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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE UNIDADE ACADÊMICA ESPECIALIZADA EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FLORESTAIS EFEITO DOS ESTRESSES DE SECA E CALOR SOBRE PLÂNTULAS DE PINHÃO- MANSO (Jatropha curcas L.) MESTRANDO: JOSÉ DENILSON DE PAULA ARAÚJO ORIENTADOR: PROFª. DRª. CRISTIANE ELIZABETH COSTA DE MACÊDO MACAÍBA/RN DEZEMBRO/2014 JOSÉ DENILSON DE PAULA ARAÚJO EFEITO DOS ESTRESSES DE SECA E CALOR SOBRE PLÂNTULAS DE PINHÃO- MANSO (Jatropha curcas L.) Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciências Florestais. ORIENTADOR: PROFª. DRª. CRISTIANE ELIZABETH COSTA DE MACÊDO MACAÍBA/RN DEZEMBRO/2014 Araújo, José Denilson de Paula. Efeito dos estresses de seca e calor sobre Plântulas de pinhão manso (jatropha curcas L.) / José Denilson de Paula Araújo. - Macaíba, RN, 2014. 38 f. Orientador (a): Prof. Dra. Cristiane Elizabeth Costa de Macêdo. Dissertação (Mestrado em Ciências Florestais). Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias Campus Macaíba. Programa de Pós- Graduação em Ciências Florestais. 1. Seca Fisiológica - Dissertação. 2. Solutos Orgânicos - Dissertação. 3. Taxas de Crescimento - Dissertação. I. Macêdo, Cristiane Elizabeth Costa de. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias Campus Macaíba. IV. Título. RN/UFRN/BSPRH CDU: 551.557.3 Divisão de Serviços Técnicos Catalogação da Publicação na Fonte. Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias Campus Macaíba Biblioteca Setorial Professor Rodolfo Helinski OFEREÇO . DEDICO À Raimundo (in memorian). Aos familiares e amigos, incondicionalmente. AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente ao corpo docente deste Programa de Pós-graduação em Ciências Florestais, por todo conhecimento compartilhado durante o mestrado e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior pela bolsa concedida. Em especial aos professores Eduardo Voigt e Mauro Pacheco, por me ensinar novas perspectivas de conhecimento. Também aos professores Márcio Dias e Sidney Praxedes por toda atenção e suporte. Por todas as grandes colaborações e auxílios, agradeço ao professor Josemir Maia e ao colega Yuri Melo, pois estes contribuíram muito nos norteamentos deste trabalho. Por toda confiança depositada, agradeço à minha orientadora, professora Cristiane Macêdo. Agradeço à Universidade de Havana por toda parceria e concessão de sementes e aos professores, Rosa Rodés e Loiret García, por todas as lições passadas enquanto estiveram no Brasil. Também aos meus amigos, que me deram todo apoio nas horas de necessidade e toda compreensão quando tive que me fazer ausente. Agradeço a equipe do Laboratório de Estudos em Biotecnologia Vegetal, parceiros de rotina diária, Ana Paula, Hudson Rafael, Danilo Flademir, Hanieri Alves, Paula Ortiz, José Demetrios, Cibelley Dantas, Lisiane Bezerra, Monique Cristina e Ciro Oliveira. Finalmente aos amigos de curso, Adna Laís, Bruno Rafael, Bruno Noronha e Virginia Cláudia. Sinceramente, muito obrigado. SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................... VII LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................................ VIII 1. RESUMO.......................................................................................................................... 9 2. ABSTRACT ................................................................................................................... 10 3. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 11 4. HIPÓTESE ..................................................................................................................... 13 5. OBJETIVOS .................................................................................................................. 13 5.1. Objetivo Geral ............................................................................................................ 13 5.2. Objetivos Específicos.................................................................................................. 13 6. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................... 14 6.1. Condições de Germinação e Obtenção das Plântulas ................................................... 14 6.2. Aclimatação e Coleta do Material Vegetal .................................................................. 15 6.3. Indicadores de Estresse e Determinações Bioquímicas ................................................ 16 6.3.1. Indicadores de Estresse Hídrico ............................................................................. 16 6.3.2. Determinações Bioquímicas ................................................................................... 17 6.3.2.1. Proteínas Solúveis Totais (PST) .......................................................................... 17 6.3.2.2. Aminoácidos Livres Totais (AALT).................................................................... 17 6.3.2.3. Prolina ................................................................................................................ 18 6.3.2.4. Glicina Betaína ................................................................................................... 18 6.3.2.5. Açúcares Solúveis Totais (AST) e Amido ........................................................... 19 6.4. Análises Estatísticas .................................................................................................... 20 7. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 21 8. CONCLUSÕES .............................................................................................................. 31 9. REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 32 10. ANEXOS ...................................................................................................................... 36 VII LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Taxa de crescimento absoluto (TCA). Massa fresca total em g.dia-1. Valores representam médias das réplicas em cada tratamentos. Letras diferentes indicam a diferença significativa entre os tratamentos a 5% segundo teste de Tukey. ........................................... 