JuliaJD-DISSERT

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JULIA JENSEN DIDONET 
 
 
 
 
 
ESTUDO DOS EFEITOS COMPORTAMENTAIS DO 
NEUROPEPTÍDEO S EM CAMUNDONGOS SUBMETIDOS A 
MODELOS ANIMAIS DE PARKINSON 
 
 
Dissertação apresentada à 
Universidade Federal do Rio Grande 
do Norte, para obtenção do título 
de Mestre em Psicobiologia. 
 
 
 
 
Natal 
2012 
 2 
 
JULIA JENSEN DIDONET 
 
 
 
 
 
ESTUDO DOS EFEITOS COMPORTAMENTAIS DO 
NEUROPEPTÍDEO S EM CAMUNDONGOS SUBMETIDOS A 
MODELOS ANIMAIS DE PARKINSON 
 
 
Dissertação apresentada à 
Universidade Federal do Rio Grande 
do Norte, para obtenção do título 
de Mestre em Psicobiologia. 
 
Orientadora: Profa. Dra. Elaine 
Cristina Gavioli 
 
 
 
Natal 
2012 
 
 3 
 
ESTUDO DOS EFEITOS COMPORTAMENTAIS DO 
NEUROPEPTÍDEO S EM CAMUNDONGOS SUBMETIDOS A 
MODELOS ANIMAIS DE PARKINSON 
 
Julia Jensen Didonet 
Defesa 29/06/2012 
 
 
Banca Examinadora 
 
 
_____________________________ 
Profa. Janaína Zanoveli 
Universidade Federal do Paraná, PR 
 
 
_____________________________ 
Profa. Dra. Alessandra M. Ribeiro 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN 
 
 
____________________________ 
Profa. Dra. Elaine Cristina Gavioli 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN 
 4 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“You don't get something for nothing 
You can't have freedom for free 
You won't get wise 
With the sleep still in your eyes 
No matter what your dreams might be” 
 
(Something for Nothing, Rush, 2112) 
 
 5 
 
AGRADECIMENTOS 
À Professora e orientadora Dra. Elaine Cristina Gavioli, pela paciência e carinho que 
sempre teve para me eninar tudo o que eu aqui apresento. Pelas várias horas de 
reuniões e as longas tardes em que esteve comigo coletando os dados experimentais. 
Por viver a simplicidade da rotina da ciência, apesar de tantos compromissos. Obrigada 
pela confiança, compreensão, e incentivo prof! 
Às Profas e Dras do laboratório, Vanessa Rachetti e Eunice André, pela simpatia e 
disponibilidade. O sorriso e a piada sempre na ponta da língua e as mãos sempre 
dispostas a ajudar. 
Ao Professor Judney e à Professora Mirian, por disponibilizarem o laboratório e várias 
horas de ensinamentos no laboratório de imunoistoquímica. 
Aos colegas de laboratório, que dividem as horas e o espaço com tranquilidade. Em 
conversas agradáveis mesmo que em sussurros. 
À especial colega, amiga e querida Laila Asth, Lailinha. Este trabalho guarda suas horas 
de trabalho e esforço também. Nas entrelinhas ficam a força e apoio que sempre foi 
pra mim, dividindo o peso de estar longe da família, tornando tudo mais fácil de 
suportar. Os conselhos, os almoços, as risadas e confidências. Obrigada por estar 
sempre presente! 
Aos amigos Dani Moura, Fe Palhano, Fe Negreiros e Pedro de Moraes. Pelas conversas 
enriquecedoras, na volta do kung fu ou lavando louça. Pela amizade de preço 
inestimável. Porque me conhecem bem e sabem o quanto eu preciso de alguém para 
me escutar, tentar me compreender, o quanto eu preciso de palavras carinhosas. Por 
fazer meu coração sorrir em cada encontro. 
Aos amigos de república, Grego, Jordy, Chapa, Zaca, Marília e Pedro, por fazerem a 
vida mais divertida. Por fazer o viver fácil e prazeroso, mesmo entre 7 pessoas tão 
diferentes. 
Aos meus pais, pelo apoio emocional e financeiro. Pelo amor que guardam por mim 
que faz tudo valer a pena. Pela confiança e despreendimento que se exige quando se 
quer sair do ninho e as asas ainda batem vacilantes. O vôo é dificil, mas há se jogar. 
Ao Maninho, ao Buddy, à Anis e à Iti. Pelas horas de celular e por aquelas guardadas na 
memória. São força para o passo mais a frente. 
Às inseparáveis distantes amigas queridas, Momo e Re. Cuja amizade, em conselhos e 
apoio muitas vezes silenciosos, sempre renova meu ânimo de voltar para mais uma 
temporada tão longe de vocês. Amo e estimo de mais! 
Aos amigos todos que distante ficaram, na cidade que amo tanto e que faz uma falta 
enorme. Em especial ao Cho, companheiro, paciente e carinhoso sempre! 
 6 
 
RESUMO 
O neuropeptídeo S (NPS) é o ligante endógeno do receptor NPSR acoplado à proteína 
G. Estudos pré-clínicos mostraram que a ativação do receptor NPSR promove aumento 
da vigília, ansiólise, efeito anoréxico, além de hiperlocomoção. Este último efeito é 
robusto e ainda pouco entendido. Evidências apontam para o envolvimento do sistema 
dopaminérgico no efeito estimulatório do NPS. Tendo em vista a modulação exercida 
pelo sistema NPS-receptor NPSR na locomoção espontânea de animais, a expressão do 
receptor NPSR em núcleos dopaminérgicos e a relação intrínseca entre a dopamina e a 
Doença de Parkinson, o presente estudo visou investigar o papel exercido pelo sistema 
do NPS no prejuízo motor de camundongos induzido pela administração 
intracerebroventricular (icv) de 6-OHDA e sistêmica de haloperidol. Para avaliação dos 
prejuízos motores induzidos por 6-OHDA e haloperidol, camundongos Swiss foram 
submetidos aos testes do rota-rod e da catalepsia e o desempenho motor na barra 
giratória do rota-rod e o tempo de imobilidade na plataforma elevada foram 
registrados, respectivamente. O efeito do tratamento dos camundongos com L-Dopa 
(via oral), um antiparkinsoniano clássico, e do NPS (icv) foi avaliado nos dois testes 
comportamentais citados acima. No teste do rota-rod, três dias após a administração 
de 6-OHDA, os animais apresentaram significativo prejuízo motor. A reversão do 
prejuízo motor foi verificada após a administração de L-Dopa (25 mg/kg) ou de NPS 
(0,1 e 1 nmol). A administração de 6-OHDA também elevou o tempo de permanência 
na plataforma elevada (teste da catalepsia), mas este efeito foi muito variável, não 
sendo, portanto, utilizado para investigar a ação do NPS. O prejuízo motor induzido 
pelo haloperidol no teste do rota-rod e catalepsia foi revertido pela administração de 
L-Dopa (100 e 400 mg/kg), mas não pelo NPS (0,1 e 1 nmol) ou pela associação de L-
Dopa 10 mg/kg e NPS 1 nmol. Em conclusão, os danos motores induzidos pela 
administração de 6-OHDA, mas não de haloperidol, foram revertidos pelo tratamento 
central com NPS. Estes dados sugerem que o NPS parece facilitar a liberação de 
dopamina na via nigroestriatal, o que justificaria a melhora do desempenho motor 
induzida pela administração do NPS em animais tratados com 6-OHDA, mas não com 
haloperidol (que causa bloqueio de receptores dopaminérgicos). Por fim, os achados 
aqui apresentados apontam, pela primeira vez, para a possibilidade de agonistas do 
receptor NPSR atuarem como agentes terapêuticos ou adjuvantes no tratamento da 
Doença de Parkinson. 
 
Palavras-chaves: dopamina; doença de Parkinson; camundongos; neuropeptídeo S; 
atividade motora. 
 
 7 
 
ABSTRACT 
Neuropeptide S (NPS) is the endogenous ligand of a G-protein coupled receptor. 
Preclinical studies have shown that NPSR receptor activation can promote arousal, 
anxiolytic-like behavioral, decrease in food intake, besides hyperlocomotion, which is a 
robust but not well understood phenomenon. Previous findings suggest that dopamine 
transmission plays a crucial role in NPS hyperactivity. Considering the close 
relationship between dopamine and Parkinson Disease (PD), and also that NPSR 
receptors are expressed on dopaminergic nuclei in the brain, the current study 
attempted to investigate the effects of NPS in motor deficits induced by 
intracerebroventricular (icv) administration of 6-OHDA and systemic administration of 
haloperidol. Motor deficits induced by 6-OHDA and haloperidol were evaluated on 
Swiss mice in the rota-rod and catalepsy test. Time on the rotating rod and time spent 
immobile in the elevated bar were measured respectively in each test. L-Dopa, a classic 
antiparkinsonian drug, and NPS were administrated in mice submitted to one of the 
animal models of PD related above. 6-OHDA injection evoked severe motor 
impairments in rota-rod test, while the cataleptic behavior of 6-OHDA injected mice 
was largelyvariable. The administration of L-Dopa (25 mg/kg) and NPS (0,1 and 1 
nmol) reversed motor impairments induced by 6-OHDA in the rota-rod. Haloperidol-
induced motor deficits on rota-rod and catalepsy tests which were reversed by L-Dopa 
(100 e 400 mg/kg), but not by NPS (0,1 and 1 nmol) administration. The association of 
L-Dopa 10 mg/kg and NPS 1 nmol was also unable to counteract haloperidol-induced 
motor deficits. To summarize, 6-OHDA-, but not haloperidol-, induced motor deficits 
were reversed by the central administration of NPS. These data suggest that NPS 
possibly facilitates dopamine release in basal ganglia, what would explain the 
overcome of motor performance promoted by NPS administration in animals pre-
treated with 6-OHDA, but not haloperidol. Finally, the presented findings point, for the 
first time, to the potential of NPSR agonist as an innovative treatment for PD. 
 
