Adesão de células mesenquimais em superfícies de titânio

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A UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA 
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PERIODONTIA E PRÓTESE DENTÁRIA 
 
Adesão de células mesenquimais da medula óssea de 
camundongos e do ligamento periodontal de ratos a 
diferentes superfícies de titânio: 
Estudo comparativo in vitro
Luciana Bastos Alves 
 
 
Natal/ RN 
2008 
Luciana Bastos Alves 
Adesão de células mesenquimais da medula óssea de 
camundongos e do ligamento periodontal de ratos a 
diferentes superfícies de titânio: 
Estudo comparativo in vitro
Dissertação apresentada ao Programa de 
Pós Graduação em Odontologia, com 
área de concentração em Periodontia e 
Prótese Dentária, da Faculdade de 
Odontologia da UFRN, como requisito 
parcial para obtenção do grau de mestre. 
Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza
Natal – 2008 
Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia 
Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”. 
Alves, Luciana Bastos. 
 Adesão de células mesenquimais da medula óssea de camundongos e do 
ligamento periodontal de ratos a diferentes superfícies de titânio: estudo 
comparativo in vitro / Luciana Bastos Alves. – Natal, RN, 2008. 
70 p. : il. 
Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza. 
Dissertação (Mestrado) – Departamento de Odontologia, Centro de Ciências da 
Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
1. Ligamento periodontal - Dissertação. 2. Medula óssea – Dissertação. 
3. Titânio – Dissertação. I. Barboza, Carlos Augusto Galvão. II. Título. 
 
RN/UF/BSO Black D64 
 Dedico este trabalho 
A Deus, pelo seu amor e sua 
presença em minha vida que me faz mais 
forte e segura. 
Aos meus pais Edmar e Lúcia, que 
sempre me apoiaram, incentivaram e se 
esforçaram para a concretização de mais 
uma etapa da minha vida. Sem vocês eu 
nada seria. Muito obrigada! 
AGRADECIMENTOS 
 Ao meu orientador, Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza, pela confiança 
depositada em meu trabalho, pela sua disponibilidade irrestrita, pelos ensinamentos 
compartilhados, pelo incentivo e estímulo na área de cultivo celular que me abriram as portas 
para a próxima etapa, pelo apoio nos momentos difíceis e pelo carinho e amizade. 
 À aluna de iniciação científica do curso de Biomedicina da UFRN, Fernanda Ginani, 
pelos primeiros passos na área de cultivo de células, pela sua disponibilidade e amizade que 
construímos e “cultivamos” junto com este trabalho.
 Ao colega e Prof. José Sandro Pereira da Silva, pelas amostras de titânio e completa 
contribuição na caracterização de superfícies, pelas orientações nesta área, pelo apoio, atenção 
e disponibilidade na elaboração deste trabalho. 
 Ao LabPlasma (Departamento de Física da UFRN), na pessoa do Prof. Dr. Clodomiro 
Alves Júnior, pelo espaço e estrutura cedidos para o tratamento das amostras. 
 Ao laboratório de cultura de células do Departamento de Bioquímica do Centro de 
Biociências da UFRN, na pessoa do Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha, pelo 
espaço e estrutura cedidos para o cultivo celular. 
 Ao Departamento de Energia Nuclear da UFPE, na pessoa da Prof. Dra. Helen Jamil 
Khoury, pela irradiação das amostras. 
 Ao Laboratório de Cronobiologia do Departamento de Morfologia da UFRN, pela 
concessão dos animais utilizados neste trabalho. 
 A Faculdade de Odontologia da UFRN, na pessoa do chefe do departamento Prof. Dr.
Antônio Ricardo Calazans Duarte, 
 Aos Professores Dra. Ruthnéia Diógenes Alves Uchoa e Dr. Adriano Rocha 
Germano, pela participação na banca da qualificação, o que contribuiu para qualidade desta 
dissertação. 
 Aos Professores Dra. Adriana da Fonte Porto Carreiro, Dr. Antônio Ricardo 
Calazans Duarte, Dr. Gustavo Augusto Seabra Barbosa, pelos ensinamentos em Prótese 
Dentária, e em especial ao Prof. Dr. Eduardo Gomes Seabra pelos ensinamentos em 
Periodontia. 
 Aos Professores do Programa de Pós-graduação em Odontologia da UFRN, Dra. 
Maria Ângela Ferreira, Dr. Kênio Costa Lima, Dr. Ângelo Giuseppe Roncalli, Dra. 
Elizabethe Cristina Fagundes de Souza, Dra. Maria do Socorro Costa Feitosa Alves, Dra.
Íris do Céu Clara costa, e Dra. Maria Celeste Nunes de Melo, pelas orientações e 
ensinamentos partilhados. 
 A todos os funcionários da Faculdade que contribuíram de alguma forma para a 
concretização deste trabalho, em especial a Sandra, Ocian e Cecília. 
 Aos meus colegas de turma, Luana, Eudivar Alessandra, Lidiane, Miguel, Pedro 
Henrique, Ana Rafaela e Arcelino, pela convivência amiga e alegre durante todo o curso. 
 Ao aluno de iniciação científica do curso de Odontologia da UFRN, Marcel Cortês 
Bonifácio Varela Cavalcanti, pelo seu apoio no cultivo de células. 
 Ao aluno do curso de Odontologia da Universidade Potiguar, Almir Nery, pela 
contribuição no tratamento de superfícies das amostras. 
 Ao meu irmão Rafael Bastos Alves, que mesmo distante se fez presente através do 
amor, amizade e cumplicidade, o que me deu forças para realização desta etapa. 