21 Figura 2 - Valores das taxas de crescimento absoluto do caule (TCAC) e raíz (TCAR) das plantas de J. curcas, submetidas aos estresses hídrico e térmico. Crescimento cm/dia. Valores representam médias das réplicas em cada tratamentos. Dados não suportados na estatística. Exibidos como observação complementar. ............................................................................. 22 Figura 3 - Conteúdo relativo de água (CRA) de folhas e raízes, expresso em porcentagem. Valores representam médias das réplicas em cada tratamentos. Letras diferentes indicam a diferença significativa entre os tratamentosa 5% segundo teste de Tukey . .......................... 23 Figura 4 - Dano de membrana (DM) de folhas e raízes, expresso em porcentagem. Valores representam médias das réplicas em cada tratamentos. Letras diferentes indicam a diferença significativa entre os tratamentos a 5% segundo teste de Tukey. ........................................... 24 Figura 5 - Concentrações de proteínas solúveis totais (PST) nas amostras de folhas ( ) e raízes ( ). Massa seca (MS). Valores representam médias das réplicas em cada tratamentos. Letras diferentes indicam a diferença significativa entre os tratamentos a 5% segundo teste de Tukey. ...................................................................................................................... ............... 25 Figura 6 - Concentrações de aminoácidos livres totais (AALT) nas amostras de folhas ( ) e raízes ( ). Massa seca (MS). Valores representam médias das réplicas em cada tratamentos. Letras diferentes indicam a diferença significativa entre os tratamentos a 5% segundo teste de Tukey. ..................................................................................................................................... 26 Figura 7 - Concentrações de prolina (PRO) nas amostras de folhas ( ) e raízes ( ). Massa seca (MS). Valores representam médias das réplicas em cada tratamentos. Letras diferentes indicam a diferença significativa entre os tratamentos a 5% segundo teste de Tukey. .......... 26 Figura 8 - Concentrações de glicina betaína (GB) nas amostras de folhas ( ) e raízes ( ). Massa seca (MS). Valores representam médias das réplicas em cada tratamentos. Letras diferentes indicam a diferença significativa entre os tratamentos a 5% segundo teste de Tukey. .................................................................................................................................................. 27 Figura 9 - Concentrações de açúcares solúveis totais (AST) nas amostras de folhas ( ) e raízes ( ). Massa seca (MS). Valores representam médias das réplicas em cada tratamentos. Letras diferentes indicam a diferença significativa entre os tratamentos a 5% segundo teste de Tukey. ...................................................................................................................... ............... 28 Figura 10 - Concentrações de e amido nas amostras de folhas ( ) e raízes ( ). Massa seca (MS). Valores representam médias das réplicas em cada tratamentos. Letras diferentes indicam a diferença significativa entre os tratamentos a 5% segundo teste de Tukey. .......... 29 VIII LISTA DE ABREVIATURAS AALT – Aminoácidos Livres Totais AST – Açúcares Solúveis Totais BOD – Biochemical Oxygen Demand “Demanda Bioquímica de Oxigênio” CRA – Conteúdo Relativo de Água DM – Dano de Membrana GB – Glicina betaína HSP – Heat Shock Proteins “Proteínas de Proteção de Calor” MF – Massa Fresca MS – Massa Seca MT – Massa Túrgida PEG – Polietilenoglicol – PEG6000 PRO – Prolina PST – Proteínas Solúveis Totais TCA – Taxa de Crescimento Absoluto TCAC – Taxa de Crescimento Absoluto do Caule TCAR – Taxa de Crescimento Absoluto da Raiz 9 1. RESUMO Biocombustíveis são um foco de discussão, ao que se trata de energias renováveis. Quanto a esse ponto, atualmente discutisse a utilização de zonas áridas para produção de biocombustíveis derivados de espécies oleaginosas resistentes às condições de aridez. Jatropha curcas L. tem sido indicada como uma espécie potencial para esse tipo de utilização, apontada pela literatura como resistente em condições desfavoráveis: seca e salinidade. Todavia, pouco é descrito sobre sua resistência a altas temperaturas e secas severas, principalmente sobre a sinergia de estresses combinados, cenário típico de regiões semiáridas. Este trabalho visa portanto avaliar os efeitos da temperatura sobre J. curcas em condições de seca. O estresse hídrico foi aplicado utilizando duas concentrações de PEG6000 diluídas em solução hidropônica, induzindo potencial hídrico de -0,3 e -0,7 MPa. Já o estresse térmico foi conduzido em câmara B.O.D. à 40ºC. Após aplicação dos estresses, o material vegetal foi coletado para avaliação dos indicadores de estresse como conteúdo relativo de água (CRA), dano de membrana (DM) e taxa de crescimento absoluto (TCA), além das determinações bioquímicas de proteínas, aminoácidos totais (AALT), prolina (PRO), glicina betaína (GB), açúcares solúveis totais (AST) e amido. Os resultados mostraram que o CRA pouco se altera, em condições de estresse e DM foi menor sob estresse térmico, provavelmente por contribuição sinérgica de solutos como proteínas e GB. Os solutos AALT, PRO e amido tiveram concentrações mais significativas em folhas, enquanto que proteínas, GB e AST foram mais significativas nas raízes. AALT e PRO foram os solutos com respostas mais significativas em folhas, principalmente em seca severa sob estresse térmico. GB teve aumento nas concentrações tanto em folhas quanto em raízes, quando em condições de estresse hídrico e térmico. Concentrações de amido mostraram uma redução, o que pode ser reflexo na redução da TCA das plântulas. Os resultados observados sugerem que J. curcas é capaz de suportar os efeitos do estresse hídrico, considerando a pouca alteração do CRA sob as condições experimentadas. No geral as plântulas foram mais sensíveis ao estresse de calor. Todavia, quando combinados os estresses, os resultados apresentaram uma tendência de aumento em relação ao estresse de calor isolado. Palavras-chave: Seca fisiológica; solutos orgânicos; taxa de crescimento. 