Key words: dopamine; Parkinson disease; mouse; neuropeptide S; motor activity. 
 8 
 
LISTA DE FIGURAS E TABELAS 
Tabela 1. Média do peso dos animais no dia da cirurgia estereotáxica e no terceiro, 
quarto e quinto dia após a administração de 6-OHDA...................................................65 
Figura 1. Núcleos da Base e suas correlações, vias direta e indireta..............................19 
Figura 2. Núcleos da Base e suas correlações sob condições normais e na DP..............21 
Figura 3. Representação esquemática do neurônio dopaminérgico na SNc e os agentes 
usados para indução de modelos animais de DP...........................................................26 
Figura 4. Estruturas primárias do Neuropeptídeo S de humano, chimpanzé, 
camundongo, rato, cachorro e galinha...........................................................................30 
Figura 5. NPS e o receptor NPSR.....................................................................................31 
Figura 6. Delineamento experimental, etapa I, experimento I.......................................50 
Figura 7. Delineamento experimental, etapa I, experimento II......................................51 
Figura 8. Delineamento experimental, etapa I, experimento III.....................................52 
Figura 9. Delineamento experimental, etapa I, experimento IV....................................53 
Figura 10. Delineamento experimental, etapa II, experimento I....................................56 
Figura 11. Delineamento experimental, etapa II, experimento II...................................57 
Figura 12. Delineamento experimental, etapa II, experimento III..................................59 
Figura 13. Delineamento experimental, etapa II, experimento IV.................................60 
Figura 14. Delineamento experimental, etapa II, experimento IV.................................61 
Figura 15. Efeito da administração de 6-OHDA no tempo de imobilidade de 
camundongos.................................................................................................................65 
Figura 16. Efeito da administração de L-Dopa 25 mg/kg na incoordenação motora de 
camundongos promovida pela administração de 6-OHDA...........................................67 
 9 
 
Figura 17. Área sob a curva do efeito da administração de L-Dopa 25 mg/kg na 
incoordenação motora causada pela administração de 6-OHDA em 
camundongos.................................................................................................................67 
Figura 18. Correlação entre o número de células que expressam a enzima tirosina-
hidroxilase (TH) e a AUC.................................................................................................68 
Figura 19. Número de neurônios corados para a enzima TH na substância negra de 
camundongos tratados com 6-OHDA.............................................................................70 
Figura 20. Efeito da administração de NPS 0,1 nmol na incoordenação motora de 
camundongos promovida pela administração de 6-OHDA............................................71 
Figura 21. Área sob a curva do efeito da administração de NPS 0,1 nmol na 
incoordenação motora causada pela administração de 6-OHDA...................................72 
Figura 22. Efeito da administração de NPS 1 nmol na incoordenação motora de 
camundongos promovida pela administração de 6-OHDA............................................73 
Figura 23. Área sob curva do efeito da administração de NPS 1 nmol na incoordenação 
motora causada pela administração de 6-OHDA...........................................................74 
Figura 24. Porcentagem de desempenho motor dos animais após administração de 6-
OHDA e NPS (0,1 e 1 nmol) e L-Dopa (25 mg/kg)..........................................................75 
Figura 25. Correlação entre a imobilidade no teste da catalepsia causada pela 
administração de 6-OHDA e o desempenho motor no teste do rota-rod dos mesmos 
camundongos................................................................................................................76 
Figura 26. Efeito da administração de L-Dopa 100 mg/kg na acinesia induzida por 
haloperidol em camundongos.......................................................................................77 
Figura 27. Área sob a curva do efeito da administração de L-Dopa 100 mg/kg na 
acinesia induzida por haloperidol..................................................................................77 
Figura 28. Efeito da administração de L-Dopa 400 mg/kg na incoordenação motora de 
camundongos promovida pela administração de haloperidol......................................78 
 10 
 
Figura 29. Área sob a curva do efeito da administração de L-Dopa 400 mg/kg na 
incoordenação motora causada pela administração de haloperidol.............................79 
Figura 30. Efeito da administração de L-Dopa 100 mg/kg na incoordenação motora de 
camundongos promovida pela administração de haloperidol.......................................80 
Figura 31. Área sob a curva do efeito da administração de L-Dopa 100 mg/kg na 
incoordenação motora causada pela administração de haloperidol.............................81 
Figura 32. Efeito da administração de NPS 1, 0,1 nmol ou salina na acinesia induzida 
por haloperidol...............................................................................................................82 
Figura 33. Área sob a curva do efeito da administração de NPS 0,1, 1 nmol (icv) ou 
salina na acinesia induzida por haloperidol....................................................................83 
Figura 34. Efeito da administração de NPS 0,1 nmol na incoordenação motora de 
camundongos promovida pela administração de haloperidol.......................................84 
Figura 35. Área sob a curva do efeito da administração de NPS 0,1 nmol na 
incoordenação motora causada pela administração de haloperidol.............................85 
Figura 36. Efeito da administração de NPS 1 nmol na incoordenação motora de 
camundongos promovida pela administração de haloperidol.......................................86 
Figura 37. Área sob curva do efeito da administração de NPS 1 nmol na incoordenação 
motora causada pela administração de haloperidol......................................................86 
Figura 38. Efeito da administração de L-Dopa 10 mg/kg associado ao NPS 1 nmol na 
incoordenação motora de camundongos promovida pela administração de 
haloperidol.....................................................................................................................88 
Figura 39. Área sob a curva do efeito da administração de L-Dopa 10 mg/kg associado 
ao NPS 1 nmol na incoordenação motora causada pela administração de 
haloperidol.....................................................................................................................88 
 11 
 
Figura 40. Porcentagem de desempenho motor de camundongos após administraçãode haloperidol e NPS (0,1 e 1 nmol) ou L-Dopa (100 e 400 mg/kg) ou L-Dopa 10 mg/kg 
e NPS 1 nmol.................................................................................................................89 
 12 
 
ABREVIAÇÕES 
6-OHDA – 6-hidroxidopamina 
AC – enzima adenilil ciclase 
AMPc – adenosina monofosfato cíclico 
AP – ântero-posterior 
ATP – adenosina tri-fosfato 
AUC – área sob a curva 
CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais 
CRF1 – fator liberador de corticotropina 1 
DAB - 3,3’,4,4’tetrahidrocloreto-diaminobenzidina 
DNA – ácido desoxirribonucleico 
DP – doença de Parkinson 
DV – dorso-ventral 
EPM – erro padrão médio 
ERO(s) – espécie(s) reativa(s) do oxigênio 
GABA – ácido gama-aminobutírico 
Gi – proteína G inibitória 
Gs – proteína G estimulatória 
Gq – proteína G que ativa fosfolipase C 
GPe – globo pálido externo 
Gpi – globo pálido interno 
 13 
 
icv - intracerebroventricular 
ip – intraperitonial 
L-Dopa - L-3,4-dihidroxifenilalanina 
MAO-B – enzima monoamina oxidase-B 
ML – médio-lateral 
MPTP – 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina 
NAcSh - parte shell do núcleo accumbens 
NMDA - receptor N-metil-d-aspartato 
NPS – neuropeptídeo S 
NPSR – receptor do neuropeptídeo S 
REL – retículo endoplasmático liso 
RNAm – ácido ribonucléico mensageiro 
rpm – rotações por minuto 
SNc – substância negra parte compacta 
SNr – substância negra parte reticulada 
STN – núcleo subtalâmico 
TH – enzima tirosina hidroxilase 
VL – ventrículo lateral 
VIP – peptídeo intestinal vasoativo 
vo – via oral 
VTA - área tegmental ventral 
 14 
 
SUMÁRIO 
1. Introdução.......................................................................................................16 
1.1. A Doença de Parkinson...............................................................................16 
1.2. Fisiopatologia da Doença de Parkinson.......................................................18 
1.3. Modelos Animais para a DP.........................................................................23 
1.4. Tratamento Farmacológico da DP...............................................................26 
1.5. O Sistema do Neuropeptídeo S....................................................................29 
1.6. Atividades Biológicas do Neuropeptídeo S..................................................31 
2. Objetivos............................................................................................................35 
2.1. Objetivos gerais...........................................................................................35 
2.2. Objetivos específicos...................................................................................35 
3. Metodologia.......................................................................................................37 
3.1. Animais........................................................................................................37 
3.2. Drogas e tratamentos..................................................................................37 
3.3. Cirurgia para implantação da cânula icv......................................................39 
3.4. Injeções icv................................................................................,.................40 
3.5. Análise comportamental.............................................................................41 
3.6. Análise morfológica do tecido cerebral.......................................................46 
3.7. Quantificação dos neurônios da SNc corados para TH................................47 
3.8. Delineamento experimental........................................................................49 
3.9. Análise estatística........................................................................................62 
4. Resultados Experimentais...................................................................................64 
4.1. Etapa I, experimentos I, II, III e IV................................................................64 
4.2 .Etapa II, experimentos I, II, III e IV...............................................................76 
 15 
 
5. Discussão..........................................................................................................90 
6. Conclusão.........................................................................................................110 
7. Referências.......................................................................................................112 
 
 16 
 
1. INTRODUÇÃO 
1.1. A Doença de Parkinson 
A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa progressiva, 
caracaterizada por perda de neurônios da substância negra e a presença de inclusões 
de proteínas citoplasmáticas chamadas de Corpos de Lewy (Hughes e cols., 1992). A DP 
é a segunda doença neurodegenerativa mais frequente, precedida apenas pela doença 
de Alzheimer (Nutt e Wooten, 2005); tem início normalmente entre a quinta ou sexta 
década de vida. Estudos recentes mostram aumento da incidência de casos com o 
avanço da idade, a taxa de incidência na população mundial fica entre 0,09 a 0,13 por 
1000 habitantes (WHO, 2006). Como a DP é uma doença crônica prolongada, a taxa de 
prevalência é muito maior que a incidência. Segundo projeções da Organização 
Mundial de Saúde, existe a perspectiva de que a DP afete quase 6 milhões de pessoas 
no mundo em 2015, numa prevalência estimada da população mundial de 0,84 casos 
para cada 1000 habitantes (WHO, 2006). Segundo a mesma organização, a DP acomete 
1,5 vezes mais homens do que mulheres. 
Na DP, a principal manifestação clínica é a síndrome parkinsoniana, referente 
ao comprometimento motor que se estabelece progressivamente. Os distúrbios 
mentais, demência e depressão e os distúrbios autonômicos, como constipação 
intestinal, seborréia e tendência à hipotensão, também frequentes na DP, são 
decorrentes da neurodegeneração de estruturas cerebrais fora do circuito motor 
(Barbosa e Sallem, 2005). 
O diagnóstico de parkinsonismo é baseado na presença de uma síndrome 
rígido-bradicinética, caracterizada pela dificuldade de iniciação de movimentos 
 17 
 
