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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE FOTOPROTETORA DE EXTRATOS DE Aniba canelilla (H.B.K) MEZ OBTIDOS POR DIFERENTES MÉTODOS DE EXTRAÇÃO
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46 UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS – UEA ESCOLA SUPERIOR DE TECNOLOGIA – EST CURSO DE ENGENHARIA QUÍMICA DÂMARYS BRITO DE FARIAS AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE FOTOPROTETORA DE EXTRATOS DE Aniba canelilla (H.B.K) MEZ OBTIDOS POR DIFERENTES MÉTODOS DE EXTRAÇÃO MANAUS 2016 DÂMARYS BRITO DE FARIAS AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE FOTOPROTETORA DE EXTRATOS DE Aniba canelilla (H.B.K) MEZ OBTIDOS POR DIFERENTES MÉTODOS DE EXTRAÇÃO Monografia apresentada ao Curso de Graduação em Engenharia Química da Escola Superior de Tecnologia da Universidade do Estado do Amazonas, para obtenção do título de Bacharel em Engenharia Química. Orientador: Prof. MSc. Geverson Façanha da Silva MANAUS 2016 DÂMARYS BRITO DE FARIAS AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE FOTOPROTETORA DE EXTRATOS DE Aniba canelilla (H.B.K) MEZ OBTIDOS POR DIFERENTES MÉTODOS DE EXTRAÇÃO Monografia de Conclusão de Curso para obtenção do título de Engenheiro, Habilitação em Engenharia Química – Escola Superior de Tecnologia, Universidade do Estado do Amazonas Banca Examinadora: Prof. MSc. Geverson Façanha da Silva – Orientador Prof. Dr. Rafael Lopes e Oliveira – UFAM Prof. Dra. Érica Simplício de Souza – UEA Conceito: Manaus, 01 de julho de 2016 “A persistência é o caminho do êxito” Charles Chaplin AGRADECIMENTOS Aos meus pais, Pedro e Gean Farias, pelo apoio e incentivo em todos os momentos desde o início da minha vida; Aos meus irmãos, Rodrigo, Karen e Jonathas, pela amizade e pelos momentos de alegria e descontração; À minha melhor amiga, Jessyca Lennys, que, mesmo longe, foi peça chave na minha trajetória pelo apoio constante e por acreditar em mim, as vezes até mais do que eu; Ao meu pequeno grande amigo, Juan Costa, que esteve ao meu lado e me deu apoio sempre que eu precisei; Ao meu grande amigo, Sergio Deodoro, pela amizade, apoio e companheirismo em todos os momentos; À minha amiga e parceira de pesquisa, Laiane Sá, pela amizade, paciência e por toda ajuda que me prestou nessa jornada; Ao meu amigo divo, Juliano Camurça, que me apoiou e me ajudou antes e, principalmente, durante a realização desse trabalho; Aos meus amigos de graduação e da vida, Rebbeka Lima, Jennyfer Loys, Bárbara Mello, Caio Calheiros, Liliane Costa e todos que compartilharam anos de estudos e que me apoiaram durante meu desenvolvimento acadêmico e pessoal; Aos amigos que a P&G me deu, Konan Koyama e Leandro Silva, por serem muito mais que apenas chefes, pelo apoio, pela paciência nos dias difíceis, pela flexibilidade, compreenssão e por contribuírem com o meu desenvolvimento profissional; À minha eterna professora, Denise Menezes, por todo o apoio, conhecimento e atenção que vem me dando desde a época de pré-vestibular; Ao meu orientador MSc. Geverson Façanha da Silva pela paciência, dedicação e carinho com que passou seus conhecimentos e experiências, os quais foram fundamentais para a realização deste trabalho; Aos professores do curso de Engenharia Química da UEA/EST, em especial Bayardo Dupotey, Ronaldo Santos, Jorge Leiva, Leonel Puyans, Patrícia Albuquerque, Sérgio Duvoisin, Ricardo Serudo, Aracélis Ferreira, Clairon Pinheiro e Erica Simplício, pelos conhecimentos passados com tanta dedicação e amor pela profissão; À Coordenação do curso pela dedicação, atenção e apoio aos alunos; Às técnicas químicas do laboratório da EST, Adriana e Sara, por ajudarem com o desenvolvimento da parte laboratorial deste trabalho; Aos membros da banca examinadora por aceitarem o convite e colaborarem para o enriquecimento do meu trabalho; À Universidade do Estado do Amazonas, em especial à Escola Superior de Tecnologia, pela estrutura de qualidade e pelo apoio a esta conquista. Obrigada! RESUMO A busca pela proteção solar se intensificou quando os efeitos nocivos do sol tornaram-se mais conhecidos e divulgados. O aumento da procura pela fotoproteção tem crescido juntamente com a busca por novos produtos que possam satisfazer o mercado, trazendo a proteção ideal. Assim, extratos vegetais ricos em constituintes fenólicos, como flavonóides, vêm sendo empregados em formulações fotoprotetoras associadas aos filtros UV, uma vez que, comprovada sua capacidade de absorver a radiação solar e antioxidante, podem intensificar a proteção final do produto e/ou neutralizar os radicais livres produzidos na pele após exposição à radiação solar. O objetivo deste trabalho consistiu em avaliar o potencial fotoprotetor de extratos de Aniba canelilla obtidos a partir de diferentes vias de extração, sendo estes caracterizados como maceração à frio com solventes em ordem crescente de polaridade e maceração à frio seguido de partição líquido-líquido. O perfil químico dos extratos obtidos também foi estudado. Foi observada a presença de pelo menos uma substância em todos os extratos obtidos com propriedades desejáveis de absorção da luz ultravioleta, como taninos, flavonóides e alcalóides. O teste de fator de proteção solar resultou em valores promissores de FPS, medida de eficácia protetora na região UV-B do espectro, e relação UVA/UVB, medida da eficácia protetora na região UV-A do espectro, sendo o extrato acetato de etila obtido pelo método de maceração à frio com solventes em ordem crescente de polaridade o que apresentou os melhores resultados (FPS 89,63 e UVA/UVB 0,92) frente aos outros extratos obtidos e em equiparação a um filtro solar comercial. Palavras-chave: fotoproteção, Aniba canelilla, extrato. ABSTRACT The search for sun protection has intensified when the sun's harmful effects became more known and disseminated. The Increase of the demand for sun protection has grown along with the search for new products that can fill the market, bringing ideal protection. Thus, plant extracts rich in phenolic components, as flavonoids, have been used in sun protective formulations associated with UV filters, once proven their capacity to absorb solar radiation and their antioxidant property can enhance the final product protection and/or counteract free radical produced on the skin after exposure to sunlight. The objective of this study was to evaluate the potential sun protection of Aniba canelilla extracts obtained from different extraction routes, which were characterized as cold maceration with solvents in order of increasing polarity and cold maceration followed by liquid-liquid partition. The chemical profile of the extracts was also analyzed. It was observed the presence of at least one component in all the extracts having desirable absorption properties of ultraviolet light, such as tannins, flavonoids and alkaloids. The sun protection factor test resulted in promising values of SPF, measuring protective efficacy in UV-B region of the spectrum and ratio UVA/UVB, as the protective efficacy in the UV-A region of the spectrum, and the ethyl acetate extract obtained by the cold maceration with solvents in order of increasing polarity method showed the best results (SPF 89.63 and UVA/UVB 0.92) compared to the others obtained extracts and comparable with a commercial sunscreen. Keywords: sun protection, Aniba canelilla, extract. LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 – Faixas de Radiação Solar................................................................................ 14 FIGURA 2 – Alcance da radiação solar UV.......................................................................... 15 FIGURA 3 – Aniba canelilla (H.B.K.) Mez........................................................................... 20 FIGURA 4 – Imagem da localização da Reserva Florestal Adolfo Ducke............................ 