10 2. ABSTRACT Biofuels are a focus of discussion when it comes to renewable energy. On this point, actually discuss the use of arid zones for production of biofuels derived from oil plant species resistant to arid conditions. Jatropha curcas L. has been indicated as a potential species for this application, because it resistance to unfavorable conditions as: drought and salinity. However, a few studies have been described about its resistance to high temperatures and severe droughts, especially on the synergy of combined stresses, typical of semiarid lands. This study aims to evaluate the temperature effects of J. curcas on dry conditions. Water stress was caused using two concentrations of PEG6000 diluted in hydroponic solution, inducing water potentials of -0.3 and -0.7 MPa, while the heat stress was conducted in growth chamber at 40ºC. After applying the stress, the plant material was collected for evaluation of stress indicators such as relative water content (RWC), membrane damage (MD) and absolute growth rate (AGR), and the biochemical determinations of proteins, total amino acids (TFAA), proline (PRO), glycine betaine (GB), total soluble sugars (TSA) and starch. The results showed that the RWC few changes in stress conditions and MD was lower under heat stress, probably due to the contribution of solutes such as protein and GB. Solutes TFAA, PRO and starch had more significant concentrations in leaves, while proteins, GB and TSA were more significant in the roots. TFAA and PRO were solutes with more significant responses on leaves, mainly in severe drought under heat stress. GB had an increase in the concentrations both in leaves and in roots, when under to drought and heat stress. Starch concentrations was reduced, which may be a reflex the reduction of AGR of the seedlings. The data suggest that J. curcas is able to withstand the effects of drought stress, considering fewer changes of the CRA under the studied conditions. Overall the seedlings were more sensitive to heat stress. However, when combined the both drought and heat stresses, the results showed an increasing trend in relation to just heat stress. Keywords: Physiological drought;organic solutes; growth rate. 11 3. INTRODUÇÃO Atualmente, os biocombustíveis têm sido um grande foco de discussão quando o assunto é energia renovável, principalmente quando o tema envolve palavras-chave como: aquecimento global, combustíveis fósseis, produção sustentável e energias alternativas. Todavia, essas discussões sempre possuem divergências quando é levada em consideração, entre outras questões ambientais, a conversão de áreas agrícolas produtoras de alimentos para cultivos de plantas potenciais à produção do biodiesel (ACHTEN et al., 2012). O uso e ocupação do solo se tornam um dilema na agricultura, sobretudo quando é necessário definir prioridades em respeito ao que se deve (ou não) ser produzido. Porém, uma potencial solução tem chegado à esse debate: produção em regiões áridas. Estas regiões são geralmente vistas como “estéreis e improdutivas” e estima-se que hoje, pelo menos 40% de toda porção continental do planeta são regiões classificadas como áridas, semiáridas e hiperáridas. Isso é mais do que todo mosaico de culturas e terras cultivadas ou em manejo, que corresponde a 26% da superfície continental (ACHTEN et al., 2012). Dados como estes, enfatizam o potencial das terras áridas na realização de plantios, desviando a atenção dos debates para uma nova busca: culturas de plantas tolerantes as condições ambientais áridas e semiáridas; principalmente salinidade, seca e temperatura elevada. As condições ambientais de seca e calor são os tipos mais comuns de estresses ambientais, presentes nas regiões dos trópicos (LARCHER, 2000). Ambos podem prejudicar a capacidade da planta em realizar fotossíntese, e consequentemente, o desenvolvimento do vegetal (TAIZ e ZEIGER, 2013). O déficit hídrico pode provocar a perda de turgor da célula vegetal e causar sua desidratação, o que pode provocar adversidades fisiológicas, entre elas: inibição da expansão celular, inibição fotossintética, desestabilização de membranas e proteínas, e produção de espécies reativas o oxigênio (TAIZ e ZEIGER, 2013). Já o calor é mais danoso, pois além de potencializar os danos causados pelo déficit hídrico, provocam um dano ao citoesqueleto e espécies de RNA, reduz a eficiência enzimática e desbalanceamento metabólico (MITTLER et al., 2012; TAIZ e ZEIGER, 2013). 12 Quanto a espécies potenciais para produção em condições de semiárido, Jatropha curcas L. tem alcançado destaque nas pesquisas ao redor do mundo (GTZ, 2009), principalmente no Oriente Médio, China e África (BAUR et al., 2007). J. curcas é uma espécie nativa do México e região da América Central. Suas sementes são altamente viáveis a produção do biodiesel com uma proporção média de 250g de óleo/ kg de semente (ACHTEN et al., 2012). J. curcas possui um bom desenvolvimento em regiões tropicais secas, equatoriais úmidas, locais semiáridos e uma considerável resistência a longos períodos de estiagem (BARBOZA Jr., 2011), podendo ser considerada uma planta tolerante ao estresse hídrico (DÍAZ-LÓPES et al., 2012). Além disso, sua utilização em áreas degradas, não compete com cultivares de produção alimentícia (AL- BUSAIDI et al., 2012). Contudo, J. curcas mostrou melhores desempenhos de cultivo em condições úmidas (BARBOZA Jr., 2011) e é considerada por muitos como uma potencial espécie para a segunda geração de plantas viáveis a produção do biocombustível, principalmente, devido as suas características de resistência as condições ambientais semiáridas (NAHAR e OZORES-HAMPTON, 2011), embora tenha apresentado resultados ditos insatisfatórios em cultivos no semiárido indiano (RAO et al., 2012). Para todo o sucesso adaptativo de um vegetal às condições de estresse, há uma complexa e importante resposta fisiológica. Na condição de estresse hídrico, há o ajustamento osmótico, que de acordo com Taiz e Zeiger (2013), é uma resposta celular que permite a planta manter suas funções fisiológicas sob condições de déficit hídrico. Durante esse ajustamento, a planta aumenta consideravelmente a concentração de solutos orgânicos (açúcares, ácidos orgânicos e aminoácidos) e íons inorgânicos (principalmente K+). Entre os solutos orgânicos, destacam-se a prolina e a glicina betaína (ASHRAF e FOODLAD, 2007), que têm sido apontados como significativos na resposta da J. curcas contra estresses abióticos, em estudos realizados (salinidade, seca e temperatura) por Silva et al. (2009, 2010a, 2010b, 2012). Além do ajustamento osmótico, outras respostas também estão envolvidas no aumento da tolerância da planta, como aclimatação e mudança da expressão gênica durante o estresse osmótico e a produção de HSP (‘heat shock proteins’ ou proteínas de proteção ao calor) em casos de estresse de calor (LARCHER, 2000; TAIZ e ZEIGER, 2013). 