Relatório de aula prática imunofenotipagem por citometria de fluxo

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Universidade Federal do Pará 
Instituto de Ciências Biológicas 
Faculdade de Biomedicina 
 
 
 
 
 
 
 
INGRID RAQUEL SILVA SANTOS 
 
 
 
 
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA: IMUNOFENOTIPAGEM POR CITROMETRIA 
DE FLUXO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Belém-Pa 
2023 
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1. INTRODUÇÃO 
 
A imunofenotipagem por citometria de fluxo é uma técnica laboratorial utilizada para 
identificar e quantificar os diferentes tipos celulares a partir da marcação de suas moléculas de 
superfície com anticorpos associados a fluorocromos, assim como o grau de dispersão frontal 
e lateral dos feixes de luz que incidem em sua membrana. O método baseia-se principalmente 
na análise da ligação entre moléculas celulares e os conjugados imunofluorescentes. Essa etapa 
ocorre em uma máquina chamada de citômetro de fluxo que verifica individualmente as células 
presentes na amostra por meio da intensidade de fluorescência emitida a partir da ligação 
entre conjugado (anticorpo-fluorocromo) e antígenos celulares, possibilitando assim a 
quantificação das células na amostra e suas respectivas classificações (ABBAS, 2008). 
Tecnicamente, a quantificação e detecção da fluorescência emitida por esses conjugados ocorre 
quando as células são passadas, uma de cada vez, por um canal estreito do citômetro de fluxo, 
o qual é acoplado a um feixe incidente de laser que realizada essa etapa e associa a cor emitida 
a um tipo molecular. Em suma, os equipamentos utilizados rotineiramente detectam três ou 
mais sinais fluorescentes de diferentes cores, específicos para determinados antígenos celulares, 
possibilitando a verificação das combinações de moléculas de superfície e sua associação com 
determinados tipos celulares. Além disso, a dispersão frontal e lateral dos feixes de luz, 
proporcionam a identificação da complexidade celular. Nesse sentido, os linfócitos e os 
neutrófilos causam maior dispersão lateral, devido aos seus grânulos citoplasmáticos. Enquanto 
os monócitos causam maior dispersão frontal devido ao seu tamanho (SILVA, 2004). 
A imunofenotipagem por citometria de fluxo e um teste realizado em muitas rotinas 
laboratoriais. Comumente realiza-se a análise de amostras suspeitas de infecção por HIV para 
verifica a quantidade e variedade celular presente no sangue do paciente e assim analisar seu 
estado de saúde. As células preferencialmente avaliadas são os linfócitos TCD 4 e 
TCD8. Portanto, às atividades práticas referentes a essa técnica são muito importantes no 
processo de aprendizagem dos discentes. Desse modo, objetivou-se a observação da realização 
do teste com o intuito de demostrar a técnica e seus possíveis resultados em relação às amostras 
advindas de pacientes possivelmente infectados pelo HIV. 
 
 
 
 
 
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2. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
2.1. PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS 
 
Durante a realização do teste utilizaram-se os tubos do kit BD TrucountTM tubes (figura 
1). Cada um deles possuía pequenas esferas de polímero equivalente a 
500 células, denominadas bids. Elas tinham como propósito o controle da contagem celular. 
Nesse passo utilizou-se um pacote do kit que continha 25 tubos, então, eles foram identificados 
com a numeração dos pacientes e em cada um deles pipetou-se 20 µl da solução multiteste 
(anticorpo conjugado ao fluorocromo) e 50 µl de sangue bem homogeneizado (figura 2). Para 
evitar erros durante a pipetagem das amostras seguiu-se o método da pipetagem reversa, em 
que o botão da pipeta é pressionado até a segunda parada para aspirar a amostra, pegando a 
capacidade total da pipeta, e um volume preciso de amostra é expelido pressionando o botão 
até a primeira parada, deixando o excesso de amostra na ponteira, a qual deve ser descartada. 
Além disso, três tubos foram selecionados para servirem de controle, eles receberam uma 
mesma amostra de sangue (selecionada aleatoriamente) e a solução multiteste. Em seguida, 
todos os tubos foram fechados e levados para o agitador, onde ficaram incubando por 15 
minutos. Após esse período os tubos foram levados novamente a bancada e com uma pipeta em 
série, receberam 450 µl da solução de lise. Novamente eles foram levados ao agitador e 
permaneceram por 15 minutos. Posteriormente, cada um dos tubos controle recebeu 50 µl de 
uma solução de bids marcadas como baixa, média e alta concentração, respectivamente. 
Consecutivamente todos os tubos forma levados para análise ao citômetro de fluxo. 
 
