Contribuicaoviasreparo-Cadavid-2021

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE - UFRN 
REDE NORDESTE DE BIOTECNOLOGIA (PPG - RENORBIO) 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA 
 
 
 
 
 
TESE DE DOUTORADO 
 
 
 
 
Contribuição das vias de reparo por excisão de bases e nucleotídeos no 
desenvolvimento de fenótipos neurodegenerativos nos modelos 
transgênicos de Caenorhabditis elegans 
 
 
 
 
 
 
 
CESAR ORLANDO MUNOZ CADAVID 
Orientadora: Profª. Drª Riva de Paula Oliveira 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Natal - RN 
2021
 
CESAR ORLANDO MUNOZ CADAVID 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Contribuição das vias de reparo por excisão de bases e nucleotídeos no 
desenvolvimento de fenótipos neurodegenerativos nos modelos 
transgênicos de Caenorhabditis elegans 
 
 
 
 
 
 
 
Tese de doutorado apresentada ao 
Programa de Pós - Graduação em 
Biotecnologia - RENORBIO da Universidade 
Federal do Rio Grande do Norte como um 
dos requisitos para a obtenção do título de 
doutor em Biotecnologia, área de 
concentração: Biotecnologia em Saúde. 
 
Orientadora: Profª. Drª Riva de Paula 
Oliveira 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Natal - RN 
2021 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DEDICATÓRIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
À minha mãe, 
Maria Guillermina Cadavid Londono 
 
À minha esposa Sandra Milena 
Gallego Betancur e aos meus filhos 
Juanita Munoz Gallego e Emiliano 
Munoz Gallegos. 
 
À minha irmã Patricia E. Munoz. 
 
Sinceramente à minha orientadora 
professora Drª Riva de Paula Oliveira. 
 
A todos os meus familiares e amigos. 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMENTOS INSTITUCIONAIS 
 
 
À minha orientadora professora Riva de Paula Oliveira inicialmente por ter tido a 
coragem de dar oportunidade. Professora Riva, muito obrigado pelos vários 
ensinamentos, pelas oportunidades de crescimento acadêmico e profissional, 
pela amizade e confiança que fomos construindo ao longo do doutorado e por ter 
me motivado a sempre buscar excelência e alto padrão de qualidade em tudo. 
 
A professora Dra Lucymara Fassarella Agnez Lima por toda ajuda e o 
acompanhamento na realização deste trabalho, suas importantes indicações e 
sua co-orientação. 
 
A Universidade Federal do Rio Grande do Norte, ao Programa de Pós – 
Graduação em Biotecnologia/ Coordenação do Renorbio ponto focal RN, ao 
Centro de Biociências, ao Laboratório de Biologia Molecular e Genética – LBMG, 
Laboratório de Mutagênese Ambiental – LAMA. 
 
A Capes e ao CNPq pelo orçamento para realização do projeto e minha bolsa de 
doutorado. 
 
Aos amigos do Laboratório de Genética Bioquímica - LGB da UFRN, Ricardo 
Basílio de Oliveira Calad, Giovanna Melo Martins Silva, Iolanda Raquel Ferreira 
Paulo, José Felipe da Costa, pela parceria, companheirismo e troca de 
conhecimentos. Agradeço em especial ao Ricardo e Giovanna que foram mais 
que amigos, verdadeiros irmãos, estiveram comigo em todos os momentos do 
doutorado, me ajudaram profissional e pessoalmente. 
 
Aos professores da UFRN: Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros, Julliane 
Tamara Araújo de Melo, Viviane Amaral e Raquel Theodoro. 
 
 Aos professores externos à UFRN que aceitaram o convite para participar da 
banca de defesa: Carlos Renato Machado (Universidade Federal de Minas 
Gerais), Fernanda Marques da Cunha (UNIFESP) e Daiana da Silva Ávila 
(Universidade Federal do Pampa). 
 
 
Aos técnicos administrativos da UFRN: Paula Peroba, Diogo, Mayara, Fran e 
Eliene. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMENTOS PESSOAIS 
 
 
À Deus e a Nossa Senhora por estarem sempre comigo. 
 
À minha mãe Maria Guillermina Cadavid Londono por todo o amor, carinho, pelas 
orações e por ser meu porto seguro, fonte dos meus conhecimentos familiares e 
religiosos. 
 
À minha esposa Sandra Milena Gallego pelo amor, companheirismo e paciência 
ao longo dos anos. Aos meus filhos Juanita Munoz Gallego e Emiliano Munoz 
Gallego pelo amor, carinho e pela compreensão de que era necessário fazer este 
sacrifício. Vocês são minha vida. 
 
Às minhas irmãs Patricia Munoz e Maria Eugenia Munoz pelo amor, incentivo e 
orações. 
 
 
Especial agradecimento à família de minha esposa, especialmentea Juan Jose 
Gallego, Maria Nelly Betancur e seus filhos Marcela Gallego e Victor Gallego, 
muito obrigado por sua ajuda e por ficar junto de minha família na Colômbia 
durante o tempo que fiquei afastado deles. 
 
A meu amigo Edwar Franco pelos bons conselhos e amizade. 
 
Finalmente quero agradecer ao pessoal do Brasil que me acolheu como amigo, 
especialmente ao Sr. Luis Freire e Vinicius Morais, eternamente agradecidos com 
vocês. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMO 
 
As doenças neurodegenerativas (DN) são caracterizadas por uma perda neuronal 
progressiva que leva ao comprometimento motor ou cognitivo. Embora ainda não 
sejam completamente compreendidas, as DN compartilham muitos mecanismos 
moleculares, como: estresse oxidativo, agregação de proteínas, deficiência do 
sistema ubiquitina-proteassoma-autofagia, disfunção mitocondrial, bioenergética 
prejudicada, disfunção de neurotrofinas e processos neuroinflamatórios. As 
observações clínicas de que as deficiências nas vias de reparo por excisão de 
nucleotídeos (NER) e reparo por excisão de base (BER) causam patologias 
humanas associadas a sintomas neurológicos sugerem que NER e BER também 
podem desempenhar um papel crítico em DNs crônicas. Neste estudo, avaliamos 
a deficiência das vias de BER e NER, especialmente EXO-3 e XPA-1, 
respectivamente, no desenvolvimento de fenótipos neurodegenerativos em 
Caenorhabditis elegans. A inibição de EXO-3 e XPA-1 afetou o status redox 
aumentando os níveis de ERO e regulando positivamente a expressão de genes 
relacionados à resistência ao estresse de uma maneira dependente de SKN-1. 
Resultados semelhantes foram encontrados quando as proteínas APN1, XPC1 e 
CSB1 foram avaliadas. A deficiência de EXO-3 e XPA-1 também ativou o retículo 
endoplasmático e a resposta da proteína não dobrada mitocondrial (UPR) e 
interferiu na proteostase, conforme indicado pela atividade reduzida do 
proteassoma e expressão das subunidades do proteassoma. Essas alterações 
foram associadas à neurodegeneração de neurônios marcados com pan e 
colinérgico. A neurodegeneração induzida pela deficiência de EXO-3 e XPA-1 
parece ser desencadeada pela hiperativação do sensor de danos ao DNA PARP-
1, uma vez que este fenótipo é resgatado pela inibição de PARP-1. A inibição dos 
genes apn-1, xpc-1 e csb-1 nos animais transgênicos para Mal de Alzheimer e 
Doença de Hungtinton acelerou os fenótipos neurodegenerativos, sendo o efeito 
mais marcado nos animais tratados com csb-1(RNAi). Juntos, esses resultados 
suportam um modelo em que a deficiência das vias BER e NER desempenha um 
papel ativo, gerando uma rede de sinais de estresse suficientemente forte para 
desencadear a neurodegeneração. 
Palavras chaves: BER; NER; estresse oxidativo; proteostase; Mal de Alzheimer; 
Doença de Huntington. 
 
ABSTRACT 
 
Neurodegenerative diseases (NDs) are characterized by a progressive neuronal 
loss leading to motor or cognitive impairment. Although it is still not completely 
understood, NDs share many molecular mechanisms such as: oxidative stress, 
protein aggregation, deficiency of the ubiquitin–proteasome–autophagy system, 
mitochondrial dysfunction, impaired bioenergetics, dysfunction of neurotrophins 
and neuroinflammatory processes. The clinical observations that deficiencies in 
the nucleotide excision repair (NER) and base excision repair (BER) pathways 
cause human pathologies associated with neurological symptoms suggest that 
NER and BER might also play a critical role in chronic NDs. Here, we evaluated 
the deficiency of BERand NER pathways, especially EXO-3 and XPA-1, 
respectively, on the development of neurodegenerative phenotypes in 
Caenorhabditis elegans. EXO-3 and XPA-1 inhibition affected redox status by 
increasing ROS levels and up-regulating the expression of stress resistance 
related genes in a SKN-1 dependent manner. Similar results were found when 
APN1, XPC1 and CSB1 proteins were evaluated. EXO-3 and XPA-1 deficiency 
also activated the endoplasmic reticulum and mitochondrial unfolded protein 
response (UPR) and interfered in proteostasis as indicated by the reduced 
proteasome activity and proteasome subunits expression. Thesee alterations 
were associated with neurodegeneration of pan- and cholinergic-marked neurons. 
The neurodegeneration induced by EXO-3 and XPA-1 deficiency appears to be 
triggered by hyperactivation of the DNA damage sensor PARP-1 since this 
phenotype is rescued by PARP-1 inhibition. Inhibition of the apn-1, xpc-1 and csb-
1 genes in transgenic animals for Mal de Alzheimer and Hungtinton's disease 
accelerated neurodegenerative phenotypes, the most marked affect were in 
animals treted with csb-1(RNAi). Together, these results support a model where 
deficiency of NER and BER pathways plays an active role generating a network of 
stress signals sufficiently strong to trigger neurodegeneration. 
 
Key words: BER; NER; oxidative stress; proteostasis; Alzheimer's disease; 
Huntington's disease 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
 RESUMO 
 ABSTRACT 
 LISTA DE FIGURAS 
 LISTA DE TABELAS 
 LISTA DE ABREVIATURAS 
1. INTRODUÇÃO 
2. REVISÃO DE LITERATURA 
2.1 Doenças neurodegenerativas 
2.1.1 Mal de Alzheimer 
2.1.2 Doença de Huntington 
2.2 Estresse oxidativo em doenças neurodegenerativas 
2.3 Espécies reativas, fontes e equilíbrio celular pro/antioxidante 
2.3.1 Via de sinalização Nfr2-ARE 
2.4 Disfunção mitocondrial e neurodegeneração 
2.4.1 Toxicidade de proteínas na mitocôndria 
2.5 Sistema de proteassoma ubiquitina (UPS) 
2.5.1 Agregação e Proteotoxicidade 
2.5.2 Disfunção de proteassoma desencadeia ativação de SKN-1 
2.6 Dano no DNA: O papel dos mecanismos de reparo de DNA 
nas lesões induzidas por estresse oxidativo 
 
2.6.1 Reparo por excisão de bases (BER). 
2.6.2 Reparo por excisão de nucleotídecaos (NER). 
2.6.3 Interações entre proteínas de sistemas BER e NER 
2.6.4 BER e NER no desenvolvimento de doenças 
neurodegenerativas 
 
2.6.5 Outras funções do XPA fora do reparo de DNA por excisão de 
nucleotídeos 
 
2.7 O C. elegans como um organismo modelo de estudo 
2.7.1 Vias de sinalização celular envolvidas na resposta ao 
estresse em C. elegans 
 
2.8. 
 