13 Em virtude dos fatos expostos e do pouco conhecimento que se tem sobre J. curcas, este trabalho busca observar suas respostas fisiológicas aos estresses abióticos déficit hídrico e calor, com o intuito de compreender os mecanismos que viabilizam a capacidade dessa espécie em suportar ou não tais condições. 4. HIPÓTESE H1 – Os estresses de seca e calor, atuando de forma isolada e/ou combinada, interferem (ou não) nos indicadores fisiológicos de ajustamento osmótico, avaliados em J. curcas L. 5. OBJETIVOS 5.1 Objetivo Geral Compreender e identificar mecanismos que atuam no ajustamentos osmótico de J. curcas L. em condições de seca e calor, isolados e combinados. 5.2 Objetivos Específicos Avaliar o crescimento da planta com base na perda de água durante o tempo de estresse. Mensurar a quantidade de osmólitos relacionados ao ajustamento osmótico (proteínas totais, aminoácidos totais, prolina, glicina betaína, açúcares totais e amido), presentes nas plântulas submetidas aos estresses isolados e combinados. 14 6. MATERIAL E MÉTODOS Este trabalho foi realizado no Laboratório Estudos em Biotecnologia Vegetal, localizado no Departamento de Biologia Celular e Genética, no Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. O experimento foi conduzido em quatro etapas: (i) seleção das sementes e germinação. (ii) Transferência das plântulas para vasos de hidroponia; aclimatação das plântulas; aplicação dos tratamentos nas plântulas aclimatadas (seca e seca a 40ºC); observação dos efeitos do estresse. (iii) Coleta do material vegetal para análises em laboratório. (iv) Análises bioquímicas das amostras e interpretação dos resultados. 6.1 Condições de Germinação e Obtenção das Plântulas As sementes de J. curcas foram desinfetadas com hipoclorito de sódio a 2% por 3 minutos e depois escarificadas manualmente. Na escarificação as sementes foram pressionadas com o dedo polegar contra a superfície da bancada, quebrando os tegumentos, que foram retirados. Os embriões foram selecionados para germinação e semeados em folhas de papel toalha (tipo Germitest®), umedecidas com água destilada em proporção de 1,5 vezes a massa seca do papel. Os embriões foram distribuídos linearmente sobre duas folhas de papel toalha e em seguida cobertos por uma terceira folha. Após isso, estas foram enroladas no sentido de distribuição do semeio, formando um rolo com dez embriões. Após semeados, os rolos foram envelopados em sacos plásticos desinfestados com álcool etílico 70% (v/v) e incubados em câmara de crescimento sob condições controladas (25ºC) por três dias no escuro e quatro dias em fotoperíodo de 12 horas. Com sete dias completos, os embriões germinados foram transplantados para vasos de hidroponia (um por vaso), com capacidade para 870 mL, preenchidos com solução estoque de Hoagland e Arnon (1950) meia-força e transportados para casa de vegetação. 15 6.2 Aclimatação e Coleta do Material Vegetal Após um período de aclimatação de 30 dias, foram aplicados os tratamentosde estresse, identificados como controle (C), seca moderada (P1), seca severa (P2), controle a 40ºC (CT), seca moderada a 40ºC (P1T) e seca severa a 40ºC (P2T). Durante o período de execução do experimento, as condições da casa de vegetação foram registradas, com temperatura média de 32ºC durante o dia, 26ºC durante a noite e Umidade relativa do ar em torno de 50%. O estresse hídrico foi aplicado utilizando diferentes concentrações do polímero polietilenoglicol (PEG6000), induzindo potenciais hídricos de -0,3 e -0,7 MPa (moderado e severo respectivamente), ambos calculados de acordo com o proposto por Villela et al. (1991). Quanto ao estresse de calor, este foi conduzido em câmara incubadora tipo B.O.D. (demanda bioquímica de oxigênio) com fotoperíodo de 12 horas, sendo diariamente 12 horas a 40°C e as demais em temperatura média de 26°C, simulando respectivamente dia e noite. O tempo total dos estresses, desde a aplicação até o momento da coleta, foi de 96 horas. Depois de finalizado o estresse, foi realizada a coleta das amostras vegetais (folhas e raízes) para avaliação dos indicadores de estresse e determinações bioquímicas. 16 6.3 Indicadores de Estresse e Determinações Bioquímicas 6.3.1 Indicadores de Estresse Hídrico Foram medidas a massa total das plântulas, comprimento da parte aérea e comprimento das raízes para avaliar a taxa de crescimento absoluto, segundo Barbieri Jr. et al., (2007) e Silva et al., (2000), das plântulas submetidas ao estresse, calculados pelas equações: TCA = [M2 – M1] / [T2 – T1] TCA (Caule e Raiz) = [C2 – C1] / [T2 – T1]. Também foram coletadas amostras de folhas e raízes para estimar conteúdo relativo de água (CRA) e dano de membrana (DM), calculados segundo as referências de Slavick (1979) e Lutts et al., (1996). Para os cálculos, usaram-se as equações: CRA (%) = [MF – MS] / [MT – MS] * 100 DM (%) = [L1/L2] * 100. O cálculo do CRA foi realizado através da massa vegetal, coletada e pesada para determinação da massa fresca (MF). Em seguida as mesmas, foram transferidas para 100 mL de água destilada por seis horas a 25ºC. Após isso, a massa foi coletada, seca com toalha de papel e pesadas para obtenção da massa túrgida (MT). Finalmente, para obtenção da massa seca (MS), as amostras vegetais foram transferidas para estufa a 75ºC por 72 horas e após isso, pesadas mais uma vez. Para o cálculo do DM, as L1 e L2 correspondem respectivamente a primeira e segunda leitura de condutividade elétrica, realizadas a partir de amostras de folhas e raízes coletadas e imersas em frascos contendo 100 mL de água destilada. Sendo L1 realizada 16 horas após a coleta do material e L2 feita após as amostras serem submetidas ao banho-maria por uma hora a 100ºC. Ambas as leituras são realizadas quando as amostras estão em temperatura ambiente de 25 ºC. 17 6.3.2 Determinações Bioquímicas A massa vegetal restante foi armazenada em freezer à -80ºC e posteriormente utilizada para realização das determinações bioquímicas: proteínas (BRADFORD, 1976), aminoácidos livres totais (PEOPLES et al., 1989), prolina (BATES et al., 1973), glicina betaína (GRIEVE e GRATTAN, 1983), Açúcares e Amido (DUBOIS et al., 1956). Realizadas utilizando extratos de massa fresca para proteínas e massa seca para aminoácidos, prolina, glicina betaína, açúcares totais e amido. 