25 FIGURA 5 – Maceração a frio em frasco de vidro................................................................ 26 FIGURA 6 – Ciclo de extração por maceração a frio acelerada por uso de ultrassom.......... 27 FIGURA 7 – Esquema do processo de separação líquido-líquido..................................... 28LISTA DE TABELAS TABELA 1 – Rendimento amostral em porcentagem dos extratos obtidos com solventes de diferentes polaridades............................................................................................................. 32 TABELA 2 - Resultados dos testes fitoquímicos dos extratos obtidos de Aniba canelilla.................................................................................................................................. 33 TABELA 3 – Relação efeito eritemogênico (EE) versus intendidade da radiação (I) conforme o comprimento de onda (λ)..................................................................................... 36 TABELA 4 – Valores de FPS calculados para cada extrato obtido........................................ 36 TABELA 5 - Sistema Boot’s Star Rating relacionado com a razão UVA/UVB.......................... 38 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS ABS Absorbância CFC Clorofluorcarboneto EROs Espécies Reativas ao Oxigênio FPS Fator de Proteção Solar INPA Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia INPE Intituto Nacional de Pesquisas Espaciais g Grama Km Quilômetro L Litro m/v Massa/Volume mL Mililitro mm Milímetro NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato Na2SO4 Sulfato de sódio nm Nanômetro UEA Universidade do Estado do Amazonas UV Ultravioleta vpm Vibrações por minuto °C Graus Celsius SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO................................................................................................................ 12 2 REVISÃO DE LITERATURA........................................................................................... 14 2.1 RADIAÇÃO SOLAR...................................................................................................... 14 2.1.2 Radiação Ultravioleta............................................................................................... 14 2.1.2 Efeitos da radiação UV na pele.............................................................................. 15 2.2 PROTEÇÃO SOLAR.................................................................................................... 16 2.3 EXTRATOS VEGETAIS............................................................................................... 18 2.4 FAMÍLIA LAURACEAE................................................................................................. 19 2.5 Aniba canelilla (H.B.K) Mez.......................................................................................... 20 2.6 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO......................................................................................... 20 2.6.1 Extrações a Frio....................................................................................................... 21 2.6.2 Extrações a quente em sistemas abertos............................................................. 22 2.6.3 Extrações a quente em sistemas fechados.......................................................... 23 3 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................ 24 3.1 COLETA, ARMAZENAMENTO E PREPARO DAS AMOSTRAS DE FOLHA.............. 24 3.2 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS.................................................................................... 26 3.2.1 Maceração a frio com solventes em ordem crescente de polaridade................ 26 3.2.2 Maceração a frio seguida de partição líquido-líquido.......................................... 28 3.3 TRIAGEM FITOQUÍMICA............................................................................................. 30 3.3.1 Esteróides................................................................................................................ 30 3.3.2 Fenóis e Taninos..................................................................................................... 30 3.3.3 Alcalóides................................................................................................................. 30 3.3.4 Flavonódes............................................................................................................... 31 3.3.5 Saponinas................................................................................................................. 31 3.4 TESTE DE FATOR DE PROTEÇÃO SOLAR............................................................... 31 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................... 33 4.1 TRIAGEM FITOQUÍMICA............................................................................................. 34 4.2 FATOR DE PROTEÇÃO SOLAR................................................................................. 36 5 CONCLUSÕES............................................................................................................... 40 REFERÊNCIAS….….......................................................................................................... 41 1 INTRODUÇÃO A biodiversidade vem sendo reconhecida como um dos elementos centrais para o desenvolvimento e bem-estar da humanidade assim como responsável pelo equilíbrio ambiental global. Embora apenas uma pequena parte de seus componentes tenha sido adequadamente estudada e seus benefícios futuros ainda não sejam totalmente conhecidos, sua capacidade de gerar benefícios socioeconômicos tem sido valorizada devido ao seu potencial como matéria-prima para diferentes campos do conhecimento, como a medicina e diversos setores da indústria (NASCIMENTO, MARX, 2006). A indústria cosmética obteve um crescimento significativo devido ao desenvolvimento de novas formulações através da utilização de matérias-primas naturais em detrimento aos ativos sintéticos. Dessa forma, os consumidores entendem que cosméticos obtidos a partir de produtos naturais têm efeitos sobre a pele e sobre todo o organismo, trazendo um equilíbrio saudável, e os consideram como produtos que não agridem a saúde e nem ao meio ambiente (ANVISA, 2008). Os fotoprotetores são produtos de uso tópico destinados a proteger a pele dos efeitos causados pela radiação solar. Assim, o desenvolvimento de produtos mais eficientes, com altos fatores de proteção, menor quantidade de agentes sintéticos, menor potencial irritante e valores de mercado mais acessíveis tem despertado o interesse de muitos pesquisadores (DAL`BELO, 2008; PINTO et al., 2012; RANGEL, 2002). Neste cenário, as espécies vegetais se consolidam por possuírem um significativo potencial para dar origem a substâncias bioativas que podem ser empregadas a fim de proporcionar uma fotoproteção cutânea mais ampla à formulação, dentre elas estão os antioxidantes como as vitaminas C e E, os taninos, alcalóides e flavonóides (SOUZA et al., 2013). A extração é um dos processos mais utilizados para o isolamento de produtos bioativos de matérias vegetais. Dentre os diversos métodos de extração sólido-líquido, maceração, percolação e a extração com Soxhlet são os mais comumente utilizados (MARCANO, HASEGAWA, 1991; MELECCHI, 2005). Devido à ação fotoprotetora de muitos extratos e óleos de plantas e semelhança em estrutura molecular, esses compostos têm sido introduzidos na composição de protetores solares como alternativa aos compostos sintéticos (FONSECA JÚNIOR et al., 2015). A Aniba canelilla, conhecida popularmente como “casca-preciosa” é uma espécie da família Lauraceae que se apresenta em grande distribuição na região amazônica. O chá de suas folhas e casca é utilizado na medicina popular para fins digestivo, carminativo e anti-inflamatório (INTERAMINENSE, 2010; MAIA et al., 2001). Fonseca Júnior et al. (2015) mostraram que o extrato etanólico bruto das folhas de Aniba canelilla (H.B.K.) Mez possui grande potencial de FPS (Fator de Proteção Solar). Sendo assim, o problema científico deste trabalho refere-se a pouca investigação sobre diferentesvias de obtenção de extratos a partir das folhas de Aniba canelilla (H.B.K) Mez para avaliação do potencial de FPS. Logo, como hipóteses ao problema proposto têm-se que: (i) o estudo de outras vias de extração para as folhas de Aniba canelilla pode proporcionar descobertas de processos mais eficientes e otimizados e (ii) o potencial de FPS do extratos das folhas de Aniba canelilla pode vir a ser uma grande alternativa para inserção em formulações de protetores solares. Portanto, o objetivo geral deste trabalho consiste em avaliar o potencial fotoprotetor de extratos de Aniba canelilla obtidos a partir de diferentes vias de extração. E os objetivos específicos são: · Promover a caracterização fitoquímica dos extratos obtidos; · Comparar o potencial fotoprotetor de cada extrato obtido; · Verificar se a via de extração influencia nas propriedades e eficiência do FPS dos extratos obtidos; · Apresentar uma alternativa natural para loções de proteção solar. 