RELATÓRIO - IMUNOFLUORESCÊNCIA E CITOMETRIA DE FLUXO

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NOME DA INSTITUIÇÃO
NOME DO CAMPUS/UNIDADE
NOME DO CENTRO/NÚCLEO
NOME DO CURSO
RELATÓRIO DE IMUNOLOGIA
NOME DO ALUNO (TARCÍSIO SOUZA)
 IMUNOFLUORESCÊNCIA E CITOMETRIA DE FLUXO
CIDADE – UF
2021
IMUNOFLUORESCÊNCIA
A imunofluorescência foi descrita, precipuamente, no ano de 1942, por Albert Coons e colaboradores, em que demonstraram a marcação de anticorpos antipneumococos no tecido pulmonar com o uso da fluoresceína. A técnica possibilita a visualização de antígenos teciduais ou em suspensão celular, por meio de anticorpos específicos marcados com fluorocrômo. Atualmente, a imunofluorescência é fundamental para o diagnóstico de várias doenças, como o lúpus eritematoso, líquen plano, vasculites, porfiria, doenças granulomatosas renais, entre outras (AOKI et al., 2010).
A técnica aqui descrita tem como princípio a capacidade dos anticorpos em se ligarem covalentemente aos fluorocrômos. Trata-se de um método qualitativo e semiquantitativo, que possibilita a inferência e a localização dos antígenos em células e tecidos, utilizando-se, para tanto, anticorpos específicos marcados com os agentes fluorescentes que, ao serem excitados, emitem luz, a qual é captada pelo microscópio de fluorescência, possibilitando a visualização dos antígenos (FERRO, 2014). 
Os fluorocromos, ou fluoróforos, são, portanto, substâncias com a capacidade de absorverem comprimentos de luz ultravioleta, que os excita, culminando na produção, pelo fluorocromo, de luz no espectro óptico visível, ou seja, ficam fosforescentes. Na prática cotidiana, o isotiocianato de fluoresceína (FITC) é o fluoróforo mais comum, o qual se cora em verde. Não obstante, outros tipos também podem ser utilizados, como a rodamina (TRITC), que emite luz vermelha quando excitada (FERRO, 2014; MINEO, 2016).
Existem, pois, duas formas de serem realizadas a imunofluorescência: a direta e a indireta (MINEO, 2016):
Na imunofluorescência direta, é utilizado um anticorpo monoclonal que se encontra ligado quimicamente ao fluoróforo. A amostra a ser analisada é então fixada na lâmina, tratada e posteriormente incubada com o anticorpo. Nessa etapa, se houver a presença da proteína que o anticorpo reconhece, haverá a ligação entre ambos. Então, procede-se com a lavagem exaustiva para remover os anticorpos não ligados da amostra, levando-a para ser analisada no microscópio fluorescente. Essa técnica é válida para detecção de vírus, parasitas, antígenos de tumor, entre outros (CAVALCANTI, 2019; MEULDAU, 2021). 
Já a técnica de imunofluorescência indireta é destinada a reconhecer a presença de anticorpos presentes no soro do indivíduo. Inicialmente, antígenos para o qual se quer descobrir a presença de anticorpos são fixados em uma lâmina e depois é realizada a incubação com o soro do paciente, que teoricamente possui anticorpos específicos para oantígenos. Findo esse processo, é realizada a lavagem da lâmina, e adicionado um anticorpo anti-imunoglobulina humana ligado ao fluorocromo. Se o indivíduo realmente possuía os anticorpos para o antígeno, eles se fixaram à lâmina, e ao ser jogado os anticorpos anti-imunoglobulina, estes se ligam à porção FC dos anticorpos do indivíduo. É feita uma nova lavagem para remover os anticorpos não ligados, e levados ao microscópio fluorescente, em que os fluróforos são excitados, procedendo-se com a análise da lâmina (CAVALCANTI, 2019; MEULDAU, 2021).