2.81 
C. elegans como modelo para estudo das doenças 
neurodegenerativas 
Modelos C. elegans para o Mal de Alzheimer 
 
2.8.2 Modelos C. elegans para a Doença de Huntington 
2.9 
3 
3.1 
Justificação 
OBJETIVOS 
Objetivo geral 
 
3.2 Objetivos específicos 
4. MATERIAIS E MÉTODOS 
4.1 Reagentes 
4.2 Cepas e manutenção do Caenorhabditis elegans 
4.3 Sincronização cronológica do Caenorhabditis elegans 
4.4 Culturas com RNAi 
4.5 Quantificação da Progênie 
4.6 Ensaio de sensibilidade a UV 
4.7 
4.8 
Quantificação de ERO intracelular 
Análise da expressão gênica por qPCR 
 
4.8.1 Extração de RNA 
 
4.8.2 Síntese do DNA complementar (cDNA) 
4.8.3 PCR quantitativa em tempo real (qPCR) 
4.8.4 Curvas padrão para determinação da eficiência dos 
iniciadores 
 
4.8.5 Escolha do gene de referência endógena 
4.9 Análise de genes repórteres 
4.10 Quantificação da atividade do proteossoma 
4.11 Ensaio de paralisia induzida pelo peptídeo β-amiloide 
4.12 Quantificação de agregados poliglutaminicos em C. elegans 
4.13 Ensaio de sobrevivência neuronal 
4.14. Potencial de membrana mitocondrial ∆Ψm 
4.15 Conteúdo Mitocondrial 
4.16 Análise Estatística 
5 RESULTADOS 
5.1 A inibição dos genes exo-3 e xpa-1 afetam o status redox em 
C. elegans de maneira dependente de SKN-1. 
 
5.2 A inibição de EXO-3 e XPA-1 está associada à ativação de 
UPRer e UPRmt 
 
5.3 A inibição de EXO-3 e XPA-1 diminui a expressão de genes 
da subunidade do proteassoma e a atividade UPS 
 
5.4 A inibição de XPA-1 e EXO-3 agrava os fenótipos associados 
à agregação de proteínas tóxicas em modelos de C. elegans 
para MA e HD. 
 
5.5 A inibição de EXO-3 e XPA-1 ativa PARP1 e causa disfunção 
mitocondrial 
 
5.6 A inibição de XPA-1 e EXO-3 desencadeia neurodegeneração 
em C. elegans por meio da ativação de PARP1 
 
5.7 A Efeito da inibição de PARP1 na integridade neuronal, status 
redox, a função mitocondrial e o fenótipos de paralisia. 
 
5.8 Alteração do estado redox e ativação de SKN-1 parece ser 
um evento comum na situação de deficiência de BER e NER. 
 
5.9 Efeito da inibição de outras proteínas do sistema BER e NER 
nos fenótipos associados à agregação de proteínas tóxicas 
em modelos de C. elegans para MA e HD 
 
6 DISCUSSÃO 
7 CONCLUSÃO 
8 PERSPECTIVAS 
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
10 ANEXOS 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1: Geração de espécies reativas 
Figura 2: Reparo por excisão de Bases. 
Figura 3: Reparo de excisão de nucleotídeos. 
Figura 4: Ciclo de vida de C. elegans a 20°C. 
Figura 5: Modelo de ativação de SKN-1 durante estresse oxidativo 
em C. elegans. 
 
Figura 6: Efeito da inibição de EXO-3 e/ou XPA-1 na expressão de 
genes antioxidantes e o status redox em C. elegans. 
 
Figura 7: Efeito da inibição de EXO-3 e / ou XPA-1 nos níveis de 
ERO intracelulares e na expressão gst-4::GFP em 
mutantes de C. elegans. 
 
Figura 8: Efeito da inibição de EXO-3 e/ou XPA-1 na expressão do 
gene UPR em C. elegans.. 
 
Figura 9: Efeito da inibição de EXO-3 e/ou XPA-1 na degradação de 
proteínas em C. elegans. 
 
Figura 10: Efeito da inibição de EXO-3 e/ou XPA-1 no fenótipo 
neurodegenerativo em linhagens transgênicas para MA e 
DH em C. elegans. 
 
Figura 11: Efeito da inibição de EXO-3 e/ou XPA-1 nas porcetagens 
de variações média dos fenótipos neurodegenerativos em 
linhagens transgênicas para MA e DH em C. elegans. 
 
Figura 12: Efeito da inibição de EXO-3 e/ou XPA-1 na expressão de 
PARP1, potencial de membrana mitocondrial e conteúdo 
mitocondrial em C. elegans. 
 
Figura 13: Efeito da inibição de EXO-3 e/ou XPA-1 na integridade 
neuronal pan- e colinérgica em linha transgênica em C. 
elegans. 
 
Figura 14: Efeito do inibidor de PARP1 na neurodegeneração 
induzida por deficiência de EXO-3- e XPA-1 em C. 
elegans. 
 
Figura 15: Efeito do inibidor PARP1 no progresso da paralisia da 
cepa CL2006 submetida a RNAi contra exo-3 e / ou xpa-1. 
 
Figura 16: 
 
 
Fifura 17: 
 
 
Figura 18: 
 
 
Figura 19: 
 
 
 
 
Figura 20: 
Efeito do tratamento com RNAi para os genes BER e NER 
no acúmulo intracelular de ERO e na expressão de GST4 
no modelo C. elegans. 
Efeito do tratamento com RNAi na paralisia induzida pelo 
β-amiloide no modelo transgênico de C. elegans para o 
Mal de Alzheimer. 
Efeito do tratamento com RNAi simples ou duplo no 
número de agregados poliglutamínicos no modelo 
transgênico de C. elegans para a doença de Huntington 
utlizando a cepa AM141. 
Efeito do tratamento com RNAi simples ou duplo na 
sobrevivência dos neurônios ASH no modelo transgênico 
de C. elegans da doença de Huntington utlizando a cepa 
HA759. 
Modelo de trabalho. 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1: Cepas de C. elegans utilizadas no estudo 
Tabela 2: Lista de iniciadores utilizados na qPCR 
Tabela 3: Efeito da inibição do EXO-3 e XPA nos fenotipos 
neurodegenerativos 
 
Tabela 4: Efeito do inibidor PARP1 no progresso da paralisia de 
CL2006 
 
Tabela 5: Efeito da inibição dos genes BER e NER nos 
fenótipos neurodegenerativos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
 
Aβ - β-amiloide 
AGE-1 – (Ortógolo fosfatdil inositol 3 quinase, PI3-quinase) 
APE1 - AP endonuclease 1 
APL-1 - Proteína precursora amiloide em C. elegans 
APP – Proteina precursora amiloide 
ARE – Elemento de resposta ao estresseATP - Trifosfato de adenosina 
BER - Reparo de excisão de base 
CAT – Catalase 
cDNA - Ácido Desoxirribonucleico complementar 
CNC - cap'n'collar 
CS – Síndrome de cockayne 
CSA – Síndrome de cockayne A 
CSB – Síndrome de cockayne B 
CYP - Citocromo P450 
DAF-16 - Ortólogo de FOXO em C. elegans 
DDR – Resposta a danos no DNA (do inglês: DNA Damage response) 
DEPC - Dietilpirocarbonato 
DH – Doença de Huntington 
DNA - Ácido Desoxirribonucleico 
DP – Doença de Parkinson 
DSB - Quebras de fita dupla (DSBs do inglês: double strand breaks) 
DSBR - Reparo de quebra de fita dupla 
DsND – Donças neurodegenerativas 
dsRNA - Ácido ribonucleico de fita dupla 
ELA – Esclerose lateral amiotrófica 
EO – Estresse oxidativo 
ERCC1/XPF – Complexo endonuclease específico da estrutura 
ERN – Espécies reativas de nitrogênio 
ERO – Espécies reativas de oxigênio 
ETC - Cadeias de transporte de elétrons microssomais (ETC do inglês: electron 
transport chains) 
 
FEN1 - Endonuclease tipo 1 específica da estrutura Flap (do 
inglês: Flap structure-specific endonuclease 1) 
g – Gramas 
GAPDH – Gliceraldeído 3- fosfato desidrogenase 
GCS-1 - Glutamil cisteína sintetase 1 
GFP – Proteína verde fluorescente 
GG-NER – Global genome reparo de excisão de nucleotídeo 
GPx – Glutationa peroxidase 
GR - Glutationa redutase 
GSH - Glutationa reduzida 
GSK-3 - Glicogênio sintetase quinase 
GSSG - Glutationa dissulfeto 
GST4 – Glutationa-S-transferase 4 
GT - Glutationa transferase 
H2DCFDA - diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceina 
HNE – 4-Hidroxinonenal 
HSF-1 – Fator de transcrição de choque térmico 
HSP - Proteínas de choque térmico 
Htt – Huntingtina 
ICL – Interligação cruzada 
IL-1 – Interleucina 1 
IL6 – Interleucina 6 
ILS - Via de sinalização da insulina 
IPTG - Isopropil β-D -1-thiogalactopyranoside 
LB – Luria-Baertani 
M - Molar 
MA – Mal de Alzheimer 
mL - Mililitros 
MAPK – Proteína quinase ativada por mitógeno 
MDA - Malondialdeído 
mg – Miligramas 
MMR - Reparo de desemparelhamento 
MPG – DNA - N-metilpurina glicosilase 
 
mtDNA - Ácido Desoxirribonucleico mitocondrial 
NAD(H) - Nicotinamida adenina dinucleotídeo 
NAD(P)H - Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato 
nDNA - Ácido Desoxirribonucleico nuclear 
NEIL1 – DNA glicosilase tipo Nei (NEIL1 do inglês: Nei 
like DNA glycosylase 1) 
NER - Reparo de excisão de nucleotídeo 
NFTs - Emaranhados neurofibrilares (NFTs do inglês: neurofibrillary tangles) 
NGM – Meio de crescimento de nematoide 
NHEJ - Junção endêmica não-homóloga 
Nrf2–ARE - Fator nuclear 2 relacionado ao eritróide fator 2-elemento de resposta 
antioxidante 
O2
-
- Radical superóxido 
OD – Densidade óptica 
OGG1 - DNA glicosilase 8-oxoguanina (do inglês: 8-oxoguanine DNA 
glycosylase), 
OH-- Radical hidroxila 
ON – Óxido nítrico 
PARP1 - Poli(ADP-ribose) polimerase 1 
PCNA - Antígeno nuclear de proliferação celular (do inglês: 
Proliferating cell nuclear antigen) 
PCR – Reação em cadeia da polimerase 
PI3K – Fosfatidilinositol-3-quinase 
PMK-1 - Ortóloga à p38 de humanos 
PQE-1 – Proteína aumentadora de poliQ 
PSEN1 - Presenilinas 1 
PSEN2 - Presenilinas 2 
qPCR – PCR quantitativa em tempo real 
RA – Ácido retinóico 
RH – Recombinação homóloga 
RNA – Ácido Ribonucleico 
RNAi - RNA de interferência 
RNAP2 – RNA polimerase II 
 