6.3.2.1 Proteínas Solúveis Totais (PST) A determinação do conteúdo de proteínas totais foi realizada pelo método de Bradford (1976), que baseia-se na mudança da coloração do quando liga-se a proteína. O extrato protéico diluído foi transferido para tubos de ensaio, em seguida foi adicionado 2 mL do reagente de Bradford (Coomassie briliant blue G-250). Após leve agitação, os tubos foram incubados a 25°C por 15 minutos e então foi realizada leitura da reação a 595 nm em espectrofotômetro. A concentração de proteínas solúveis totais foi obtida pela comparação das leituras obtidas nas amostras, com as obtidas em curva padrão onde a proteína utilizada foi a Albumina sérvica bovina. A concentração de proteínas solúveis foi expressa em mmol de PST . kg-1 massa seca. 6.3.2.2 Aminoácidos Livres Totais (AALT) A concentração de AALT foi determinada segundo o método descrito por Peoples et al., (1989) com algumas modificações. Os extratos foram colocados em tubos de ensaio acrescidas de água destilada. Em seguida foram adicionados solução de tampão citrato, com pH = 5,0, a 200 mM e 250 μL de reagente de ninhidrina. Os tubos foram hermeticamente fechados, agitados em vortex e colocados em banho-maria a 100ºC por 15 minutos. A reação da solução foi interrompida imediatamente com banho de gelo. Por fim, foram adicionados à solução de etanol a 50% (v/v). Após uma nova agitação em vortex, os tubos permaneceram por 20 minutos em temperatura ambiente para realização da leitura em espectrofotômetro a 570 nm de absorbância. 18 As concentrações de aminoácidos totais foram determinadas com base em curva padrão e ajustada a partir de concentrações crescentes de uma mistura padronizada de L-Glutamina. Os resultados foram expressos em mmol AALT . kg-1 de massa seca. 6.3.2.3 Prolina A concentração de prolina foi determinada segundo metodologia descrita por Bates (1973) com modificações. Os extratos das amostras foram distribuídos em tudos de ensaio e foram adicionados 1 mL do reagente de ninhidrina ácida. Os tubos foram hermeticamente fechados, agitados em vortex e transferidos para banho-maria a 100°C por uma hora. Após isso a reação foi interrompida imediatamente com banho de gelo. Em seguida, foram adicionados à solução 2 mL de tolueno e agitados vigorosamente por 20 segundos. Após estabilização, duas fases foram estabelecidas na solução, sendo a fase aquosa superior formada pelo tolueno e o cromóforo de coloração avermelhada. Esta foi retirada e submetida à leitura em espectrofotômetro a 520 nm. As concentrações de prolina foram determinadas com base em uma curva padrão obtida a partir de L-prolina, com seus resultados expressos em mmol prolina . kg-1 de massa seca. 6.3.2.4 Glicina Betaína A concentração de glicina betaína foi determinada segundo método descrito por Grieve e Grattan (1983) com algumas modificações. Os extratos das amostras foram distribuídos em eppendorfs e foram adicionados 250 μL de ácido sulfúrico 2N. Os eppendorfs foram deixados em banho de gelo (0 a 4 ºC) por uma hora. Em seguida foram adicionados 200 μL de KI-I2 gelado, e deixados em repouso por 16 horas a 0ºC. Após esse períoido, os eppendorfs são centrifugados a 10.000 rpm por 15 minutos a 4ºC e o sobrenadante é descartado. Nesta é feita duas lavagens do precipitado utilizando 2 mL da ácido sulfúrico, centrifugados por 10 minutos (10.000 rpm a 4ºC). Após as lavagens o precipitado foi dissolvido em 1,2-dicloroetano agitando vigorosamente. Após duas horas de descanso, foi realizada a leitura das amostras em espectrofotômetro 365 nm. 19 As concentrações de glicina betaína foram determinadas com base em uma curva padrão obtida a partir de glicina betaína, com seus resultados expressos em mmol prolina . kg-1 de massa seca. 6.3.2.5 Açúcares Solúveis Totais (AST) e Amido A concentração de AST e Amido foram determinada pelo método de fenol- sulfúrico descrito por Dubois et al., (1956). As amostra foram transferidas para tubos de ensaio convencionais, completadas com água destilada, acrescido de fenol a 5% (m/v) e agitados vigorosamente. Para iniciar a reação, foi adicionado de uma única vez e no centro do tubo ácido sulfúrico concentrado. A homogeneização, em agitador vortex, foi realizada logo após a adição do ácido para usar o calor da reação exotérmica da hidrólise ácida para uma melhor homogeneização. Em seguida os tubos permaneceram por 20 min em temperatura ambiente para leitura em espectrofotômetro a490 nm. As concentrações de AST foram determinadas com base na curva padrão ajustada a partir de concentrações crescentes de uma solução estoque de D-glicose, com seus resultados expressos em mmol . kg-1 de massa seca. 20 6.4 Análises Estatísticas Para os testes estatísticos, foi utilizado o software Assistat® selecionando o método ANOVA seguindo teste de Tukey com nível significância de p < 0,05. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com dois tratamentos testemunha (um associado à temperatura de 40ºC) e quatro tratamentos de seca (dois associados à temperatura de 40ºC), além de duas partes da planta analisadas (folhas e raízes). Cada um dos seis tratamentos continha quatro repetições totalizando 48 amostras. 