 As minhas amigas Alinne Alice e Renata Filgueira, pelo carinho, apoio e amizade 
durante os momentos de convivência alegre fora da faculdade. 
 A Tony, pelo incentivo, compreensão, carinho e boas energias transmitidas durante a 
realização deste trabalho. 
 As minhas primas de sangue, irmãs de coração e colegas de profissão Nathália Bastos
e Ludmila Alves, pelo carinho e apoio nos momentos difíceis. 
 A minha “grande família”: tios, primos, sobrinhos e especial aos meus amados avós 
Geraldo e Lysia, que estiveram sempre na torcida por mim. 
 A todos que de acreditaram em mim e de alguma forma contribuíram para a realização 
deste trabalho. 
Se as coisas são inatingíveis... ora! 
 Não é motivo para não querê-las... 
Que tristes os caminhos, se não fora 
 a mágica presença das estrelas! 
 (DAS UTOPIAS – Mário Quintana) 
RESUMO 
O presente trabalho utilizou a cultura celular para analisar a capacidade de adesão de células 
mesenquimais da medula óssea de camundongos e do ligamento periodontal de ratos a 
diferentes superfícies de titânio. Para tanto, foram utilizados discos de titânio grau II ASTM 
F86 nas dimensões de 15mm de diâmetro por 1,5mm de espessura, os quais receberam 
diferentes tratamentos de superfície em 2 grupos distintos (polido e nitretação a plasma por 
gaiola catódica). As células foram isoladas da medula óssea de camundongos e do ligamento 
periodontal de ratos e cultivadas em meio de cultura meio básico α-MEM contendo 
antibióticos e suplementado com 10% de FBS, por 72 horas, em atmosfera úmida com 5% de 
CO2 a 37ºC. No subcultivo as células foram cultivadas em 1 placa de 24 poços, na densidade 
de 1 x 104 células por poço, onde os discos de titânio foram distribuídos de acordo com os 
grupos, incluindo-se controles positivos sem os discos de titânio. Após 24 horas de cultivo, as 
células foram submetidas a contagem em câmara de Neubauer. Os resultados analisados 
mostraram que tanto as células mesenquimais da medula óssea de camundongos como as 
células do ligamento periodontal de ratos tiveram melhor adesão à superfície controle. O 
número de células da medula óssea aderidas a superfície de Ti polido não foi estatisticamente 
significante quando comparado ao mesmo tipo celular aderido à superfície de Ti tratada por 
plasma na configuração de gaiola catódica, entretanto diferença significante foi encontrada 
entre o grupo controle e o grupo Ti polido. Com relação à adesão das células do ligamento 
periodontal, diferença significativa foi encontrada apenas entre as superfícies controle e as 
superfícies de Ti tratadas por plasma. No que diz respeito às comparações entre superfíciesiguais com células diferentes, não foi observada nenhuma diferença estatisticamente 
significante. Portanto, conclui-se que o titânio é um bom biomaterial para a adesão de células 
mesenquimais e que as diferentes formas de tratamento de superfície dada ao material podem 
influenciar neste processo. 
Palavras-chave: Células mesenquimais; medula óssea; ligamento periodontal; titânio. 
ABSTRACT 
The present experiment used cell culture to analyze the adhesion capacity of mouse 
mesenchymal bone marrow cells and rat periodontal ligament to different titanium surfaces. 
Grade II ASTM F86 titanium discs 15mm in diameter and 1.5mm thick were used and 
received 2 distinct surface treatments (polished and cathodic cage plasma nitriding). The cells 
were isolated from the mouse bone marrow and rat periodontal ligament and cultured in α-
MEM basic culture medium containing antibiotics and supplemented with 10% FBS and 5% 
CO2, for 72 hours at 37ºC in a humidified atmosphere. Subculture cells were cultured in a 24-
well plate with a density of 1 x 104 cells per well. The titanium discs were distributed in 
accordance with the groups, including positive controls without titanium discs. After a 24-
hour culture, the cells were counted in a Neubauer chamber. The results show that both the 
mouse mesenchymal bone marrow cells and rat periodontal ligament cells had better adhesion 
to the control surface. The number of bone marrow cells adhered to the polished Ti surface 
was not statistically significant when compared to the same type of cell adhered to the Ti 
surface treated by cathodic cage plasma nitriding. However a significant difference was found 
between the control and polished Ti groups. In relation to periodontal ligament cell adhesion, 
a significant difference was only found between the control and plasma-treated Ti surfaces. 
When comparing equal surfaces with different cells, no statistically significant difference was 
observed. We can therefore conclude that titanium is a good material for mesenchymal cell 
adhesion and that different material surface treatments can influence this process. 
Key words: Mesenchymal cells; bone marrow; periodontal ligament; titanium. 
LISTA DE FIGURAS 
Figura 1. Esquema básico de um equipamento para nitretação iônica (ALVES Jr, 1995). 
Figura 2. Equipamento para nitretação iônica. 
Figura 3. Esquema do equipamento para nitretação iônica em gaiola catódica (SOUSA, et 
al.2008). 
Figura 4. Corte das epífises ósseas. 
Figura 5. Extração da medula óssea. 
Figura 6. Rato Wistar. 
Figura 7. Incisivos no meio básico alfa-MEM. 
Figura 8. Remoção do ligamento periodontal. 
Figura 9. Fragmentos de ligamento periodontal cultivados em tripsina. 
Figura 10. Suspensão centrifugada. 
Figura 11. Placa de cultura contendo meiobásico alfa-MEM supletmentado com 10% de 
SFB. 
