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Resumo Método e Técnicas em Analises Clinicas: Aula 1- Métodos de diagnóstico sorológico: • Reação da inibição da hemaglutinação. • ELISA. • Imunocromatografia. • Imunoblot(Western Blot). Princípio das técnicas sorológicas: • Interação antígeno (presentes nos reagentes) e anticorpo (presentes na amostra biológica. • Antígeno: qualquer substância que, sob condições apropriadas, é capaz de estimular a formação de anticorpos. • Anticorpo: proteína que é formada em resposta à exposição de um antígeno e reage especificamente com este, formando imunocomplexos. • Forças de ligação envolvidas nas reações: Forças de Vander Waals: As forças de atração ou repulsão entre entidades moleculares (ou entre grupos dentro da mesma entidade molecular)diferentes daquelas que são devidas à formação de ligação ou a interação eletrostática de íons ou grupos iônicos uns como outros ou com moléculas neutras. Ligações de Hidrogênio: As ligações de hidrogênio são o tipo de força intermolecular mais intenso, que ocorre entre dipolos permanentes das moléculas, em que o polo positivo é sempre o hidrogênio, e o polo negativo pode ser o flúor, o oxigênio ou o nitrogênio • Estabelecer um diagnóstico 1. Teste padrão (“padrão ouro”)! Serve para comparar com o teste em questão e avaliar sua exatidão. 2. SENSIBILIDADE: é a probabilidade de um teste dar POSITIVO dado que o individuo tenha a doença. VP/TOTAL DE DOENTES 3. ESPECIFICIDADE: é a probabilidade de um teste dar NEGATIVO dado que o individuo NÃO tenha a doença. VN/TOTAL DE NÃO DOENTES Reprodutibilidade! Refere-se à obtenção de resultados iguais em testes realizados com a mesma amostra, por pessoas diferentes em locais diferentes Curva Roc! são uma forma de representar a relação, normalmente antagônica, entre a sensibilidade e a especificidade de um teste diagnóstico quantitativo, ao longo de um contínuo de valores de "cutoffpoint". Linearidade! A capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado. Aula 2- Mecanismos imunológicos aplicados ao diagnostico molecular das doenças IMUNOGLOBULINAS: IgA-predominante nas lágrimas, saliva, leite materno, secreções respiratórias e trato gastrointestinal. Fornece proteção contra organismos que invadem estas áreas. IgG-também chamada de gama globulina. Fornece imunidade a longo prazo. É a única que atravessa a placenta e fornece ao recém nascido a imunidade que vai durar vários meses. IgM-primeira produzida em resposta a um antígeno, mas não fornece imunidade a longo prazo. IgE-está envolvida nas reações alérgicas e nas infecções parasitárias. • IgG negativo (não reagente) e IgM negativo (não reagente): indicam que o paciente nunca entrou em contato com o agente patogênico (agente causador da doença), ou seja, nunca foi nem vacinado nem contaminado. • IgGnegativo (não reagente) e IgMpositivo (reagente): indicam infecção aguda (ou seja, iniciada há dias ou semanas). • IgGpositivo (reagente) e IgMnegativo (não reagente): indicam infecção antiga (com meses ou anos) ou que a pessoa foi vacinada e o organismo teve sucesso na produção de anticorpos • IgGpositivo (reagente) e IgMpositivo (reagente): infecção recente (semanas ou meses). Métodos de Imunoensaios Reagentes não-marcados: • Precipitação: Reação de precipitação em gel Imunodifusão radial (Método de Mancini) • Quantificação do Ag ou Ac-> utilização :dosagem de proteínas séricas • Ac incorporado ao ágar->diluições do Ag padrão são colocadas nos orifícios- >incubação em câmara úmida ->precipitação-> formação de halos • Mede o diâmetro do halo após a incubação (48/72h) Imunodifusão dupla: • eletroforese do Ag e do Ac, simultaneamente, que migram em direções opostas a partir de orifícios separados do gel. • Utilizado para identificação rápida de Ag de bactérias associadas a meningite, septcemia, pneumonia, etc. Aglutinação :formação de agregados visíveis, como resultado da interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis que contem determinantes antigênicos na sua superfície. Tipos de reação de aglutinação: 1. Aglutinação direta! tipagem sanguínea , Teste de Widal para salmoneloses,teste de aglutinação para toxoplasmose e tripanossomíase • Aglutinação