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 RADIAÇÃO SOLAR A vida terrestre depende da energia radiante do Sol. A luz solar é composta de um espectro contínuo de radiação eletromagnética que está dividido em três regiões principais de comprimentos de onda (FIGURA 1): ultravioleta (UV), visível e infravermelho (MATSUMURA e ANANTHASWAMY, 2004; NASCIMENTO, 2008). FIGURA 1 – Faixas de Radiação Solar Fonte: http://www.cosmeticinnovation.com.br (2016). Os comprimentos de onda provenientes da radiação solar irradiam a superfície da Terra e apresentam-se distribuídos em 56% de infravermelho, 39% de luz visível e 5% de radiação ultravioleta (PALM e O’DONOGHUE, 2007). 2.1.2 Radiação Ultravioleta A radiação UV compreende os comprimentos de onda de 200-400 nm e é dividida em três seções, cada um dos quais tem efeitos biológicos distintos: UV-A (320-400 nm), UV-B (280-320 nm) e UV-C (200-280 nm). Apesar da radiação solar ser a principal fonte de exposição humana à radiação UV, com o advento das fontes artificiais a oportunidade para exposição adicional aumentou (SGARBI et al., 2007). A radiação UV-C é efetivamente impedida de alcançar a superfície da Terra pela camada de ozônio estratosférica (FIGURA 2), embora a exposição acidental pode ocorrer a partir de fontes artificiais, tais como lâmpadas germicidas e de bronzeamento artificial (GLOSTER e BROADLAND, 1996; NASCIMENTO et al., 2009). Os níveis de radiação UV-B solar que atingem a superfície da Terra são em grande parte controlados pela camada de ozônio estratosférica, que tem sido progressivamente esgotada como resultado da acumulação de produtos químicos que destroem a camada de ozônio na atmosfera da Terra – como clorofluorocarbonetos (CFC) e hidroclorofluorocarbonos (HCFC), os quais eram largamente utilizados em aparelhos de refrigeração e ar condicionado (PALM e O’DONOGHUE, 2007). As radiações UV-A e UV-B atingem a superfície da Terra (FIGURA 2) em quantidades suficientes para ter consequências biológicas importantes para a pele e os olhos (GLOSTER e BROADLAND, 1996). Quando a radiação UV atinge a pele (UVA e UVB), é totalmente absorvida pelas primeiras camadas da pele e promove alterações que podem ser benéficas ou maléficas no ser humano (RANGEL e CORRÊA, 2002). FIGURA 2 – Alcance da radiação solar UV. Fonte: http://4.bp.blogspot.com (2016). 2.1.2 Efeitos da radiação UV na pele A dose de exposição anual acumulada de radiação UV solar varia amplamente entre os indivíduos de uma dada população, dependendo, em grande medida, da ocupação e extensão das atividades ao ar livre. A agressão do sol é cumulativa e irreversível, capaz de produzir alterações normalmente imperceptíveis aos nossos olhos, como induzir a diversas alterações bioquímicas, inclusive alterações das fibras colágenas e elásticas, perda de tecido adiposo subcutâneo e fotocarcinogênese (BIHHIMER, 1989; LAUTENSCHLAGER, 2007; RIEGER, 1983). Embora a radiação UV-A seja o componente predominante da radiação UV solar a que estamos expostos é suposto ser fracamente cancerígenas, mas leva ao envelhecimento e enrugamento da pele. Comprimentos de onda na região UV-B do espectro solar que são absorvidos pela pele e podem levar à produção de eritema, queimaduras e, eventualmente, cancro da pele. (TAYLOR, 2005). Além disso, a exposição à radiação UV pode levar a mobilização de neutrófilos e ativação do sistema NADPH oxidase, o que gera uma série de espécies reativas oxidantes. O resultado disso é uma alteração no sistema imunológico com a diminuição de células alteradas devido às mudanças na produção de citocinas pelos queratinócitos, na expressão genética de moléculas de adesão e na ativação dos melanócitos (aumento da síntese de melanina) - esta última alteração pode ser constatada pelo bronzeamento duradouro da pele. Também pode levar ao espessamento da camada córnea e redução de alguns fatores, como firmeza, elasticidade e hidratação da pele (BARON et al., 2008; RABE et al., 2006). Outras alterações podem ocorrer em função dos efeitos crônicos da exposição solar, como o aumento da expressão do gene p53, que é um indicador de mutações e risco de câncer de pele (LAUTENSCHLAGER et al., 2007; MORALES-MOLINA et al., 2006; NAIK et al., 2007). Devido ao aumento na incidência do câncer de pele e outras afecções dermatológicas causadas pela radiação UV é necessário proteger a pele dos efeitos nocivos dessa radiação. Os protetores solares podem ser aplicadas para controlar a dose de radiação UV a qual a pele é exposta (PERUGINI et al., 2002). 2.2 PROTEÇÃO SOLAR Os protetores solares surgiram quando observou-se a existência de substâncias capazes de prevenir a queimadura da pele pelos raios solares. Os protetores solares são substâncias químicas largamente produzidos pela indústria cosmética que tem capacidade de refletir ou absorver as radiações ultravioletas que atingem a pele, diminuindo assim os efeitos maléficos dessas radiações (URBACH, 2001; STEINER, 1998). De acordo com o tipo de proteção que oferecem, os filtros solares podem ser classificados em físicos ou químicos. Os filtros físicos possuem a função de refletir ou dispersar as radiações ultravioletas que incidem sobre a pele, evitando que ocorra uma agressão às células da pele, funcionando como barreira. Geralmente, os filtros físicos são compostos inorgânicos, onde os mais utilizados são o dióxido de titânio, óxido de zinco, óxido de magnésio, o talco, o carbonato de cálcio, o caulim, o óxido de ferro e a guanina, sendo mais comumente usado o dióxido de titânio e o óxido de zinco. Os filtros inorgânicos são constituídos de partículas que devem ser de tamanho adequado com a ordem de radiação que se quer espalhar. São opacos, o que é um inconveniente, pois ficam depositados na pele e também refletem a luz visível, formando uma película branca o que pode ser esteticamente desagradável, porém com a redução do tamanho de suas partículas melhora a aparência cosmética do produto. Estes filtros solares representam a forma mais segura e eficaz para proteger a pele, pois apresentam baixo potencial de irritação, sendo inclusive, os filtros solares recomendados no preparo de fotoprotetores para uso infantil e pessoas com peles sensíveis. Os filtros físicos podem aumentar o FPS das preparações quando associados a menores quantidades de filtros químicos (HABIF, 2005; MASSON e SCOTTI, 2003). Já os protetores químicos são aqueles que possuem como característica a absorção de um ou mais comprimentos de onda específicos, transformando-o em outro tipo de energia. De acordo com o tipo de radiação que absorvem, os filtros químicos são classificados em: filtros UVA, que absorvem a radiação com comprimento de onda entre 320-400 nm e filtros UVB, que absorvem a radiação entre 290-320 nm. Já existem protetores solares que possuem a