Biotecnologia

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Biotecnologia 
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/ Isolamento de trechos determinados do DNA de um organismo 
e sua inserção no DNA de outro 
 
Enzimas de restrição 
/ Fragmentam o DNA dos cromossomos na interfase em locais 
específicos, permitindo o isolamento do trecho do material 
genético 
⁃ Bactérias: a enzima faz parte dos mecanismos de defesa contra 
os vírus, cortando o DNA viral e tornando-o inativo 
0As enzimas são isoladas das bactérias e purificadas 
\ São comercializadas por grandes empresas da área de 
biologia molecular 
⁃ Cada enzima corta o DNA somente quando encontra uma 
sequência específica de bases nitrogenadas 
\ Os cientistas sabem onde atua cada uma das enzimas 
0Ex.: enzima Eco R1: ao encontrar a seguinte sequencia, sempre 
corta o DNA entre as bases G e A 
 
DNA ligases 
/ Inserem os segmentos isolados do DNA em outra molécula de 
DNA 
/ DNA recombinante: a molécula de DNA associada ao novo 
trecho inserido 
 
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/ Produção de inúmeras copias idênticas de um mesmo 
fragmento da molécula de DNA 
1. Isolamento de fragmentos do DNA a serem clonados 
pela ação das enzimas de restrição 
2. Trechos introduzidos no DNA de vetores, como vírus e 
bactérias, pela ação das DNA ligases 
3. Ao se reproduzir, os microrganismos multiplicam as 
moléculas recombinantes e originam copias idênticas 
4. Produção de um grande número de copias exatas 
(clones) de um mesmo trecho de DNA 
 
Bactérias 
/ Plasmídeos: pequenas moléculas circulares de DNA 
independentes do cromossomo circular 
\ Geralmente apresentam genes que conferem as 
bactérias resistência a antibióticos 
⁃ São usados como vetores: podem ser manipulados e as 
bactérias continuam vivendo e se reproduzindo normalmente 
 
 
PRODUCAO DE HORMONIOS 
/ A insulina produzida por engenharia genética é idêntica a 
sintetizada pelo pâncreas humano 
⁃ Elimina o risco de qualquer reação alérgica pelo diabético, que 
antes era mais frequente por ser a insulina extraída do pâncreas 
de ratos criados em laboratório ou de bois e porcos obtidos em 
matadouros 
 
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“Impressão digital” genética ou DNA fingerprint 
/ Obs.: gêmeos monozigóticos tem o mesmo patrimônio genético 
e não se distinguem pela análise do DNA 
⁃ Suas impressões digitais podem ser ligeiramente diferentes pois, 
durante o desenvolvimento embrionário, podem surgir diferenças 
 
/ Cromossomos humanos: os genes representam apenas 2% do 
genoma humano; o restante é formado por DNA não codificante 
/ VNRTs: sequencias de DNA não codificante utilizadas para 
determinar o DNA fingerprint, formadas por repetições de 
unidades compostas de poucos nucleotídeos 
\ VNRTs: número variável de repetições em sequência 
⁃ Cada individuo tem um padrão específico de repetições dessas 
unidades, herdado dos pais 
1. O DNA é quebrado 
2. Isolam-se fragmentos de diferentes tamanhos 
3. Os fragmentos são separados por eletroforese em gel 
4. Os fragmentos são marcados com marcadores 
radioativos que serão impressos em um filme de raios X 
 
 
Aplicações práticas do DNA fingerprint 
/ Identificação de pessoas por meio de eletroforese em gel 
/ Investigação de um assassinato: padrões encontrados do sangue 
na roupa do suspeito coincidem com o sangue da vítima 
 
 
⁃ Investigação de um estupro: o padrão do sêmen encontrado na 
vagina da vítima coincide com a amostra de sêmen do suspeito 1 
 
 
⁃ Teste de paternidade: o bebê deve ter 50% do padrão de 
barras da mãe e 50% do padrão de barras do pai, que, no caso, 
pode ser o homem 2 
 