Figura 1 – kit BD TrucountTM tubes 
 
Fonte: www.bdbiosciences.com 
 
 
http://www.bdbiosciences.com/
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2.2. CITÔMETRO DE FLUXO 
 
A leitura e identificação das células ocorre de forma automatizada no citometrô de fluxo. 
Inicialmente calibrou-se a máquina com a adição de solução salina em um compartimento 
adequado, tal solução é necessária para a leitura, pois focaliza as células. Nesse mesmo passo 
utilizou-se quatro soluções de bids marcadas com fluorocromos de cores variadas que indicam 
especificamente algumas moléculas celulares presente em leucócitos, foram eles: o APC, de 
cor vermelha e especificidade por moléculas CD4; o PerCP, cor de vinho e que se liga a 
moléculas CD45; O PE, de cor laranja e especificidade por moléculas CD8; e o FITC, de cor 
verde e com especificidade por moléculas CD3. Desse modo, dois tubos, classificados como A 
e B receberam 3 e 1 ml de solução salina, respectivamente. No tubo A depositou-se uma gota 
da bid marcada com florocromo APC e uma gota de bid não marcada. No tubo B utilizou-se a 
bid não marcada e todas as outras bids marcadas (APC, PerCP, PE e FITC). Dessa forma, os 
tubos foram levados ao compartimento do citômetro que coleta as amostras e faz a leitura. O 
resultado foi gerado a partir de quatro diferentes gráficos que apareceram no monitor conectado 
a máquina. Estes apresentaram regiões com diferentes cores produzidas pela leitura das luzes 
emitidas pelos fluorocromos. A concentração e localização dessas regiões demonstravam a 
quantidade de moléculas presente nas células (ex.: DC8, DC4, DC3, etc.), assim como o tipo 
celular (granulócito ou agranulócitos) e por consequência, por se tratar da identificação de 
linfócitos, a sua classificação em relação as variadas classes de linfócitos. Após a calibração 
ocorreu a leitura e interpretação de algumas amostras. 
 
 
3. CONCLUSÃO 
 
Durante as atividades de aula prática os discentes tiveram a oportunidade de observar a 
técnica de imunofenotipagem por citometria de fluxo. Sendo assim, o primeiro tubo levado ao 
citômetro de fluxo gerou um gráfico que indicava concentrações dentro do esperado de 
linfócitos CD4 e CD8. A segunda amostra gerou um gráfico que indicava a presença de poucos 
linfócitos CD4 e muitos CD8, demostrando baixa quantidade dessas células por microlitro de 
sangue nesse paciente. Dessa forma, os diferentes resultados obtidos possibilitaram a avaliação 
dos estados de saúde em pacientes HIV soro positivo em estados de saúde diferentes. 
Possibilitando o esclarecimento da técnica e a leitura e interpretação de seus resultados. 
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REFERÊNCIAS 
 
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, S. Imunologia celular e molecular: 9. ed. Rio 
de janeiro: Elsevier, 2008. 
 
SILVA, Teresa Lopes da et al. Citometria de fluxo: funcionalidade celular on-line em 
bioprocessos. Boletim de Biotecnologia, p. 32-40, 2004.