Relatório de aula prática ELISA

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Universidade Federal do Pará 
Instituto de Ciências Biológicas 
Faculdade de Biomedicina 
 
 
 
 
 
 
 
INGRID RAQUEL SILVA SANTOS 
 
 
 
 
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA: ENSAIO IMUNOSSORVENTE LIGADO À 
ENZIMA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Belém-Pa 
2023 
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1. INTRODUÇÃO 
 
Atualmente existem diversos métodos imunológicos para a quantificação de antígenos 
e de anticorpos no soro humano e animal, eles podem detectar com alta sensibilidade e 
especificidade essas moléculas, sendo assim utilizados como modelo padrão na pesquisa e na 
rotina laboratorial. Dentre os muitos testes utilizados na detecção de anticorpos ou de antígenos 
a partir de amostras biológicas, pode-se destacar o Ensaio Imunossorvente Ligado à Enzima 
(ELISA), tal teste, assim como os demais pertencentes a essa categoria, baseia-se na 
quantificação de anticorpos ou antígenos a partir da ligação de moléculas marcadoras. Dessa 
forma, a versão mais comum do ELISA fundamenta-se na ligação “sanduíche” entre dois 
antígenos ou anticorpos e a molécula que está sendo testada (ABBAS et al. 2008). Na placa 
onde o teste é realizado encontram-se antígenos ou anticorpos fixados aos poços, os quais se 
ligam ao antígeno ou anticorpo presente na amostra, essa ligação serve como ponte para a 
ligação de um segundo antígeno ou anticorpo associado a uma enzima capaz de converter seu 
substrato em uma solução colorida que pode ser mensurada por meio da absorbância detectada 
no espectrofotômetro, gerando um resultado quantitativo referente a presença de anticorpos ou 
antígenos na amostra do paciente. Sendo assim, a realização desse teste se faz presente em 
quase todas as rotinas laboratoriais, possibilitando o diagnóstico de infecções ocasionadas por 
diversos agentes microbianos. Por isso, as aulas práticas referentes ao ELISA objetivaram a 
realização prática do teste, com o intuito de demostrar seus possíveis resultados. 
 
2. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
Para a realização do ELISA utilizou-se o kit Murex HTLV I + II (foto 1) e uma única 
fileira da placa impregnada com antígenos. Os poços correspondentes a primeira coluna da 
placa (A1, B1, C1, D1, E1, F1, G1 e H1) foram todos utilizados, sendo assim pipetados, 
respectivamente, 50 µl de três amostras do controle negativo, uma amostra do controle positivo 
e quatro amostras provenientes de pacientes (foto 2). 
 
 
 
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Foto 1 – Reagentes e soluções do Kit Murex HTLV I + II. 
 
Fonte: arquivo pessoal 
 
Foto 2 – Placa de ELISA como as amostras utilizadas durante o teste. 
 
Fonte: arquivo pessoal 
 
Em uma cuba depositou-se 1 ml do diluidor de amostra e, com o auxílio de uma pipeta 
multicanal, pipetou-se 50 µl dessa solução em cada poço. Todos as amostras utilizadas foram 
devidamente identificadas e suas posições na placa foram anotadas em um documento, 
garantindo o controle do teste. A placa com as amostras foi homogeneizada e em seguida 
colocada em um recipiente metálico com tampa, o qual estava revestido com papel molhado, 
mantendo a umidade necessária para a etapa de incubação que ocorreu logo em seguida durante 
trinta minutos a 37 °C. Durante a primeira incubação ocorreu o preparo da solução de lavagem, 
para essa etapa depositou-se em um Erlenmeyer de 125 ml, 1.300 µl de solução de lavagem e 
18,7 ml de água destilada. A solução foi homogeneizada e transferida para uma cubeta. Após o 
período necessário, a placa foi retirada da incubação e levada novamente para a bancada, onde 
passou pela primeira etapa de lavagem, nesse passo utilizou-se a pipeta multicanal e depositou-
se 200 µl da solução de lavagem em cada poço. Em um recipiente plástico forrado com papel 
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absorvente, inverteu-se a placa rapidamente para descartar as amostras contidas nos poços e 
com a placa ainda virada para baixo, levou-a para secar em um papel na bancada, no qual se 
encostou a placa até que não houvesse mais regiões molhadas. Esse processo de pipetagem, 
descarte da amostra e secagem da placa foi repetido mais quatro vezes, completando as cinco 
lavagens necessárias (foto 3). 
 
Foto 3 – Materiais utilizados na etapa de lavagem. 
 
Fonte: arquivo pessoal 
 
Posteriormente à última secagem da placa, com o auxílio de uma pipeta multicanal, pipetou-se 
50 µl do anticorpo conjugado à enzima, em cada um dos poços. Logo depois a placa foi 
homogeneizada e levada pela segunda vez a estufa para que ficasse encubando por 30 minutos 
a 37 ºC. Após a segunda etapa de incubação descartou-se o conjugado adicionado na etapa 
anterior e assim como na primeira etapa de lavagem, realizou-se esse processo cinco vezes. Na 
próxima etapa, preparou-se o substrato necessário para a produção de cor nas amostras. Por este 
ser sensível à luz, foi necessário realizar esse processo com as luzes apagadas. Sendo assim, em 
uma cubeta preparou-se uma mistura homogênea de proporção 1:1, com 1 ml de substrato 
incolor e 1 ml de substrato concentrado, então 100 µl dessa mistura foi repassada para os poços 
da placa de ELISA com a pipeta multicanal. Novamente a placa foi levada a estufa por 30 
minutos a 37 ºC. Ao final da terceira etapa de incubação foi possível notar a variação na 
coloração dos controles negativos – mais claros, dos controles positivos – mais escuros, e das 
amostras dos pacientes. Assim, foi adicionado nos poços 50 µl da solução de parada para conter 
as reações obtidas e realizar a leitura na máquina. Em um computador conectado ao 
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espectrofotômetro deve-se escolher o protocolo de avaliação referente a kit utilizado para o 
teste e identificar a placa utilizada. Para a etapa de leitura das amostras, conforme os critérios 
estabelecidos pelo kit utilizado, o valor da densidade ótica (O.D.) referente ao controle negativo 
deve ser obtido a partir da média aritmética entre os valores da O.D. das três amostras de 
controle negativo somado a 0,2. Para a mostra de controle positivo, como garantia de qualidade, 
deve-se verificar a O.D. e certificar-se que ela está em um valor 8x acima do valor de controle 
negativo. Com esses valores é possível estabelecer uma curva, em que se determina, conforme 
o valor da O.D. da amostra do paciente, a negatividade ou positividade das mesmas. 
 
3. CONCLUSÃO 
 
Durante as atividades de aula prática os discentes tiveram a oportunidade de aprender 
sobre a técnica referente ao ELISA, a qual foi exemplificada de forma teórica e prática. Os 
alunos puderam realizar os testes e avaliar os diferentes resultados obtidos, diferenciando entre 
aqueles negativos e positivos, o que proporcionou o esclarecimento da técnica e a fixação das 
etapas metodológicas na sua realização laboratorial. 
 
4. REFERÊNCIAS 
 
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, S. Imunologia celular e molecular: 
9. ed. Rio de janeiro: Elsevier, 2008.