RPA – Proteína de replicação A 
SEK-1 - MAP2K da via da p38 em C. elegans 
SKN-1 – SkiNhead Ortólogo de Nrf em C. elegans 
SNC – Sistema nervoso central 
SSBs - Quebras de fita simples (SSBs do inglês: single-strand breaks) 
SOD – Superóxido dismutase 
TC-NER – Transcrição acoplada a reparo de excisão de nucleotídeo 
TFIIH – Fator de transcrição geral IIH sub-unidade 1 
TNF-α - Fator de necrose tumoral alfa 
Trx – tiorredoxina 
UCP – Uncopling protein 
UNC-54 - Codificação de proteínas, gene presente em C. elegans não 
coordenados 
UNG – DNA uracil glisosilase 
UPS - Sistema de proteassoma ubiquitina (UPS do inglês: 
ubiquitin proteasome system) 
UV – Ultravioleta 
VMTP - Variação média do tempo de paralisia 
VMNA - Variação média de números de agregados 
VMSN – Variação média da sobrevivência neuronal 
WT – Tipo selvagem 
XP - Xeroderma pigmentosum 
XPA – Xeroderma pigmentosum grupo A 
XPC - Xeroderma pigmentosum grupo C 
XPD - Xeroderma pigmentosum grupo D 
XPF - Xeroderma pigmentosum grupo F 
XPG - Xeroderma pigmentosum grupo G 
XRCC1 - Reparo de raios X com complemento cruzado 1 
(XRCC1 do inglês: X-ray repair cross complementing 1) 
YFP- Proteína fluorescente amarela.
18 
1 INTRODUÇÃO 
 A identificação de fatores que contribuem para processos neurodegenerativos 
no cérebro é um dos principais objetivos da medicina moderna. Atualmente, 
existem várias hipóteses sobre os mecanismos que levam ao dano e morte de 
células cerebrais nas doenças neurodegenerativas (DN), tais como efeitos 
excitotóxicos por aminoácidos excitatórios, metabolismo celular alterado, e 
estresse oxidativo (EO), causado por radicais livres ou outras moléculas reativas.
 A produção excessiva de espécies reativas, a insuficiente atividade dos 
mecanismos de defesa tais como genes antioxidantes e detoxificantes, o sistema 
de proteassoma ubiquitina e os sistemas de reparo ao DNA têm sido implicados 
na patogênese de muitas doenças neurodegenerativas, incluindo a esclerose 
lateral amiotrófica (ELA), Doença de Parkinson (DP), Mal de Alzheimer (MA) e 
Doença de Huntington (DH) (Li et al., 2013). 
 O estresse oxidativo desempenha um papel importante no desenvolvimento de 
várias doenças, tais como artrite, câncer, distúrbios autoimunes, envelhecimento, 
doenças cardiovasculares e (DN). Com a idade, algumas características 
genéticas e fatores ambientais, tornam o sistema oxidativo-redox desequilibrado 
e os níveis de espécies reativas de oxigênio (ERO) e de nitrogênio (ERN) são 
aumentados. Nesse contexto, mitocôndrias utilizando oxigênio para a produção 
de energia são consideradas as principais fontes de estresse oxidativo. O 
NAD(P)H e a cadeia transportadora de elétrons após uma estimulação excessiva 
levam a uma superprodução de ERO. 
 Embora as ERO/ERN em concentrações moderadas desempenhem papéis 
importantes em processos fisiológicos tais como vias de sinalização, indução de 
resposta mitogênica, defesa contra patógenos infecciosos, uma superprodução 
ou uma deficiência de defesas antioxidantes endógenas levam a danos 
oxidativos, como modificações pós-traducionais e oxidação de proteínas, 
oxidação de lipídios e DNA / RNA, que são as características comuns de muitas 
DN, pois o cérebro é a parte mais suscetível do corpo às espécies reativas (Bhat 
et al., 2015; Gan e Jhonson, 2014). 
 