funcionalidade de absorver tando a radiação UV-A quanto a radiação UV-B (GARCIA, 2001; MOTA, 2003; SHAATH, 1997). São formados por moléculas orgânicas e tem a função de absorver as radiações ultravioletas de alta energia capazes de causar danos à pele humana,convertendo-as em radiações de baixa energia e inofensivas ao ser humano. São compostos aromáticos conjugados com um grupo carboxílico e geralmente apresentam um grupo doador de elétrons, como um grupo metoxila ou uma amina (LEONARDI, 2004). Os filtros químicos podem ser de origem natural ou sintética. Segundo Dal`Belo (2008) muitas formulações contendo filtros químicos sintéticos não proporcionam proteção total, principalmente quando são considerados efeitos crônicos como fotoenvelhecimento e fotocarcinogênese. Sobre a matéria prima natural, ainda é discutível alguns fatores que limitam seu uso como filtros solares. Entretanto, os extratos vegetais podem ser utilizados de forma positiva em preparações fotoprotetoras como coadjuvantes associados aos filtros sintéticos, pois, independentemente de seus efeitos filtrantes, tais produtos apresentam enormes vantagens eudérmicas (RANGEL, 2002; MORAIS et al., 2004) Assim, extratos vegetais ricos em constituintes fenólicos, como flavonóides, vêm sendo empregados em formulações fotoprotetoras associadas aos filtros UV, uma vez que, comprovada sua capacidade de absorver a radiação solar e antioxidante, podem intensificar a proteção final do produto e ou neutralizar os radicais livres produzidos na pele após exposição à radiação solar (NASCIMENTO et al., 2009). A eficácia de uma formulação contendo filtro solar é determinada através do grau de proteção contra eritema ou queimadura solar. Uma das técnicas mais utilizadas para isso é a determinação do Fator de Proteção Solar. A estimativa do FPS por espectrofotometria é realizada pela avaliação da altura, largura e localização da curva de absorção dentro do espectro do ultravioleta. Contudo, para avaliar um protetor solar pela espectrofotometria, não basta olhar a curva de absorção. É necessário calcular o fator de proteção solar (MANSUR, 1986). O FPS é um índice definido, de modo geral, como a razão entre a Dose Eritematógena Mínima (DEM) na pele protegida pela DEM na pele desprotegida (BRAILE, 2001). 2.3 EXTRATOS VEGETAIS Extratos brutos vegetais são, normalmente, misturas complexas constituídas quase sempre por diversas classes de produtos naturais, contendo diferentes grupos funcionais. Segundo Ramos et al. (1996), existe uma equivalência estrutural entre filtros químicos sintéticos e os princípios ativos extraídos de plantas, uma vez que a absorção ultravioleta tem sido verificada quando se utiliza extrato vegetal em produtos farmacêuticos e cosméticos, apontando uma possível ação fotoprotetora. Substâncias naturais extraídas de plantas e líquens foram considerados como potenciais protetores solares graças a sua absorção na região UV e ao seu poder antioxidante. Dentre as substâncias ativas presentes nos vegetais que podem ser empregadas a fim de proporcionar uma fotoproteção cutânea mais ampla à formulação, estão os antioxidantes como as vitaminas C e a E, os taninos, alcalóides e flavonóides (ROSA et al., 2008; VIOLANTE et al., 2009). O espectro de absorção dos flavonóides, quando dispersos em etanol, mostra em geral, dois picos, um entre 240–280nm e o outro entre 300-550nm, sinalizando um potencial para a absorção da radiação UV-B pela similaridade entre os espectros de absorção cujos comprimentos de onda estão entre 290 a 320nm (VIOLANTE et al., 2009). Estudos in vitro e in vivo têm demonstrado que os flavonóides inibem enzimas que estão envolvidas na produção de EROs sendo termodinamicamente capazes de reduzir os radicais livres gerados por meio da doação de elétrons a estes radicais (DAL’BELO, 2009; KORKINA e AFANAS’EV, 1997; BROWN et al., 1998). De acordo com Velasco et al. (2008), os flavonóides não apresentam tendência à absorção cutânea, assim interpreta-se que a atividade seria exercida nas camadas superficiais da pele, ação desejada para os filtros solares. 2.4 FAMÍLIA LAURACEAE A família Lauraceae é considerada uma das famílias mais primitivas pertencentes à divisão Magnoliophyta. É uma importante família de árvores e arbustos com registro desde o período Cretáceo. A família Lauraceae é formada por cerca de 50 gêneros, presente no mundo inteiro, com significativa distribuição nas regiões tropicais e subtropicais do planeta, especialmente nas florestas centro e sulamericanas. As Lauraceae destacam-se pela sua importância econômica. Algumas espécies têm sido utilizadas pela indústria para a fabricação de produtos diversos, porém a maioria das espécies têm seu uso restrito às comunidades tradicionais que detêm o conhecimento empírico da utilização dessas plantas. As espécies aromáticas da família Lauraceae estão compreendidas principalmente entre os gêneros Aniba, Nectandra, Octea, Licaria e Dicypellium (CRONQUIST, 1988; GAIAD e CARVALHO, 2016; HU et al., 2007; MARQUES, 2001). Os primeiros registros relativos a utilização das espécies desta família datam de 2.800 A.C., sendo originários da Grécia antiga. Após séculos de exploração na Região Amazônica, as espécies da família Lauraceae produtoras de óleos essenciais continuam tendo interesse comercial, mas com poucos estudos químicos e farmacológicos. Óleos voláteis de espécies da família Lauraceae tem grande importância na indústria farmacêutica e de perfumes, sendo obtidos a partir de Aniba rosaeodora, que tem como constituinte majoritário o álcool terpênico linalol, amplamente utilizado em fragrâncias de perfumes. Da mesma forma, a cânfora, extraída de Cinnamomum camphora, e o safrol, extraído de Ocotea pretiosa e Sassafras albidum, são amplamente utilizados na indústria de cosméticos. Espécies produtoras de óleos essenciais como o de pau-rosa (Aniba rosaeodora), casca preciosa (Aniba canelilla) e sassafrás (Ocotea odorifera) estão em extinção, ou próximas dela, mas ainda agregam grande valor econômico para as comunidades da região, abastecendo os mercados nacionais e internacionais de cosméticos e perfumes (ALCÂNTARA, 2010; BRUNETON, 2001; GUENTHER, 1960; RIZZINI e MORS, 1995; ZELLNER et al.; 2006). O gênero Aniba possui cerca de 41 espécies que estão distribuidas em sua maioria na Amazônia, dentre elas a A. canelilla (H.B.K.) Mez (MELO et al, 2006). 2.5 Aniba canelilla (H.B.K) Mez Aniba canelilla (H.B.K.) Mez (FIGURA 3), conhecida como "casca-preciosa", é uma espécie importante e histórica da Região Amazônica. Uma árvore comum na floresta tropical chega a 25 m de altura e casca do caule com cheiro de canela. Foi confundida com árvores de canela, em 1540, durante a viagem de Pizzaro e Orellana dos Andes até o estuário do Amazonas, e, em 1800, durante a expedição de Humbolt e Bonpland no rio Orinoco para encontrar a "famosa canela amazonense" (SILVA, et al., 2007). FIGURA 3 – Aniba canelilla (H.B.K.) Mez. Fonte: Dicionário informal (2016). Tronco, caules finos e folhas da A. canelilla são usadas como especiarias e ingredientes para pratos locais, fragrâncias e sachês de aromatização. O óleo da casca de A. canelilla exerce efeitos relaxantes sobre o músculo liso intestinal, o que justifica o uso da planta para distúrbios gastrointestinais. O chá da casca e folhas é comumente utilizado na medicina popular para uso antiespasmódico, digestivo, estimulante e de propriedades carminativas. A planta também tem sido utilizada para tratar resfriado, sífilis, leucorréia e febres intermitentes. A infusão ou decocção da casca foi indicada para o tratamento perda de memória, edema do pé e inflamação. Além disso, efeitos cardiovasculares do óleo vegetal da casca foram relatados em ratos normotensos, causando hipotensão e bradicardia (BERG, 1982; INTERAMINENSE et al., 2010; PIMENTEL, 1994; VIEIRA, 1991; SILVA, 2012). 