 
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/ Polimerases: enzimas que ocorrem nas células e catalisam 
reações de polimerização (formação de cadeias longas) 
⁃ PCR: duplicação de trechos de DNA in vitro, utilizando a DNA 
polimerase 
/ Antes da PCR, para se detectar genes ou VNRTs havia 
necessidade de grande quantidade de DNA-alvo, o que nem 
sempre era possível 
⁃ A introdução do PCR possibilitou a obtenção de quantidades 
muito grandes de fragmentos específicos do DNA por meio da 
amplificação em ciclos 
 
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/ SNP: polimorfismos de nucleotídeo único = alterações em um 
único par de bases em certos locais do genoma 
\ Tipo mais comum de variação de sequência no DNA 
⁃ Para que uma alteração de base única seja classificada como 
SNP, ela deve ocorrer em pelo menos 1% da populacao 
/ Ex.: uma pessoa pode ter, em uma sequencia do DNA, a base 
citocina emparelhada com a guanina, enquanto outra pessoa tem 
nesse mesmo local a base adenina emparelhada com a timina 
 
/ SNPs em regiões do DNA que não são genes: marcadores 
biológicos = auxiliam na localização de genes associadas a doenças 
/ SNPs dentro de genes: pode afetar a função deste 
⁃ Na região reguladora do gene: afeta a quantidade de proteínas 
produzida por ele = papel direto na determinação de uma doença 
⁃ Na região codificadora: afeta a sequência de aminoácidos 
\ A maioria das SNPs ocorrem em regiões do DNA que 
não são genes e não causa efeitos na saúde humana 
 
/ Importância: preveem respostas individuais a certas drogas, 
susceptibilidades a fatores ambientais como toxinas e riscos de 
desenvolvimento de doença e nos estudos que traçam a herança 
de doenças genéticas em famílias 
 
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/ Substituição do alelo associado a uma doença pelo alelo normal 
 
/ Principais formas de introduzir genes em humanos nos casos de 
terapia genica: uso de um vetor, como um vírus modificado, que 
contenha o alelo normal 
E Técnica ex vivo: colhem-se glóbulos brancos do sangue da 
pessoa afetada e permite-se que os vírus alterados infectem essas 
células em meio de cultura 
0Os vírus introduzem nos leucócitos o alelo normal 
0Os leucócitos modificados são mantidos em meios propícios a 
sua intensa multiplicação 
0Os leucócitos são reintroduzidos no paciente, num processo 
semelhante a uma transfusão de sangue 
E Técnica in vivo: clonagem de um vetor do alelo normal e de seu 
preparo para introdução no paciente por meio de injeção na veia 
ou intramuscular 
0Alguns dos alelos podem ser incorporados as células do 
paciente e dentro delas passam a codificar proteínas normais 
 
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/ Produzidas a partir de genes ou fragmentos de genes que 
codificam antígenos potencialmente capazes de estimular o 
sistema imunitário 
⁃ Os genes isolados são ligados a plasmídeos, e a vacinação pode 
ser feita por injeção intramuscular, por via oral, intranasal ou 
intradérmica 
⁃ O material genético (DNA) inoculado é incorporado pelas células, 
alojando-se no núcleo 
⁃ Utilizando as vias metabólicas normais da célula hospedeira, o 
DNA inoculado é transcrito em RNAm, que passa para o citosol, 
onde é traduzido em proteínas (antígeno do agente infeccioso) 
/ Imunidade obtida pela vacina de DNA: dura muito tempo, pois a 
produção de antígeno dentro da célula hospedeira é constante, 
mantendo os estímulos que desencadeiam respostas imunes 
 
 
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/ Conjunto de proteínas expressas por um genoma 
E Genoma: é praticamente constante, independentemente de qual 
das células nucleadas (excetuando-se óvulos e espermatozoides) 
está sendo analisada ou de variações do meio ambiente 
E Proteoma: variável, já que as diferenças morfológicas e funcionais 
entre as células são reflexo do conjunto de proteínas produzidas 
por cada uma 
0O mesmo tipo de célula pode apresentar diferentes proteomas 
em resposta a estímulos externos como a ação de drogas, a 
poluição ou o estresse nervoso 
0O proteoma é o resultado da expressão de um conjunto de 
genes e das modificações pós-traducionais das proteínas 
produzidas em resposta a condições ambientais definidas 
 