21 7. RESULTADOS E DISCUSSÃO As plântulas tratadas com polietilenoglicol apresentaram um crescimento menor do que os controles. Tal efeito foi mais acentuado nas plântulas submetidas a seca severa sob estresse de calor. Tanto a taxa de crescimento absoluto da massa fresca total (TCA) das plântulas (Figura 1) quanto do comprimento do caule (TCAC), tiveram taxas de crescimento negativas nos tratamentos induzidos com seca, quando comparadas aos tratamentos controle e controle sob estresse de calor (Figura 2). A taxa de crescimento das raízes (TCAR) teve um crescimento em todos os tratamentos (exceto em seca severa), com as taxas mais elevadas nos tratamentos com seca moderada e seca severa sob estresse de calor. A redução na TCA de massa fresca total das plântulas, deu-se provavelmente devido a seca induzida pelo polímero, já que este altera o potencial osmótico da solução, dificultando a entrada de água na planta e consequentemente reduzindo o conteúdo de água nas células (MICHAEL e KAUFMANN, 1973; TAIZ e ZEIGER, 2013), efeito que se reflete na redução da TCAC nos tratamentos sob estresse. Semelhante ao observado por Maes et al., (2009), em J. curcas sob diferentes intensidades de estresse hídrico, o resultado também foi a redução da massa fresca total das plântulas em todas as condições de seca. Figura 1: Taxa de crescimento absoluto (TCA). Massa fresca total em g.dia-1. Valores representam médias das réplicas em cada tratamentos. Letras diferentes indicam a diferença significativa entre os tratamentos a 5% segundo teste de Tukey. a b b a b c-0,800 -0,600 -0,400 -0,200 0,000 0,200 0,400 C P1 P2 CT P1T P2T TC A ( g . d ia -1 ) 22 Figura 2: Valores das taxas de crescimento absoluto do caule (TCAC) e raíz (TCAR) das plântulas de J. curcas, submetidas aos estresses hídrico e de calor. Crescimento cm/dia. Valores representam médias das réplicas em cada tratamentos. Dados não suportados na estatística. Exibidos como observação complementar. Quanto a intensificação dessa redução da TCA nas plântulas sob estresse de calor, provavelmente foi provocada pela perda de água através da parte aérea da planta, já que a planta tende a perder mais água por evapotranspiração na medida em que a temperatura aumenta (LARCHER, 2000). Além disso, tecidos vegetais em crescimento são prejudicados pelo calor, pois são mais sensíveis a temperaturas elevadas. Quando bem hidratados estes tecidos podem utilizar o esfriamento evaporativo para manter uma temperatura suportável, porém quando em déficit hídrico esse mecanismo não seria eficiente (TAIZ e ZEIGER, 2013). Em um estudo realizado por Silva et al., (2012), também foi observado uma perda de biomassa em J. curcas sob o estresse de calor, semelhante ao visto neste trabalho. Al-Busaidi et al., (2012), estudou os efeitos da seca e calor sobre a J. curcas, e observou que a temperatura é o principal inibidor do crescimento de planta. Principalmente de plantas jovens. O estresse hídrico induziu uma redução no conteúdo relativo de água nas folhas em seca severa sob estresse de calor (60% em relação ao controle). Nas raízes a redução foi significativa apenas no controle sob estresse de calor (Figura 3), porém, a pouca variação entre os tratamentos sugere que essa diferença em raízes não é biologicamente representativa. -0,250 -0,200 -0,150 -0,100 -0,050 0,000 0,050 0,100 C P1 P2 CT P1T P2T TC A C ( cm / d ia ) 0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 C P1 P2 CT P1T P2T TC A R ( cm / d ia ) 23 Figura 3: Conteúdo relativo de água (CRA) de folhas e raízes, expresso em porcentagem. Valores representam médias das réplicas em cada tratamentos. Letras diferentes indicam a diferença significativa entre os tratamentos a 5% segundo teste de Tukey. Quando sob déficit hídrico, as células do tecido foliar sofrem uma redução na capacidade de expansão e consequentemente redução da capacidade de turgescência e esses efeitos podem ser potencializados pelo calor (TAIZ e ZEIGER, 2013). O indicativo disso seria o menor CRA nas folhas sob a condição de estresse de seca e calor. No caso das raízes, há possibilidade que as raízes não sofram o efeito de ambos os estresses, já que estas encontram-se imersas em solução aquosa com temperatura diferente da sentida pelas folhas. Quanto ao vazamento de eletrólitos, indicador indireto relacionado aos danos nas membranas celulares, este foi maior em folhas sob estresse de calor e raízes sob estresse hídrico (Figura 4). Nas folhas, os tratamentos sem aplicação do estresse de calor tiveram os menores danos de membrana (aproximadamente 11%), enquanto que o maior dano foi observado no tratamento controle sob estresse de calor (60,78%). Já nos tratamentos seca moderada e severa sob estresse de calor, o dano de membrana foi de 46,58% e 34,15%, respectivamente. Esse é um possível indicativo que os tecidos foliares são mais susceptíveis as injúrias provocadas pelo calor, principalmente quando estes tecidos são os mais expostos aos seus efeitos. a ab ab ab ab b 0 25 50 75 100 C P1 P2 CT P1T P2T C R A F o lh as ( % ) ab ab ab b ab a 0 25 50 75 100 C P1 P2 CT P1T P2T C R A R aí ze s ( % ) 24 Figura 4: Dano de membrana (DM) de folhas e raízes, expresso em porcentagem. Valores representam médias das réplicas em cada tratamentos. Letras diferentes indicam a diferença significativa entre os tratamentos a 5% segundo teste de Tukey. Nas raízes, o dano foi maior nos tratamentos controle, seca moderada e severa (em torno de 40%) e menor nos tratamentos submetidos ao estresse de calor (em torno de 25%). De um ponto de vista fisiológico, um possível justificativa para os menores danos de membranas nas raízes, em tratamentos sob o estresse de calor, é que o aditivo térmico pode estimular a produção de proteínas protetoras e estas podem, de alguma, forma contribuir contra o dano provocado pela seca, atuando em conjunto com outros solutos (SILVA et al., 2009; 2010). Neste experimento, os maiores índices de proteínas, glicina betaína e açúcares são observados em raízes (Figuras 5, 8 e 9). Esse pode ser possivelmente o motivo pelo qual os tratamentos sob seca teriam um dano maior do que os tratamentos sob estresse de calor. A concentração de proteínas, em folhas, reduziu em torno de 52% nos tratamentos sob estresse de calor, quando comparado ao tratamento controle (Figura 5). Já em raízes, quando comparados ao controle, houve um aumento na concentração de proteínas na seca moderada (49% a mais) e uma redução de 52% no tratamento controle sob estresse de calor. Nos demais tratamentos não houve diferença significativa. e e d a b c 0 25 50 75 100 C P1 P2 CT P1T P2T D M F o lh as ( % ) a ab ab c c bc 0 25 50 75 100 C P1 P2 CT P1T P2T D M R aí ze s ( % ) 25 Figura 5: Concentrações de proteínas solúveis totais (PST) nas amostras de folhas ( ) e raízes ( ). Massa seca (MS). Valores representam médias das réplicas em cada tratamentos. Letras diferentesindicam a diferença significativa entre os tratamentos a 5% segundo teste de Tukey. As concentrações de aminoácidos totais, em folha, apresentaram um aumento nos tratamentos de seca