volutários e progressiva redução da velocidade e amplitude dos movimentos (Hughes e 
cols., 1992). Para diagnóstico de DP, é necessário que haja também rigidez muscular, 
tremor de repouso e instabilidade postural, além de bradicinesia e acinesia (Hughes e 
cols.1992). A rigidez muscular encontrada no paciente parkinsoniano refere-se à 
resistência ao movimento passivo, essa pode ser contínua ou intermitente (Barbosa e 
Sallem, 2005, Dauer e Przedborski, 2003). Já o tremor acontece no repouso e diminui 
no movimento voluntário, assim, tipicamente não atrapalha a vida diária (Nutt e 
Wooten, 2005, Hughes e cols., 1992). A bradicinesia representa uma diminuição da 
velocidade do movimento, fraqueza e descoordenação do membro, enquanto a 
acinesia caracteriza-se pela inabilidade de iniciar movimentos voluntários; manifesta-
se mais frequentemente durante a marcha, que pode surgir quando o paciente se 
depara com um obstáculo real ou uma tensão emocional (Nutt e Wooten, 2005, 
Barbosa e Sallem, 2005, Dauer e Przedborski, 2003). 
A postura na síndrome parkinsoniana é inclinada para frente e para baixo, 
encurvada na parte superior do corpo (ântero-flexão), com semi-flexão dos membros. 
Os reflexos de readaptação postural são perdidos, levando a uma instabilidade que 
frequentemente resulta em quedas (Barbosa e Sallem, 2005, Dauer e Przedborski, 
2003). Em decorrência destes fatores, o ato de caminhar torna-se também 
característico, denominada marcha parkinsoniana (Okamoto, 2008, Barbosa e Sallem, 
2005). Há redução do comprimento dos passos, com pés arrastados, e diminuição ou 
ausência da movimentação associada aos membros superiores (Okamoto, 2008, Nutt e 
Wooten, 2005). 
 
 18 
 
1.2. Fisiopatologia da Doença de Parkinson 
Os principaiscomponentes do sistema motor responsáveis pelos movimentos 
voluntários são os núcleos da base; esses são constituídos por quatro núcleos 
subcorticais: estriado, globo pálido (subdividido em segmento interno e externo), 
substância negra (subdividida em parte reticulada e parte compacta) e os núcleos 
subtalâmicos (Kandel e cols., 2000). Em conjunto, estes núcleos recebem seu principal 
estímulo vindo do córtex; enviam uma resposta para o tronco cerebral, e, via tálamo, 
de volta para o córtex prefrontal, pré-motor e motor (Kandel e cols., 2000). Dessa 
maneira, os núcleos da base são as áreas cerebrais mais importantes na mediação dos 
impulsos entre o tronco cerebral, medula e córtex motor (Kandel e cols.000). 
Os dois núcleos principais de saída dos núcleos da base, o globo pálido 
(segmento interno) e a substância negra parte reticulada, inibem tonicamente o 
tálamo e o tronco cerebral. A inibição da saída é modulada por duas vias paralelas, a 
via indireta e a via direta (Kandel e cols., 2000; Figura 1). 
 19 
 
 
Figura 1. Núcleos da base e suas correlações, mostrando as vias direta e indireta. Setas cinza 
claro indicam conexões excitatórias e setas cinza escuro indicam conexões inibitórias. Gpe = 
globo pálido externo, Gpi = globo pálido interno, SNc = substância negra parte campacta; STN 
= núcleo subtalâmico (adaptado de Kandel e cols., 2000). 
 
A via indireta passa primeiro pelo segmento externo do globo pálido e de lá 
para os núcleos subtalâmicos com conexões exclusivamente GABAérgicas. O núcleo 
subtalâmico, por sua vez, conecta-se com o globo pálido interno na única ligação 
excitatória que acontece entre os núcleos da base, liberando glutamato, que faz com 
 20 
 
que o estímulo para o tálamo seja fortemente inibitório. O resultado da ativação da via 
indireta é a inibição transitória do tálamo e, consequentemente, do córtex, causando, 
portanto maior dificuldade no movimento (Kandel e cols., 2000). 
A via direta tem projeções imediatas GABAérgica para o segmento interno do 
globo pálido, inibindo os impulsos para o tálamo. A ativação da via direta promove a 
diminuição do estímulo tônico inibitório sobre o tálamo, permitindo que esse e, 
posteriormente, o córtex sejam ativados, gerando, portanto, facilitação do movimento 
(Kandel e cols., 2000). 
A via indireta possui receptores dopaminérgicos do tipo D2, cujos receptores 
são acoplados à proteína Gi, enquanto que a via direta possui receptores 
dopaminérgicos D1, que são receptores acoplados à proteína Gs (Ferro e cols., 2005, 
Kandel e cols., 2000). A dopamina proveniente dos neurônios dopaminérgicos da 
substância negra parte compacta é moduladora dos circuitos dos núcleos da base, pois 
promove ativação da via direta e inibição da via indireta (Ferro e cols., 2005). 
Na DP, ocorre perda gradual de neurônios dopaminérgicos nigroestriatais, além 
disso, são encontrados nos corpos celulares desses neurônios dopaminérgicos 
inclusões de proteínas citoplasmáticas chamadas Corpos de Lewy; essas alterações na 
via nigroestriatal são consideradas as marcas fisiopatológicas da DP (Dauer e 
Przedborski, 2003, Hughes e cols., 1992, Gibb e Lees, 1988). Na ausência da modulação 
dopaminérgica, devido à morte dos neurônios nigroestriatais, o estímulo tônico sobre 
o tálamo permanece, causando prejuízo na realização de movimentos voluntários 
(Ferro e cols., 2005; Figura 2). 
 21 
 
 
Figura 2. Núcleos da base e suas correlações sob condições normais e na DP. Setas cinza claro 
indicam conexões excitatórias e setas cinza escuro indicam conexões inibitórias. A 
degeneração da via dopaminérgica nigroestriatal na DP leva à alteração na atividade estriatal, 
evidenciada na figura da direita por setas opacas e pretas. Gpe = globo pálido externo, Gpi = 
globo pálido interno, SNc = substância negra parte campacta, STN = núcleo subtalâmico 
(adaptado de Kandel e cols., 2000). 
 
Hughes e colaboradores (1992) confirmaram haver uma correlação entre a 
morte de células nigroestriatais e a severiadade da DP. O início dos sintomas motores 
ocorre quando há perda de aproximadamente 60% dos neurônios dopaminérgicos da 
substância negra, o que leva a supor que a morte destes neurônios se inicia muito 
antes do aparecimento dos sintomas motores (Dauer e Przedborski, 2003, Hughes e 
cols. 1992, Gibb e Lees, 1988). As causas para a neurodegeneração na DP são várias e 
ainda incertas, duas teorias são aceitas: a primeira postula que a agregação de 
proteínas α–sinucleína intracitoplasmáticas é tóxica para os neurônios e causa a sua 
 22 
 
morte celular; a segunda propõe que o dano neuronal pode ser causado pela disfunção 
mitocondrial, que gera estresse oxidativo e consequentemente causa apoptose 
neuronal (Dauer e Przedborski, 2003; Spillantini, 1997). 
Os corpos de Lewy nas células nigroestriatais são agregações de proteínas 
normalmente eosinofílicas, intracitoplasmáticas com diâmetro entre 5 e 25 µm (Gibb e 
Lees, 1988). São formados por neurofilamentos, principalmente α–sinucleína, com 
diâmetro de 7 a 15 nm que se arranjam radialmente ou aleatóriamente; a coloração 
revela um centro escuro (núcleo) e anéis (lâminas) ao redor (Singleton e cols., 2003, 
Spillantini, 1997, Gibb e Lees, 1988). As partes mais escuras são devido à maior 
densidade de filamentos e decomposição da sua estrutura por causa do 
empacotamento; externamente, há menos filamentos e algumas organelas que não 
são marcadas (Gibb e Lees, 1988). A toxicidade das inclusões citoplasmáticas pode ser 
proveniente da deformação que causam à célula, atrapalhando o tráfico de organelas, 
por exemplo, ou do sequestro de proteínas essenciais para a sobrevivência da célula 
(Dauer e Przedborski, 2003). Vários estudos relacionam mutações genéticas com a 
tendência à DP, como foi determinado recentemente por Singleton e colaboradores 
(2003) que a mutação no gene da α–sinucleína triplica o locus de expressão dessa 
proteína, causando maior risco a DP, provavelmente de forma quantitativa e não 
qualitativa. Todos os organismos aeróbicos são suscetíveis ao estresse oxidativo 
simplesmente porque espécies reativas de oxigênio (ERO), superóxido e peróxido de 
hidrogênio, são produzidos pela mitocôndria durante a respiração, uma quantidade 
aproximada a 2% do oxigênio total consumido forma EROs (Floyd, 1999). O cérebro é 
especialmente sensível ao dano oxidativo por demandar 20% do oxigênio total do 
 23 
 
corpo (Floyd, 1999). Uma vez formadas, as EROs reagem com proteínas, membrana 
lipídica, DNA entre outros, e causam danos celulares severos (Floyd e Hensley, 2002). 
Os neurônios dopaminérgicos podem ser especialmente suscetíveis à formação de 
ERO, já que os subprodutos da metabolização da dopamina também são peróxido de 
hidrogênio e radicais superóxidos (Tansey e cols., 2007, Spina e Cohen, 1989). 
 