Aplicações 
/ Comparação de expressão de cepas (variedades) patogênicas e 
não patogênicas de microrganismos, ajudando no desenvolvimento 
de métodos diagnósticos e de agentes terapêuticos 
/ Comparação de tecidos humanos normais e doentes 
E Ex.: no caso do câncer, varias proteínas marcadoras já foram 
identificadas por analisede proteomas 
 
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Reprodução em laboratório 
/ No caso de animais como mamíferos, estimula-se em laboratório 
o surgimento de gêmeos monozigóticos 
1. Recolhem-se sêmen e óvulos de animais selecionados 
que possuem características de interesse 
2. Promove-se a fecundação em laboratório 
3. O zigoto se forma e iniciam as primeiras divisões 
celulares 
4. As células originadas são separadas artificialmente 
5. As células são implantadas em fêmeas (mães de aluguel) 
6. O desenvolvimento embrionário se completa 
7. As células dão origem a indivíduos geneticamente 
idênticos 
A partir de células somáticas 
/ Ex.: o caso da ovelha Dolly 
/ Uma célula receptora, o ovócito retirado do ovário de uma 
ovelha da raça Blackface, teve seu material genético removido 
com auxílio de uma micropipeta 
/ Uma célula 2n retirada da glândula mamaria de uma ovelha 
adulta da raça Finn Dorset foi mantida em estado de quiescência, 
ou seja, em condições que a tornaram pouco ativas 
⁃ Essa célula foi fundida ao ovócito desprovido de material genético 
nuclear 
⁃ O ovócito, agora com o núcleo 2n da célula somática, foi 
estimulado a iniciar o desenvolvimento embrionário 
⁃ O embrião com poucas células foi introduzido no útero de uma 
“mãe de aluguel” 
 
 
A partir de células embrionárias 
/ Ex.: o caso do primeiro animal clonado no Brasil (a bezerra 
vitória da raça simental) 
/ Vitoria é fruto da transferência do núcleo de uma célula de 
embrião de cinco dias, coletada de uma vaca da raça simental, para 
um ovócito enucleado retirado de uma vaca de outra raça 
⁃ O embrião em início de desenvolvimento foi implantado em uma 
“vaca de aluguel” 
 
Observações 
/ A clonagem humana para fins reprodutivos, com a obtenção de 
um individuo, não é permitida por lei, mas a clonagem terapêutica, 
feita com a finalidade de produção de células tronco embrionárias 
para utilização terapêutica, sim 
 
/ Não se clonam indivíduos, mas sim genomas (conjunto de todo 
o DNA nuclear que o organismo tem em suas células) 
/ A clonagem não impede as interações complexas do genótipo 
com o ambiente na produção do fenótipo: apesar de 
genotipicamente idênticos, os clones não terão exatamente os 
mesmos fenótipos 
 
/ DNA mitocondrial: pode conter alguns genes associados a 
doenças 
⁃ Clonagem feita apenas com a transferência de núcleo 2n para 
ovócito desprovido de DNA nuclear = o DNA mitocondrial será o 
do ovócito e o clone não será completo devido ao material 
genético das mitocôndrias 
⁃ Fusão entre a célula 2n e o ovócito desprovido de DNA nuclear 
= o DNA mitocondrial é em parte do ovócito e em parte da célula 
somática, e o clone terá mitocôndrias tanto do ovócito quanto da 
célula que se fundiu a ele 
/ Testes de maternidade: podem ser feitos pela analise do DNA 
mitocondrial, pois as mitocôndrias dos descendentes são herdadas 
apenas da mãe 
 
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/ Recebem genes de outras espécies de seres vivos 
/ Importância: obtenção de indivíduos com características 
vantajosas e que produzam substâncias de interesse para o ser 
humano 
 