19 
 O fator nuclear de resposta relacionado ao eritróide 2 (Nrf2) – elemento de 
resposta antioxidante (ERA) (Nrf2-ARE do inglês: The nuclear factor erythroid 2-
related factor 2 (Nrf2)-antioxidant response element (ARE)) é um sensor primário 
e o principal regulador em resposta ao estresse oxidativo através de sua 
capacidade de modular a expressão de centenas de genes antioxidantes e 
desintoxicantes (Johnson et al., 2008; Lee et al., 2003; Shih et al., 2003). A 
ativação da via de sinalização Nrf2-ARE mostrou benefícios em modelos animais 
de muitos distúrbios neurodegenerativos, o que apóia o conceito de 
desenvolvimento de produtos biofarmacêuticos para ativar a via Nrf2-ARE no 
cérebro. 
 O reparo do DNA é essencial para a sobrevivência celular e manutenção da 
homeostase no tecido. Os organismos celulares precisam combater 
constantemente com danos endógenos ao DNA e desenvolver vários sistemas de 
reparo de DNA para lidar com essas agressões. Nesse sentido, uma rede de 
mecanismos de resposta a danos no DNA (DDR do inglês: DNA damage 
response) protegem organismos contra o contínuo estresse genotóxico induzido 
por metabólitos reativos e outros agentes genotóxicos, tais como contaminantesambientais e radiação ultravioleta (UV) do sol (Hoeijmakers, 2001). A rede DDR 
consiste em vários mecanismos de reparo de DNA, pontos de verificação do ciclo 
celular e senescência celular e cascatas de sinalização apoptótica. Em geral, os 
sistemas de reparo de DNA podem discriminar entre bases regulares e 
modificadas. De fato, bases de DNA oxidadas são especificamente reconhecidas 
entre a grande maioria por glicosilases de DNA e endonucleases 
apurinérgicas/apirimidínicas (AP) nas vias de reparo de excisão de base (BER) e 
reparo de excisão de nucleotídeos (NER). Adicionalmente, NER é um mecanismo 
de reparo de DNA que é capaz de remover uma ampla variedade de lesões 
desestabilizadoras da hélice de DNA, incluindo aquelas induzidas pela luz UV 
(Krokan e Bjoras, 2013; Yasui, 2013). 
 Apesar de haver trabalhos que indicam o envolvimento do reparo nas DN, 
ainda faltam evidências que contribuam no esclarecimento de como eles causam 
neurodegeneração, e quais são os mecanismos envolvidos no processo. Neste 
trabalho a gente pretende avaliar o papel das vias BER e NER no 
20 
desenvolvimento dos fenótipos neurodegenerativos nos modelos transgênicos de 
C. elegans e como a inibição destes afeta a homeostase redox, mitocondrial e 
proteossomal. Nós mostramos que o knockdown de exo-3 e/ou xpa-1 causou 
neurodegeneração e agravou os fenótipos neurodegenerativos em linhagens 
transgênicas para MA e DH em C. elegans. Nossos dados sugerem que a 
combinação de aumento do estresse oxidativo, deficiência de UPS, hiperativação 
de PARP e disfunção mitocondrial são o mecanismo subjacente da 
neurodegeneração induzida pela deficiência de XPA-1 e EXO-3. 
2 REVISÃO DE LITERATURA 
2.1 Doenças neurodegenerativas 
 Os efeitos deletérios e cumulativos de espécies reativas sobre a integridade 
celular podem eventualmente conduzir ou participar no desenvolvimento de 
doenças ou processos patológicos tais como doenças cardiovasculares, 
processos inflamatórios crônicos, câncer, diabetes, aterosclerose, além de várias 
DsND em humanos e animais (Finkel e Holbrook, 2000). Embora o EO não seja o 
agente etiológico ou a causa direta responsável pelas neuropatologias, ele 
participa da cascata de eventos patológicos envolvidos nessas doenças (Finkel e 
Holbrook, 2000). 
2.1.1 Mal de Alzheimer 
 Estima-se que 10% da população mundial possam estar atualmente afetados 
pelo MA (Meraz-Rios et al., 2014). O MA é caracterizado por demência e é a 
DND mais comum que ocorre em idosos (principalmente> 60 anos de idade), 
ainda que existam alguns casos precoces associados à hereditariedade e a 
mutações principalmente nos genes da Proteína Precursora do Amiloide (APP) e 
das Presenilinas 1 e 2 (PSEN1 e PSEN2) (Paula et al., 2009; Revett et al., 2013). 
Entre vários eventos moleculares complicados, a presença de emaranhados 
neurofibrilares (NFTs), placas senis e perda neuronal são os mais notáveis. A 
disfunção mitocondrial e um acúmulo de espécies reativas promovem 
desequilíbrio redox e neurotoxicidade induzida por β-amiloide (βA) ou tau. 
Geralmente, uma produção aumentada e agregação de βA facilita a 
polimerização e a fosforilação da tau e, portanto, a sucessão do MA (Zhao et al., 
21 
2013). 
 Os níveis aumentados de ERO estimulam a transcrição gênica pró-inflamatória 
e a liberação de citocinas, como a interleucina (IL) -1 e 6, o fator de necrose 
tumoral alfa (TNF-α), as quais levam a processos neuroinflamatórios. A 
neuroinflamação crônica é responsável pela perda de neurônios, bem como pela 
sensibilidade imunológica (McGeer et al., 1988). Caso contrário, as reações 
inflamatórias ativam ainda a micróglia e os astrócitos para gerar grandes 
quantidades de ERO, que é uma das principais causas de EO crônico. Os efeitos 
combinados de estresse oxidativo e neuroinflamação levam à geração de β-
amilóide (Aβ). Assim, a geração de uma cascata de eventos patológicos, 
incluindo a formação de NFTs, reações inflamatórias, estresse no retículo 
endoplasmático, alterada neurotransmissão acetililinférgica, aumento do estresse 
oxidativo e disfunção mitocondrial levam à morte celular e demência (Benilova et 
al., 2012; Sochocka et al., 2013). 
 A morte progressiva de neurônios em regiões específicas do cérebro, 
especialmente o neocórtex (Markaki e Tavernarakis, 2010) leva ao aparecimento 
dos sintomas cognitivos, sendo o mais impactante deles a perda de memória. 
Também são observados distúrbios comportamentais, mudanças de 
personalidade e depressão (Paula et al., 2009). Na atualidade, ainda não existem 
tratamentos capazes de curar o Mal de Alzheimer. De acordo com o protocolo 
clínico e as diretrizes terapêuticas para o MA (Brasil, 2013), o tratamento atual é 
constituído da administração dos fármacos Donepezil e Rivastigmina tendo como 
objetivo apenas a melhora da memória e atenção e a redução da velocidade de 
progressão da doença. Ainda que os mecanismos envolvidos na gênese e na 
progressão da doença não tenham sido totalmente esclarecidos, três 
características fisiopatológicas podem ser observadas em todos os pacientes: os 
emaranhados neurofibrilares compostos pela proteína TAU, placas senis 
compostas pelo peptídeo β-amiloide e um quadro progressivo de 
neurodegeneração (Trushina e Mielke, 2014; Paula et al., 2009). 
 A proteína TAU é intracelular e, dentre outras funções, está envolvida na 
composição do citoesqueleto através da interação intermitente com a tubulina, 
interagindo com o microtúbulo. A temporariedade dessa interação é mediada pela 
22 
fosforilação da proteína TAU (Revett et al., 2013). Nos indivíduos acometidos 
pela doença, a proteína TAU se encontra constantemente hiperfosforilada, o que 
impede sua ligação com a tubulina e provoca sua agregação em emaranhados 
que se depositam dentro da célula (Paula et al., 2009). Ainda que não tenha sido 
estabelecida uma relação causa-efeito entre os emaranhados neurofibrilares e os 
sintomas observados nos pacientes, estes são um dos principais achados no 
cérebro acometido pelo Mal de Alzheimer (Mi e Johson, 2006). 
 A presença das diferentes formas de acúmulo do peptídeo β-amiloide (βA), 
entretanto, já foi associada à grande parte dos eventos e sintomas observados na 
progressão do MA, gerando a hipótese de que o βA poderia ser um fator causal 
na doença (Teoria da Cascata Amiloide) (Korczyn, 2008). O peptídeo βA consiste 
em uma cadeia peptídica de 39 a 42 aminoácidos provenientes da clivagem 
sucessiva da proteína precursora amiloide (APP) (Revett et al., 2013). Em 
indivíduos normais, a APP é clivada preferencialmente pela α-secretase, gerando 
peptídeos sem importância patológica, cujas funções ainda não são bem 
conhecidas. Em indivíduos acometidos pelo Alzheimer, a APP é clivada 
preferencialmente pela β-secretase e, em seguida, pelas subunidades da γ-
secretase (as presinilinas), gerando os peptídeos tóxicos (Paula et al., 2009). Os 
monômeros de βA formam oligômeros intracelulares, que podem ser exportados 
para fora da célula e se depositar no meio extracelular, formando placas senis 
nos neurônios. Segundo a literatura, os oligômeros βA inibem o funcionamento 
normal do sistema de degradação protéica da célula (Munoz-Lobato et al., 2014), 
interagem com neurônios e células da glia induzindo a produção de ERO, 
desregulam o metabolismo do cálcio e induzem a morte neuronal por apoptose 
(Paula et al., 2009). Ainda que controversa, a teoria da cascata amiloide é uma 
das hipóteses mais discutidas da literatura e norteia o desenvolvimento de 
inúmeros ensaios clínicos com candidatos terapêuticos (Trushina et al., 2014). 
2.1.2 Doença de Huntington 
 A DH é uma doença poliglutamínica, que constitui um grupo de desordens 
neurodegenerativas caracterizadas por repetições do trinucleotídeo CAG (codifica 
o aminoácido glutamina) em regiões codificantes de determinados genes (Shao e 
Diamond, 2007). Essa doença apresenta um início dependenteda idade, 
23 
vulnerabilidade neuronal seletiva e evolução clínica progressiva geralmente fatal 
(Hammond et al., 2014; Rubinsztein et al., 2003). Quanto maior a expansão 
poliglutamínica, maior é a tendência de tais proteínas a se agregarem, mais 
graves serão os sintomas e mais cedo começam a surgir os sintomas da 
neurodegeneração. No caso da DH, uma doença neurodegenerativa autossômica 
dominante, essa repetição ocorre na região codificante do gene da Huntingtina 
(htt) que é um polipeptídeo citoplasmático ubiquamente expresso (Gil-Mohapel e 
Rego, 2011; Goehler et al., 2004). Esta localização de huntingtina tornou difícil 
definir uma função primária da proteína, mas sugeriu que esta era um andaime 
grande e móvel com muitos complexos dinâmicos, com localização e 
conformação sensíveis a eventos de estresse celular (Maiuri et al., 2019). A 
doença é progressiva e fatal, sendo caracterizada pela disfunção motora, 
cognitiva, comportamental e psicológica (Borgs et al., 2012). Os sintomas se 
iniciam, geralmente, por volta dos 40 a 50 anos de idade, mas existem alguns 
casos em jovens que representam aproximadamente 6% devido a antecipação 
por mutações instáveis (Borgs et al., 2012; Cendes, 2004; Myers et al., 1993). 
 Segundo Shao e Diamond (2007) a patogênese da doença de Huntington 
está associada não à disfunção da huntingtina, mas à sua clivagem proteolítica, 
formando fragmentos poliglutamínicos (poliQ). Estes fragmentos, pela presença 
das repetições poliglutamínicas, tendem a sofrer alterações conformacionais que 
favorecem a formação de oligômeros, agregados e inclusões proteicas, que 
possuem efeitos tóxicos por promoverem desregulação transcricional, 
remodelamento da cromatina, disfunção metabólica, alteração da homeostase do 
cálcio, excitotoxicidade e ativação de caspases, podendo levar à morte neuronal 
(Borgs et al., 2012). Os fragmentos poliglutamínicos também já foram associados 
ao bloqueio da atividade normal do proteassoma e ao sequestro de chaperonas 
moleculares, interferindo assim na atividade dos sistemas de controle de 
qualidade proteica da célula (Shao e Diamond, 2007). 
2.2 Estresse oxidativo em doenças neurodegenerativas 
 As doenças neurodegenerativas (DN) são caracterizadas por progressivos 
danos nas células neurais e perda neuronal, que podem levar ao 
comprometimento da função motora e ou da função cognitiva. Doenças 
24 
neurodegenerativas comumente incluem ao Mal de Alzheimer (MA), Doença de 
Parkinson (DP), doença de Huntington (DH), amiotrófica esclerose lateral (ALS) e 
ataxia espinocerebelar (SCA) (Alzheimer´s Association, 2016; Albers e Beal, 
2000). Essas doenças representam um problema primário de saúde, 
especialmente na população idosa (Albers e Beal, 2000; Hamer e Chida, 2009). 
Por exemplo, o MA está classificado como a sexta causa de morte nos Estados 
Unidos. A DP, a segunda doença neurodegenerativa mais prevalente, afeta 1 a 
2% da população acima de 65 anos (Bekris et al., 2010; Farrer, 2006). 
 A complexa patogênese das DN permanece amplamente desconhecida. No 
entanto, evidências crescentes sugerem que espécies reativas de oxigênio (ERO) 
podem desempenhar um papel crítico, pois altos níveis são comumente 
observadas no cérebro de pacientes com condições neurodegenerativas (Albers 
e Beal, 2000; Dias et al., 2013). 
 Numerosos estudos foram realizados para investigar o papel de ERO na 
progressão neurodegenerativa (St-Pierre et al., 2006; Hensley et al., 2006). 
Embora ERO não possa ser o fator desencadeador de doenças 
neurodegenerativas, elas podem exacerbar a progressão da doença por meio de 
danos oxidativos e interação com mitocôndrias (Dias et al., 2013). Importante 
lembrar que as células neuronais são particularmente vulneráveis a danos 
oxidativos devido ao seu alto teor de ácidos de gordura poli-insaturada nas 
membranas, alto consumo de oxigênio e defesa antioxidante fraca (Rego e 
Oliveira, 2003). A patogênese de várias doenças neurodegenerativas, como MA e 
A DP, está associada ao acúmulo de proteínas mal dobradas. A agregação 
dessas proteínas modificadas pode por sua vez desencadear uma resposta 
inflamatória no cérebro, o que induz ERO e subsequentemente o EO (Zuo et al., 
2015). A disfunção mitocondrial, que muitas vezes acompanha a produção 
exacerbada de ERO, está intimamente ligada aos distúrbios neurodegenerativos 
(Albers e Beal, 2000; Wallace, 1999). Por exemplo, em DH, a huntingtina mutante 
(mHTT) pode interagir diretamente com as mitocôndrias, levando ao 
comprometimento do fornecimento de energia e a níveis aumentados de ERO 
(Ross e Tabrizi, 2011). 
 
25 
2.3 Espécies reativas, fontes e equilíbrio celular pro/antioxidante 
 Sabe-se que os oxidantes biológicos que causam dano oxidativo 
compreendem os produtos de processos endógenos e exógenos que envolvem 
oxigênio e nitrogênio. As espécies reativas que contêm oxigênio são produzidas 
durante a respiração aeróbica, metabolismo celular e defesa contra patógenos 
(Falkowski e Godfrey, 2008). O potencial químico da molécula de oxigênio 
depende de sua estrutura eletrônica (dois elétrons desemparelhados em seu 
estado tripleto básico). Isto promove reações de um elétron que formam a base 
na respiração (redução de moléculas de oxigênio em quatro reações de elétrons 
simples), cadeias de transporte de elétrons microssomais (ETC do inglês: 
electron transport chains) (via citocromo P-450 (CYP 450)) e atividade de 
explosão oxidativa em macrófagos (Paiva e Bozza, 2014). 
 A alta dinâmica dos processos químicos que são alcançados em reações 
elementares de um único elétron é a fonte de moléculas reativas, os quais são 
produtos secundários indesejáveis gerados na respiração, metabolismo ou 
processo de defesa. Essas moléculas reativas são conhecidas como espécies 
reativas de oxigênio (ERO) e espécies reativas de nitrogênio (ERN). Entre eles, 
os mais conhecidos são singleto de oxigênio (1O2), radicais ânion superóxido (O2− 
•), radicais hidroxila (HO•), peróxido de hidrogênio (H2O2), óxido nítrico (ON) e 
ânions peroxinitrito (ONOO−) (Metodiewa e Koska, 2000; Popa-Wagner et al., 
2013). 
 As espécies reativas de oxigênio (ERO) são moléculas quimicamente reativas 
que têm sido implicadas na patogênese de DN. Elas são geradas naturalmente 
dentro do sistema biológico, desempenhando papéis importantes na mediação de 
atividades celulares, como inflamação, sobrevivência celular e respostas 
estressantes, bem como muitas doenças, incluindo distúrbios cardiovasculares, 
disfunção muscular, alergia e cânceres (Zuo et al., 2014; Zuo et al., 2015; He e 
Zuo, 2015). Devido à sua reatividade, altas concentrações de ERO podem levar à 
morte celular ou estresse oxidativo (EO), que é definido como a ruptura do 
equilíbrio entre os níveis pró-oxidantes e antioxidantes (Zuo et al., 2015). Um 
aumento descontrolado dessas concentrações leva a uma cadeia de reações que 
aumenta o risco de danos às moléculas biológicas em um organismo vivo. Isso é 
26 
causado pela alta reatividade de ERO e ERN com lipídios, proteínas, carboidratos 
e ácidos nucléicos. Portanto, é necessário estabelecer uma barreira antioxidante 
para limitar os níveis de ERO/ERN a uma quantidade que não ameace a 
integridade dos sistemas biológicos. A formação excessiva de ERO/ERN que 
excede a capacidade máxima da barreira antioxidante leva a uma perturbação no 
equilíbrio pró/antioxidante e, finalmente, ao desenvolvimento do estado conhecido 
como estresse oxidativo (EO) (Pisoschi e Pop, 2015). 
 O EO pode ser desencadeado por radicais produzidos por processos 
exógenos (por exemplo, xenobióticos, frio, infecções por vírus e bactérias, 
radiação ionizante, ultrassom ou foto-oxidação, dieta inadequada, consumo de 
álcool e fumo) ou processos endógenos, que são reações bioquímicas básicas no 
corpo (Figura 1) (Luu et al., 2015). 
 