severa e seca severa sob estresse de calor, respectivamente 158% e 253% a mais que o controle. Já nas raízes, houve um aumento em seca severa sob estresse de calor, aproximadamente 57% a mais que o tratamento controle (Figura 6). A tendência observada é que a concentração de proteínas em folha tende a reduzir com a severidade do estresse, principalmente sob calor. Quando observada a concentração de aminoácidos, a tendência é o aumento desses solutos sob as condições de seca e seca com aditivo térmico. Essa relação entre redução de proteínas e aumento de aminoácidos, foi observada em J. curcas sob condições de estresse salino (SILVA et al., 2009), sugerindo que aminoácidos teriam um papel importante para o ajustamento osmótico em folhas de J. curcas submetidas ou não ao estresse. Possivelmente, este mesmo efeito ocorre quando a planta está sob estresse de calor, além de que a quantidade de proteínas pode ser reduzida drasticamente sob alta temperatura (SILVA et al., 2010a), principalmente por desnaturação proteica. a ab ab b b b 0,00 1,50 3,00 4,50 6,00 C P1 P2 CT P1T P2T m m o l P ST . kg -1 M S b a ab c ab b 0,00 3,00 6,00 9,00 12,00 C P1 P2 CT P1T P2T m m o l P ST . kg -1 M S 26 Figura 6: Concentrações de aminoácidos livres totais (AALT) nas amostras de folhas( ) e raízes( ). Massa seca (MS). Valores representam médias das réplicas em cada tratamentos. Letras diferentes indicam a diferença significativa entre os tratamentos a 5% segundo teste de Tukey. Quanto ao observado nas raízes, neste trabalho, a concentração de aminoácidos é metade da observada nas folha. Essa concentração mais baixa em relação as folhas e a pouca variação entre os demais tratamentos, sugere que os aminoácidos não sejam tão atuantes nas tecidos radiculares ou este seja mais um indicativo que as raízes não sentiram tanto as condições de estresse testadas, quanto as folhas. Sobre a prolina, foram observadas maiores quantidades em folhas do que em raízes (Figura 7). Em folhas, os estresses hídrico e de calor, provocaram o aumento das concentrações do soluto em seca moderada e seca severa sob estresse de calor, com um aumento em torno de 110% a mais que o controle. Nas raízes, foi observada a mesma tendência de aumento, sendo os tratamentos seca moderada e severa sob estresse de calor com 47% e 73% a mais que o controle. Figura 7: Concentrações de prolina (PRO) nas amostras de folhas( ) e raízes( ). Massa seca (MS). Valores representam médias das réplicas em cada tratamentos. Letras diferentes indicam a diferença significativa entre os tratamentos a 5% segundo teste de Tukey. bc bc a c bc a 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 C P1 P2 CT P1T P2T m m o l A A . kg -1 M S b c bc b bc a 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 C P1 P2 CT P1T P2T m m o l A A . kg -1 M S c a b bc bc a 0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 C P1 P2 CT P1T P2T m m o l P R O . kg -1 M S c c c bc ab a 0,000 0,002 0,005 0,008 0,010 C P1 P2 CT P1T P2T m m o l P R O . kg -1 M S 27 Os conteúdos de prolina tendem a aumentar nos tecidos de folha e raiz quando a plântulas é submetida a estresses abióticos. Esse aumento pode ser considerado consequente ao aumento de aminoácidos, respostas dos tecidos da planta em aclimatação aos estresses, ou ainda a prolina estaria relacionada ao ajustamento osmótico da planta e proteção de estruturas celulares contra danos oxidativos (SILVA et al., 2009; 2010). Por outro lado, Silva et al., (2009, 2010a, 2012), consideraram este aumento insuficiente, nos tecidos de J. curcas, para afirmar que este soluto atue no ajustamento osmótico e por tanto, a prolina estaria possivelmente relacionada a resposta de aclimatação da planta as alterações metabólicas provocadas pelo estresse de calor (principalmente em tecidos foliares) ou uma resposta de tolerância a seca (SILVA et al., 2012). Sobre as concentrações de glicina betaína, uma maior quantidade foi observada nas raízes. Em folhas, ambos os tratamentos seca severa e seca moderada sob estresse de calor, mostram um aumento em torno de 200% a mais em relação ao controle. Já em condição de seca severa sob estresse de calor, esse aumento é de sete vezes mais (Figura 8). Nas raízes, quando comparado aos tratamentos controle e controle sob estresse de calor, houve um aumento na concentração do soluto em todos os tratamentos, em torno de vinte vezes a mais que os controles. Figura 8: Concentrações de glicina betaína (GB) nas amostras de folhas( ) e raízes( ). Massa seca (MS). Valores representam médias das réplicas em cada tratamentos. Letras diferentes indicam a diferença significativa entre os tratamentos a 5% segundo teste de Tukey. Nestes resultados, observa-se uma tendência no aumento da glicina betaína quando nas condições de seca e estresse combinados. Quando em condição de estresse de calor isolado, tanto em folhas quanto em raízes, a concentração do soluto é semelhante ao controle. Isso sugere que a glicina betaína está relacionada a uma resposta ao estresse c bc b c b a 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 C P1 P2 CT P1T P2T m m o l G B . kg -1 M S c b ab c a ab 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 C P1 P2 CT P1T P2T m m o l G B . kg -1 M S 28 hídrico (ASHRAF e FOODLAD, 2007). Ainda, em altas temperaturas aumento nos conteúdos de glicina betaína, sugere que este soluto teria um papel importante na tolerância ao estresse térmico, provavelmente no auxílio contra danos oxidativos (WAHID et al., 2007) ocasionados pela formação de espécies reativas o oxigênio (TAIZ e ZEIGER 2013). Para Silva et al., (2009), este soluto pode atuar como auxiliar no ajustamento osmótico no citosol e proteção de estruturas da membrana celular. Ainda, Silva et al., (2010) evidencia a participação da glicina betaína no ajustamento osmótico dos tecidos foliares e radiculares em J. curcas sob estresse hídrico, além da provável participação deste soluto compatível como um osmoprotetor no citoplasma e de organelas (cloroplastos). As concentrações de açúcares totais foram maiores em raízes do quê em folhas. Nas folhas, houve uma redução em torno de 41% nos tratamentos seca moderada e controle sob estresse de calor, quando comparados ao controle. Quanto aos demais tratamentos não houve variação (Figura 9). Nas raízes, os