2.6 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO O termo “extração” significa retirar, da forma mais seletiva e completa possível, as substâncias ou frações ativas contidas no vegetal. Antes do processo de extração, os vegetais normalmente são desidratados, liofilizados ou congelados, e ainda peneirados ou moídos. Assim, os substratos atingem maior superfície de contato com o solvente de extração (GÁMEZ-MEZA et al., 1999; JUNTACHOTE e BERGHOFER,2005; SIMÕES, 1997). Na escolha de um método extrativo, deve-se avaliar a eficiência, a estabilidade das substâncias extraídas, a disponibilidade dos meios e o custo do processo escolhido, considerando a finalidade do extrato que se quer preparar. Embora uma planta possa conter centenas de metabólitos secundários, apenas os compostos presentes em maior concentração são geralmente isolados e estudados pela fitoquímica clássica (FILHO e YUNES, 1998; SIMÕES, 1997). Entre os métodos para extração e obtenção de compostos a partir de produtos vegetais estão: 2.6.1 Extrações a frio 2.6.1.1 Maceração É a operação na qual a extração da matéria prima vegetal é realizada em recipiente fechado, em temperatura ambiente, durante um período prolongado (horas ou dias), sob agitação ocasional e sem renovação do líquido extrator (processo estático). Pela sua natureza, não conduz ao esgotamento da matéria prima vegetal, seja devido à saturação do líquido extrator ou ao estabelecimento de um equilíbrio difusional entre o meio extrator e o interior da célula. Diversas variações conhecidas desta operação objetivam, essencialmente, o aumento da eficiência de extração, entre elas: a) Digestão: consiste na maceração, realizada em sistema aquecido a 40 – 60°C; b) Maceração dinâmica: maceração feita sob agitação mecânica constante; c) Remaceração: quando a operação é repetida utilizando o mesmo material vegetal, renovando-se apenas o líquido extrator (SIMÕES, 1997). Este processo é o mais utilizado quando se trabalha com substâncias ativas pouco solúveis, plantas com elevado índice de intumescimento e possíveis proliferações microbianas. Apesar dos inconvenientes apresentados, ainda é uma das técnicas extrativas mais usuais devido à simplicidade e custos reduzidos (BARRETO JUNIOR, 2005). Os métodos de extração utilizados neste trabalho estão classificados dentro dos métodos de maceração, sendo eles as variações: a) Maceração a frio com solventes em ordem crescente de polaridade; b) Maceração a frio seguida de partição líquido-líquido. 2.6.1.2 Percolação A percolação, ao contrário da maceração, é um processo dinâmico, onde se faz o arraste do princípio ativo pela passagem contínua do líquido extrator, levando ao esgotamento da planta através do gotejamento lento do material. Também permite obter soluções extrativas mais concentradas, gradiente de polaridade, economia do líquido extrator e tempo relativamente curto. A percolação é indicada em processos extrativos de substâncias farmacologicamente muito ativas, presentes em pequena quantidade ou pouco solúveis. (POVH et al., 2001). 2.6.1.3 Turboextração Nessa técnica, a extração ocorre simultaneamente com a redução do tamanho da partícula, resultado da aplicação de elevadas forças de cisalhamento em rotações de 5000 a 2000 rpm. A redução drástica do tamanho de partícula e o consequente rompimento das células favorece a rápida dissolução das substâncias, resultando em tempos de extração da ordem de minutos e o quase esgotamento do material (NAVARRO, 2005). A turbólise, porém, pode gerar problemas com substâncias voláteis pois libera calor que pode interferir em processos metabólicos, sendo, portanto, recomendado apenas quando se tratar de materiais de dureza elevada ou muito fibrosos como caules, raízes, rizomas ou lenhos (BARRETO JUNIOR, 2005). 2.6.2 Extrações a quente em sistemas abertos 2.6.2.1 Infusão A extração por infusão ocorre pela permanência, durante certo tempo, do material vegetal em água fervente, num recipiente tapado. A infusão é aplicável às partes vegetais moles, as quais devem ser trituradas, cortadas ou pulverizadas, a fim de que possam ser mais facilmente penetradas e extraídas pela água (SIMÕES, 1997). 2.6.2.2 Decocção A decocção consiste em manter o material vegetal em contato, durante certo tempo, com um solvente (normalmente água) em ebulição. É uma técnica de emprego restrito, pois muitas substâncias ativas são alteradas por um aquecimento prolongado e é geralmente empregada para materiais vegetais duros e de natureza lenhosa (QUEIROZ et al., 2001). 2.6.3 Extrações a quente em sistemas fechados 2.6.3.1 Arraste por vapor d’água Esse método de extração é utilizado para a extração de óleos voláteis. Os óleos voláteis possuem tensão de vapor mais elevada que a da água, sendo, por isso, arrastados pelo vapor d’água. Em pequena escala emprega-se o aparelho de Clevenger. O óleo volátil obtido, após separar-se da água deve ser seco com Na2SO4 anidro. Esse procedimento, embora clássico, pode levar à formação de material explosivo em função da alta temperatura empregada. Preferencialmente, esse método é utilizado para extrair óleos de plantas frescas (SIMÕES, 1997). 2.2.3.2 Extração em aparelho de Soxhlet É utilizado, sobretudo, para extrair sólidos com solventes voláteis, exigindo o emprego do aparelho de Soxhlet. Em cada ciclo da operação, o material vegetal entra em contato com o solvente renovado; assim, o processamento possibilita uma extração altamente eficiente, empregando uma quantidade reduzida de solvente, em comparação com as quantidades necessárias nos outros processos extrativos, para se obter os mesmos resultados qualitativos e quantitativos (POVH et al., 2001). 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 COLETA, ARMAZENAMENTO E PREPARO DAS AMOSTRAS DE FOLHA As folhas utilizadas neste trabalho foram coletadas previamente, pelo professor MSc Geverson Façanha, da base de 10 árvores em áreas individuais da Reserva Florestal Adolpho Ducke, pertencente ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), localizada no Km 26 da rodovia AM-010 (FIGURA 4), no municipio de Manaus – Amazonas, no período seco (Setembro/2014) pela parte da manhã. FIGURA 4 – Imagem da localização da Reserva Florestal Adolfo Ducke. Fonte: INPE (2004). As folhas coletadas foram enviadas ao Laboratório de Engenharia da Universidade do Estado do Amazonas (UEA) e submetidas à secagem em local seco, arejado e protegido do sol à temperatura de 27°C por 10 dias e foram armazenadas em forma de ramalhete, baseado na metodologia de Gontijo (2015). Após o período de secagem, as folhas foram submetidas ao processo de trituração em moinho elétrico de facas da marca Marconi. Após o processo de trituração, as folhas foram submetidas à peneiração em um agitador de peneiras eletromagnético da marca Produtest com tempo de agitação de 10 minutos em potência média a uma frequência de 3600 vpm. Foram selicionados tamanhos de partículas de 1,7 mm a 6,3 mm para partículas menores e de 6,3 mm a 8,0 mm para partículas maiores, de acordo com a metodologia de Gontijo (2015). Por fim, as folhas foram armazenadas em saco plástico e mantidas em congelador até a sua utilização no processo de extração. 