Figura 1: Geração de espécies reativas 
Principais reações bioquímicasbásicas como fonte de ERO e atuação dos mecanismos de defesa 
antioxidante na detoxificação dessas moléculas. CAT: Catalase; GPX: Glutationa peroxidase; GR: 
Glutationa redutase; SOD: Superóxido dismutase; GSSG: Glutationa dissulfeto. Fonte: 
Adaptada de Niedzielska et al. (2016) 
27 
 Sabe-se que compostos altamente reativos induzem mudanças na estrutura e 
função das membranas celulares, proteínas, lipoproteínas, enzimas, hormônios e 
material genético. Em particular, as membranas são o alvo primário para ERO. 
Os produtos de conversão da peroxidação lipídica levam à decomposição de 
ácidos graxos poli-insaturados e à formação dos produtos finais, ou seja, os 
aldeídos reativos, como malondialdeído (MDA) e 4-hidroxinonenal (HNE). Estes 
compostos reagem com DNA ou moléculas de proteína e modificam sua estrutura 
e funções (Albarracin et al., 2012; Fritz e Petersen, 2013). 
 Existem alguns mecanismos que protegem o organismo contra os efeitos 
nocivos das ERO e ERN. A quantidade final de ERO/ERN está sob o estrito 
controle do corpo como resultado de mecanismos de defesa enzimáticos e não 
enzimáticos. A produção de danos induzidos por ERO e ERN (o efeito final de 
EO) no tecido pode ser confirmada pela presença de biomarcadores específicos 
e não específicos para tecidos (Ho et al., 2013; Miller et al., 2014; Zitka et al., 
2013). 
 O sistema antioxidante celular, que prevê danos ao tecido, é composto de 
enzimas antioxidantes e outros compostos não enzimáticos que têm a 
capacidade de reduzir diferentes estruturas químicas (Kadiiska et al., 2013). 
Esses compostos são responsáveis por manter o equilíbrio entre os agentes pró 
e antioxidantes diminuindo o EO. Os antioxidantes enzimáticos são produzidos 
endogenamente e fazem parte de um sistema de detoxificação de três fases, 
altamente conservadas entre eucariotos. As proteínas de detoxificação 
envolvidas neste processo são classificadas em fase I, II e III (Sarkadi et al., 
2006). Os componentes essenciais da defesa antioxidante enzimática são 
superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e 
glutationa redutase (GR), enquanto os antioxidantes não enzimáticos incluem 
glutationa (GSH), tiorredoxina (Trx), vitaminas A, E e C, flavonóides, 
oligoelementos e proteínas, por exemplo, albumina, ceruloplasmina e 
metalotioneína (Figura 1). 
 A enzima citocromo P450 monooxigenase (CYP) é a principal envolvida na 
fase I do metabolismo xenobiótico, e as enzimas CYPs oxidam os xenobióticos 
por hidroxilação. Uma rede de enzimas detoxificadoras, tais como SOD, CAT, 
28 
GPx e glutationa transferase (GT) fazem parte da fase II. A SOD age 
transformando dois ânions radicais superóxidos em um peróxido de hidrogênio, 
podendo ocorrer de três formas, dependendo do metal associado a ela, sendo 
cobre (Cu) e zinco (Zn) no citoplasma e manganês (Mn) na matriz mitocondrial de 
eucariotos e ferro (Fe) em bactérias (Perez et al., 2010). A CAT tem função de 
proteger as células catalisando a decomposição do peróxido de hidrogênio em 
oxigênio molecular e água sem produção de radicais livres (Ratnam et al., 2006; 
Sies, 1993). A GPx é uma enzima localizada no citosol e na matriz mitocondrial, 
que reduz peróxido de hidrogênio e hidropeptídeos orgânicos utilizando a 
glutationa (GSH). A GSH atua como co-substrato da GPx, com propriedade 
doadora de elétrons, podendo ser regenerada através da glutationa redutase 
(GR) com transferência de hidrogênio do NADPH. Neste processo, são 
transferidos dois hidrogênios dos grupamentos sulfidrila para os peróxidos, 
transformando-os em álcool e/ou água, resultando em glutationa dissulfeto 
(GSSG). Na fase III de detoxificação, os conjugados tóxicos são bombeados para 
fora da célula por transportadores cassetes de ligação de ATP (Transpotador 
ABC) ou outros transportadores (Figura 1) (Sarkadi et al., 2006). 
2.3.1 Via de sinalização Nfr2-ARE 
 O fator nuclear de resposta relacionado ao eritróide 2 (Nrf2) – elemento de 
resposta antioxidante (ERA) é o fator de transcrição responsável por ativar a 
defesa entioxidante (Moi et al., 1994). Nrf2 é ubiquamente expresso em todos os 
tecidos humanos, incluindo o cérebro, e é um dos fatores de transcrição 
cap'n'collar (CNC) (Moi et al., 1994). As proteínas do CNC são uma família de 
fatores de transcrição básicos de zíper de leucina que são conservados em 
vertebrados. Eles são definidos pela presença de um motivo conservado do CNC 
de 43 aminoácidos, que está localizado na região N-terminal do domínio de 
ligação ao DNA (Alam, 2006). Este fator de transcrição se liga ao elemento de 
resposta antioxidante (ARE). O ARE é um elemento potenciador com uma 
sequência consenso de RTGACnnnGC, localizada na região flanqueadora 5´ de 
muitos genes desintoxicantes e antioxidantes da fase II (Rushmore et al., 1991; 
Rushmore e Pickett, 1990). O Nrf2 se liga ao ARE através do seu domínio de 
ligação ao DNA para regular esta via (Moi et al., 1994). Em condições basais, 
29 
Nrf2 é regulado negativamente no citoplasma por uma proteína associada actina 
chamada Keap1. O Keap1 previne a translocação nuclear de Nrf2 e funciona 
como uma proteína adaptadora à ligase E3 para promover a degradação de Nrf2 
através do sistema de proteassoma ubiquitina (UPS) (Cullinan et al., 2004; Itoh et 
al., 1999, 2003; McMahon et al., 2003; Zhang et al., 2003, 2004). Após a ruptura 
da ligação Keap1-Nrf2, o Nrf2 se transloca para o núcleo e se liga a pequenas 
proteínas Marf. O heterodímero formado se liga à ARE e coordena a transcrição 
de genes envolvidos na fase II de desintoxicação e defesa antioxidante (Itoh et 
al., 1997). As proteínas expressas por esses genes desintoxicantes e 
antioxidantes de fase II são responsáveis pela manutenção do equilíbrio redox. 
Alguns exemplos incluem superóxido dismutase 1 (SOD1), catalase, 
sulforedoxina, tiorredoxina e peroxirredoxina. Outras proteínas envolvidas na 
síntese e no metabolismo da glutationa incluem glutationa peroxidase, glutationa 
redutase, gama glutamina cisteína ligase e gama glutamina cisteína sintase. Além 
disso, há proteínas que impedem a reciclagem de quinonas e preservam a 
homeostase do ferro com base na análise de microarranjos após a ativação do 
Nrf2 (Johnson et al., 2008; Lee et al., 2003). 
2.4 Disfunção mitocondrial e neurodegeneração 
 A produção de ERO como efeito colateral da respiração aeróbica ocorre na 
membrana interna da mitocôndria (Venditti et al., 2013). A cadeia respiratória 
consiste em uma série de 5 complexos ligados à membrana: complexo I forma 
reduzida de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH)/ubiquinona redutase), 
complexo II (succinato ubiquinona redutase), complexo III (citocromo ubiquinol c 
redutase), complexo IV (citocromo c oxidase) e complexo V (trifosfato de 
adenosina (ATP) sintase) (Li et al., 2013). O receptor final de elétrons e prótons, 
uma molécula de oxigênio, sofre redução de quatro elétrons, o que pode levar à 
produção de moléculas de água. Durante a ETC, vazamentos de elétrons 
individuais reduzem o oxigênio molecular e formam O2- • e, mais tarde, H2O2 e 
HO• (Figura 1) (Mailloux et al., 2013). 
 Sabe-se que a mitocôndria é a principal fonte de ERO na porção intracelular, 
pois produz 1-5% de ERO em condições fisiológicas normais (Wei et al., 2001). A 
produção de O·−2 e OH, juntamente com os outros danos oxidativos causa um 
30 
dano não reparado ao DNA mitocondrial (mtDNA), o que leva ao defeito no 
complexo I ou III. Isso pode aumentar a redução de elétrons de O2 para formar 
O·−2 (Castro et al., 2012). O nível aumentado de O·−2 é responsável pelas lesões 
de mtDNA, estresse oxidativo metabólico, lesão celular e instabilidade genômica 
(Hollensworth et al., 2000). Além disso, a regulação negativa da função da cadeia 
de transporte de elétrons e a apoptose mediada por ERO também são evidentes 
(Van Houten et al., 2016). Assim mesmo, as mitocôndrias também sãosuscetíveis a efeitos nitrosativos induzidos por ON e ONOO- (Sas et al., 2007). 
Este último efeito modifica de maneira prejudicial a atividade de enzimas como a 
desidrogenase do NAD e a citocinas oxidase Cyt-C (Andreazza et al., 2010). 
 As espécies reativas são formadas no cérebro principalmente pela produção 
de ATP através de fosforilação oxidativa. Tendo maiores taxas metabólicas e as 
demandas de energia, o cérebro (principalmente o SNC) depende muito da 
função mitocondrial. A esse respeito, em DN relacionadas à idade, como o MA, a 
DH, a ELA e DP as mitocôndrias desempenham um papel importante (Federico et 
al., 2012). As mitocôndrias são as únicas organelas nas células eucarióticas que 
possuem seu próprio DNA (mtDNA) distinto do DNA nuclear (nDNA); portanto, 
são suscetíveis a mutações. Particularmente, o genoma mitocondrial que não é 
protegido pelas histonas e sua taxa de mutação é maior do que o nDNA (Filosto 
et al., 2011). 
 De fato, o estresse oxidativo no mtDNA, juntamente com um desequilíbrio na 
cadeia respiratória mitocondrial, homeostase de Ca2+, excitotoxicidade, apoptose, 
permeabilidade da membrana e sistemas de defesa mitocondrial são as causas 
notáveis do desenvolvimento de DN, ou amplificam a disfunção neuronal e 
desencadeiam a neurodegeneração (Guo et al., 2013). 
 Vale a pena notar que a função prejudicada da cadeia de transporte de 
elétrons mitocondrial é uma fonte primária de EO. Defeitos nesta via resultam em 
aumento de radicais livres e níveis diminuídos de ATP; ambos foram observados 
em doenças neurodegenerativas. O aumento da produção de radicais livres pode 
prejudicar ainda mais a mitocôndria, formando assim um ciclo de feedback 
positivo. Além disso, os níveis de radicais livres são aumentados devido a um 
desequilíbrio entre a taxa de geração de oxidante e a capacidade antioxidante 
31 
endógena. Os sistemas antioxidantes, muitos dos quais são regulados pela via 
Nrf2-ARE, são responsáveis pela remoção de radicais livres. A falha dos 
sistemas de defesa antioxidante também foi examinada em cérebros de 
pacientes com DN após a morte. Por exemplo, de acordo com o aumento da 
carga de espécies reativas na doença, os pacientes com DP apresentam níveis 
reduzidos de glutationa nos neurônios do SNC (Sian et al., 1994; Sofic et al., 
1992) e neurônios dopaminérgicos (Pearce et al., 1997) do que nos controles 
pareados por idade. 
2.4.1 Toxicidade de proteínas na mitocôndria 
 Disfunção mitocondrial é uma das principais características d as doenças 
neurodegenerativas. A disfunção mitocondrial pode ser causa primária e 
secundária da neurodegeneração. Em alguns casos a disfunção mitocondrial é 
claramente uma consequência primária direta da toxicidade da proteína na 
mitocôndria. O acúmulo extracelular de beta amiloide é um dos principais 
características patológicas do MA, em que a disfunção mitocondrial é 
freqüentemente observada (Spuch et al., 2012). Lustbader et al. mostrou em 
2004 que amiloide beta pode se localizar na mitocôndria e se ligar diretamente a 
álcool desidrogenase de ligação beta-amiloide (ABAD) para induzir toxicidade 
mitocondrial (Lustbader et al., 2004). Beta amilóide também demonstrou interagir 
com a ciclofilina D (CypD), uma componente da transição da permeabilidade do 
poro mitocondrial (mPTP), que sensibiliza a abertura do mPTP em ambos 
pacientes com MA e cérebros de camundongos mAPP (Du et al., 2008). 
 A disfunção mitocondrial não é exclusiva do MA. Na DH, a disfunção 
mitocondrial relacionada a um déficit de energia foi observada pela primeira vez 
há mais de duas décadas (Browne et al., 1997). O mecanismo pelos quais os 
mutantes de proteínas htt induzem disfunção mitocondrial tem se mostrado tão 
diverso como no MA. As mutantes htt apresentam uma transcrição perturbadora 
de genes relacionados à biogênese mitocondrial e função no núcleo (Cui et al., 
2006; Farshbaf e Ghaedi, 2017), e podem também diretamente interagir com 
proteínas mitocondriais (Kim et al., 2016). O fragmento N terminal de mutante htt 
localiza-se na mitocôndria (Choo et al., 2004; Orr et al., 2008) tanto in vivo quanto 
in vitro, e interage com o complexo TIM23, obstruindo assim o processo de 
32 
importação do sistema mitocondrial (Yano et al., 2014). Essas interações tóxicas 
de mutantes Htt com proteínas mitocondriais pertubam a regulação do cálcio, 
sensibilizam a abertura de mPTP, despolarizam a potencial de membrana 
mitocondrial e, por utimo, levam à morte neuronal (Choo et al., 2004; Orr et al., 
2008; Yano et al., 2014). 
2.5 Sistema de proteassoma ubiquitina (UPS) 
 O proteassoma é um complexo proteinase de múltiplas subunidades, 
responsável pela degradação da maioria das proteínas intracelulares. Além da 
quebra de proteínas obsoletas e danificadas, os proteassomas regulam muitos 
processos celulares importantes via degradação controlada dos fatores de 
transcrição, reguladores do ciclo celular, enzimas, etc. O proteassoma eucariótico 
contém três subunidades catalíticas: β1, β2 e β5, cada uma tendo sua própria 
especificidade de substrato. Além disso, vários tipos de células contêm variantes 
de proteassomas com diferentes perfis de atividade e especificidade; as funções 
desses proteassomas ainda não foram totalmente compreendidas. Muitos 
inibidores da atividade proteolítica proteossômica são atualmente usados como 
drogas no tratamento da má formação hematológica; A aplicação potencial de 
inibidores do proteassoma no tratamento de outras doenças, incluindo doenças 
neurodegenerativas, está sendo ativamente estudado (Papaevgeniou e 
Chondrogianni, 2014). 
2.5.1 Agregação e Proteotoxicidade 
 Proteínas deformadas e a subsequente formação de agregados/inclusões são 
importantes contribuintes para a patologia em muitas doenças 
neurodegenerativas. A maioria das doenças tem agregados de proteínas com 
propriedades incorretas, tais como αSyn na PD, placas beta-amilóides (βA) e 
emaranhados de neurofilamentos de tau (NFTs) no MA e Huntingtina (Htt) na DH. 
O estresse oxidativo é a principal fonte de modificações proteicas e afeta sua 
síntese, dobramento e função. 
 Embora os agregados de proteínas sejam uma característica patológica das 
proteopatias, não é conhecido se elas são tóxicas ou neuroprotetoras. Postulou-
se que a coleta de proteína mal formada em agregados representa um 
33 
mecanismo de defesa celular para combater a proteotoxicidade e manter a 
proteostase (Cheng et al., 2007). Essas inclusões, no entanto, têm sido 
consideradas proteotóxicas, seja pela perda de função, onde as proteínas 
agregadas são incapazes de desempenhar sua função fisiológica normal e/ou 
pelo incremento de funções, adquirindo novas funções que contribuem para a 
morte celular (Winklhofer et al., 2008). 
2.5.2 Disfunção de proteassoma desencadeia ativação de SKN-1 
 A ativação de Nrf1 em resposta à disfunção do proteassoma é complexa. 
Análises in vitro em humanos e células de camundongo indicam que Nrf1 é uma 
glicoproteína associada à membrana do retículo endoplasmático (RE) que é 
constitutivamente direcionado para via de degradação proteassomal associada a 
RE (ERAD). Após a inibição do proteassoma, Nrf1 é estabilizado, sofre 
desglicosilação e clivagem proteolítica e localiza-se no núcleo (Radhakrishnan et 
al., 2014; Sha e Goldberg, 2014; Wang et al., 2006; Zhang e Hayes, 2013; Zhang 
et al., 2007, 2014, 2015). Como o processamento de Nrf1 é orquestrado, e sua 
importância nas respostas à interrupção do proteassoma in vivo não é entendido. 
Após a interrupção do proteassoma, C. elegans induz a transcrição da 
subunidade do proteassoma, genes de resposta imune e desintoxicação, e os 
animais alteram seu comportamento para evitar sua fonte alimentação bacteriana 
(Li et al., 2011; Melo e Ruvkun, 2012). A resposta transcricional após interrupção 
do proteassoma envolve o fator de transcrição skn-1, que codifica várias 
isoformas com semelhançasentre ambos Nrf1 e Nrf2 (Blackwell et al., 2015; Li et 
al., 2011). SKN-1 foi originalmente identificado por seu papel essencial no 
desenvolvimento embrionário (Bowerman et al., 1992), mas também é necessário 
nos estágios iniciais para respostas ao estresse de uma maneira análoga ao 
Nrf1/2 de mamíferos (An e Blackwell, 2003; Oliveira et al., 2009; Paek et al., 
2012). SKN-1 se liga aos promotores dos genes da subunidade do proteassoma 
e medeia sua regulação positiva em resposta à interrupção do proteassoma, e é 
necessário para a sobrevivência de um mutante com função proteassoma 
atenuada (Keith et al., 2016; Li et al., 2011; Niu et al., 2011). O mecanismo 
molecular que liga a ativação do SKN-1 à detecção da disfunção do proteassoma 
não foi estabelecido. 
34 
 