tratamentos seca severa e seca moderada sob estresse de calor, tiveram uma redução de 41% e 30%, respectivamente, em comparação ao controle e demais tratamentos, onde não houve variação. Figura 9: Concentrações de açúcares solúveis totais (AST) nas amostras de folhas( ) e raízes( ). Massa seca (MS). Valores representam médias das réplicas em cada tratamentos. Letras diferentes indicam a diferença significativa entre os tratamentos a 5% segundo teste de Tukey. Concentrações de amido foram maiores em folhas do quê nas raízes. Ambos os estresses hídrico e calor, provocaram uma redução das quantidades de amido nos tratamentos seca severa, controle sob estresse de calor e seca severa sob estresse de calor, em torno de 38% a menos que o tratamento controle (Figura 10). Já nas raízes, ab cd bc d a bc 0,00 25,00 50,00 75,00 100,00 C P1 P2 CT P1T P2T m m o l A ST . kg -1 M S ab ab c a c a 0,00 70,00 140,00 210,00 280,00 C P1 P2 CT P1T P2T m m o l A ST . k g -1 M S 29 não houve variação da concentração entre os tratamentos controle, enquanto que nos tratamentos com ação dos estresses hídrico e hídrico sob estresse de calor, houve uma redução de 40% a menos em relação aos controles. Figura 10: Concentrações de e amido nasamostras de folhas( ) e raízes( ). Massa seca (MS). Valores representam médias das réplicas em cada tratamentos. Letras diferentes indicam a diferença significativa entre os tratamentos a 5% segundo teste de Tukey. Açúcares totais são considerados os solutos que mais contribuem para o ajustamento osmótico da planta (SILVA et al., 2009; PRISCO e FILHO, 2010; TAIZ e ZEIGER, 2013) enquanto que o acúmulo de amido está relacionado diretamente com plantas sob estresse abiótico, assim como sua redução é relacionada com a redução da taxa fotossintética, assimilação de carbono e crescimento da planta (SILVA et al., 2010; TAIZ e ZEIGER, 2013). Contudo, a pouca concentração de açúcares totais nas folhas em comparação com as raízes, sugere que possivelmente os tecidos radiculares possuem um ajustamento osmótico mais efetivo do que tecidos foliares ou por outro lado, as raízes não tenham sentido tanto o efeito dos estresses quanto as folhas, já que as concentrações entre os tratamentos quase não diferem da condição controle. Quanto ao amido, as concentrações tanto em folhas quanto em raízes, chegam a ser muito menores quando comparadas aos açúcares totais. Essa baixas concentrações podem ser possivelmente, tanto um reflexo da redução da taxa de assimilação e crescimento da planta ou uma hidrólise do amido induzida principalmente pelo estresse hídrico (SILVA et al., 2010; 2012; TAIZ e ZEIGER, 2013). a ab b b ab b 0,00 2,50 5,00 7,50 10,00 C P1 P2 CT P1T P2T m m o l A m id o . kg -1 M S a b b a b b 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 C P1 P2 CT P1T P2T m m o l A m id o . kg -1 M S 30 Tendo em vista a resposta da J. curcas à sinergia dos estresses, as alterações mais significativas são observadas quando comparados o controle à seca severa sob estresse de calor. No ambiente natural, estresses geralmente não ocorrem isolados e sim em conjunto, por isso é possível que diferentes estresses, aplicados ao mesmo tempo, podem estimular respostas da planta que favoreça ou prejudique a resposta adaptativa como um todo (LARCHER, 2000). Sabe-se que J. curcas é uma planta adaptada as condições típicas do semiárido, e os resultados significativos nas condições mais severas de estresse, reforçam os estudos sobre esta espécie quanto a mecanismos eficientes de resistência a seca (MAES et al., 2009; DÍAS-LÓPEZ et al., 2012; FINI et al., 2012; H. SAPETA et al., 2012). J. curcas ainda é uma espécie arbórea com poucas informações relacionadas a desempenhos de cultivos, principalmente quando comparada a cultivos de outras espécies já domesticadas ou estudos sob condições de estresses combinados. Este trabalho julga ter alcançado seu objetivo quanto a observação de efeitos dos estresses hídrico e calor. Porém, sugere que mais testes relacionando diferentes estresses abióticos, ainda sejam necessários, realizados a fim de compreender como os estresses combinados podem atuar sobre J. curcas e que outras respostas ela pode apresentar sob estas condições. 31 8. CONCLUSÕES Os resultados obtidos nesse trabalho sugerem que J. curcas é uma espécie capaz de suportar os efeitos do estresse hídrico, considerando que sob as condições testadas o conteúdo relativo de água das plântulas foi pouco alterado. No geral quanto ao estresse de calor as plântulas se mostraram mais susceptíveis, considerando que o conteúdo de solutos orgânicos quando nessa condição tende a diminuir. Todavia, quando combinados os estresses hídrico e calor, os resultados apresentaram uma tendência de aumento em relação ao estresse de calor isolado. Sendo na maioria das vezes, a seca severa sob estresse de calor o tratamento com maior concentração de soluto. 32 9. REFERÊNCIAS AL-BUSAIDI, A., AHMED, M., CHIKARA, J.. 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Em destaque mais escuro as regiões semiáridas com aproximadamente 16% desse total (Imagem adaptada de Atchen et al., 2012.). 37 Principais efeitos dos estresses de déficit hídrico e calor sobre as plantas, de acordo com Mittler et al., (2012) e Taiz e Zeiger, (2013). A imagem relaciona como ambos os estresses podem potencializar os efeitos um do outro, afetando tanto o crescimento da planta quanto as estruturas celulares e metabolismo, numa cadeia que leva a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS). 38 Panorama geral dos resultados observados na Jatropha curcas, sob as condições experimentais deste trabalho. Da esquerda para direita, as colunas indicam os resultados observados nas condições de déficit hídrico (seca), estresse térmico (calor) e ambos estresses combinados (S+C). Acima da linha pontilhada, estão indicados os resultados das folhas, enquanto que abaixo são os resultados de raízes. Crescimento da parte área foi reduzido enquanto que o crescimento das raízes aumentou. Barras paralelas indicam pouca ou nenhuma alteração nos resultados, setas para cima indicam aumento e setas para baixo indicam diminuição. Setas com contorno indicam que naquela condição houve maiores concentração do soluto orgânico.
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