Por ser uma técnica que detém uma alta sensibilidade e especificidade, ela é extremamente útil no diagnóstico de várias doenças, bem como no desenvolvimento de pesquisas (CAVALCANTI, 2019). 
CITOMETRIA DE FLUXO
A citometria de fluxo é uma técnica de imunofenotipagem utilizada para avaliação de populações celulares, tanto normais como neoplásicas. Ela é comumente utilizada em laboratórios clínicos para identificar e enumerar as células, mas pode também ser aplicada na quantificação antigênica, variações linfoproliferativas, fagocitose e apoptose. A técnica se baseia na detecção dos fluorocrômos acoplados a anticorpos com afinidade de ligação a moléculas previamente determinadas nas células. Hoje, a citometria é capaz de fornecer dados quantitativos e qualitativos das células, com uma alta sensibilidade e especificidade (CARVALHO et al. 2010). 
Prioritariamente, para se analisar uma amostra no citômetro de fluxo, o material deve estar em suspensão celular. Estando nessa condição prévia, as células seguem para a marcação com anticorpo monoclonal. Quando o anticorpo específico utilizado já está conjugado ao fluorocromo, diz-se que é uma marcação direta, que torna a técnica mais ágil, com preparação/produção onerosa. Já quando as células em suspensão são incubadas inicialmente por um anticorpo monoclonal primário, mas sem a ligação ao fluoróforo. As células são então lavadas e incubadas novamentes com anticorpos, chamados de secundários, dessa vez conjugados ao fluorocromo. Esse anticorpo secundário é capaz de se ligar a imunoglobulina primária utilizada, sendo a maior vantagem dessa técnica uma maior acurácia em decorrência da amplificação de sinal das ligações dos anticorpos secundários (CARVALHO et al. 2010). 
O passo seguinte é a acoplação do tubo contendo a suspensão ao citômetro de fluxo, em que as células são, aos poucos, aspiradas para o interior da câmara flow cell. Essa câmara é banhada por uma solução salina que possibilita às células seguirem um fluxo linear, sendo cada vez mais imputadas, devido ao estreitamento do canal da câmara, a ficarem em linha indiana, saindo por uma pequena abertura. Ao saírem, uma por vez, são interceptadas por um laser, que culmina na refração luminosa do laser e na liberação da fluorescência do fluorocromo aderido (CARVALHO et al. 2010). 
A emissão das luzes é então captada por filtros específicos, sendo enviados os dados dessa captura para os softwares que analisarão o tamanho celular, sua granulidade, aspectos fenotípicos e funcionais. Os dados são transpassados para gráficos previamente selecionados, em que podem ser feitas todas as inferências do exame. 
Como aludido anteriormente, essa técnica é utilizada para quantificar e qualificar células, sendo útil, inclusive, para inferências sobre possíveis neoplasias malignas nestas. Ademais, é útil na identificação de células em sofrimento, ou infectadas por vírus e protozoários, como o Leishmania amazonenses (CARVALHO et al. 2010). 
REFERÊNCIAS
AOKI, V. et al. Imunofluorescência direta e indireta. Anais Brasileiros de Dermatologia. São Paulo, 2010. p 490 – 500. 
CARVALHO, A. T. et al. Citometria de Fluxo no estudo de doenças infecto-parasitárias. Instituto Oswaldo Cruz. Cursos de Inverno. [S.I.], 2010. 111 p.
CAVALCANTI, T. Imunofluorescência – o que você precisa saber?. [S.I.], 2019. Disponível em: https://www.youtube.com/watch?v=lytLl3PeYio. Acesso em: 27 de Abr. de 2021. 
FERRO, A. B. Imunohistoquímica. Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Lisboa (ESTeSL). Lisboa, 2014. 
MELDAU, D.C. Imunofluorescência. Infoescola [S.I], 2021. Disponível em: https://www.infoescola.com/exames-medicos/imunofluorescencia/. Acesso em: 27 de Abr. de 2021 
MINEO, J. R. et al.. Manual ilustrado de práticas laboratoriais em Imunologia. Uberlândia: EDUFU, 2016. 114 p.