Figura 12. Suspensão centrifugada. 
Figura 13. Placa de cultura com discos e células. 
Figura 14. Esquema dos discos de titânio na placa de cultura de 24 poços. 
Figura 15. Adesão de células às diferentes superfícies de titânio. 
Figura 16. Adesão de células da medula óssea às diferentes superfícies de titânio. 
Figura 17. Adesão de células do ligamento periodontal às diferentes superfícies de titânio. 
Figura 18. Adesão de células às superfícies controle.
Figura 19. Adesão de células à superfície Ti Polido. 
Figura 20. Adesão de células à superfície Ti Gaiola. 
LISTA DE TABELAS 
Tabela 1. Parâmetros de tratamento com plasma de nitrogênio. 
Tabela 2. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às diferentes 
superfícies. 
Tabela 3. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às superfícies 
Controle e Ti Polido. 
Tabela 4. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às superfícies 
Controle e Ti Gaiola. 
Tabela 5. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às superfícies Ti 
Polido e Ti Gaiola. 
Tabela 6. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às diferentes 
superfícies. 
Tabela 7. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às superfícies 
Controle e Ti Polido. 
Tabela 8. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às superfícies 
Controle e Ti Gaiola. 
Tabela 9. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às superfícies Ti 
Polido e Ti Gaiola. 
Tabela 10. Análise da adesão dos dois tipos celulares sobre a superfície controle. 
Tabela 11. Análise da adesão dos dois tipos celulares sobre a superfície controle Ti Polido. 
Tabela 12. Análise da adesão dos dois tipos celulares sobre a superfície Ti Gaiola. 
Tabela 13. Valores de rugosidade média (Ra) obtidas por profilômetro. 
Tabela 14. Valores da média e desvio padrão de molhabilidade.
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS 
ABCG-2 - Marcador de células-tronco mesenquimais 
ALP- Fosfatase alcalina 
AOs - Osteoblastos alveolares 
α -MEM – Meio essencial mínimo tipo alfa 
α-SMA – Actina de músculo liso tipo alfa 
ASTM – Sociedade Americana de Análise e Padronização de Materiais 
β-FGF- Fator de crescimento fibroblástico beta 
BSP- Sialoproteína óssea 
β-TCP - Fosfato tricálcio beta 
ºC - Grau Celsus 
Cbfa-1 - Subunidade alfa 1 do fator de ligação ao core 
CD - Marcador de superfície celular 
CFU-F – Unidades formadoras de colônias de fibroblastos 
c-KIT - Marcador de células-tronco mesenquimais. 
cm2 - Centímetro quadrado 
CO2 - Gás carbônico
Col I - Colágeno tipo I 
Col XII - Colágeno tipo XII 
CTM - Célula-tronco mesenquimal 
EDTA- Ácido etilenodiamino tetra-acético 
EGF- Fator de crescimento epidérmico 
FBS - Soro fetal bovino 
g - Grama 
GFAP – Proteína glial ácida fibrilar 
GFs - Fibroblastos gengivais 
H - Hidrogênio 
hESCs - Células-tronco embrionárias humanas 
HNK1 - Marcador para células de cristas neurais indiferenciadas 
H2O2 - Peróxido de hidrogênio 
hPDLF - Fibroblastos do ligamento periodontal humano 
I-11 - Interleucina-11 
kGy - KiloGray 
L1 - Grupo de células do ligamento periodontal sobre superfície controle 
L2 - Grupo de células do ligamento periodontal sobre superfície de titânio polido 
L3 - Grupo de células do ligamento periodontal sobre superfície de titânio tratado 
M1 - Grupo de células da medula óssea sobre superfície controle 
M2 - Grupo de células da medula óssea sobre superfície de titânio polido 
M3 - Grupo de células da medula óssea sobre superfície de titânio nitretado 
mA - Miliampére 
Mbar - Milésimo de bar (pressão) 
MC3T3-E1 – Linhagem de células osteoblásticas da calvária de embrião de camundongos 
MEV - Microscopia eletrônica de varredura 
MG-63 – Linhagem de células osteoblásticas 
mg/L - Miligramas por litro 
mL- Mililitro 
mm - Milímetro 
mM - Milimolar 
mRNA - Ácido ribonucleico mensageiro 
MUC18 - Marcador de células-tronco mesenquimais 
µl - Microlitro 
N - Nitrogênio 
NFM - Neurofilamento M 
Oct-4 - Fator crítico transcripicional para manutenção da pluripotencialidade 
OCNE - Marcador de células-tronco mesenquimais 
OCN - Osteocalcina 
OP-CHEM - Tipo de pano de polimento 
OPG - osteoprotegerina 
OPN - Osteopontina 
OSC – Osteocalcina 
Osteo-1- Linhagem celular 
p75 – Proteína associada a células das cristas neurais indiferenciadas 
PBS - Tampão fosfato-salino 
PCNA – Antígeno nuclear de proliferação celular 
PDL - Ligamento periodontal 
PDLFs - Fibroblastos do ligamento peridontal 
pH - Potencial hidrogeniônico 
Ra – Parâmetro de rugosidade média 
RANKL – Ligante do receptor ativador do fator nuclear Kappa 
rpm – Rotação por minuto 
RTG - Regeneração tecidual uuiada 
RUNX-2 – Fator de transcrição associado ao Runt 
sccm - Centímetro cúbico padrão por minuto (medida de fluxo de gás) 
SiC- Carbeto de silício 
Slug - Fator de transcrição associado à crista neural 
STRO-1 - Marcador de superfície de células-tronco mesenquimais 
Sox2 - Fator de transcrição 
Sox9 - Fator de transcriçãoTi - Titânio 
Ti6A14V - Liga de Titânio 
Twist - Fator de transcrição 
U-2 OS – Linhagem de células osteoblásticas de ostessarcoma 
V -Voltz 
Vol. - Volume 
SUMÁRIO 
1 INTRODUÇÃO...................................................................................................................17 
2 REVISÃO DE LITERATURA..........................................................................................20 
2.1 Células mesenquimais da medula óssea.........................................................................20 
2.2 Regeneração periodontal.................................................................................................21 
2.3 Células mesenquimais do ligamento periodontal..........................................................22 
2.4 Osseointegração................................................................................................................31 
2.4.1 Titânio (Ti).....................................................................................................................31 
2.4.2 Características superficiais e respostas celulares.......................................................32 
2.4.3 Tratamento de superfície..............................................................................................35 
2.4.3.1 Nitretação iônica.........................................................................................................35 
3 OBJETIVOS........................................................................................................................38 