/ Camundongos 
⁃ Os ovócitos das fêmeas de camundongos foram removidos 
cirurgicamente e fecundados in vitro com espermatozoides de 
machos da mesma espécie = origem do zigoto 
⁃ Incorporação de copias do gene associado ao hormônio de 
crescimento humano = os camundongos adultos atingiram 
tamanho duas a três vezes maior que o normal 
⁃ Incorporação de um gene de água-viva no DNA, que codifica 
uma proteína responsável pela cor verde fluorescente 
0Pesquisas futuras sobre o câncer: a proteína verde fluorescente 
poderia ser utilizada para marcar células cancerígenas, que seriam 
facilmente visualizadas em microscópio, sob luz azul 
 
/ Ovelhas transgênicas: apresentam o gene humano que codifica 
a proteína alfa-1-antitripsina; as ovelhas lançam essa proteína no 
leite produzido em suas glândulas mamarias 
⁃ A ausência dessa proteína na espécie humana provoca 
deficiência hepática e suscetibilidade a enfisema pulmonar 
0As ovelhas transgênicas possibilitam a obtenção dessa proteína 
a um custo bem menor quando comparado a extração do sangue 
de pessoas normais 
 
Organismos geneticamente modificados (OMGs) 
/ Obtenção de organismos transgênicos em plantas 
⁃ Vegetais como milho, algodão, tomate e outras, portam e 
expressam genes de bactérias que lhes conferem resistência a 
insetos = são menos predadas por esses organismos 
⁃ Batata, feijão e mamão resistentes ao ataque de vírus 
⁃ Bananas resistentes ao ataque de fungos 
⁃ Soja transgênica resistente a herbicidas 
⁃ Variedade de arroz rica em betacaroteno, substância precursora 
da vitamina A 
 
 
 
 
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/ Baseia-se em técnicas conhecidas, mas amplia as técnicas que 
criam organismos transgênicos, modificando genes antes de inseri-
los nos seres vivos e até mesmo criando em laboratório novas 
moléculas de DNA a partir de bancos de referencia 
/ Objetivo: desenhar seres vivos que respondam a necessidades 
especificas para a espécie humana 
 
/ Pode ser usada de forma extremamente positiva, gerando 
possíveis soluções para a saúde humana e para o meio ambiente 
⁃ A esperança é que seja empregada para enfrentar obstáculos 
naturais como a poluição das águas e até mesmo possíveis 
epidemias de novas doenças 
0Organismos com capacidade de metabolizar poluentes ou 
produzir anticorpos específicos poderiam ser produzidos 
/ Pode ser usada de forma negativa, como na criação de armas 
biológicas e na formação de novas formas de vida, que podem 
afetar o equilíbrio dos ecossistemas 
 
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/ Casais normais que não conseguem ter filhos porque a mulher 
não consegue engravidar ou levar uma gestação a termo, 
passando por abortos consecutivos: convém esclarecer que é 
comum ocorrer aborto na primeira gestação e que, em geral, a 
segunda gravidez vai a termo 
/ Casais normais com casos de doenças genéticas na família da 
mulher e/ou do homem 
/ Casais normais que já tiveram filho com anomalia genética ou 
cromossômica 
/ Casais consanguíneos, pois tem risco maior de ter filhos com 
anomalias 
/ Casais com mais de 35 anos de idade, sendo mais importante a 
idade da mulher: maior chance de se ter um filho com anomalias 
cromossômicas, como a síndrome de Down 
/ Casais em que pelo menos um dos conjugues recebeu radiação 
ionizante, tomou drogas mutagênicas para tratamento de câncer 
ou fez uso de drogas que provocam mutações, como a droga 
ilegal LSD 
 
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/ Permite que se saiba com antecedência se a criança que vai 
nascer é do sexo feminino ou masculino e se ela pode apresentar 
alguma das anomalias cromossômicas ou genéticas, detectáveis por 
meio de varias técnicas laboratoriais 
 