indireta • Ag solúveis adsorvidos na superfície da partículas inertes • -hemácias–hemaglutinação-um dos melhores suportes • outros suportes: látex, carvão ,gelatina e sepharose • detecta IgG eIgM • lâmina ou microplaca em“V”ou“U” • Uso:diagnóstico da toxoplasmose ,doença de Chagas,fator reumatóide(FR),proteína C reativa(PRC), ASLO Diagnóstico da sífilis • Testes não treponêmicos qualitativos–rotineiramente utilizados como testes de triagem para determinar se uma amostra é reagente ou não; quantitativos–são utilizados para determinar o título dos anticorpos presentes nas amostras que tiveram resultado reagente no teste qualitativo e para o monitoramento da resposta ao tratamento metodologias utilizadas nos testes existentes para o diagnóstico da sífilis: 1. Microscopia ! a fresco em campo escuro, Coloração (Fontana-Tribondeaux ou Imunfluorescência Direta Nos testes não treponêmicos: Floculação! VDRL; RPR;USR;TRUST; Aglutinação!Testes Rápidos –TR Imunoenzimáticos (ELISA)! Eliza Imunocromatográficos! Testes Rápidos –TR Hemaglutinação(HA) ! Reação que gera agregação de eritrócitos devido à presença de anticorpos(ou vírus ou lecitinas). ! Quando na ausência de agente hemaglutinante (anticorpo),as hemácias sedimentam na forma de botão e quando há aglutinação as hemácias sedimentam na forma de tapete(difusa). Radio imunoensaio (RIA) ! Método de doseamento de um antígeno ou de um anticorpo utilizando um antígeno radioativo. O radioimunoensaio é utilizado para dosear inúmeras substâncias do sangue circulante (hormônios) Vantagens: –Alta sensibilidade –Permite medidas rápidas e precisas ou fármacos, por exemplo Desvantagens: –Custo –Vida média dos reagentes –Risco operacional(radiação) Técnica : 1- sensibilização da placa com antígeno 2- lavagem 3- adição do anticorpo teste 4- lavagem 5- adição do ligante marcado 6- lavagem 7- medida do marcador Fluorescência! Fluorescência é um processo onde um elemento chamado fluorocromo absorve energia na forma de espectro luminoso,tornando-se eletricamente“excitado”;ao liberar essa energia emitem luz num comprimento de onda específico. A imuno fluorescência é uma técnica baseada na ligação de anticorpos com fluorocromos. A imuno fluorescência pode ser direta ou indireta. Direta : Aplicações: -Detecção direta de microrganismos (secreções, urina, cortes de tecidos); -Identificação de subpopulações de linfócitos; -Fenotipagem de células tumorais Ex.:Detecção de Chlamydia trachomatis em secreção uretral Indireta: Aplicações: -Detecção de anticorpos específicos contra diversos microrganismos; -Diagnóstico de doenças auto-imunes; QUIMIOLUMINESCENTE AUTOMATIZADO: A técnica se baseia na ligação de antígeno-anticorpo, um dos reagentes é conjugado a uma substancia que, quando ativada emite uma luz visível Imunoensaio de micropartículas (MEIA): caracteriza-se por um ensaio imunoenzimático com a fase sólida sendo constituída de partículas de látex revestidas com molécula de captura específica para o analito a ser determinado. Colorimetria: Método de análise quantitativa que se baseia na comparação da cor produzida por uma reação química com uma cor padrão. De acordo com a intensidade da cor produzida, infere-se a concentração do determinado analito(substância que se quer analisar) Nefolometria: A Nefelometria é uma técnica para medir as concentrações de IgA,IgM e IgG e outras proteínas plasmáticas de uma amostra.Um aparelho específico que mede a turbidez é utilizado e mede a difração(desvio)da luzao passar por uma solução contendo complexos imunológicos. Eletroquimioluminescência: Utiliza a emissão de luz através da aplicação de potenciais de oxidação ou redução a um eletrodo imerso em soluções que emitem radiação(em geral compostos de rutênio) Western Blotting é utilizada para detectar e quantificar proteínas em amostras de células ou tecidos biológicos. Sua finalidade é compreender a quantidade de proteínas específicas na amostra em questão. Assim, é possível analisar os resultados do que se está pesquisando. Por exemplo, após a aplicação de uma vacina cujo objetivo é aumentar a quantidade de uma proteína X, é possível compreender se isso aconteceu de fato. Ensaio Imunoenzimático (ELISA): é um teste sorológico