3.2 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS 3.2.1 Maceração à frio com solventes em ordem crescente de polaridade Foram pesados 400g de folhas de Aniba canelilla (H.B.K) Mez e essa massa foi depositada dentro de um frasco de vidro com capacidade para 2L. Foi realizada maceração a frio com n-Hexano P.A. A extração caracterizou-se como maceração a frio com solvente (FIGURA 5) acelerada por uso de ultrassom, em uma lavadora ultrassônica da marca UNIQUE. FIGURA 5 – Maceração à frio em frasco de vidro. A extração foi feita em ciclos, seguindo o fluxograma abaixo (FIGURA 6). A maceração aconteceu em 3 ciclos, no primeiro cliclo foram adicionados 1,5L de solvente e no segundo e terceiro ciclos 1L de solvente cada, seguido de agitação manual até que toda a porção de folhas estivesse totalmente molhada. Foi utilizada uma rolha envolta com filme plástico, para evitar a interação rolha-solvente, e o frasco foi hermeticamente fechado. FIGURA 6 - Ciclo de extração por maceração a frio acelerada por uso de ultrassom. As etapas de ultrassom duraram 20 minutos com intervalo de 24 horas entre si. As etapas de filtração a vácuo foram realizados com o uso de funil de Büchner, papel de filtro e kitassato conectado à bomba de vácuo por uma mangueira. Os extratos obtidos foram medidosem proveta, tranferidos para um frasco de vidro, identificados e armazenados em geladeira. Foram realizadas remacerações, seguindo o mesmo fluxo da maceração, utilizando os solventes Diclorometano, Acetato de Etila e Etanol, nesta ordem, classificados em ordem crescente de polaridade. Após o término de todos os ciclos, as folhas foram descartadas e os extratos de solvente semelhante foram misturados, resultando em 4 extratos únicos. Os solventes foram evaporados sob pressão reduzida a 50°C em evaporador rotativo da marca Tecnal. Antes da secagem total, os extratos foram transferidos para béqueres e deixados para secar em banho maria a 50°C com auxílio de sistema de exaustão em capela. Após secos, os extratos foram protegidos com filme plástico e armazenados em geladeira. 3.2.2 Maceração a frio seguida de partição líquido-líquido Foram pesados 400g de folhas de Aniba canelilla (H.B.K) Mez e depositados dentro de um frasco de vidro com capacidade para 2L. Foi realizada maceração a frio em 1,5L de Álcool Etílico 92,8 P.A. em 3 ciclos, seguindo o mesmo fluxo de processo da FIGURA 6. A extração caracterizou-se como maceração a frio com solvente acelerada por uso de ultrassom. As etapas de ultrassom duraram 20 minutos com intervalo de 24 horas entre si. As etapas de filtração a vácuo foram realizadas com o uso de funil de Büchner, papel de filtro e kitassato conectado à bomba de vácuo por uma mangueira. Os extratos obtidos foram medidos em proveta, tranferidos para um frasco de vidro, identificados e armazenados em geladeira. Após o término de todos os ciclos, as folhas foram descartadas, os extratos foram misturados e evaporados sob pressão reduzida a 50°C em evaporador rotativo. Antes da secagem total, o extrato foi transferido para um béquer e deixado para secar em banho maria à 50°C com auxílio de sistema de exaustão em capela. Após seco, foi calculado o rendimento e retirada uma alíquota para os testes de fator de proteção. O extrato bruto resultante foi dissolvido em etanol-água (1:3) e submetido à partição líquido-líquido (FIGURA 7), utilizando os solventes n-Hexano, Diclorometano e Acetato de Etila, nessa ordem, restando ainda uma fração hidroalcóolica. FIGURA 7 – Esquema do processo de separação líquido-líquido. Fonte: SILVA (2012). Os solventes obtidos foram evaporados e os extratos foram secos pelos mesmos processos utilizados para os extratos resultantes do processo de maceração. 3.3 TRIAGEM FITOQUÍMICA A triagem fitoquímica foi realizada através do processo de prospecção qualitativa, baseada na metodologia de Matos (2009), adaptada por Rizzato et al. (2016). Para cada extrato obtido foram prepadas soluções de 2mg/mL usando álcool etílico P.A.. Os extratos foram submetidos a testes qualitativos para a verificação da presença de metabólitos secundários, dentre eles, alcalóides, flavonóides, estreróides, saponinas, taninos e fenóis. 3.3.1 Esteróides O teste foi baseado na reação de Lieberman-Burchard (anidrido acético + ácido sulfúrico concentrado). Foram pipetados 2mL de cada extrato da planta e colocados em tubos de ensaio. A cada tubo de ensaio foram adicionados 2mL de clorofórmio e água destilada para observação das duas fases formadas. As soluções clorofórmicas foram separadas e filtradas em funil de vidro que continha algodão polvilhado com sulfato de sódio anidro, em tudos de ensaio. Em seguida, foram adicionados 1mL de anidrido acético e 3 gotas de ácido sulfúrico concentrado nas amostras filtradas. A mudança de cor de azul seguida de verde indica a presença de esteróides livres. 3.3.2 Fenóis e Taninos Em tubos de ensaio, foram adicionadas 3 gotas de solução alcoólica de FeCl3, previamente preparada, em 2mL de cada um dos extratos obtidos. As soluções foram submetidas a agitação para a observação de mudança de coloração ou formação de precipitado. Coloração entre azul e vermelho indica presença de fenóis e a formação de precipitado escuro de cor azul ou verde indica presença de taninos. 3.3.3 Alcalóides Foram alcalinizados, em tubos de ensaio, 2ml de cada extrato com 15 gotas de hidróxido de sódio a 1%. Foram adicionados 2mL de água destilada e 2mL de clorofórmio. Após breve agitação, verificou-se a formação de duas fases; a fase clorofórmica foi separada da fase aquosa com o auxílio de funis de separação. Na fase clorofórmica, foram adicionadas 15 gotas de ácido clorídrico a 1% e 2mL de água destilada. Novamente, foi observada a formação de duas fases; a fase aquosa ácida foi separada e foram acrescentadas 3 gotas do reagente de Bouchardat a ela. A presença de precipitados insolúveis e floculosos indicam a presença de alcalóides. 3.3.4 Flavonóides Foi utilizado o teste de Shinoda, sendo adicionados 2mL de ácido clorídrico concentrado em 2mL de cada extrato em tubos de ensaio e logo após foi adicionado um pedaço pequeno de magnésio em fita. A variação de cor de parda a avermelhada indica a presença de flavonóides. 3.3.5 Saponinas Em tubos de ensaio, contendo 2mL de extrato, foram adicionados 2mL de clorofórmio e 5mL de água destilada. Foi observada a formação de duas fases; as duas fases foram separadas com ajuda de funis de separação e as fases aquosas foram submetidas à agitação mecânica. A presença de espuma persistente no extrato indica a presença de saponinas. 3.4 TESTE DE FATOR DE PROTEÇÃO SOLAR O potencial de FPS foi determinado pelo método espectrofotométrico desenvolvido por Mansur et al. (1986), onde foram feitas soluções dos extratos de Aniba canelilla obtidos pelos dois métodos de extração utilizados, incluindo o extrato hidroalcoólico resultante do método de partição líquido-líquido, na concentração de 1% (m/v) seguidas de diluições necessárias para a análise. As soluções dos extratos foram preparadas com etanol, e assim, realizou-se uma varredura entre os comprimentos de onda de 280 a 400nm (Espectrofotômetro Shimadzu, modelo UV-1800) em cubeta de quartzo de 1,0 cm de caminho óptico. As soluções foram diluídas até que fosse possível observar valores de absorbância entre 0 e 1. As absorbâncias obtidas foram normalizadas e utilizadas para o cálculo do FPS in vitro e também necessárias para a elaboração dos espectros de absorção. Além disso, determinou-se a razão UVA/UVB a fim de conhecer sua proteção em relação à radiação UVA, proposta por Boot the Chemist Limited. A estimativa do FPS por espectrofotometria é realizada pela avaliação da altura, largura e localização da curva de absorção dentro do espectro do ultravioleta. Contudo, para avaliar um protetor solar pela espectrofotometria, não basta olhar a curva de absorção. É necessário calcular o fator de proteção solar. Para calcular o FPS na região do espectro UVB, os valores médios obtidos através das leituras foram aplicados na fórmula proposta por Mansur (1986) demonstrada pela equação (1). (1) Onde, FC = fator de correção (=10), EE (λ) = efeito eritemogênico da radiação de comprimento de onda (λ) I (λ) = intensidade do sol no comprimento de onda (λ) abs (λ) = leitura espectrofotométrica da absorbância da solução do filtro solar no comprimento de onda (λ) O FPS na região UVA foi obtido a partir da relação UVA/UVB, de acordo com a equação (2) abaixo: (2) A transmitância espectral medida [abs(λ)] é convertida em valores de absorbância espectral Aλ = −log[abs(λ)] e razão entre a curva UVA/UVB é determinada e associada com a proteção frente à radiação UVA. 