1.3. Modelos animais para a DP 
Muitas perguntas já foram respondidas desde que James Parkinson descreveu 
pela primeira vez a síndrome por ele denominada de shaking palsy (livre tradução: 
paralisia agitante), em seu livro entitulado “Essay on the Shaking Palsy” de 1817. 
Porém, as perguntas nunca cessam: Por que há certa seletividade por neurônios 
dopaminérgicos? Qual o papel do envelhecimento na DP, tanto esporádica quanto 
herdada? Será que a manipulação farmacológica ou genética pode prevenir a 
neurodegeneração? Tais perguntas podem ser respondidas em certa medida pela 
análise de tecido pós-mortem ou experimentos in vitro, mas o uso de animais 
experimentais que mimetizam aspectos da doença é uma ferramenta muito mais 
consistente para o entendimento das bases neurobiológicas da DP (Dauer e 
Przedborski, 2003). 
De maneira geral, os modelos animais possibilitam o acesso aos processos 
patológicos que causam perda neuronal e o uso de técnicas invasivas que não podem 
ser utilizadas em humanos (Geyer e Markou, 2002, Betarbet e cols., 2002, Duty e 
Jenner, 2011). Os modelos animais possibilitamtambém o estudo de novas terapias 
 24 
 
farmacológicas ou novas estratégias para o tratamento da DP (Betarbet e cols., 2002, 
Duty e Jenner, 2011), além de permitirem reduzir significativamente o custo da 
pesquisa, antes do início dos testes clínicos, que são caros e consomem muito tempo 
(Geyer e Markou, 2002). 
O modelo de roedor tratado com reserpina foi um dos primeiros modelos 
farmacológicos empregados para estudo da Doença de Parkinson. A administração 
sistêmica de reserpina produz acinesia e rigidez nos membros posteriores (Duty e 
Jenner, 2011). A reserpina age bloqueando o transportador vesicular de monoaminas, 
o que acarreta em incapacidade de envesicular os neurotransmissores dopamina, 
serotonina e noradrenalina, consequentemente, gerando diminuição na 
disponibilidade desses neurotransmissores no sistema nervoso central e periférico 
(Duty e Jenner, 2011). 
Outro modelo farmacológico de indução dos sinais de Parkinson, muito 
utilizado em roedores, é a administração de haloperidol. O haloperidol é um 
antagonista dopaminérgico de receptores D2, e em menor grau D1, que atua 
bloqueando a transmissão dopaminérgica para o estriado nas vias direta e indireta 
(Craig e Stitzel, 2008). A administração de haloperidol em humanos produz um 
fenômeno que se manifesta comportamentalmente por rigidez muscular e catalepsia; 
a rigidez é uma característica clínica bem estabelecida da síndrome parkinsoniana, a 
catalepsia é entendida como inabilidade em iniciar movimentos voluntários (também 
denominada de acinesia) (Duty e Jenner, 2011). 
Algumas toxinas usadas para mimetizar os sinais da DP em roedores promovem 
degeneração de neurônios dopaminérgicos, fato este que se assemelha ao que ocorre 
 25 
 
em humanos parkinsonianos. A 6-hidroxidopamina (6-OHDA) é levada para dentro da 
célula neuronal pelo transportador de dopamina, o mecanismo pelo qual a substância 
exerce toxicidade ainda não é bem conhecido, mas sabe-se que o início da 
degeneração ocorre por uma combinação de estresse oxidativo e disfunção 
mitocondrial (Betarbet e cols., 2002). Rapidamente oxidada, forma EROs que reduzem 
os níveis de enzimas antioxidantes no espaço intracelular, ainda interage diretamente 
com a cadeia de respiração mitocondrial, causando mais estresse oxidativo (Duty e 
Jenner, 2011). 
O 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) é uma toxina comumente 
usada para induzir DP em roedores e primatas, baseada na sua capacidade de induzir 
parkinsonismo em humanos. Os efeitos comportamentais promovidos pela exposição 
ao MPTP são acinesia, rigidez, catalepsia e postura anormal (Lane e Dunnett, 2008). 
Por ser altamente lipofílico, o MPTP atravessa a barreira hemato-encefálica com 
facilidade após administração sistêmica (intraperitoneal ou subcutânea) e, uma vez no 
tecido cerebral, promove formação de EROs além de bloquear o fluxo de elétrons da 
cadeia respiratória mitocondrial no complexo I. Esta combinação (estresse oxidativo 
com menor formação de ATP) é responsável pela ativação da sinalização apoptótica 
interna (Shober, 2004, Duty e Jenner, 2011). A grande desvantagem desse modelo é o 
risco que o manuseamento de MPTP oferece para os humanos (Duty e Jenner, 2011). 
Outra toxina também utilizada para mimetizar em roedores os sinais da DP é a 
rotenona, também utilizada como inseticida (Dauer e Przedborski, 2003, Betarbet e 
cols., 2002). A rotenona é bastante lipofílica, e ao atingir a corrente sanguínea 
rapidamente ganha acesso a todos os órgãos, onde produz toxicidade sistêmica, 
 26 
 
principalmente cardiovascular, e assim alta taxa de mortalidade; sua toxicidade parece 
envolver o bloqueio de enzimas da cadeia de respiração mitocondrial, especialmente a 
do complexo I (Dauer e Przedborski, 2003, Betarbet e cols, 2002). Os animais 
intoxicados com esse composto desenvolvem hipocinesia, postura inclinada e severa 
rigidez, alguns apresentam tremores nas patas (Betarbet e cols., 2002; Figura 3). 
 
Figura 3. Representação esquemática de um neurônio dopaminérgico da substância negra 
parte compacta mostrando os diversos agentes usados para indução de modelos animais de 
DP. * Indica aqueles que necessitam injeção direta intracerebral (adaptada de Duty e Jenner, 
2011). 
 
1.4. Tratamento farmacológico da DP 
A DP é uma das poucas doenças neurodegenerativas que há décadas possui 
tratamento farmacológico com alto grau de eficácia (Klivenyi e Vecsei, 2010). Logo nos 
anos 60, foi demonstrado o metabolismo catecolaminérgico anormal na DP (Barbeau, 
1969). Posteriormente, a baixa quantidade de dopamina encontrada nos núcleos da 
base e na urina de pacientes com DP deu suporte a ideia do uso da L-3,4-
 27 
 
dihidroxifenilalanina (L-Dopa), um precursor da dopamina, no tratamento desta 
doença (Barbeau, 1969). Apesar do sucesso na reversão dos sintomas do Parkinson 
promovidos pela L-Dopa, o uso prolongado deste fármaco resulta em complicações 
motoras severas, promovida pela perda da eficácia terapêutica, seguida por discinesias 
e também por um fenômeno conhecido como liga-desliga, no qual há expressão de 
tremores e bradicinesia, mesmo sob o tratamento com a L-Dopa (Alachkar e cols., 
2010; Barbeau, 1969). A discinesia é a manifestação de movimentos involuntários 
anormais e surpreendentemente ocorre em mais de 50% dos casos, caracterizado por 
protrusões da língua ou rotações, mastigação repetitiva e, posteriormente, pode vir 
acompanhado de movimentos involuntários nos membros superiores e mais 
raramente nos membros inferiores, tornando quase impossível a vida normal 
(Barbeau, 1969). Além destes, outros efeitos colaterais relatados pelos pacientes em 
tratamento crônico com L-Dopa são: náusea e vômitos, que geralmente aparecem pela 
manhã em quase todos os pacientes, hipotensão arterial, halucinações e psicose 
(Barbeau, 1969). 
Tendo em vista o exposto acima, agonistas dopaminérgicos são 
frequentemente utilizados como primeira abordagem na terapia da DP por 
apresentarem menos tendência a causar discinesia, além de retardarem o início do uso 
da L-Dopa ou são usados como adjuvantes do tratamento com L-Dopa, reduzindo a 
dose diária desta (Craig e Stitzel, 2005, Nutt e Wooten, 2001). Também apresentam 
efeitos colaterais aos pacientes tais como náusea, sonolência, fadiga, hipotensão 
postural, entre outros. Recomenda-se um aumento gradual da dose na medida do 
desenvolvimento de tolerância aos efeitos adversos (Craig e Stitzel, 2005). Outra 
 28 
 
terapia já utilizada na clínica envolve inibidores da enzima responsável pela 
degradação da dopamina da fenda sináptica, a monoamina oxidase B (MAO-B). A 
selegilina é o principal fármaco com este mecanismo, mas em doses altas age em 
múltiplos sistemas, inclusive inibindo liberação gutamatérgica (Fox e cols., 2008, Craig 
e Stitzel, 2005). 
Ainda em estudos clínicos, há uma variedade de antagonistas de receptores 
adenosinérgicos A2A; de fato, existem receptores A2A pós-sinápticos (acoplados à 
proteína Gs) nos corpos celulares e terminações de neurônios GABAérgicos da via 
indireta nigroestriatal. A ativação do receptor A2A promove a liberação de GABA na via 
indireta, o que contribui para a hiperatividade dessa via, observada na DP (Fox e cols., 
2008). Outros fármacos, como os inibidores da liberação de glutamato, antagonistas 
de receptores NMDA e inibidores da recaptação de noradrenalina e dopamina também 
estão em estudos clínicos (Fox e cols., 2008). 
Os sistemas neuropeptidérgicos também podem ser considerados alvos 
farmacológicos inovadores para o tratamento da DP. Estudos in vitro e in vivo 
mostraram capacidade neuroprotetora do peptídeo intestinal vasoativo (VIP) em 
neurônios dopaminérgicos e fibras do trato nigroestriatal; provavelmente por meio do 
bloqueio de mediadores pró-inflamatórios (Delgado e Ganea, 2003). Outra família de 
peptídeos envolvida na síndrome parkinsoniana é a dos opióides. Constatou-seaumento da transmissão de peptídeos opióides em modelos animais de DP, bem como 
em pacientes que apresentam discinesias (Delgado e Ganea, 2003). Contudo, o uso de 
antagonistas de receptores opióides não-seletivos tiveram resultados contraditórios 
 29 
 
nas espécies de primatas não-humanos e inconclusivos em humanos (Delgado e 
Ganea, 2003). 
Com base no que foi discutido acima, fica clara a importância e necessidade da 
mudança de foco no desenvolvimento de tratamentos farmacológicos para a DP que 
envolvam mecanismos complementares à L-Dopa ou alternativos. Novos fármacos que 
possam aliviar os sintomas debilitantes da DP complementando o tratamento 
dopaminérgico e/ou permitindo o uso de doses ótimas e prolongadas de L-Dopa, sem 
o desenvolvimento das flutuações motoras, são bem-vindos na clínica, uma vez que 
podem retardar o aparecimento dos efeitos colaterais promovidos pelo uso 
prolongado de L-Dopa (Fox et cols., 2008). 
 