3.1 Objetivo geral....................................................................................................................38 
3.2 Objetivos específicos.........................................................................................................38 
4 METODOLOGIA................................................................................................................39 
4.1 Preparo das amostras.......................................................................................................39 
4.1.1 Protocolo de nitretação..................................................................................................39 
4.2 Caracterização das amostras...........................................................................................41 
4.2.1 Composição da camada.................................................................................................41 
4.2.2 Textura superficial.........................................................................................................41 
4.2.3 Rugosidade.....................................................................................................................41 
4.2.4 Molhabilidade................................................................................................................41 
4.3 Esterelização das amostras..............................................................................................42 
4.4 Cultura de células.............................................................................................................42 
4.4.1 Obtenção das células da medula óssea de camundongos...........................................42
4.4.2 Cultivo das células da medula óssea............................................................................43 
4.4.3 Obtenção das células do ligamento periodontal de ratos..........................................43 
4.4.4 Cultivo das células do ligamento periodontal.............................................................43 
4.4.5 Cultivo nos discos de Titânio........................................................................................45 
4.5 Viabilidade e adesão celular............................................................................................46 
4.6 Análise estatística..............................................................................................................46 
5 RESULTADOS....................................................................................................................47 
5.1 Resultados da análise de superfície.................................................................................47 
5.2 Resultados de adesão celular...........................................................................................47 
5.2.1 Adesão das células da medula óssea de camundongos às diferentes superfícies.....47 
5.2.2 Adesão das células do ligamento periodontal de ratos às diferentes superfícies.....49 
5.2.3 Adesão de células da medula óssea de camundongos e do ligamento periodontal de 
ratos à mesma superfície........................................................................................................50 
6 DISCUSSÃO........................................................................................................................52 
7 CONCLUSÕES...................................................................................................................58 
REFERÊNCIAS.....................................................................................................................59 
APÊNDICE.............................................................................................................................67 
ANEXOS ................................................................................................................................69
1 INTRODUÇÃO 
As células mesenquimais indiferenciadas, ou células-tronco como são conhecidas, são 
células com grande capacidade de auto-renovação e de produzir pelo menos um tipo celular 
altamente especializado. Existem duas categorias de células-tronco: as células-tronco 
embriononárias pluripotentes que são procedentes do embrioblasto durante a fase de blástula 
do embrião e que são capazes de dar origem a todas as linhagens celulares do corpo; e a 
categoria de células unipotentes ou multipotentes, denominadas células-tronco adultas, que 
têm capacidade de dar origem a tipos celulares específicos (SOUZA et al., 2003). 
A maior vantagem do uso de células-tronco embrionárias é a sua capacidade de 
proliferação e de diferenciação em diversos tipos celulares. Contudo, existem desvantagens, 
como a sua instabilidade genética, a obrigatoriedade de sua transplantação para hospedeiros 
imunocomprometidos e o risco de formação de teratocarcinomas, além da questão ética. Já as 
células-tronco adultas apresentam a vantagem de serem autogênicas, não incorrendo em 
limitações morais, e responsivas aos fatores de crescimento inerentes ao hospedeiro. No 
entanto, também apresentam desvantagens, como o fato de não serem pluripotentes, a 
dificuldade de obtêlas, purificá-las e cultivá-las in vitro, além de sua presença em menor 
quantidade nos tecidos (SONG et al., 2004; SOARES, 2007). 
A principal fonte de células-tronco adultas é a medula óssea. Constituem uma pequena 
população celular, contudo, podem ser expandidas com alta eficiência e induzidas a se 
diferenciarem em múltiplas linhagens em condições de cultura definidas. Estas células têm a 
capacidade de se diferenciarem em células dos tecidos ósseo, adiposo, cartilaginoso e 
muscular, o que demonstra sua alta plasticidade. O interesse neste tipo celular cresceu 
vertiginosamente nos últimos anos devido ao seu grande potencial de uso na regeneração de 
tecidos e órgãos lesados (PITTENGER et al., 1999; ROSADA et al., 2003;, SHORT et al., 
2003; BARRY, MURPHY, 2004). 
Inúmeros estudos também têm isolado células mesenquimais indiferenciadas derivadas 
dos tecidos orais, tais como polpa dentária (GRONTHOS, MANKANI, BRAHIM, 2000; 
GRONTHOS et al, 2002; MIURA et al., 2003; SHI, ROBEY, GRONTHOS, 2001; SHI, 
GRONTHOS, 2003; SLOAN, SMITH, 2007) e ligamento periodontal (SEO et al, 2004; 
CHEN et al., 2006; AKIZUKI et al. 2005; NAGATOMO et al., 2006; GRONTHOS et al, 
2006). A identificação desta população celular nos tecidos dentais tem estimuladoo interesse 
no potencial regenerativo destas células e na sua aplicabilidade na engenharia tecidual, ou 
bioengenharia. 