2.6 Dano no DNA: O papel dos mecanismos de reparo de DNA nas lesões 
induzidas por estresse oxidativo 
 Ácidos nucléicos, proteínas e lipídios são continuamente danificados por 
agentes físicos e químicos. Fontes exógenas de danos no DNA incluem radiação, 
dieta e produtos químicos ambientais. Fontes endógenas de danos no DNA 
incluem instabilidade química, como depurinação, erros espontâneos durante a 
replicação e reparo do DNA, e ERO, como subprodutos do metabolismo normal. 
Acredita-se que as ERO geram até 50.000 lesões de DNA por célula humana por 
dia (Lindahl 1993), incluindo modificações de base, quebras de fita simples 
(SSBs), quebras de fita dupla (DSBs) e reparo de interligação cruzada (ICL). 
 Danos no DNA não reparados podem causar instabilidade genômica e induzir 
cascatas de sinalização que levam à senescência celular ou morte celular, os 
quais são fenótipos celulares associados ao envelhecimento (Rodier et al., 2009). 
De fato, é esperado que a capacidade de reparar danos no DNA diminua à 
medida que as células envelhecem (Moriwaki et al., 1996). 
 Considerando os danos que as ERO podem causar ao DNA em condições de 
EO, existem vários sistemas relacionados ao reconhecimento (proteínas 
sensoras que reconhecem a própria lesão ou até mesmo alterações na 
conformação do DNA devido ao dano) e reparo desses danos (proteínas 
transdutoras são ativadas e dão início a um mecanismo de ativação de proteínas 
efetoras que formam complexos de reparo nos sítios de dano) em diversos 
organismos (Barzilai e Yamamoto, 2004; Whitaker et al., 2017). 
 Para preservar e transmitir fielmente o DNA para a próxima geração, as células 
são equipadas com uma variedade de vias de reparo do DNA e respostas de 
danos ao DNA associadas, coletivamente referidas como a resposta ao dano ao 
DNA (DDR) (do inglês: DNA damage response). O DNA é continuamente 
danificado por agentes genotóxicos ambientais e derivados do metabolismo. É 
vital que as células e organismos lidem adequadamente com os danos ao DNA, 
porque danos não reparados podem causar mutação e morte celular. A 
importância do DDR é ilustrada por várias doenças hereditárias humanas 
35 
propensas ao câncer e/ou progeróides, que são baseadas em defeitos no DDR. 
Nos últimos tempos, uma riqueza de informações sobre o mecanismo molecular 
de diferentes vias de reparo foi obtida a partir de dados detalhados in vitro e in 
vivo. Atualmente, esse conhecimento adquirido está sendo usado para 
desenvolver estratégias terapêuticas para tratar pacientes que sofrem as 
consequências de danos não reparados no DNA, como câncer e envelhecimento 
(Boss et al., 2010). 
 O dano é reparado por diferentes vias de reparo do DNA, dependendo do tipo 
de lesão do DNA, localização genômica e fase do ciclo celular (Essers et al., 
2006; Giglia-Mari et al., 2011; Jackson e Bartek, 2009). As principais vias de 
reparo de DNA em células de mamíferos são reparo de excisão de base (BER) 
(do inglês: Base Excision Repair), reparo de excisão de nucleotídeo (NER) (do 
inglês: Nucleotide Excision Repair), reparo de desemparelhamento (MMR) e 
reparo de quebra de fita dupla (DSBR). O foco deste trabalho é NER e BER que 
serão descritas a seguir. 
2.6.1 Reparo por excisão de bases (BER). 
 Pequenas modificações de base, tais como lesões oxidativas que não 
distorcem substancialmente a dupla hélice, são reparadas pelo sistema BER. O 
BER remove uma ou várias bases e repara a lacuna por síntese de DNA. O 
sistema de reparo BER compreende duas subvias: A curta e a longa. A subvia 
curta tem início com a ação das glicosilases monofuncionais UNG (do inglês: 
uracil-DNA glycosylase) e MPG (do inglês: N-methylpurine-DNA glycosylase), que 
removem o dano e a extremidade 5' e permitem a ação da AP endonuclease 1 
(APE1) que, por sua vez, hidrolisa o esqueleto fosfodiéster gerando sítios AP pela 
incisão do DNA na ligação fosfodiéster na extremidade 5’ ao sítio AP, que resulta 
em uma quebra de fita contendo uma extremidade 3’OH (3’ hidroxila) e uma 
extremidade 5’dRP (5’ desoxirribose fosfato). Esses grupamentos acionam a 
ação da Polimerase β que possui atividade 5’dRP ligase e promove a adição de 
nucleotídeos e, por fim, permite a ação da Ligase3α juntamente com XRCC1 que 
promove a ligação da fita e o fim do reparo (Figura 2) (Whitaker et al., 2017). 
 A subvia longa tem início através das glicosilases bifuncionais NEIL1 (do 
36 
inglês: Nei like DNA glycosylase 1) e OGG1 (do inglês: 8-oxoguanine DNA 
glycosylase), que removem o dano e apresentam atividade ligase (ou β-ligase), 
clivando o sítio AP na extremidade 3’. O sítio AP apresenta grupamento 3’OH, 
que é removido pela ação de APE1 gerando 3’OH e 5’P. Com isso, o complexo 
Polimerase δ/ε, PCNA (do inglês: Proliferating cell nuclear antigen) e FEN1 (do 
inglês: Flap structure-specific endonuclease 1) adicionam o nucleotídeo e leva a 
ativação da DNA Ligase 1, que promove a ligação da nova fita de DNA, 
finalizando assim o reparo (Whitaker et al., 2017). (Figura 2). 
 