1.5. O sistema do Neuropeptídeo S 
Vários neuropeptídeos têm sido descobertos nos últimos anos por meio da 
deorfanização de receptores de proteínas G (também chamadas de receptores de 
proteínas G órfãos), o que tem ampliado a compreensão de funções particulares do 
cérebro e auxiliado na revelação de novos alvos terapêuticos para disfunções mentais 
(Civelli e cols., 2001). Xu e colaboradores (2004) descreveram pela primeira vez as 
funções fisiológicas do Neuropeptídeo S (NPS), ligante endógeno de um receptor 
acoplado à proteína G denominado de NPSR. O NPS leva esse nome devido à presença 
de um aminoácido serina (S) na porção amino-terminal da estrutura primária desse 
peptídeo, que se encontra preservada em várias espécies animais, como mostra a 
Figura 4. 
 30 
 
 
 
Figura 4. Estruturas primárias do Neuropeptídeo S de humano, chimpanzé, camundongo, rato, 
cachorro e galinha. Aminoácidos divergentes da sequência humana são mostrados em negrito. 
O aminoácido serina (S) na porção N-terminal está conservado em todas as espécies que 
expressam o peptídeo (adaptada de Xu e cols., 2004). 
 
Em termos moleculares, a ativação do receptor NPSR causa mobilização de 
cálcio intracelular, aumento dos níveis intracelulares de AMPc e aumento na 
concentração intracelular de proteínas quinases fosforiladas (Figura 5; Xu e cols., 2004; 
Reinscheid e cols., 2005), sugerindo que o NPSR pode sinalizar via proteína Gq e Gs, 
causando excitabilidade celular. 
A expressão do RNAm do precursor do NPS no cérebro exibe uma distribuição 
muito limitada. A maioria dos neurônios que expressam o NPS foi encontrada nas 
seguintes regiões do tronco cerebral: núcleo sensorial trigeminal, núcleo parabraquial 
lateral e locus coeruleus (Xu e cols., 2007). Em oposição ao precursor do NPS, o 
receptor NPSR é amplamente distribuído no cérebro. Altos níveis de expressão do 
RNAm do NPSR foram encontrados no córtex, núcleo olfatório, tálamo, hipotálamo, 
amígdala e subiculum (Xu e cols., 2004, 2007). É interessante notar que o receptor 
NPSR encontra-se expresso moderadamente na substância negra e na área tegmental 
ventral, o que sugere um papel modulatório desempenhado por este sistema sobre a 
neurotransmissão dopaminérgica (Xu e cols., 2007). O perfil da expressão do receptor 
NPSR sugere o envolvimento do sistema NPS-NPSR na regulação de múltiplas funções 
 31 
 
centrais, a citar: locomoção, sono e vigília, ingestão de alimentos, ansiedade, entre 
outros (Guerrini e cols., 2009a). 
 
Figura 5. NPS e o receptor NPSR. A ligação do NPS ao seu receptor NPSR desencadeia a síntese 
de AMPc intracelular via proteína G (G) por ativação da adenilil ciclase (AC). Além disso, a 
interação entre o NPS e o NPSR leva a um aumento significante da concentração de cálcio 
(Ca2+), devido à ativação de canais de Ca2+ da membrana plasmática e/ou do retículo 
endoplasmático liso (REL) (adaptada de Pape e cols., 2009). 
 
1.6. Atividades biológicas do Neuropeptídeo S 
Estudos demonstraram que a ativação do sistema NPS-receptor NPSR promove 
diminuição de todos os estágios do sono e aumento da vigília, ansiólise e diminuição 
da ingestão de alimentos, atuando como agente anorexigênico, e pode ainda interferir 
no sistema de recompensa, induzindo procura por reforço positivo (Xu e cols., 2004; 
Smith e cols., 2006; Pañeda e cols., 2009). 
Xu e colaboradores (2004) demonstraram, pela primeira vez, que a 
administração supraespinhal de NPS 0,1 nmol causou hiperlocomoção em 
camundongos habituados e não habituados ao ambiente. A duração do efeito 
hiperlocomotor produzido pela administração icv de NPS foi de aproximandamente 
 32 
 
uma hora. Estes resultados foram posteriormente confirmados por vários grupos de 
pesquisa, tanto em camundongos (Roth e cols., 2006; Leonard e cols., 2008; Rizzi e 
cols., 2008; Okamura e cols., 2008; Castro e cols., 2009; Paneda e cols., 2009) quanto 
em ratos (Smith e cols., 2006), mostrando que o efeito estimulatório da atividade 
locomotora é robusto e consistente, apesar das diferentes condições experimentais e 
das espécies animais empregadas. 
O envolvimento do receptor NPSR na atividade locomotora foi demonstrado 
com o uso de dois antagonistas quimicamente não relacionados, o composto não-
peptídico SHA 6824 (Okamura e cols., 2008) e o peptídico [D-Val5]NPS (Guerrini e cols., 
2009b) e também através do uso em estudos comportamentais de camundongos que 
não expressam o receptor NPSR (knockout). Ambos os antagonistas foram eficazes em 
antagonizar o efeito estimulatório do NPS na locomoção, mas não produziram efeito 
per se na atividade locomotora. Estes achados demonstram que a ação do peptídeo 
ocorre devido à ativação do NPSR e sugerem que o sistema endógeno não exerce um 
controle tônico no comportamento motor do animal. 
Os camundongos knockout para o receptor NPSR foram submetidos a uma 
bateria de testes comportamentais em uma série de estudos e as diferenças 
fenotípicas entre estes e camundongos normais foram observadas. Os estudos 
mostraram que no teste do campo aberto os animais knockout para o receptor NPSR 
não apresentaram locomoção aumentada após adminsitração de NPS. Fendt e 
colaboradores (2010), acharam ainda que o comportamento de hiperatividade não 
desaparecia quando sob administração de cocaína. A conclusão sugerida é que o 
comportamento de ativação locomotora induzida pelo NPS é exclusivamente 
 33 
 
dependente do receptor NPSR, porém os animais ainda são capazes de expressar 
comportamentos hiperlocomotivos como observado após a administração de cocaína. 
Com o objetivo de testar se a presença do receptor NPSR influencia a atividade 
motora espontânea dos animais e motivação de exploração, Duangdao e 
colaboradores (2009) e Fendt e colaboradores (2010) mediram a distância percorrida 
por camundongos que não expressam o receptor NPSR. Estes estudos demonstraram 
que os camundongos knockout para o receptor NPSR apresentaram redução na 
distância percorrida em um ambiente novo quando comparados aos animais 
selvagens, sugerindo que a sinalização do receptor NPSR modularia tonicamente a 
locomoção espontânea dos animais, ao contrário do sugerido por Okamura e Guerrini 
e colaboradores (2008 e 2009b, respectivamente) no teste com antagonistas do 
receptor NPSR, que não apresentaram atividade per se. Já Ruzza e colaboradores 
(2012) não observaram diferença na distância percorrida por camundongos que não 
expressam o receptor NPSR comparados aos animais selvagens. Porém, a linhagem de 
camundongo knockout utilizada por este último grupo é diferente dos estudos 
anteriores e foi obtida por meio de sucessivos cruzamentos com a linhagem CD-1, e 
assim se aproxima comportamentalmente com a linhagem de camundongos utilizada 
nos experimentos para teste dos antagonistas do receptor NPSR (Ruzza e cols., 2012, 
Okamura e cols., 2008, Guerrini e cols., 2009b). A vantagem disso é justamente 
eliminar traços do comportamento da linhagem dos trabalhos supracitadosque 
podem interferir negativamente nos achados, tais como baixa atividade locomotora e 
perfil ansiogênico. A conclusão sugerida por Ruzza e colaboradores (2012) para 
 34 
 
camundongos knockout é que o sistema NPS - receptor NPSR não participa 
tonicamente do controle da locomoção espontânea dos animais. 
Em relação aos mecanismos pelos quais o NPS promove hiperlocomoção, 
alguns estudos in vivo sugerem a participação dos sistemas adenosinérgico, 
dopaminérgico, e também do sistema peptidérgico do CRF na mediação do efeito 
hiperlocomotor do NPS em roedores. De fato, considerando que o receptor NPSR 
encontra-se distribuído em várias áreas cerebrais, incluindo a área tegmental ventral 
(Xu e cols., 2007), Mochizuki e colaboradores (2010) propuseram que a atividade 
hiperlocomotora induzida por NPS pode ser mediada pela ativação da via 
dopaminérgica mesolímbica, através da ativação do NPSR expresso na área tegmental 
ventral. A injeção intra-área tegmental ventral de NPS causou aumento da atividade 
locomotora em ratos, que foi significativamente inibida pela pré-administração de 
sulpiride, um antagonista do receptor D2, no núcleo accumbens. Por meio de 
microdiálise, foi possível constatar o aumento significativo de metabólitos de 
dopamina no núcleo accumbens de ratos tratados com NPS na área tegmental ventral. 
Estes resultados suportam a hipótese de que o NPS ativa o sistema mesolímbico 
dopaminérgico, presumivelmente através da ativação do receptor NPSR localizado na 
VTA, estimulando a atividade locomotora dos animais (Mochizuki e cols., 2010). 
Tendo em vista o papel exercido pelo sistema do NPS na modulação da 
locomoção espontânea de animais, a expressão do receptor NPSR em núcleos 
dopaminérgicos, bem como a ação moduladora do sistema do NPS sobre o 
dopaminérgico, intrinsecamente relacionado à DP, o presente estudo visou a investigar 
o papel exercido pelo sistema do NPS no prejuízo motor de camundongos induzido por 
 35 
 
6-OHDA e haloperidol. A presente investigação torna-se bastante atrativa por 
apresentar possibilidades de ligantes do receptor NPSR atuarem como agentes 
terapêuticos ou adjuvantes no tratamento da Doença de Parkinson, intensificada ainda 
pelas vastas limitações que o tratamento prolongado com L-dopa apresenta. 
 36 
 
2. OBJETIVOS 
2.1 Geral 
O presente estudo investigou os efeitos da administração 
intracerebroventricular de neuropeptídeo S na coordenação motora e catalepsia de 
camundongos submetidos a modelos animais de Parkinson. 
2.2 Específicos 
1) Validar os danos motores causados pela injeção 
intracerebreoventricular de 6-OHDA, uma neurotoxina dopaminérgica, em 
camundongos e avaliar os efeitos do tratamento agudo com L-Dopa na reversão das 
alterações comportamentais causadas pela 6-OHDA; 
2) Avaliar os efeitos do tratamento com NPS no prejuízo motor causado da 
administração intracerebroventricular de 6-OHDA em camundongos. 
3) Quantificar o número de células que expressam a enzima TH na 
substância negra de animais tratados com 6-OHDA por meio da técnica da 
imunoistoquímica. 
4) Validar o prejuízo motor causado pelo tratamento com haloperidol em 
camundongos e avaliar o efeito do tratamento agudo com L-Dopa na reversão das 
alterações comportamentais causadas pelo haloperidol; 
5) Investigar os efeitos do tratamento intracerebroventricular com NPS no 
prejuízo motor causado pela administração de haloperidol. 
 37 
 