A bioengenharia é usada para construção ou para regeneração dos tecidos injuriados 
ou perdidos, decorrentes de doenças degenerativas, trauma, câncer ou doença periodontal, tais 
como o tecido ósseo. Baseia-se na terapia celular envolvendo células mesenquimais 
associadas ou não aos biomateriais (SILVÉRIO et al., 2008). 
Dentre os biomateriais, diversos estudos têm mostrado que o titânio atualmente é 
considerado o biomaterial de escolha para a confecção de implantes osseointegrados em 
implantodontia e ortopedia, devido à característica osteocondutora e às propriedades 
mecânicas, estabilidade química e biocompatibilidade, que varia de acordo com o tratamento 
dado a esse metal. (AMARANTE, LIMA, 2001). Portanto, a natureza da superfície determina 
a resposta biológica ao redor do biomaterial e, como conseqüência, o sucesso da interação 
célula-superfície. 
A interação das células ao biomaterial pode ser dividida em três fases. Na primeira 
fase as células em contato com a superfície primeiramente se ligam, aderem e se espalham. 
Esta fase é a mais importante, pois a qualidade desta adesão influenciará na morfologia e na 
capacidade para proliferação e diferenciação das células. Durante a segunda fase, as células se 
proliferam e se diferenciam. Finalmente, durante a terceira fase, ocorre a deposição da matriz 
extracelular mineralizada. (KASEMO, 2002; ANSELME, 2000). 
 Na busca por superfícies que melhoram a essa interação e supram à necessidade de 
obter uma boa adesão, e conseqüentemente uma maior proliferação e formação óssea, 
contribuindo para a osseointegração, vários métodos de tratamento de superfície têm sido 
utilizados, tais como: a aspersão com plasma de titânio, jateamento com óxido de titânio, 
deposição a laser de carbeto de titânio, condicionamento ácido, e outros (XUANYONG, 
2004). 
Dentre os diferentes métodos, pode-se citar a nitretação iônica ou nitretação a plasma, 
um processo de introdução do elemento nitrogênio na superfície dos metais com o objetivo de 
alterar as propriedades superficiais desse material (COOPER, MASUDA,WHITSON, 1999; 
BRAMA, 2007). 
Devido ao importante papel das células mesenquimais nos processos de regeneração 
óssea e fixação dos implantes, o presente estudo busca avaliar a capacidade de adesão das 
células mesenquimais da medula óssea de camundongos e do ligamento periodontal de ratos 
às superfícies de titânio lisas e nitretadas por plasma na configuração de gaiola catódica. 
2 REVISÃO DE LITERATURA 
2.1 Células mesenquimais da medula óssea 
A medula óssea não é apenas o local onde ocorre a hematopoese na vida pós-natal, 
mas também é um reservatório de células-tronco adultas (CANCEDDA, BIANCHI, 
DERUBEIS, 2003) Um tipo específico de célula-tronco adulta é a célula-tronco mesenquimal 
(CTM) (PITTENGER et al., 1999; HU et al., 2002) também denominada de célula-tronco 
estromal da medula (BIANCO et al., 2001) ou apenas célula estromal da medula (PROCKOP, 
1997). 
As células-tronco mesenquimais (CTM) foram isoladas pela primeira vez por 
Friedenstein e colaboradores no início da década 70, a partir de uma suspensão celular da 
medula óssea, e caracterizadas como células aderentes, fibroblastóide e clonogênica, sendo 
inicialmente denominadas de células formadoras de colônia fibroblastóides (CFU-F = colony 
forming units – fibroblastic) (FRIEDENSTEIN et al., 1966) ou células mesenquimais 
estromais multipotentes, de acordo com a nova nomeclatura proposta pela Sociedade 
Internacional para Terapia Celular, em 2005 (HOROWITZ et al., 2005). Essas células 
mostraram ser multipotenciais e não apenas participam como estroma de mielosuporte, como 
também se diferenciam em linhagens mesodérmicas quando implantadas in vivo (OWEN, 
1988). 
Atualmente, muitos estudos têm isolado as CTM e têm controlado, in vitro, a sua 
diferenciação em tecido cartilaginoso e ósseo, utilizando fatores de crescimento específico, 
com o objetivo de usar esta nova tecnologia no reparo de tecidos lesados de origem 
mesenquimal (PITTENGER et al., 1999; MARTIN et al., 2002; MEIRELES, NARDI, 2003). 
Além disso, células estromais da medula óssea também têm sido bastante utilizadas no reparo 
de grandes defeitos ósseos, através da associação com biomateriais e injeção sistêmica de 
células osteogênicas para o tratamento de doenças ósseas genéticas, como a osteogênese 
imperfeita (CANCEDDA, BIANCHI, DERUBEIS, 2003; SHANTI et al., 2007). 
As células-tronco mesenquimais podem se diferenciar em osteoblastos e promover 
mineralização quando cultivadas na presença de ácido ascórbico, betaglicerol fosfato e 
dexametasona (MAEDA et al. 2007). As células adquirem morfologia de osteoblastos, após 
14 a 21 dias (KIM et al., 2004) com aumento da atividade da fosfatase alcalina, deposição de 
uma matriz extracelular rica em cálcio (BARRY, MURPHY, 2004) e formação de cristais de 
hidroxiapatita (BARRY, 2003). 