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO As folhas da planta, depois de secas e trituradas, apresentaram coloração marrom esverdeada e odor agradável característico. Os extratos obtidos apresentaram cor entre o verde e o marrom, de acordo com o solvente utilizado nos dois métodos de extração utilizados, tendo sido verificado que quanto mais polar o solvente mais verde era o extrato obtido. Os extratos foram pesados e, então, foram calculados os valores dos rendimentos de cada extração. Os cálculos dos rendimentos dos extratos obtidos por maceração a frio com solventes foram feitos em relação à massa de folhas (400g) utilizada paraa obtenção dos extratos. Os rendimentos dos extratos obtidos por partição líquido-líquido foram calculados em relação à massa do extrato bruto etanólico utilizado para partição. Os valores dos rendimentos estão demonstrados na TABELA 1. TABELA 1 – Rendimento amostral em porcentagem dos extratos de Aniba canelilla obtidos com solventes de diferentes polaridades. Solventes Maceração a frio com solventes de ordem crescente de polaridade Maceração a frio seguida de partição líquido-líquido n-Hexano 3,94 0,99 Diclorometano 1,24 1,25 Acetato de Etila 1,29 0,97 Etanol 3,03 6,02 Total (%) 9,5 9,23 De modo geral, os melhores rendimentos foram obtidos pelo método de maceração a frio com solventes em ordem crescente de polaridade (método 1). Os valores observados de rendimentos obtidos pelo método 1 demonstraram valores maiores e uma maior simetria na quantidade de extrato obtido comparando com a que houve partição líquido-líquido (método 2), onde o extrato etanólico bruto apresentou melhor rendimento isolado entre todos os extratos e fases. 4.1 TRIAGEM FITOQUÍMICA Os testes para detecção de metabólitos secundários mostraram que existia pelo menos um dos metabólitos testados em cada extrato obtido, independente do método utilizado. TABELA 2 - Resultados dos testes fitoquímicos dos extratos obtidos de Aniba canelilla. Classe de Metabólitos Maceração a frio com solventes em ordem crescente de polaridade Maceração a frio seguida de partição líquido-líquido EH ED EA EE EB FH FD FA Esteróides + + + - + + + - Taninos - - - + + - - + Alcalóides + - - - + + - - Flavonóides - - - + + - + + Saponinas - - - + + - - - EH = Extrato Hexânico obtido pelo método 1; ED = Extrato Diclorometano obtido pelo método 1; EA = Extrato Acetato de Etila obtido pelo método 1; EE = Extrato Etanólico obtido pelo método 1; EB = Extrato Bruto Etanólico; FH = Fase Hexânica obtida por partição; FD = Fase Diclorometano obtida por partição; FA = Fase Acetato de Etila obtida por partição; + = Resultado positivo; - = Resultado negativo. Comparando os métodos, o método 2 apresentou uma melhor separação das classes de compostos bioativos em relação ao método 1 visto que nos extratos obtidos pelo segundo método foi detectada em todos os extratos obtidos a presença de compostos de classes com potencial de fotoproteção e antioxidantes (flavonoides, alcalóides e taninos), enquanto os extratos obtidos pelo primeiro método apresentaram a presença desses compostos ativos em apenas dois dos extratos. Segundo Oliveira (2015), o método de extração via maceração a frio, presente nos dois métodos, é largamente utilizado e o maior tempo de contato do material vegetal com o solvente pode favorecer a extração de metabólitos secundários. O teste para a presença de esteroides deu positivo para quase todos os extratos obtidos pelos dois métodos de extração utilizados, com exceção do extrato etanólico obtido pelo primeiro método e da fase acetato de etila obtida pelo segundo método. A presença de esteroides não está ligada com a atividade fotoprotetora das plantas, porém estes compostos apresentam outros tipos de atividade biológica, como atividade antifúngica. Segundo Bruneton (2001), os esteroides são substâncias bastante abundantes e fazem parte de um grupo fitoquímico proveniente de metabólitos dos triterpenos. Inclusas nos grupos dos esteroides estão as saponinas, outra classe de metabólitos que possui atividade antifúngica, inclusive para variações de Candida sp. O extrato bruto etanólico e a fase acetato de etila, obtidos a partir do método 2, avaliados qualitativamente, continham, em sua composição, taninos enquanto nos extratos obtidos pelo método 1 apenas o extrato etanólico apresentou taninos em sua composição. De acordo com Santana et al. (2001) a presença deste metabólito sinaliza um potencial na absorção da radiação UV. Segundo Santos e Mello (2004), os taninos são compostos polifenólicos solúveis em água e em solventes orgânicos polares, verificado claramente no método 1 onde só foi detectada a presença desse composto no extrato etanólico, mais polar dos 4 solventes utilizados. Os taninos podem ser utilizados em alguns campos da indústria, em especial na farmacêutica, pois segundo Santos e Mello (2004) as plantas que apresentam em sua composição química certas quantidades de taninos tendem a ser utilizadas na medicina popular para o tratamento de diarreias, hipertensão arterial, reumatismo, problemas no estômago e inflamações em geral, além de apresentar propriedades fotoprotetoras. São utilizadas também como antioxidantes em sucos e refrigerantes pela indústria alimentícia por possuírem ação sequestradora de radicais livres. Os extratos hexânicos obtidos pelos dois métodos e o extrato bruto etanólico obtido pelo segundo método demonstraram presença de alcalóides. Estes são metabólitos com núcleos aromáticos que atuam como absorvedores da radiação ultravioleta (Henriques et al., 2000). A presença de alcalóides representa característa importante em um extrato para utilização em formulações de proteção solar. Os flavonoides são substâncias com núcleo fenólico que possuem alto poder de captação de espécies reativas de oxigênio (EROs) agindo como importantes agentes antioxidantes, capazes de inibir e retardar a oxidação de lipídios e alguns danos causados às células (AMARAL et al., 2001). Flavonóides foram identificados nos extratos etanólicos obtidos pelos dois métodos, na fase diclorometano e na fase de acetato de etila, obtidos pelo método 2. De acordo com Nascimento et al. (2009), extratos vegetais ricos em constituintes fenólicos, como flavonóides, vêm sendo empregados em formulações fotoprotetoras associadas aos filtros UV, uma vez que, comprovada sua capacidade de absorver a radiação solar e antioxidante, podem intensificar a proteção final do produto e ou neutralizar os radicais livres produzidos na pele após exposição à radiação solar. O teste para determinar a presença de saponinas deu positivo para os extratos etanólicos obtidos pelos dois métodos utilizados. Saponinas são glicosídeos de esteróides ou de terpenos policíclicos. Esse tipo de estrutura, possui uma parte com característica lipofílica (triterpeno ou esteróide) e outra parte hidrofílica (açúcares) o que determina a propriedade de redução da tensão superficial da água e suas ações detergente e emulsificante (SARKER, 2009). As saponinas em solução aquosa possuem como característica marcante a formação de espuma persistente e abundante. Essa atividade provém, como nos outros detergentes, do fato de apresentarem na sua estrutura, como já mencionado, uma parte lipofílica, denominada aglicona ou sapogenina e uma parte hidrofílica constituída por um ou mais açúcares. A espuma formada é estável à ação de ácidos minerais diluídos, diferenciando-a daquela dos sabões comuns. Essa propriedade é a mais característica desse grupo de compostos, da qual deriva o seu nome (do latim sapone = sabão) (SIMÕES, 1999). De acordo com Bobin et al. (1994) que estudaram 100 diferentes extratos vegetais, um dos fatores que determinam a eficácia de um produto natural como fotoprotetor é sua composição química e consequentemente sua atividade em absorver o espectro ultravioleta, além do coeficiente de extinção molar e a solubilidade. Testes realizados por Rizzato et al. (2016) utilizando o extrato bruto etanólico de folhas de Aniba canellila colhidas em época de seca, obtido por maceração a frio, mostraram a presença de taninos, alcalóides e flavonóides, enquanto no presente trabalho o teste apresentou positividade para todas as classes analisadas. Para a fase hexânica o teste deu positivo para a presença de taninos, alcaloides e esteroides, enquanto no presente trabalho o teste deu positivo para a presença de esteroides e tanino. Para a fase diclorometânica o teste deu positivo para a presença de esteróides, enquanto no presente trabalho o teste deu positivo para esteróides e taninos. Algumasdiferenças foram observadas, porém segundo Matos (2009), a diferença na presença de algumas classes de metabólitos em plantas da mesma espécie está relacionada a fatores como o clima, solo, temperatura e forma de coleta do material. De modo geral, todos os extratos obtidos pelo método 2 de extração e os extratos etanólico e acetato de etila obtidos pelo método 1 apresentaram pelo menos uma substância relevante ao estudo da atividade fotoprotetora. 