3. METODOLOGIA 
3.1. Animais 
Foram empregados camundongos Swiss fêmeas (28-35 g) provenientes do 
biotério do Departamento de Biofísica e Farmacologia da Universidade Federal do Rio 
Grande do Norte. Os animais foram alojados em caixas de polipropileno de dimensões 
(40 x 34 x 17 cm) contendo, no máximo, vinte por caixa. As caixas foram mantidas em 
um biotério setorial do departamento de Biofísica e Farmacologia, organizadas em 
estantes juntamente com outros animais da mesma linhagem. O controle do ciclo 
claro-escuro foi feito para 12 h, com luzes ligadas às 6 h, e temperatura de 24°C ± 2oC. 
Os animais receberam livre acesso a comida e água. Os experimentos foram 
conduzidos pela manhã, entre 8 h e 12 h, numa sala com isolamento acústico e em 
condições de temperatura e iluminação controladas. 
Os animais foram mantidos e manipulados conforme a Lei n° 11.714/2008 que 
regulamenta a experimentação animal no Brasil. O presente estudo foi aprovado para 
execução segundo o parecer emitido pelo comitê de ética no uso de animais (CEUA) da 
UFRN (sob o protocolo N°001/2009 e 020/2011). Para a realização deste estudo serão 
empregados 9 a 12 animais por grupo. 
 
3.2. Drogas e tratamentos 
Foram utilizadas as seguintes drogas e soluções: 
 38 
 
Haloperidol®, CRISTÁLIA Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda., dissolvido em 
salina. O haloperidol foi administrado por via intraperitoneal (ip) na dose de 1 mg/kg, 
de acordo com a literatura (Mabrouk e cols., 2010). 
Benserazida, Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO, EUA), dissolvida em 
solução salina (0,9%). Administrada ip na dose referente a ¼ da dose de L-Dopa 
utilizada no experimento. 
L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-Dopa), Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO, 
EUA), dissolvida em carboximetilcelulose 0,5%. A L-Dopa foi administrada por via oral 
(vo), nas doses de 10, 25, 100 e 400 mg/kg (Marti e cols., 2007, Kobayashi e cols., 
1997). 
6-hidroxidopamina (6-OHDA), Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO, EUA). 
dissolvido em ácido ascórbico 0,01%. A 6-OHDA foi administrada por via 
intracerebroventricular (icv) na dose de 50 µg/camundongo, como previamente 
descrito por Matsuura e colaboradores (1997). 
Ácido ascórbico, Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO, EUA), utilizado 
como agente antioxidante na solução de 6-OHDA, dissolvido em salina. 
Nortriptilina, Pamelor®, NOVARTIS Biociências S.A., 30 mg/kg, dissolvido em 
solução salina (0,9%), de acordo com o estudo de Rodriguez-Diaz e colaboradores 
(2001). 
Neuropeptídeo S (NPS), SFRNGVGTGMKKTSFQRAKS, sintetizado pelo Dr. R. 
Gerrini, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Università di Ferrara (Ferrara, Itália), 
 39 
 
dissolvido em solução salina (0,9%). Administrado por via icv nas doses de 0,1 e 1 nmol 
(Xu e cols., 2004). 
Carboxilmetilcelulose (CMC), Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO, EUA), 
utilizado como solvente para a L-DOPA, dissolvido em solução salina (0,9%). 
Solução de cloreto de sódio 0,9%, solução salina. 
O haloperidol, a benserazida e a nortriptilina foram administrados ip no volume 
de 10 ml/kg. A L-Dopa foi administrada vo, através de uma sonda orogástrica, na 
mesma proporção de volume/peso do haloperidol. Já o NPS e a 6-OHDA foram 
injetados icv em um volume de 2 µl. 
Com o objetivo de inibir a conversão periférica da L-Dopa em dopamina, 
previamente a todas as administrações desta, foi administrado benserazida ip na dose 
de um quarto da dose de L-Dopa utilizada no experimento. 
 
3.3. Cirurgia para a implantação da cânula intracerebroventricular 
Os animais foram anestesiados com uma combinação de ketamina 100 mg/kg e 
xilazina 10 mg/kg, ambos por via ip. Após verificada a imobilidade e perda de sentidos 
do animal, este foi conduzido para o aparelho estereotáxico (Insight Equip. 
Laboratoriais, Ribeirão Preto, SP, Brasil), onde foi imobilizado para a cirurgia. 
A pele da região craniana foi removida para facilitar a visualização do bregma 
que serve de ponto de partida para a orientação das coordenadas. Foi feita a assepsia 
do local com peróxido de hidrogênio (H2O2). Uma cânula-guia de 8 mm de 
 40 
 
comprimento (25 x 0,70 mm) foi implantada unilateralmente no ventrículo lateral 
esquerdo (VL) nas seguintes coordenadas: AP -0,6 mm; ML ±1,1 mm; DV -1,0 mm, em 
relação ao bregma, de acordo com o Atlas de Paxinos e Franklin (2001) para tais 
coordenadas. A cânula foi fixada com acrílico auto-polimerizável (JET Artigos 
Odontológicos Clássicos Ltda.,Brasil) e um mandril do tamanho da cânula foi 
introduzido com o intuito de impedir a oclusão. Todo o procedimento foi executado 
sob condições de higiene e o local da incisão foi tratado com o agente antisséptico 
iodo-povidine. Logo após o procedimento cirúrgico, os animais receberam uma injeção 
subcutânea do antiinflamatório diclofenaco sódico (10 mg/kg, volume 10 ml/kg) e 
intramuscular do antibiótico tetraciclina (1 mg/kg, volume 0,7 ml/kg), a fim de evitar 
infecções e atenuar a dor causada pelo procedimento. 
Após a cirurgia, os animais permaneceram aquecidos sob luz incandescente 60 
W até a completa recuperação da anestesia, depois deste período foram reconduzidos 
ao biotério em caixas de polipropileno contendo até 15 animais, comida e água eram 
disponibilizadas à vontade por três dias até o início dos testes comportamentais. 
 
3.4. Injeções intraventriculares 
Os camundongos foram tratados pela via icv com o auxílio de uma agulha (27G) 
cujo comprimento excede 1 mm a cânula-guia, e que permite a administração do NPS 
ou 6-OHDA através desta, anteriormente implantada. A agulha estava ligada a um tubo 
de polietileno (PE-20), conectado a uma microseringa de Halmilton® de 10 µl. A 
substância era injetada num volume total de 2 µl, numa taxa de 1 µl/min e a agulha foi 
 41 
 
deixada in situ por mais 30 s, a fim de favorecer a difusão da substância pelo tecido 
cerebral e evitar o extravasamento. Após o tratamento com a 6-OHDA, os 
camundongos foram mantidos nas gaiolas por 3 dias até o início dos testes 
comportamentais. Visando a minimizar a anorexia provocada pela administração de 6-
OHDA, uma porção de ração umedecida foi deixada na gaiola até a eutanásia dos 
camundongos. Para a administração de NPS, os animais foram submetidos ao teste 
comportamental 15 min após a injeção icv, de acordo com Xu e colaboradores (2004) 
que observaram efeito do NPS 15 min após sua administração, e que tem duração de 
até 60 min. No 4° dia depois da cirurgia estereotáxica, os animais foram submetidos à 
análise comportamental e imunoistoquímica de acordo com os procedimentos 
descritos abaixo. 
 
3.5. Análise comportamental dos animais 
Teste do rota-rod 
A avaliação da coordenação motora dos camundongos foi realizada no teste do 
rota-rod (AVS Projetos, Ribeirão Preto, SP, Brasil) como previamente descrito por 
Rozas e colaboradores (1997). O aparelho consiste em uma barra de 3 cm de diâmetro 
que rotaciona no sentido horário em diferentes velocidades, medida em rotações por 
minuto (rpm). A barra é elevada da plataforma de apoio em 22 cm. A barra giratória é 
dividida em 5 compartimentos, de maneira a permitir o teste de mais de um animal 
simultaneamente. 
 42 
 
Durante a realização dos testes comportamentais, os camundongos foram 
colocados na barra giratória do aparelho em condições de aceleração em quatro 
momentos: três sessões de treino e em uma sessão de teste. As sessões de treino 
eram realizadas nos dias anteriores à cirurgia estereotáxica e tem o objetivo de fazer 
com que o animal aprenda a tarefa; foi mantido um intervalo de 24 h entre cada 
sessão de treino. Nas sessões de treino, os animais foram submetidos ao rota-rod 
somente em duas velocidades de rotação: 16 e 35 rpm. Nesta condição os 
camundongos deveriam permanecer na barra giratória por 300 s, para cada uma das 
velocidades. Ainda nas sessões de treino, caso o animal caísse da barra giratória, o 
mesmo era imediatamente reconduzido até completar o tempo de permanência de 
300 s. Vinte e quatro horas após a última sessão de treino, os animais foram 
submetidos à sessão de teste no rota-rod. Na sessão de teste, o animal foi conduzido à 
barra giratória do aparelho na velocidade de 16 rpm e a latência para a primeira queda 
foi registrada no tempo máximo de 300 s para os experimentos previstos na Etapa I 
deste estudo (cujo prejuízo motor foi induzido pela 6-OHDA) e 180 s para os 
experimentos da Etapa II (cujo prejuízo motor foi induzido pelo haloperidol). Tal 
modificação no protocolo foi requerida devido a considerável melhora no prejuízo 
motor induzida pela administração de L-Dopa e NPS em animais tratados com 6-OHDA, 
uma vez que, caso fosse mantido o ponto de corte de 180 s para os experimentos da 
Etapa I, quaisquer dos tratamentos utilizados neste estudo reverteriam 
completamente o prejuízo motor induzido pela 6-OHDA, conforme verificado 
experimentalmente no laboratório. 
 43 
 