Pesquisas recentes sinalizam para a possibilidade de implantação de tecido ósseo 
desenvolvido a partir de cultura de células-tronco do próprio paciente, diferenciadas em 
osteoblasto. A regeneração óssea guiada utiliza a implantação de células-tronco no local 
afetado, sem a necessidade de enxertos ósseos, usando um biomaterial como veiculo 
(BORDJI, 1996). A associação dos implantes de titânio com o tecido ósseo em cultura poderá 
contribuir para a engenharia tecidual e o sucesso na regeneração periodontal e 
osseointegração (FRAZOLIN et al. 2008).
2.2 Regeneração periodontal 
O reparo do aparato de inserção e sustentação do periodonto, destruído como resultado 
da progressão da doença periodontal, tem sido a meta principal da terapia periodontal. A 
regeneração periodontal busca a formação de novo cemento e novo osso alveolar além da 
nova inserção e reinserção das fibras do ligamento periodontal ao novo cemento e superfície 
radicular (BARTOLD et al., 2000). 
Desde a década de 70, inúmeras técnicas têm sido utilizadas a fim de interromper a 
progressão da doença e obter a reconstituição da arquitetura e função das estruturas de suporte 
perdidas. A terapia periodontal inclui raspagem e alisamento radicular, cirurgias para 
descontaminação e biomodificação da superfície radicular, enxertos, substitutos ósseos, 
biomateriais, fatores de crescimento e regeneração tecidual guiada (RTG) (POLIMENI, 
XIROPAIDIS, WIKESJO, 2006). 
Melcher, em 1976, sugeriu que o tipo de células que repovoam a superfície radicular 
após o tratamento cirúrgico periodontal determina a natureza da inserção que formará. A 
superfície radicular tratada pode ser repovoada por células epiteliais, células do tecido 
conjuntivo, células ósseas e células do ligamento periodontal. Foi sugerido também que a 
regeneração do periodonto envolve células progenitoras presentes no ligamento periodontal, 
capazes de se diferenciarem em fibroblastos, cementoblastos e osteoblastos. 
Baseada nestas hipóteses, a técnica de RTG tem como princípio biológico a exclusão 
celular seletiva através da utilização de uma barreira física interposta entre o retalho 
periodontal e a superfície radicular tratada. Seu objetivo é excluir o tecido conjuntivo, além 
de desviar a proliferação epitelial da superfície radicular, criando um espaço protegido que 
poderá ser repovoado por células derivadas do ligamento periodontal, conduzindo assim a 
regeneração do periodonto (GOTTLOW, 1984; CAFESSE et al., 1988). 
Entretanto estas terapias são limitadas pela severidade da doença periodontal, tipo de 
defeito e por fatores locais e sistêmicos, dentre outros. Desta forma, busca-se uma nova 
terapia de reconstrução do periodonto destruído pela doença periodontal. Recentes técnicas de 
engenharia tecidual baseadas na biologia de células-tronco têm sido propostas para 
desenvolver tal terapia (NEEDLEMAN et al., 2006; HASEGAWAet al., 2005; GRONTHOS 
et al, 2006; FUJII et al., 2008).
Desta maneira, o ligamento periodontal tem sido de fundamental importância no 
processo de reparo e regeneração do periodonto, uma vez que apresentam células como 
cementoblastos, osteoblastos, mifibroblastos, células endoteliais, células epiteliais e células 
nervosas, além de “células progenitoras” ou células mesenquimais indiferenciadas (células-
tronco) que têm sido identificadas através de vários estudos (IVANOVSKI et al., 2006). 
2.3 Células mesenquimais do ligamento periodontal 
O ligamento periodontal é um tecido conjuntivo frouxo interposto entre as superfícies 
radiculares dos dentes e a parede interna do osso alveolar. Suas fibras formam uma malha que 
se estende entre o cemento e osso e está firmemente ancorada pelas fibras de Sharpey. O 
ligamento periodontal une o dente ao osso alveolar propriamente dito, promovendo suporte, 
proteção, sensitividade, nutrição, homeostase e reparo (BEERTSENC, MCCULLOC, 
SODEK, 1997). 
O conceito de que células mesenquimais indiferenciadas podem estar presentes no 
ligamento periodontal foi inicialmente proposto por Melcher em 1976, o qual observou que 
estas células presentes no ligamento periodontal eram capazes de formarem fibroblastos, 
cementoblastos e osteoblastos A partir de então, a capacidade regeneradora das células do 
ligamento periodontal tem sido pesquisada através de vários estudos (BARTOLD, SHI, 
GRONTHOS, 2006). 
Seo et al. (2004) levantaram a hipótese de que o ligamento periodontal pode conter 
células indiferenciadas multipotentes que podem ser usadas para regenerar cemento e 
ligamento periodontal in vivo. Os autores isolaram células do ligamento periodontal de 
terceiros molares extraídos de humanos, e analisaram através da imunohistoquímica para 
identificar marcadores de células-tronco. Quando transplantadas em ratos 
imunocomprometidos, as mesmas mostraram a capacidade de formar estruturas como 
cemento e ligamento e contribuir para o reparo tecidual periodontal. Os resultados da pesquisa 
mostraram que células do ligamento periodontal expressaram os marcadores de células-tronco 
mesenquimais: STRO-1 e CD146/MUC18. Em condições de cultura, células do ligamento 
periodontal diferenciaram-se em cementoblastos, adipócitos e fibroblastos. 