Figura 2: Reparo por excisão de Bases. 
Via de reparo de excisão de base de DNA (BER) pode começar com o reconhecimento de uma 
base danificada por uma glicosilase de DNA, um local de AP por APE1 ou uma quebra de fita 
simples por proteínas de processamento final. BER pode proceder através da incorporação de um 
único nucleotídeo (remendo curto, RC), ou pela incorporação de dois ou vários nucleotídeos 
(remendo longo, RL). Fonte: Adaptada de Akbari et al. (2015). 
37 
 Uma proteína de reparo envolvida na sinalização e recrutamento de outras 
proteínas de reparo é a poli (ADP-ribose) polimerase 1 (PARP-1). Em condições 
de EO, a PARP-1 se liga a regiões danificadas no DNA ou outros tipos de lesão 
estimulando a adição de unidades repetidas de ADP-riboses ou "PAR". PARP1 é 
dependente de NAD, utilizando-o como substrato para a síntese do grupamento 
ADP. A maioria das cadeias PAR ocorrem no próprio DNA, porém cerca de 10% 
das modificações PAR são colocadas em histonas e proteínas associadas à 
cromatina, alterando a estrutura do DNA e permitindo a melhor acessibilidade das 
enzimas BER ao DNA. PARP-1 também estimula a atividade de APE1. O 
acúmulo do grupamento PAR promove o recrutamento de outras proteínas, 
como: XRCC1 (do inglês: X-ray repair cross complementing 1), APE1, pol β e 
DNA ligase III (Whitaker et al., 2017). 
 A XRCC1 também é uma proteína essencial para o funcionamento da via BER. 
Inicialmente, XRCC1 foi tida como dependente do recrutamento de PARP-1 para 
reparar danos de bases como a 8 oxo-G. Porém, XRCC1 também interage com 
ela mesma e se acumula em sítio de DNA danificado. Esta proteína também é 
responsável por interagir, estabilizar e estimular a atividade de BER através da 
interação com seu domínio N-terminal, que costuma se ligar a pol β com elevada 
afinidade e dois domínios BRCT (BRCA1 C-terminal). Alguns estudos também 
mostram que a forma oxidada de XRCC1-NTD exibe alta afinidade com pol β, e 
sugere-se que a formação de uma ponte dissulfeto pode estar relacionada com a 
regulação de vias que envolvem o complexo XRCC1/pol β. Ainda, foi 
demonstradoque XRCC1 forma um complexo com a DNA ligase III (Whitaker et 
al., 2017). 
2.6.2 Reparo por excisão de nucleotídeos (NER). 
 Lesões maiores em uma fita do DNA que distorcem substancialmente a hélice 
do DNA são reparadas por NER. O NER repara as lesões cortando um pedaço 
da fita de DNA danificada e preenchendo a lacuna por síntese de DNA. Em outro 
sentido, a via NER, de forma canônica, é responsável por corrigir danos na dupla 
fita do DNA. Porém, a literatura vem mostrando que esta via também apresenta 
importante papel no reparo de danos oxidados no DNA juntamente com a via 
BER (D’errico et al., 2006; Mellis et al., 2008). 
38 
 A via NER pode ser classificada em duas subvias: o reparo acoplado à 
transcrição (do ingles: transcription-coupled repair-TC-NER) repara apenas a 
região transcricional do DNA, e o reparo do genoma global (do inglês: Global 
genomic repair - GG-NER) remove lesões encontradas em qualquer região do 
genoma (Rapin, 2013). A via NER envolve a interação de mais de 30 proteínas 
responsáveis pelo reparo do DNA. Mutações nos genes que codificam esses 
fatores são responsáveis pelos fenótipos associados a algumas doenças raras 
como Xeroderma pigmentosum (XP), Síndrome de Cockayne (CS) e 
Tricotiodistrofia, estando, provavelmente, envolvidas com fenótipo dessas 
síndromes (Kalia e Lang, 2015; Noyce et al., 2012). Além disso, é conhecido que 
pacientes deficientes em Xeroderma pigmentosum grupo A (XPA) apresentam 
atividade redox alterada, como a maior propensão ao acúmulo de ERO, e 
consequente instabilidade genômica. Nesse contexto, estudar os mecanismos 
moleculares associados às manifestações observadas em pacientes com 
Xeroderma pigmentosum e Síndrome de Cockayne são fundamentais para o 
desenvolvimento de terapias gênicas que visem à melhoria da qualidade de vida 
desses pacientes (Parlanti et al., 2012). 
 A subvia TC-NER tem início a partir do bloqueio da atividade da RNA 
polimerase II (RNA-Pol II) sobre a fita de DNA danificada na região da lesão. Por 
conseguinte, CSB (do inglês: Cockayne syndrome B) apresenta a importância de 
recrutar CSA (do inglês: Cockayne syndrome A), remodeladores da cromatina, 
como p300 (E1A Binding Protein P300), para o local da RNA-Pol II, exigindo a 
função de XPA e RPA, que, por sua vez, recrutam as proteínas que formam o 
complexo multi-proteína TFIIH e as proteínas Xeroderma pigmentasum grupo G 
(XPG) e ERCC1-XP (Figura 3) (Iyama e Wilson, 2016; May et al., 2010; Rapin, 
2013). 
 TFIIH é um complexo transcricional formado por cerca de 10 proteínas, dentre 
elas XPD (Xeroderma pigmentosum grupo de complementação D) e XPB 
(Xeroderma pigmentosum grupo de complementação B), que apresentam 
atividade helicase dependente de trifosfato de adenosina (ATP). Dentre as 
proteínas que formam este complexo, p52 (keratin 18 pseudogene 52) estimula a 
função de XPB e p44 (ribosomal protein L21 pseudogene 44) e estimula a função 
39 
de XPD, que são extremamente importantes para a abertura da dupla hélice e a 
ligação do complexo pré-incisão. Apenas a atividade de ATPase de XPB é 
necessária para que NER aconteça e, por conseguinte, XPD deve apresentar a 
atividade de ATPase e helicase e atua na detecção da lesão quando seu 
movimento sofre algum impedimento. Dentre todas as proteínas que formam este 
complexo, XPD e XPB promovem a abertura do DNA para a formação de uma 
bolha de 30 nucleotídeos em média (Figura 3) (Spivak, 2015). 
No GG-NER, o complexo XPC-hHR23B é responsável pelo reconhecimento do 
dano. A partir daí, as subvias passam a compartilhar a mesma etapa, quando a 
fita de DNA sofre uma abertura pela ação das XPD e XPB, presentes no 
complexo de reparo/transcricional TFIIH, juntamente com XPA e RPA, que 
promovem a estabilização da fita simples, permitindo a ação das endonucleases 
específicas: XPG (Xeroderma pigmentosum grupo de complementação G) e 
ERCC1-XPF (Xeroderma pigmentosum grupo de complementação F) (Figura 3). 
XPG é recrutada por meio de sua interação com TFIIH no lado 3’ da fita e seu 
posicionamento na região em que a incisão deve ser feita depende do auxílio de 
RPA. A interação entre ERCC1 e XPA estimula o recrutamento de ERCC1-XPF 
na região 5’ da lesão. A lacuna, gerada pela retirada do oligonucleotídeo é 
preenchida pelos DNA polimerases replicativas δ e ε ou pelo DNA polimerase de 
síntese translesão k, na presença de PCNA, RFC e RPA (May et al., 2010; 
Spivak, 2015). Por fim, a última ligação fosfodiéster entre o novo nucleotídeo 
inserido e o DNA já existente é realizada pela Lig1 ou pela Lig3α juntamente com 
XRCC1 (May et al., 2010). 
Alterações na integridade genômica e na via NER podem causar algumas 
síndromes, como é o caso das doenças: Síndrome de Cockayne (CS) e 
Xeroderma Pigmentosum (XP). A primeira é caracterizada por hipersensibilidade 
a luz UV, defeitos na síntese de RNA após exposição à radiação, anomalias 
graves no neurodesenvolvimento, envelhecimento precoce, catarata, alterações 
na glicemia, comprometimento hepático e renal e alterações na locomoção 
(Nance e Berry, 1992; Ozdirim et al., 1996). Entretanto, XP é uma das doenças 
mais estudadas que afetam NER, tendo em vista sua gama de mutações e 
classificações. Essa doença é classificada como Xeroderma Pigmentosum grupo 
40 
 
Figura 3: Reparo de excisão de nucleotídeos. 
Lesões de DNA volumosas que desestabilizam a hélice dupla de DNA são alvo de NER. O 
reconhecimento de danos é realizado por transcrição acoplada a NER (TC-NER) e global genome 
NER (GG-NER). Sugere-se que, antes do reconhecimento de danos, a cromatina tenha que ser 
modificada. As lesões na cadeia transcrita de genes ativos são detectadas pela RNA polimerase II 
(RNAP2) e estabilizam a interação com CSB (etapa 1b). Dentro de GG-NER, as lesões são 
reconhecidas pelos complexos UV-DDB e XPC (etapa 1a). Estes intermediários carregam o fator 
de transcrição TFIIH juntamente com a endonuclease XPG (etapas 2a e 2b). No TC-NER, o CSA 
também é recrutado para modificar e reposicionar o RNAP2 lesionada (etapa 2b). Após os dois 
modos de detecção da lesão, os dois processos se fundem numa via comum de montagem do 
fator NER recrutando o XPA e a proteína de replicação A (RPA) (etapa 3). Este intermediário NER 
carrega e orienta adequadamente o complexo endonuclease específico da estrutura ERCC1/XPF 
(etapa 4). Após a incisão dupla por XPG (3´ da lesão) e ERCC1/XPF (5´ da lesão), uma cadeia 
única de 25-29 nucleotídeos é criada (etapa 5). A XPG está provavelmente envolvida no 
recrutamento do grampo deslizante PCNA, que é carregado por RFC e forma a plataforma para 
os enchimentos da DNA polimerases ϐ, ɛ ou k (etapa 6). Descobriu-se que cada uma destas 
polimerases participa no preenchimento de lacunas dependente de NER. PCNA ou RFC estão 
também provavelmente envolvidos no recrutamento das ligases (isto é, Ligase I e III/XRCC1, 
dependendo da capacidade de proliferação da célula) para selar o nick (etapa 7). O PCNA 
também desempenha um papel na atração da histona chaperona CAF1 (etapa 8) para restaurar a 
estrutura da cromatina após o reparo (etapa 9). Fonte: Adaptada de Giglia-Mari et al. (2011). 
 