Após a avaliação do desempenho motor na velocidade de 16 rpm, o animal era 
devolvido à gaiola por 5 min, para descansar, a fim de reduzir a possibilidade da 
diminuição da latência na barra giratória por fadiga. Depois deste intervalo de 
repouso, o animal era reconduzido à barra giratória do rota-rod na velocidade de 28 
rpm e a latência para a primeira queda nesta velocidade era registrada. Novamente, 
após avaliação do desempenho motor nesta velocidade, o animal era reconduzido a 
sua gaiola e após 5 min, deu-se a avaliação do desempenho motor do animal na 
velocidade de 35 rpm. Este procedimento foi repetido até a barra giratória atingir a 
velocidade de 58 rpm; ex.: 16, 28, 35, 50, 58 rpm. Em todas as etapas, a latência para a 
primeira queda da barra giratória foi registrada (em segundos). 
Após três dias de treino, no quarto dia referente ao dia do teste, o mesmo 
animal foi avaliado no rota-rod em 3 momentos distintos: em T0, os animais estavam 
sem nenhum tratamento (linha de base do desempenho motor); em T1, os animais 
sofreram administração de haloperidol ou 6-OHDA, e o prejuízo motor causado por 
qualquer uma dessas drogas foi avaliado no rota-rod; em T2, o desempenho motor dos 
mesmos animais foi avaliado após o tratamento com L-Dopa ou NPS (0,1, ou 1 nmol). 
Nos experimentos da Etapa I, cujos animais haviam sido tratados por via icv com 6-
OHDA, a avaliação do desempenho motor nos tempos T0 e T1 aconteceu com um 
intervalo de 3 dias entre eles. Este intervalo foi escolhido com base no tempo 
necessário para indução da ação neurodegenerativa da toxina 6-OHDA sob os 
neurônios dopaminérgicos (Betarbet e cols., 2002) e, também, com base no menor 
tempo necessário a fim de detectar danos motores sem perda considerável de peso 
 44 
 
dos animais e sem prejuízo substancial da saúde dos mesmos (dados apresentados na 
sessão de resultados). 
Animais que no terceiro dia após receberem a toxina ainda apresentavam 
capacidade de permanecer na barra giratória por 300 s na velocidade de 16 rpm não 
foram considerados para a avaliação comportamental dos efeitos da L-Dopa 25 mg/kg 
e do NPS 1 e 0,1 nmol. A literatura postula que podem existir diferenças na extensão 
da lesão provocada pela 6-OHDA devido principalmente ao local da injeção e, também, 
devido à sensitividade do animal e da espécie (Betarbet e cols., 2002). Assim, os 
animais que atingiram o limite máximo do tempo na barra giratória (i.e.: 300 s) na 
velocidade mais baixa do aparelho (i.e.: 16 rpm) foram considerados com lesão da área 
motora muito pequena ou nenhuma, sendo então excluídos das análises. A 
porcentagem de exclusão de animais teve média de 54,4%. 
Quando a latência para cair da barra giratória do rota-rod foi menor que o 
ponto de corte, 300 s, três medidas da performance do animal foram feitas e o valor 
considerado foi a média dos três valores individuais. Essa metodologia visa a diminuir a 
variância obtida entre as medidas para um mesmo animal. Este mesmo procedimento 
foi adotado por Rozas e colaboradores (1997), que demonstrou ser três o número de 
medidas por animal mais eficiente e que refletia com mais precisão o desempenho 
motor dos mesmos. 
 
Teste da catalepsia 
 45 
 
O comportamento cataléptico foi avaliado posicionando o camundongo com as 
duas patas dianteiras em uma plataforma, elevada 4 cm da base. Foi mensurada a 
latência (em segundos), em triplicata, em que o animal permaneceu na posição acima 
descrita, isto é, atéque retirasse as duas patas da barra elevada. O tempo máximo de 
permanência foi de 180 s. 
A avaliação do comportamento cataléptico dos animais tratados com 
haloperidol 1 mg/kg foi realizada 10 min antes da administração deste, como forma de 
controle do desempenho dos animais, e nos tempos: 10, 30, 60, 90, 120 e 150 minutos 
após a administração do haloperidol 1 mg/kg. Visando a validar as condições 
experimentais, os animais receberam L-Dopa 100 mg/kg ou salina, sendo que a 
administração destes ocorreu 30 min após a injeção de haloperidol 1 mg/kg, quando o 
comportamento cataléptico já havia se estabelecido, conforme verificado na curva 
tempo-resposta construída em experimentos anteriores. O tempo de imobilidade 
observado nos animais tratados com L-Dopa 100 mg/kg ou veículo foi realizado 
seguindo os mesmos intervalos de tempo descritos para o grupo anterior. 
O NPS, nas doses de 0,1 e 1 nmol, foi administrado nos animais pré-tratados 
com haloperidol 1 mg/kg, 30 min após a administração deste último. Quinze minutos 
depois, a latência para tirar as patas dianteiras da plataforma elevada foi novamente 
avaliada e, medidas sucessivas do tempo de permanência na postura foram registradas 
respeitando um intervalo de 30 min entre elas. 
Nos animais que receberam 6-OHDA ou salina por via icv, a avaliação do tempo 
de imobilidade na plataforma elevada foi registrada, em três medidas consecutivas 
realizadas diariamente por animal, no terceiro, quarto e quinto dia após a 
 46 
 
administração da 6-OHDA ou salina. A média do tempo de imobilidade registrada em 
cada uma das três avaliações foi calculada. 
 
3.6. Análise morfológica do tecido cerebral 
Perfusão transcardíaca 
Depois de anestesiados, os camundongos foram submetidos à perfusão 
transcardíaca, com solução salina a 0,9% em tampão fostato 0,1 M, pH 7,4. Em 
seguida, foram infundidos com solução fixadora composta por paraformaldeido 4% em 
tampão fostato. Nos experimentos onde foi realizada a injeção icv, a localização da 
cânula foi verificada após a perfusão transcardíaca dos animais e posterior injeção do 
corante azul de metileno (2 µl) através da cânula implantada 
intracerebroventricularmente e com o auxílio de um microscópio óptico a localização 
da cânula foi averiguada. Os animais cuja cânula estava posicionada fora do ventrículo 
lateral foram desconsiderados das análises estatísticas. 
Nos experimentos de imunoistoquímica para quantificação dos neurônios da 
substância negra corados para tirosina hidroxilase, os encéfalos foram retirados três 
dias após a administração de 6-OHDA e pós-fixados por 2 h na mesma solução fixadora 
descrita acima. Em seguida, os encéfalos foram colocados em solução de sacarose 30% 
em tampão fostato, a 4ºC por pelo menos 48 h. Após esta etapa, os encéfalos foram 
submetidos à microtomia cuja espessura dos cortes foi padronizada em 30 μm. Os 
encéfalos foram então congelados por gelo seco e seccionados em micrótomo de 
 47 
 
deslizamento, obtendo-se secções coronais. Os cortes foram guardados em freezer -
20ºC. 
 
3.7. Quantificação dos neurônios da substância negra corados para tirosina 
hidroxilase 
Os cortes histológicos foram submetidos à técnica de imunoistoquímica para 
marcação da enzima tirosina hidroxilase (TH), enzima que inicia o processo de 
transformação de tirosina em dopamina e outras catecolaminas. Os cortes passaram 
por um pré-tratamento que consistiu de incubação em peróxido de hidrogênio (H2O2) 
a 0,3% em tampão fosfato, com Triton X-100 a 0,4% por trinta minutos, com a 
finalidade de abolir artefatos causados pela liberação de peroxidases endógenas. No 
início, entre as soluções e ao final desta fase, os cortes foram submetidos a três 
lavagens de dez minutos cada em solução de tampão fosfato. O próximo passo 
consistiu na incubação dos cortes em anticorpo primário, isto é, uma solução formada 
pelo anticorpo anti-TH obtido em camundongo (Sigma, EUA) em diluição de 1:5000, 
acrescido de soro normal de asno a 2% em Triton X-100 a 0,4% permanecendo em 
incubação entre 18 e 24 h em rotor com rotação lenta. Ao final deste período, os 
cortes passaram por três lavagens em tampão fosfato, em agitador orbital e em 
seguida colocados em contato com o anticorpo secundário anti-camundongo obtido 
em asno (Jackson) diluído a 1:1000 em tampão fosfato mais Triton X-100 a 0,4% por 
120 min à temperatura ambiente, sob agitação lenta, em rotor. Em seguida, os cortes 
passaram por três lavagens em tampão fostato em agitador orbital e depois colocados 
na solução do complexo avidina-biotina-HRP (Protocolo ABC, Kit elite da Vector), numa 
 48 
 
diluição de 1:333 em tampão fosfato por 120 min à temperatura ambiente, sob 
agitação lenta, em rotor. Terminada esta fase, as secções foram novamente 
submetidas a três lavagens em tampão fosfato 0,1 M em agitador orbital. Para 
visualização da reação, as secções foram postas em meio contendo 
3,3’,4,4’tetrahidrocloreto-diaminobenzidina (DAB) e H2O2 0,003% por 
aproximadamente 6 minutos. Para finalizar a reação do cromógeno (DAB) os cortes 
foram lavados três vezes em tampão fosfato em agitador orbital. Por fim, os cortes 
foram então montados em lâminas gelatinizadas, que após secas desidratadas, em 
baterias de álcool de graduação crescente até o álcool absoluto, deslipidificada em 
xilol e cobertas com lamínulas utilizando DPX como meio de montagem. 
As secções do mesencéfalo submetidas à imunoistoquímica para TH foram 
examinadas ao microscópio óptico (Olympus BX41) em campo claro. Imagens digitais 
foram obtidas dos cortes no nível rostral do núcleo interpeduncular (figura 59 de 
Franklin e Paxinos, 2008) usando uma videocâmera digital (Nikon DXM1200). Este nível 
foi escolhido devido ser a área da substância negra com maior quantidade de 
neurônios TH em camundongos (Nelson e cols., 1996). Várias fotomicrografias foram 
tirada em grande aumento utilizando o programa Nikon ACT-1 e montadas sem 
nenhum tratamento no Adobe Photoshop 7.0®. A contagem de neurônios 
imunorreativos a TH foi feita utilizando o programa Image J (NIH). 
 