Vários antígenos de superfície celular têm sido usados como marcadores para células-
tronco e são importantes para isolar essas células de outros tecidos. Chen et al. (2006) 
realizaram um estudo com o objetivo de identificar e localizar células indiferenciadas no 
ligamento periodontal humano sadio e doente usando marcadores de superfície celular para 
células mesenquimais (STRO-1, CD146 e CD44). Dentes afetados pela doença periodontal e 
sadios foram coletados, fixados em formal a 10%, descalcificados e embebidos em parafina 
para análise imunohistoquímica. Anticorpos contra STRO-1, CD146 e CD44 foram usados 
para identificar células-tronco no ligamento periodontal. Os resultados mostraram que células 
mesenquimais indiferenciadas foram identificadas tanto no ligamento de periodonto sadio 
quanto em doente. 
Akizuki et al. (2005) em um estudo piloto isolaram e cultivaram células do ligamento 
periodontal de pré-molares extraídos de cães e aplicaram essas células juntamente com 
condutor de ácido hialurônico em cinco defeitos ósseos criados cirurgicamente nas superfícies 
mesiais das raízes dos primeiros molares mandibulares de uma hemi-arcada de cada cão. A 
outra hemi-arcada foi usada como grupo controle, onde foram criados os mesmos defeitos e 
neles aplicados apenas condutor de ácido hialurônico. Após oito semanas, os animais foram 
sacrificados e os espécimes preparados a fim de avaliar histologicamente e histometricamente 
a cicatrização dos defeitos periodontais. Os resultados mostraram ausência de inflamação 
clínica ou recessão gengival em ambos os lados. No grupo experimental foi observada a 
cicatrização periodontal com formação de osso, ligamento periodontal e cemento em três dos 
cinco defeitos, e no grupo controle não foi constatada a formação de tecido periodontal, 
exceto em um defeito. A análise histométrica revelou que a formação de novo cemento no 
grupo experimental foi altamente significante quando comparada ao grupo controle. Deste 
modo, os autores concluíram que as células do ligamento periodontal têm o potencial de 
promover regeneração tecidual, sendo de grande importância para a terapia regenerativa. 
Nagatomo et al. (2006) isolaram células do ligamento periodontal de pré-molares e 
terceiros molares extraídos de humanos a fim de verificar as propriedades de renovação, 
multiplicação e expressão de marcadores dessas células. Análise de fluorescência ativada 
revelou que essas células expressaram marcadores de células-tronco CD105, CD166, e 
STRO-1. Esses resultados sugerem que as células do ligamento periodontal incluem células-
tronco mesenquimais juntamente com outras células progenitoras. 
Gronthos, Mankani e Brahim (2000) demonstraram que as células mesenquimais da 
polpa dentária expressavam a molécula de adesão celular CD106 (VCAM-1). Em 2003, 
Gronthos, Zannettino e Hay observaram que esta mesma molécula CD106 (VCAM-1) era 
expressa nas células-tronco da medula óssea. Em 2006, usaram uma estratégia de 
imunoseleção para purificar as células mesenquimais clonogênicas do ligamento periodontal 
de ovinos baseada na reatividade ao anticorpo que identifica o CD106. A positividade para 
este antígeno CD106 das células do ligamento periodontal de ovinos demonstrou a capacidade 
de formarem um agregado de células semelhantes a fibroblastos quando manipuladas em 
baixa densidade in vitro. A expanção ex-vivo dessas células exibiu alto grau de proliferação in 
vitro e expressaram um fenótipo (CD44+, CD166+, CBFA-1+, colágeno-I+, sialoproteína 
óssea+) consistente com células mesenquimais do ligamento periodontal de humanos, além da 
capacidade de regenerarem, tanto tecido mineralizado semelhante ao cemento, quanto 
ligamento periodontal, quando transplantadas em ratos imunocomprometidos. 
Kawanabe, Murakami e Yamamoto (2006) observaram que as células mesenquimais 
do ligamento periodontal exibiam um perfil funcional de células-tronco e expressavam 
ABCG-2 (um marcador usual de células-tronco) e Oct-4 (um fator crítico transcripicional para 
manutenção da pluripotencialidade), entretanto somente 3,9% das células do ligamento 
periodontal cultivadas exibiam tais características. 
Gay, Chen e Macdougall (2007) realizaram um estudo onde células do ligamento 
periodontal de humanos foram isoladas, marcadas para STRO-1 e separadas em meio de 
cultura com o objetivo de analisar sua capacidade de diferenciação em osso, cartilagem e 
tecido adiposo. Células da medula óssea foram usadas como controle nas mesmas condições 
de cultivo e indução. Os autores concluíram que as células do ligamento periodontal contêm 
células mesenquimais que têm o potencial de se diferenciarem em osteoblastos, condrócitos e 
adipócitos, semelhantes às células-tronco da medula óssea. 
Fujii et al. (2008) isolaram e cultivaram três linhagens celulares (linhas 1-4, 1-11 e 1-
24) que expressam os marcadores celulares RUNX-2, Col I, ALP, OPN, OCN, RANKL, 
OPG, escreráxe , periostina, Col XII, e α-SMA mRNA. A análise histoquímica demonstrou 
que o marcador celular CD146 foi expresso nas células das linhagens 1-4 e 1-11 e o STRO-1 
foi expresso nas linhagens 1-11 e 1-24. As células das linhagens 1-4 e 1-11 se diferenciaram 
em células osteoblásticas e adipócitos quando cultivadas em meio de diferenciação de 
linhagem específica. Quatro semanas depois das células da linhagem 1-11 serem 
transplantadas em ratos imunodeficientes com fosfato β-tricálcio (β-TCP), o transplante 
produziu tecidos semelhantes a cemento e osso ao redor do β-TCP. Oito semanas depois, as 
células 1-11 transplantadas formaram estruturas semelhantes ao ligamento periodontal nasuperfície do β-TCP. Estes resultados sugerem que as células da linhagem 1-11 eram 
derivadas das células progenitoras/ células mesenquimais do ligamento periodontal e pode ser 
bastante útil para estudar a biologia e regeneração do periodonto humano. 