41 
de complementação de A a G e ainda apresenta um grupo variante, o XP-V, 
cujos indivíduos não apresentam defeitos no NER, mas sim no mecanismo de 
reparo por síntese translesão. Dentre os fenótipos clássicos de indivíduos com 
XP, essa doença também apresenta sensibilidade à radiação UV, provocando 
diversas alterações cutâneas como atrofia, hiperpigmentação da pele, angioma, 
sardas e fotofobia (Tang et al., 2000). Em alguns pacientes XPA, de forma 
pontual, as células do gânglio da raiz dorsal morrem seletivamente, provocando 
neuropatia axonal sensitivo-motora com perda de propriocepção, fraqueza e 
atrofia muscular (Mantha et al., 2014). 
2.6.3 Interações entre proteínas de sistemas BER e NER 
 Recentes achados na literatura mostram que as proteínas da viaBER e NER, 
apresentam diversas interações com outras proteínas. Como citado 
anteriormente, vários estudos sugerem que o NER também atua no reparo de 
danos oxidados, seja estimulando a atividade de enzimas da via BER ou até 
mesmo de forma direta (Rybanska e Persel, 2003). 
 Nesse cenário, já foi relatado que APE1, enzima essencial para a via BER, 
ajuda a regular a via NER no reparo de danos provocados pela cisplatina, que 
promove a formação de adultos de platina em neurônios sensoriais (Kim et al., 
2015). Outro resultado interessante foi que a superexpressão de APE1 conferiu 
uma proteção aos neurônios expostos à cisplatina mesmo após a inibição da sua 
função redox, demonstrando que a atividade de reparo de APE1 pode estar 
relacionada com o reparo de danos que são preferencialmente associados a NER 
(Kelley et al., 2016). Adicionalmente, De Melo et al. (2016) demonstrou a ligação 
dessas vias ao observar interação física entre APE1 e XPC, indicando assim 
inter-relação das atividades dessas proteínas inicialmente descritas por atuar na 
via BER e NER, respectivamente (De Melo et al., 2016). Um outro fato 
interessante é que essa interação aumenta na presença de EO, sugerindo sua 
importância para a manutenção da integridade genômica. Além disso, foi 
observado que CSB estimula a atividade de APE1 in vitro (Iyama e Wilson, 2016; 
Muftuoglu et al., 2009; Wong et al., 2007). 
 
42 
 Estudos in vitro com células deficientes em XPA e CSB indicaram que essas 
células apresentam um defeito no processamento de 8-oxoGua e Tg, o que 
sugere o envolvimento do NER no reparo dessas lesões (Lipinski et al., 1999; 
Parlanti et al., 2012; Reardon et al., 1997; Stevnsner et al., 2002). Além disso, 
associações entre a proteína XPC e a glicosilase OGG1 já foram descritas, de 
forma que XPC aumenta o reparo de danos oxidados (D'Errico et al., 2006). 
Experimentos realizados em modelos de fibroblasto e ratos xpc-/- indicaram que 
essas células apresentam sensibilidade ao EO e elevada taxa de mutagênese em 
decorrência do acúmulo de danos oxidados (Melis et al., 2013). A associação 
entre as atividades de XPA e PARP1 também já foi relatada, visto que células 
deficientes em XPA apresentaram hiperativação de PARP1, indicando o papel de 
XPA na regulação da atividade do BER (Fang et al., 2014). 
2.6.4 BER e NER no desenvolvimento de doenças neurodegenerativas 
 Como a BER é considerada a principal via de reparo de DNA em neurônios 
(Wei e Englander, 2008), as deficiências de BER têm sido destacadas como um 
fator importante nos distúrbios neurodegenerativos. 
 Uma diminuição no reparo de DNA foi observada em tecido de camundongos 
de 24 meses (50-75%) em comparação com camundongos jovens (4 meses) 
medindo a atividade de BER in vitro (Cabelof et al., 2002). Além disso, o declínio 
observado na atividade de BER correlaciona-se com uma diminuição nos níveis 
de atividade enzimática de Pol β, bem como uma diminuição nos níveis de 
transcrição e de proteína desta DNA polimerase (Cabelof et al., 2002). Uma 
diminuição na atividade de reparo do DNA também foi observada em extratos de 
neurônios obtidos de ratos velhos (Rao et al., 2000; 2001). Além disso, a 
capacidade de reparar danos no DNA foi também medida em ratos jovens (3 
meses) em comparação com os de idade maiores (30 meses) quando são 
expostos a hiperoxia isobárica, uma condição que eleva os níveis de ERO no 
cérebro e aumenta a apoptose. Seis horas após a exposição, uma indução de 
APE1 foi observada no hipocampo e prosencéfalo basal de camundongos jovens, 
mas não velhos (Edwards et al., 1998). A importância das proteínas BER também 
é notada nos resultados de estudos knock-out. O knock-out de muitos genes BER 
centrais resultam em defeitos graves no desenvolvimento embrionário, resultando 
43 
em letalidade gestacional precoce em camundongos. Mutações humanas em 
duas proteínas periféricas de SSBR ataxia-oculomotora apraxia-1 (AOA1) e 
tirosil-DNA fosfodiesterase 1 (TDP-1) mostram claramente a importância da BER 
na manutenção neuronal humana. 
 Finalmente, em um estudo feito em 100 pessoas diagnosticadas com MA e 
110 indivíduos saudáveis, os genes APE1, hOGG1, MUTYH, PARP1 e NEIL1 
foram regulados negativamente nos linfócitos de pacientes, em comparação com 
voluntários saudáveis. A expressão de XRCC1 não foi significativamente 
diferente entre os dois grupos (Sliwinska et al., 2017). 
 Como esperado, o TC-NER é importante para o funcionamento adequado do 
sistema nervoso, como destacado pelos fenótipos neurológicos associados a 
distúrbios TC-NER em humanos (Jaarsma et al., 2011; Mellon, 2005). O papel do 
TC-NER na neurodegeneração ainda é turvo e altamente rudimentar, e os 
trabalhos não fornecem evidências conclusivas definitivas. A complexidade da via 
NER, que envolve vários atores, complica o cenário e, dentro da mesma 
patologia, mutações em diferentes genes resultam em diversos problemas 
neurológicos (Rapin et al., 2006; Saxena e Caroni, 2011). 
 Dois estudos fornecem evidências que defendem a importância do Ercc1 na 
função cerebral. Um estudo enfocou o córtex e o hipocampo e, portanto, é mais 
relevante para a patogênese do MA e demonstra que mutantes de Ercc1 
expressando apenas um alelo truncado com atividade reduzida (Weeda et al., 
1997) exibem neurodegeneração leve, mas progressiva (Borgesius et al., 2001). 
Aos 4 meses de idade, estes modelos apresentam sinais neuropatológicos, tais 
como perfis neuronais argirofílicos, indicando morte celular. Esses modelos 
também exibem gliose robusta, mais um sinal de neuropatologia associada 
também com ND crônica (Halliday e Stevens, 2011; Papura et al., 2012). A 
patogênese do ND, de fato, causa alterações não apenas nos neurônios, mas 
também nas células gliais. Se essas perturbações são tóxicas ou não, ainda é 
objeto de debate; A ativação microglial é vista geralmente como um evento 
prejudicial, pelo menos em estágios avançados. Evidências mais recentes, no 
entanto, sugerem que também existem microglia “boas”, provavelmente 
desempenhando um papel nos estágios iniciais da doença (Aguzzi et al., 2013). 
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 Em outro estudo demonstra-se que os fibroblastos dérmicos de pacientes com 
TP exibem capacidade de reparo de excisão de nucleotídeo (NER) falho, e que 
camundongos mutantes de Ercc1 com NER levemente comprometida exibem 
alterações patológicas típicas de DP, incluindo defeitos na respiração 
mitocondrial (Sepes et al., 2016). 
 Finalmente, qPCR em tempo real e espectrometria de massa foram 
empregados para determinar os níveis de expressão das proteínas NER. Os 
níveis de mRNA dos genes que codificam as proteínas NER: RAD23B, RPA1, 
ERCC1, PCNA e LIG3, bem como a proteína MPG. Os níveis de mRNA foram 
significativamente maiores no tecido cerebral do que no sangue. Além disso, os 
níveis de mRNA de LIG3 no córtex frontal foram maiores na MA comparados com 
os controles, enquanto os níveis de mRNA de MPG e LIG3 no córtex entorrinal e 
RPA1 no cerebelo foram menores na MA versus os controles. No sangue, os 
níveis de mRNA de RPA1 e ERCC1 foram menores nos pacientes com MA do 
que nos controles. Os dados sugerem que alterações na expressão gênica de 
componentes NER entre regiões cerebrais foram associadas à MA, conectando o 
reparo do DNA à patogênese da MA e sugerindo um papel distinto para a NER no 
cérebro (Jelsen et al., 2018). Mesmo assim, estudos através de análises de 
microarray em amostras de pacientes com DN têm demonstrado uma expressão 
alterada de XPA (DiGiovanna e Kraemer, 2012; Fang et al., 2014; Guthrie, 2015; 
Kobayashi et al., 2014; Melis et al., 2008). 
2.6.5 Outras funções do XPA fora do reparo de DNA por excisão de 
nucleotídeos 
 Nos últimos anos, o papel do XPA como regulador transcricional baseado na 
análise do transcriptoma tem sido descrito. Lee May et al., 2010 indicaram que a 
depleção de XPA afeta a transcrição ativada pelo ácido retinóico