4.2 FATOR DE PROTEÇÃO SOLAR O FPS das amostras de extratos foram obtidos utilizando a equação 1. Os valores de absorbância foram obtidos na leitura em espectrofotômetro. A relação entre o efeito eritematógeno e a intensidade da radiação em cada comprimento de onda EE(λ) x i(λ) é constante e foi determinada por Sayre (1979), conforme a TABELA 3. TABELA 3 – Relação efeito eritemogênico (EE) versus intensidade da radiação (I) conforme o comprimento de onda (λ). λ (nm) EE(λ) x I(λ) 290 0,0150 295 0,0817 300 0,2874 305 0,3278 310 0,1864 315 0,0839 320 0,0180 Fonte: SAYRE et al. (1979). Os valores de FPS e relação UVA/UVB calculados para cada extrato obtido estão apresentados na TABELA 4 abaixo: TABELA 4 – Valores de FPS calculados para cada extrato obtido. Método de extração Extrato FPS UVA/UVB Maceração a frio com solventes em ordem crescente de polaridade Extrato hexânico 15,91 1,09 Extrato dicloro metânico 41,53 - Extrato acetato de etila 89,63 0,92 Extrato etanólico 4,30 0,69 Maceração a frio seguida de partição líquido-líquido Extrato bruto etanólico 7,69 2,12 Fase hexânica 19,32 1,11 Fase dicloro metânica 82,74 - Fase acetato de etila 31,93 - Fase hidroalcóolica 15,68 - De acordo com os dados da Tabela 4, os resultados obtidos demonstraram que os extratos puros, quando analisados pela sua capacidade fotoprotetora, apresentaram, na sua maioria, altos FPS. De acordo com a legislação brasileira, RDC Nº 30 de 1º de junho de 2012 (BRASIL, 2012), um produto para ser utilizado em cosméticos fotoprotetores, deve apresentar FPS de, no mínimo, 6. Desta forma, com exceção do extrato etanólico obtido pelo primeiro método, os extratos apresentaram valor de FPS acima do mínimo estipulado indicando potencial fotoprotetor relevante. Apesar dos extratos etanólicos obtidos pelos dois métodos terem apresentado todos as substâncias relevantes para o estudo do potencial fotoprotetor, eles foram os que apresentaram os menores valores de FPS na faixa de fotoproteção UVB. De acordo com Violante et al. (2009), valores baixos de FPS se devem a dificuldade da determinação da absorção máxima dos extratos vegetais, por serem uma mistura complexa de moléculas ativas e menos ativas. Segundo Souza et al. (2005), os extratos que apresentam baixa absorção na faixa de fotoproteção necessitam ser incorporados em uma concentração muito alta para que haja a fotoproteção desejada. Isso representa a possibilidade de ocorrência de alergias e custo elevado da preparação final. Mas mesmo não apresentando absorções consideráveis, os extratos vegetais podem ser utilizados de maneira positiva em preparações protetoras como adjuvantes, associados aos filtros sintéticos, pois, independentemente de suas capacidades filtrantes, os extratos apresentam várias vantagens eudérmicas e subtâncias características de protetores solares convencionais (CABRAL et al., 2011). Apesar disso, os extratos etanólicos apresentaram absorbância máxima na região UVA do espectro entre 400nm – 385nm e apresentaram valores aceitáveis de relação UVA/UVB, sendo o extrato obtido pelo método 2 com valor dentro dos padrões da norma brasileira (BRASIL, 2012). Seguindo o mesmo racional, os demais extratos que apresentaram valores baixos de FPS na região UVB apresentaram potencial de proteção de superior a ultra (TABELA 5) na região UVA, de acordo com Sistema Boot’s Star Rating, que qualifica o potencial de proteção antiUVA das substâncias (LEVY, 2007; BOOTS THE CHEMISTS, 2004). TABELA 5 - Sistema Boot’s Star Rating relacionado com a razão UVA/UVB Fonte: BOOTS THE CHEMISTS (2004). Os extratos hexânicos obtidos pelos dois métodos de extração e o extrato de acetato de etila obtido pelo método 1 foram os que apresentaram valores representativos de FPS nas duas regiões dos espectro UV, de acordo com os valores apresentados na TABELA 4. Fazendo um comparativo com um filtro solar comercial analisado por Fonseca Júnior et al. (2015) de FPS 72,08 e razão UVA/UVB 1,48, o extrato de acetato de etila obtido pelo método 1 foi o que mais se assemelhou em valores obtidos para as duas regiões do espectro, mostrando um grande potencial para a utilização em formulações fotoprotetoras. O extrato de acetato de etila obtido pelo método 1 de extração, como descrito anteriormente, deu positivo para a presença de alcalóides, que representa característa importante em um extrato para utilização em formulações de proteção solar. O estudo feito por Fonseca Júnior et al. (2015) mostrou resultado melhor para o valor de FPS, 41,43 vs. 7,69 neste estudo, para o extrato bruto das folhas de Aniba canelilla, porém apresentou valor inferior a respeito da relação UVA/UVB para o mesmo extrato, 1,04 vs. 2,12 neste trabalho. Essa diferença pode estar relacionada às caracteríscas intrínsecas a origem das folhas utilizadas, de acordo com Matos (2009). De modo geral, os extratos, obtidos por ambos os métodos de extração utilizados, mostraram grande potencial de fotoproteção na região UVB do espectro, enquanto o método 1 foi mais eficiente no potencial de fotoproteção na região UVA do espectro, como o extrato de acetato de etila obtido pelo primeiro método apresentando os melhores valores nas duas regiões. Apesar de ser um teste in vitro, a metodologia empregada para este estudo apresenta uma boa correlação com os testes in vivo (VIOLANTE et al., 2009), o que garante a confiabilidade dos resultados. 5 CONCLUSÕES Os testes fitoquímicos revelaram a presença de pelo menos um metabólito secundário relevante no que diz respeito a propriedade fotoprotetora, mostrando o potencial dos extratos de folhas de Aniba canelilla. Os resultados obtidos demonstraram que, na concentração utilizada, o extrato de acetato de etila, obtido pelo método 1, apresentou-se o mais eficiente comparado aos outros extratos obtidos e também mostrou-se equiparado ao protetor comercial comparado. Com exceção do extrato de acetato de etila, os extratos obtidos pelo método 2 apresentaram os melhores resultados de FPS. Visto que, de acordo com a legislação brasileira, RDC N° 30 de 1° de Junho de 2012 (Brasil, 2012), um produto para ser utilizado em cosméticos fotoprotetores, deve apresentar FPS mínimo de 6, os extratos de Aniba canelilla mostraram-se promissores quanto sua utilização em formulações fotoprotetoras. REFERÊNCIAS ALCÂNTARA, J. M.; YAMAGUCHI, K. K. L.; VEIGA-JUNIOR, V. F. Composição química de óleos essenciais de espécies de Aniba e Licaria e suas atividades antioxidante e antiagregante plaquetária. Química Nova, v. 33, n. 1, p. 141 – 145, 2010. AMARAL, A. C. F.; KUSTER, R. M.; BESSA, W. S.; BARNES, R. A.; KAPLAN, M. A. C.; WESSJOHANN, L. A. Flavonoids and other phenolics from leaves of two Marlierea species (Myrtaceae). Biochemical Systematics and Ecology, v. 29, p. 653-654, 2001. ANVISA, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Guia de Controle de qualidade de Produtos cosméticos. 2ª edição, revista – Brasília, 2008. BARRETO JUNIOR, A. G. 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