imunoenzimático cuja metodologia se baseia em reações antígeno- anticorpo detectáveis através de reações enzimáticas. Aula 3- Teste Rápido: • Testes rápidos são aqueles cuja execução,leitura e interpretação dos resultados são feitas em,no máximo,30minutos. Além disso,são de fácil execução e não necessitam de estrutura laboratorial. Por que usar testes rápidos? PODEM SER FEITOS EM QUALQUERLOCAL •NÃO NECESSITAMEQUIPAMENTOS •PODEM UTILIZAR DIFERENTES TIPOS DE AMOSTRAS: ➢Plasma➢Sangue total➢Fluido Oral➢Urina➢Fezes Qual profissional pode realizar? Qualquer profissional de saúde(técn .Enfermagem ,médico ,enfermeiro, biomédico). Quais pessoas devem ser testadas? • Priorizar gestantes. • Qualquer pessoa desde adolescência pode realizar. • Toda gestante deve ter realizado teste HIV e SÍFILIS no pré-natal. • Oferecer já no primeiro contato,antes mesmo da 1ªconsulta. • Registrar no prontuário e cartão pré-natal. • NÃO PRECISA TER CONSENTIMENTO POR ESCRITO • NÃO PRECISA DE AUTORIZAÇÃO DOS RESPONSÁVEIS Quais unidades podem solicitar os testes? Toda unidade de atenção primária e secundária deve ter estoque disponível Tipos de testes rápidos: Características: utilizam uma membrana de nitro celulose subdividida em quatro áreas. ×Área de amostra(A), onde é aplicada a amostra e a solução tampão. ×Área intermediária(I), que contém o conjugado, geralmente com posto de ouro coloida ligado a anticorpos(imunoglobulinas). ×Área de teste(T), que contém os antígenos fixados à membrana de nitrocelulose, onde se lê o resultado da amostra testada. ×Área de controle(C), local de controle da reação e que permite a validação do teste. Reagente:×Quando houver formação de duas linhas coloridas: uma, na área de teste(T) e outra, na área de controle(C). ×Não reagente: ×Quando houver formação de uma linha colorida, somente na área de controle(C). ×Inválido: ×Quando não houver linha colorida, na área de controle(C). Aula 4- Microbiologia Técnicas Gestão das fases pré-analítica, analítica e pós-analítica no setor de microbiologia: • A fase pré-analítica diz respeito às etapas iniciais que antecedem a análise laboratorial: indicação do exame, escrita da receita, preparo do paciente, procedimentos de coleta, acondicionamento, transporte e preparo da amostra. • A fase analítica, segunda fase dos exames laboratoriais, como o próprio nome sugere, é dedicada à análise do material coletado. • A fase pós-analítica, última etapa dos exames laboratoriais, inclui a verificação das análises realizadas na fase analítica, o envio dos resultados ao médico e, por fim, a tomada de decisão. Meios de Cultura: • Meios enriquecidos : Aumentam a possibilidade de crescimento da espécie desejada,quando a mesma se encontra em pequeno número Exemplo: ágar sangue e chocolate • Meios seletivos: impedem o crescimento de determinados grupos num inóculo misto,mas permite o desenvolvimento de outros. Exemplo: ágar MacConkey inibe o crescimento de bactérias gram-positivas ,selecionando,assim,as bactérias gram-negativas. • Meio diferencial: permite a distinção dos microrganismos que crescem no referido meio. • Meios indicadores (ou diferenciais): revelam uma propriedade bioquímica, permitindo uma identificação presuntiva. • Meios de transporte: garantem por mais tempo a viabilidade dos microrganismos que não podem ser semeados logo após a coleta e que poderiam morrer. Meios de cultura mais frequentes empregados na rotina microbiológica: 1. Ágar sangue(AS)–meio enriquecido.Cultivo primário da maioria dos espécimes clínicos;verificação de hemólise;prova de satelitismo para identificação presuntiva de Haemophilus influenzae. 2. Ágar chocolate(AC)– crescimento de microorganismos exigentes,tais como Haemophilus spp, Neisseria spp,Moraxella spp,Branhamella catarrhalis avermelhada positiva–coloração Lactoseـ .3 inalterada coloração negativa Lactoseـ× .4 Bacillus e Candida Enterococcus, crescer exceção,eventualmente,podem Comـ× 5. Ágar Salmonela-Shigella(SS)–meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilização de lactose(coloração rósea)e produção de H2S(coloração negra) 6. CLED SELETIVO!Isolar e quantificar microorganismos Gram positivos,Gram negativos e leveduras,a partir,essencialmente da urina. 