3.8. Delineamento experimental 
 49 
 
Etapa I: Padronização do modelo animal da DP induzido pela administração 
de 6-OHDA 
Experimento I e II: Efeito da administração de 6-OHDA no comportamento de 
camundongos avaliados no teste da catalepsia e do rota-rod 
Para validar os danos motores causados pela injeção intracerebroventricular de 
6-OHDA em camundongos, nas nossas condições experimentais, a toxina foi 
administrada na dose de 50 µg/camundongo. A administração de 6-OHDA ocorreu um 
dia depois da implantação da cânula no ventrículo lateral. Uma injeção ip de 
nortriptilina (30 mg/kg) foi feita nos 30 min anteriores à administração da toxina, para 
inibir a degeneração de fibras noradrenérgicas centrais. A administração da 6-OHDA 
ocorreu com os camundongos anestesiados com tiopental 60 mg/kg, a fim de evitar o 
surgimento de crises convulsivas e morte imediatamente à administração da 6-OHDA 
como também foi realizado por Rodriguez-Diaz e colaboradores (2001). 
No experimento I, conforme Figura 6, três dias após a administração de 6-
OHDA a avaliação do comportamento cataléptico foi realizada nos três dias 
consecutivos, sempre no horário matutino. Também como medida associada, foi 
avaliado o peso corpóreo ao longo dos dias, para acompanhamento da saúde dos 
animais. 
 50 
 
 
Figura 6. Delineamento experimental, etapa I, experimento I. 
 
No experimento II, conforme Figura 7, a avaliação do desempenho motor basal 
(T0) dos animais no teste do rota-rod foi realizada antes da injeção icv de 6-OHDA. Três 
dias após a administração de 6-OHDA, o desempenho motor dos animais foi testado 
(T1), a fim de verificar os déficits induzidos pela administração da toxina. A reversão do 
prejuízo motor induzido pela injeção icv de 6-OHDA no teste do rota-rod foi verificada 
30 min após a administraçãode L-Dopa 25 mg/kg por via oral nos animais (T2). 
 51 
 
 
Figura 7. Delineamento experimental, etapa I, experimento II. 
 
Experimento III: Quantificação de células que expressam TH em camundongos 
tratados com 6-OHDA por meio da técnica da imunoistoquímica 
No experimento III, quantificou-se o número de células coradas para a enzima 
TH no tronco cerebral dos camundongos, através da técnica de imunoistoquímica 
(Figura 8). Primeiramente, a avaliação do desempenho motor basal (T0) dos animais 
no teste do rota-rod foi realizada antes da injeção icv de 6-OHDA. Três dias após a 
administração de 6-OHDA, o desempenho motor dos animais foi testado (T1), a fim de 
 52 
 
verificar os déficits induzidos pela administração da toxina. No mesmo dia, os animais 
sofreram eutanásia e deu-se prosseguimento aos experimentos de imunoistoquímica. 
Para a realização desta série experimental, todos os animais foram considerados, 
independente do desempenho motor apresentado no teste do rota-rod, de modo a 
tornar possível a comparação entre o desempenho motor e o tamanho da lesão 
causada pela 6-OHDA. 
 
Figura 8. Delineamento experimental, etapa I, experimento III. 
 
Experimento IV: Efeito da administração de NPS na incoordenação motora de 
camundongos tratados com 6-OHDA 
 53 
 
A fim de avaliar os efeitos do tratamento com NPS 0,1 e 1 nmol no prejuízo 
motor decorrente da injeção de 6-OHDA, os camundongos foram treinados no teste do 
rota-rod e, após os 3 dias de treino, os animais foram submetidos à cirurgia 
estereotáxica para implantação de uma cânula no ventrículo lateral. Vinte e quatro 
horas depois, ocorreu a avaliação do desempenho motor destes animais no teste do 
rota-rod (T0) e, em seguida, os animais foram tratados por via icv com a 6-OHDA. Três 
dias após a administração da 6-OHDA, o dano motor induzido pela neurotoxina foi 
avaliado no teste do rota-rod (T1). Ao final da avaliação comportamental, os animais 
foram tratados por via icv com NPS 0,1 ou 1 nmol e, após 15 min, os animais foram 
submetidos à uma nova análise de desempenho motor no rota-rod (T2; Figura 9Figura 
9). 
 54 
 
 
Figura 9. Delineamento experimental, etapa I, experimento IV. 
 
Etapa II: Padronização do modelo animal da DP induzido pela administração 
de haloperidol 
Experimento I e II: Efeito da administração de haloperidol no comportamento 
de camundongos avaliados no teste da catalepsia e do rota-rod 
Com o objetivo de avaliar os efeitos comportamentais induzidos pela 
administração sistêmica de haloperidol, camundongos foram tratados com esta droga 
na dose de 1 mg/kg e os déficits motores foram mensurados no teste da catalepsia e 
 55 
 
do rota-rod. Além disso, o efeito da administração de L-Dopa sob o déficit motor 
induzido pelo haloperidol foi avaliado nas nossas condições experimentais. 
No experimento I, conforme Figura 10Figura 10, após a administração de 
haloperidol, a avaliação do comportamento cataléptico foi realizada ao longo dos 150 
min de observação. A administração de L-Dopa 100 mg/kg, por via oral, foi realizada 30 
min após o tratamento com haloperidol. 
 56 
 
 
Figura 10. Delineamento experimental, etapa II, experimento I. 
 
No experimento II, o desempenho dos animais no teste do rota-rod foi avaliado 
em camundongos anteriormente à administração de haloperidol 1 mg/kg (T0). A fim 
de determinar o prejuízo motor induzido por haloperidol, 30 minutos após a injeção ip 
 57 
 
desta droga, o comportamento dos animais foi novamente avaliado no teste do rota-
rod (T1). Logo após a avaliação do desempenho motor no tempo T1, L-Dopa 100 ou 
400 mg/kg foi administrada oralmente e o tempo de permanência na barra giratória no 
rota-rod foi avaliado após 60 min (T2) para cada uma das seguintes velocidades, 16, 
28, 35, 50, 58 rpm (Figura 11). 
 
Figura 11. Delineamento experimental, etapa II, experimento II. 
 
 58 
 
Experimento III e IV: Efeito da administração de NPS no décifit motor de 
camundongos tratados com haloperidol 
Para avaliar os efeitos do tratamento intracerebroventricular com NPS 0,1 ou 
NPS 1 nmol no déficit motor induzido pela administração de haloperidol 1 mg/kg, 
camundongos foram canulados intracerebroventricularmente e, no dia do teste, o 
tempo de imobilidade na plataforma elevada foi avaliado 10 min antes da 
administração do haloperidol e, em medidas sucessivas, até 30 min após o haloperidol. 
O NPS 0,1 ou 1 nmol foi administrado por via icv e, 15 minutos após, o comportamento 
dos animais foi avaliado no teste da catalepsia, sendo os mesmos observados por até 
90 min após o tratamento com NPS (Figura 12). 
 59 
 
 
Figura 12. Delineamento experimental, etapa II, experimento III. 
 
A fim de avaliar os efeitos do tratamento com NPS 0,1, NPS 1 nmol ou NPS 1 
nmol + L-Dopa 10 mg/kg no prejuízo motor induzido por haloperidol, os camundongos 
foram treinados no teste do rota-rod e, após os 3 dias de treino, os animais foram 
 60 
 
submetidos à cirurgia estereotáxica para implantação de uma cânula no ventrículo 
lateral. Três a cinco dias depois, a avaliação do desempenho motor destes animais foi 
realizada no teste do rota-rod (T0) e, em seguida, os animais foram tratados por via ip 
com haloperidol. Trinta min após a administração do haloperidol, o dano motor 
induzido foi avaliado no teste do rota-rod (T1). Ao final da avaliação comportamental, 
os animais foram tratados por via icv com NPS 0,1 ou 1 nmol e, após 15 min, foram 
submetidos à nova análise de desempenho motor no rota-rod (T2; Figura 13). 
 
Figura 13. Delineamento experimental, etapa II, experimento IV. 
 61 
 
Para o teste da associação L-Dopa 10 mg/kg e NPS 1 nmol, após a medida no 
rota-rod do dano motor induzido por haloperidol (T1) os animais foram tratados por 
via oral com L-Dopa 10 mg/kg e após 45 min, foi administrado NPS 1 nmol icv e, após 
15 min, os animais foram submetidos à nova análise de desempenho motor no rota-
rod (T2; Figura 14). 
 
 
Figura 14. Delineamento experimental, etapa II, experimento IV. 
 
 62 
 
3.9. Análise estatística 
Os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média. As curvas 
de desempenho motor dos animais no teste do rota-rod, obtidas a partir do registro do 
tempo de permanência na barra giratória do aparelho, ao longo das diferentes 
velocidades, foram avaliadas estatisticamente a partir da determinação da área sob a 
curva (AUC) e na sequência pelo teste de normalidade Kolmogorov-Smirnov. A análise 
de variância (ANOVA) de medidas repetidas de um fator foi feita seguida pelo teste 
post-hoc de Newman-Keuls. Ainda no teste do rota-rod, a porcentagem de 
desempenho motor foi calculada divindindo-se a área sob a curva da performace 
motora de cada animal tratado com 6-OHDA ou haloperidol e subsequentemente 
injetado com NPS ou L-Dopa, pela área sob a curva do desempenho motor do mesmo 
animal tratado apenas com 6-OHDA ou haloperidol. 
Para os dados obtidos no teste da catalepsia induzida pelo haloperidol e 
subsequente administração de L-Dopa 100 mg/kg foi realizado teste t de Student. 
Ainda para os dados da catalepsia induzida pelo haloperidol e subsequente 
administração de NPS (0,1 e 1 nmol) foi realizado teste de ANOVA de um fator. 
Os dados das correlações foram submetidas ao teste de normalidade 
Kolmogorov-Smirnov. Foram realizados os testes de correlação paramétrico de 
Pearson para a comparação da AUC e quantidade de células que expressam TH e o 
teste não-paramétrico de Spearman para avaliar a correlação entre a AUC e o tempo 
de imobilidade assumida pelos mesmos animais no teste da catalepsia. 
 63 
 
O nível de significância assumido neste estudo foi para valores de p≤0,05. Para 
a realização das análises estatísticas empregadas neste estudo foram utilizados os 
softwares GraphPad Instat 3.06. 
 64 
 
4. RESULTADOS EXPERIMENTAIS 
4.1 Etapa I: Padronização do modelo animal da DP causado pela