO!
http://pensador.uol.com.br/autor/ida_w_scott_taylor/