7. Ágar Thayer Martin Chocolate ou TMM! inibe crescimento de enterro bactérias,Gram positivos,fungos e algumas espécies de Neisserias saprófitas.Enriquecido com a adição de complementos para a recuperação de N.meningitidis e N.gonorrhoeae • TÉCNICAS DE SEMEADURA E ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS Isolamento de um microrganismo: O isolamento consiste na obtenção de uma cultura pura(colônias isoladas de um único microrganismo,separando-o de outros que se encontram no mesmo material). Finalidades do isolamento:Identificação de um microrganismo. Semeadura:Consiste no plantio de um microrganismo em um meio de cultura,a partir de um material contaminado qualquer. Repique: Consiste na transferência de um microrganismo de um meio de cultura para outro. CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DAS COLÔNIAS 1. Puntiforme(<1mm dediâmetro)-colônias muito pequenas,características de bactérias mais exigentes. 2. Pequena(até 2mm de diâmetro)–Shigella e Yersinia costumam crescer em MaCConkey e Salmonella-Shigella como colônias pequenas e lactose negativa 3. Média (até 3mm de diâmetro)–Entero bactérias,não fermentadores e Estafilococos. 4. Grandes(mais de 4mm de diâmetro)–Bacillus spp,algumas enterobactérias como Klebsiella e Enterobacter,o mesmo ocorre com não fermentadores como Pseudomonas Meios não diferenciais –pode-se identificar a coloração características de alguns microrganismos: ×S. aureus –amarelo× Micro coccus–amarelo ×Serratia–avermelhado ×Roseomonas-róseo ×Pseudomonas–diferentes tons de verde e castanho ×Enterococcus casseliflavus–amarelo Meios diferenciais –a coloração da colônia sofre interferência das reações que ocorrem com substratos dos meios de cultura: ×Utilização da lactose no Mac Conkey–vermelho ×Utilização da lactose no CLED –amarelo ×Utilização do manitol em Ágar manitol salgado –amarelo ×Produção de H2S no Hecktoen Enteric e Salmonella-Shigella–negro Hemolise Alfa! hemólise parcial, cor verde Beta! hemólise completa, clareamento Gama! ausência de lise Técnica de GRAM: 1. Cobrir lamina com cristal violeta e deixar por 1min. 2. Escorrer excesso do corante e lavar. 3.Cobrir lamina com Lugol e deixar por 1min. 4.Escorrer excesso do corante e lavar. 5.Cobrir lamina com Eter-acetona e deixar por30s. 6. Escorrer excesso do corante e lavar. 7.Cobrir lamina com Fucsina e deixar por30s. 8 . Escorrer excesso do corante, lavar e deixar secar. Coloração deZiehl-Neelsen: a)Cobrir os esfregaço com fucsina de Ziehl. Aquecer até a emissão de vapores (Não deixar o corante secar). Esperar 5minutos; b)Lavar com água corrente; c)Descorar com álcool (97%), ácido clorídrico(1%); d)Lavar em água corrente; e)Corar com azul de metileno por 1 minuto; f)Lavar e secar; g)Observar ao microscópio as lâminas coradas; h)Como se apresentam os BAAR. Técnicas manuais hematologia : • Eritrócitos ou Hemácias-Avaliado em milhões por mm3.Variade acordo com a altitude.Quando seu número está abaixo do normal,chama-se eritropenia,e acima,eritrocitose. • Hemoglobina :Medida em g/dl.Avalia a proteína que transporta o oxigênio.Usada para definir se há ou não um estado anêmico. • Hematócrito- Avaliado em percentagem(%)e representa a proporção dos glóbulos em cada 100ml de sangue ERITROGRAMA: RBC:número total de eritrócitos; HGB:concentração de hemoglobina; HCT:hematócrito (razão de eritrócitos para volume sanguíneo total); VCM:volume corpuscular médio do eritrócito na amostratotal; HCM:hemoglobina corpuscular média por RBC; CHCM:concentração média de hemoglobina Variações da Série Vermelha: Microcitose-Hemácias abaixo de 80 (adulto) Está Associada à Deficiência de Ferro, Talassemias Macrocitose-Hemácias acima de 100 (adulto). Está Associada à Deficiência de Vitamina B12, Quimioterapia, Doença Hepática, Hipotireoidismo e Mieloma. Hipocromia -Hemácias menos coradas do que o normal. Observa-se na hematoscopiauma aumento do halo central da hemácia. Poiquilocitose-Variação na forma das hemácias. Anisocitose-Variação no tamanho das hemácias. NEUTRÓFILOS: Neutrofilia=Aumentodo nºabsoluto de neutrófilos no sangue. Desvio à esquerda=Aumento do nº de neutrófilos bastonados no sangue. Neutropenia=Diminuição do nº absoluto de neutrófilos no sangue. LINFÓCITOS: