Prévia do material em texto
Tipos de Microscopia Microscopia de luz Observação de preparações coradas através de iluminação comum que atravessa a amostra Possui 3 sistemas de lentes: condensador, objetiva e ocular. Poder de resolução – menor distância observável entre duas estruturas Para a microscopia de luz – 0,2μm Aumento da lente ocular: 10x Objetivas: 4x, 10x, 40x, 100x (necessário o uso de óleo de imersão) Observação da lâmina microscópica = (aumento da lente objetiva x aumento da lente ocular) Observação em objetiva de 4x = Aumento de 40 vezes o tamanho da amostra Observação em objetiva de 10x = Aumento de 100 vezes o tamanho da amostra Observação em objetiva de 40x = Aumento de 400 vezes o tamanho da amostra Observação em objetiva de 100x = Aumento de 1000 vezes o tamanho da amostra Tipos de amostras observáveis: indentificação de tipos celulares, conformação de tecidos, arquitetura de órgãos, vasos sanguíneos etc. Não é possível observar e diferenciar organelas celulares e filamentos proteicos. Microscopia eletrônica ◦ Interação da amostra com feixes de elétrons ◦ Resolução de aproximadamente 3nm – aumento de aproximadamente 300.000 vezes ◦ Utiliza preparações diferentes de amostras, especialmente o uso de metais pesados que interagem com os feixes de elétrons emitidos pelo microscópio ◦ Permite observação de organelas e estruturas proteicas Microscopia Microscopia eletrônica de varredura Neste tipo de microscópio, o feixe de elétrons não atravessa a estrutura, apenas incide sobre sua superfície e é refletido, formando uma imagem tridimensional de sua superfície; Possui poder de resolução de 10ƞm, o que permite a visualização da superfície das células e tecidos com alta fidelidade e riqueza de detalhes. Preparo de lâminas histológicas Observação – microscopia óptica (ou microscopia de luz) A maioria dos tecidos deve ser seccionada para observação (não necessariamente corados) – utilização de micrótomos Preparação de uma lâmina ideal – deve reproduzir as mesmas condições do tecido no humano. Etapas do preparo das lâminas ◦ Fixação – os tecidos são colocados em soluções que ligam as proteínas, evitando sua degradação e inativam as enzimas autolíticas. Ex: formol 37% ◦ Desidratação – os tecidos são submetidos a banhos de álcool com concentrações crescentes, removendo assim a água da amostra. ◦ Clarificação ou diafanização – remoção do álcool com solventes que têm afinidade tanto pelo álcool quanto pela parafina. Ex: Xilol ◦ Inclusão – As amostras são incluídas em parafina derretida (Previamente aquecida em estufa a 56°C – 60oC). Após retirado da estufa, o tecido se torna rígido. ◦ Corte – secção das amostras em parafina para visualização no microscópio óptico – Micrótomo. Secções de aproximadamente 3-10 μm. ◦ Lâminas de vidro Aplicação em medicina Biópsias - são amostras de tecido removidas durante cirurgias ou procedimentos médicos de rotina. Na sala de cirurgia, as amostras são fixadas em frascos de formol ou congeladas para posterior processamento em um laboratório de Patologia. Retirada de biópsia de parte do intestino delgado para diagnóstico de linfoma Para microscopia eletrônica – processo semelhante, exceto pela utilização de solventes específicos e inclusão em resina epóxi. Corte – secções menores que 1μm Coloração A maioria das células e estruturas da matriz extracelular são incolores, e para estudo, devem ser coradas. Os corantes são em sua maioria seletivos, e se comportam de acordo com a basicidade das estruturas celulares. Componentes como os ácidos nucleicos, são menos básicos (ácidos), tendo afinidade por corantes básicos, sendo denominadas estruturas basofílicas. Componentes mais básicos, possuem afinidade por corantes ácidos, sendo denominadas estruturas acidofílicas. Coloração de hematoxilina-eosina (HE) – mais comumente utilizada. A Hematoxilina cora o DNA no núcleo da célular, porções ricas em RNA no citoplasma das células e matriz cartilagiosa, produzindo uma coloração azul escura ou arroxeada. A eosina cora outras estruturas localizadas no citoplasma e as fibras colágenas, tendo uma coloração avermelhada/rosada. Coloração Ácido Periódico-Schiff – auxilia na coloração de glicoproteínas, evidenciando-as. Outras tipos de coloração: Giemsa, impregnação por metal (coloração por prata)