Exame das vilosidades coriônicas 
/ Vilosidades coriônicas: estruturas formadas pelos anexos 
embrionários do feto e que contribuem para a formação da 
placenta 
 
/ É possível detectar o sexo do feto, anomalias cromossômicas e 
estudar o DNA a fim de detectar anomalias genéticas 
/ Só pode ser feito entre a 8ª a 11ª semana de gravidez e é o que 
fornece diagnostico mais precoce 
/ Feito com auxilio de ultrassonografia, que orienta o medico na 
introdução de uma cânula flexível ou cateter pela vagina 
1. O cateter deve passar pelo colo do útero até atingir as 
vilosidades coriônicas 
2. Células das vilosidades coriônicas são aspiradas e 
mantidas em meio de cultura especiais, onde se dividem 
3. Interrompe-se a mitose dessas células, e as que estão 
em metáfase tem seus cromossomos analisados 
/ Feito em casos indicados por aconselhamento genético, pois há 
risco de aborto em decorrência do próprio exame 
 
Amniocentese 
/ Obtém-se as mesmas informações que no exame das 
vilosidades coriônicas, mas ela só pode ser feita a partir da 14º 
semana de gestação 
/ Coleta do liquido amniótico, por meio de uma seringa introduzida 
na barriga da mãe, acompanhada por ultrassonografia 
⁃ No líquido amniótico estão presentescélulas originadas da pele e 
dos sistemas urinário e respiratório do feto 
⁃ As células são mantidas em culturas, e então, seus cromossomos 
são analisados 
 
/ Feito em casos indicados por aconselhamento genético, pois há 
risco de aborto em decorrência do próprio exame 
 
Ultrassonografia 
/ Não apresenta riscos para o feto ou para a mãe 
/ Feito utilizando-se ondas sonoras de alta frequência, que são 
convertidas em imagens transmitidas por uma tela de computador 
/ Não proporciona análise dos cromossomos do feto, pois não se 
coletam células do embrião 
/ Permite diagnosticar anomalias do sistema nervoso central, 
como espinha bífida, anencefalia (ausência de encéfalo) e 
hidrocefalia (encéfalo com presença de liquido), anomalias renais, do 
trato digestório e cardíacas e defeitos dos ossos 
/ Em alguns casos, é possível saber o sexo do embrião 
observando-se a genitália externa 
fotoscopia 
/ Feito em situações muito especiais 
/ O feto é visualizado por meio de uma cânula com fibras ótica 
introduzida na barriga da mãe 
⁃ Podem-se observar anomalias morfológicas, como fendas faciais 
e defeitos nos membros 
⁃ É possível introduzir uma agulha e obter amostra do sangue e 
da pele do feto para fazer diagnósticos antes do nascimento 
 
 
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/ Células indiferenciadas capazes de originar outros tipos celulares 
de diferentes tecidos 
⁃ Totipotentes ou embrionárias: capazes de se diferenciar em 
qualquer um dos tipos de célula do corpo de um adulto 
⁃ Pluripotentes: se diferenciam na maioria dos tipos celulares (ex. na 
medula óssea vermelha) 
0O cordão umbilical é uma fonte de células tronco pluripotentes, 
havendo a possibilidade de preserva-lo em clinicas especializadas 
para a eventualidade futura de tratamento de doenças 
⁃ Multipotentes: se diferenciam em apenas alguns tipos celulares 
 
/ Células tronco embrionárias humanas são obtidas do botão 
germinativo presente no interior de blastocistos, cerca de 5 dias 
após a fecundação 
\ Os embriões são obtidos de processos de fertilização 
em laboratório (in vitro) 
⁃ As células são separadas do trofoblasto, desagregadas e 
cultivadas em meios de cultura que propiciam sua proliferação por 
aproximadamente 7 dias; depois podem ser transferidas para 
meios de cultura especiais que contêm fatores de diferenciação 
celular 
0Esse procedimento permite a obtenção de diferentes tipos 
celulares que, uma vez diferenciados, podem ser transferidos para 
o corpo humano nos locais danificados, visando sua recuperação