Linfocitose=Aumento do nºabsoluto de linfócitos no sangue. Linfocitose sem atipia:hemograma normaliza em semana,ocorre a ausência dos sintomas,após 40 anos investigar LLC. Linfocitose com atipia:comum em mononucleose,HIV e outras infecções Linfocitopenia=Diminuição do nº absoluto de linfócitos no sangue EOSINÓFILOS: Eosinofilia=Aumento do nºabsoluto de eosinófilos no sangue. Causas principais:doenças alérgicas de pele e parasitoses. BASÓFILOS: Basofilia=Aumento do nºabsoluto de basófilos no sangue. Causas principais:LMC MONÓCITOS: Monocitose=Aumento do nºabsoluto de monócitos no sangue Causas principais:monocitoses reacionais nas doenças infecciosas. PLAQUETAS: Trombocitose: -aumento do nºde plaquetas no sangue; -fenômeno reacional,ocorre em resposta a algo; -não representa em si uma resposta hematológica Trombocitopenia: -diminuição do nºde plaquetas no sangue; -achado frequente e importante; -deve ser confirmada com recoleta Hemograma automatizado: • Espectrofotometria:reage como ferro cianeto de potássio,técnica colorimétrica para quantificar a hemoglobina. • Desvio da luz polarizada:quantifica os elementos sanguíneos,distinguindo-os pela complexidade celular devido ao grau de divergência que a célula causa quando o laser incide sobre seu citoplasma. • Impedância:demonstra o volume celular por meio do impedimento da passagem de eletricidade entre dois compartimentos isotonicamente banhados. • Classificação dos leucócitos: Células pequenas: linfócitos Células de tamanho médio: monócitos, eosinófilos, basófilos e blastos Células de tamanho grande: neutrófilos Parâmetros plaquetários: VPM: volume plaquetário médio ×PCT: Plaquetócrito ×PDW: RDW de plaquetas Histograma: •É a curva de frequência da distribuição e tamanho dos eritrócitos, com o volume na abscissa e a frequência na ordenada • Quando a curva situa-se à esquerda,denota-se microcitose e à direita,macrocitose URINÁLISE: • Toda amostra deve: • -Estar sob refrigeração; • -O prazo entre a coleta e o transporte ao laboratório não pode ser superior a 2horas; • -Urina colhida por micção(jato médio)em frasco estéril e de boca larga; EXAME QUÍMICO: tiras reagentes Análise física: cor, aspecto e densidade Análise química: proteínas, glicose, corpos cetônicos, bilirrubina, urobilinogênio, pH e hemoglobina. Análise microscópica: células epiteliais, leucócitos, eritrócitos, cilindros e cristais e outros elementos. Qual é a técnica? Homogeneizar a urina levemente por inversão. -Remover as tiras reativas necessárias para realização dos testes do tubo e fechá-lo imediatamente. -Imergir as fitas reativas completamente por cerca de 1 segundo na amostra de urina não centrifugada,bem homogeneizada. PH: Útil na identificação de cristais e avaliação da função renal geral; NITRITO: Relaciona da com infecção→ bactérias gram negativas produzem nitrito ESTERASE LEUCOCITÁRIA:Relacionada com inflamação e infecção→procurar leucócitos no sedimento PROTEÍNAS: Não é normal ter proteínas na urina;Indicativo de lesão renal em diferentes graus GLICOSE: Não é normal ter glicose na urina;Rim excedeu a capacidade de reabsorção e libera na urina CORPOS CETÔNICOS: Jejum prolongado,acidose diabética. Cetonas são produtos da degradação de ácidos graxos SANGUE: Menstruação, problemas diversos renais, infecção urinária Análise de sedimentos: numero de elementos por campo microscópico • COMO FAZER? - Homogeneizar levemente o sedimento,deixar escorrer o restante do sedimento e colocar uma gota da urina que ficou no fundo do tubo cônico em uma lâmina de vidro. - Acrescentar uma lamínula de 22x22mm. Calculos renais : Forma quando a aumenta concentração de cálcio ou de outros sais na urina Àcido úrico e uratos: sempre coloridos (amarelo pálido ao vermelho pardo Fosfatos: Formados por fosfato triplo, freqüentemente vem misturados com uratos e oxalatos. Oxalato de cálcio: São extremamente duros, pequenos e lisos Carbonato de cálcio: pequenos, esféricos, brancos/ acinzentados Perfil hepático: lesão hepatocelular , cirrose AST: Figado, coração, musculo ,rim, cérebro – liberado quando um dos testes esta alterado ALT: fígado- dano hepático ( hepatite) LDL- colesterol
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