Coura (2008) buscando verificar a possibilidade de o ligamento periodontal conter 
células mesenquimais cresto neurais, isolou e cultivou células do ligamento em dois grupos 
distintos (um com células do ligamento de 10 dentes de 7 indivíduos diferentes e outro grupo 
com células do ligamento de 4 dentes de um mesmo indivíduo). Após serem cultivadas em 
um meio indutivo específico e as analisadas através de imunohistoquímica, observou-se a 
presença de um marcador de células-tronco neurais e também marcadores para células cresto 
neurais indiferenciadas (HNK1, p75). Os resultados foram similares nos dois grupos, 
sugerindo evidências de que o ligamento periodontal humano em adição a derivados 
mesodermas, produzem células semelhantes às células cresto neurais. 
Lin et al. (2008) realizaram um estudo a fim de identificar e localizar células 
mesenquimais indiferenciadas em biópsias em bloco e em cultura de expansão celular dos 
tecidos periodontais humanos regenerados. Para tal, foi utilizada a técnica de regeneração 
tecidual guiada com membranas em defeitos de furca e superfície dentária dos terceiros 
molares de humanos voluntários. Após o período de cicatrização de 6 semanas, os dentes e os 
tecidos ao seu redor (tecidos regenerados e osso alveolar) foram removidos cirurgicamente 
para o preparo das amostras em bloco as quais foram processadas para análise 
imunohistoquímica, e para obtenção de células para cultura. Os marcadores de células-tronco 
mesenquimais STRO-1, CD146 e CD44 foram utilizados para identificar as células. Culturas 
celulares obtidas dos tecidos regenerados foram analisadas pela citometria fluida, e os 
resultados revelaram positividade para tais marcadores. Mineralização, concentração de cálcio 
e potencial adipogênico das células dos tecidos regenerados foram acessados e comparados 
com as células mesenquimais do ligamento periodontal, células-tronco da medula óssea e 
fibroblastos gengivais. Os resultados mostraram a capacidade desses tecidos formarem 
depósitos minerais e adipócitos. Entretanto, o nível de mineralização das células do tecido 
regenerado foi mais baixo que o de células mesenquimais do ligamento periodontal e de 
células-tronco da medula óssea. 
Considerando que as células do ligamento periodontal são muito importantes para o 
processo de regeneração dos tecidos periodontais devido a sua localização e suas propriedades 
de células indiferenciadas, e que a interleucina-11 (I-11) é uma citocina multifuncional que 
participa ativamente do metabolismo ósseo, Leon et al. (2006) realizaram um estudo para 
examinar o efeito da I-11 na diferenciação osteoblástica das células do ligamento periodontal 
de humanos. As células do ligamento periodontal cultivadas foram estimuladas com I-11 e/ou 
ácido ascórbico, com ou sem inibidores para o colágeno tipo 1. A diferenciação osteoblástica 
foi analisada pela atividade de fosfatase alcalina e expressão gênica do marcador RUNX2, 
ostocalcina e sialoproteína óssea utilizando a cadeia de reação da polimerase transcripção 
reversa. O colágeno tipo 1 e o tecido inibidor da produção da metaloproteinase-1 foram 
medidos usando imunoensaios ligados à enzimas. Os resultados mostraram que a I-11 
aumentou a atividade da fosfatase alcanina e do marcador RUNX2, e que na presença de 
ácido ascórbico, aumentaram a osteocalcina e expressão gênica da sialoproteína óssea. A I-11 
induziu a produção de células do ligamento periodontal pelo colágeno tipo 1 e o tecido 
inbidor da metaloproteinase-1. Os autores concluíram que a interleucina-11 e/ou o ácido 
ascórbico induzem a diferenciação osteoblástica das células do ligamento periodontal através 
da produção de colágeno tipo 1. Os resultados também sugerem que a I-11 pode funcionar 
como uma citocina osteopromotora, estimulando a diferenciação osteoblástica das células do 
ligamento periodontal principalmente através da síntese de colágeno tipo 1 e possivelmente 
pela indução do tecido inibidor da metaloproteinase-1. 
Isaka et al. (2001) realizaram um estudo a fim de determinar se as células do 
ligamento periodontal tinham um papel importante no reparo ósseo durante o processo de 
regeneração periodontal. Para tal, foi investigada, in vitro, a expressão de fenótipo 
osteoblástico, tal como atividade da fosfatase alcalina, paratireóide hormônio-dependente 3`e 
acúmulo de adenosina monofosfato cíclica 5´ utilizando células isoladas do ligamento 
periodontal e células isoladas da mandíbula de cães. As raízes de pré-molares extraídos de 
cães foram divididas em grupos: grupo PDL(+), no qual o ligamento periodontal foi 
preservado e grupo PDL(-), no qual o ligamento periodontal foi removido. Essas raízes foram 
respectivamente transplantadas em defeitos ósseos criados cirurgicamente e cobertas com 
uma membrana biológica. Seis semanas após o transplante, os resultados mostraram o 
fenótipo osteoblático em ambas as culturas de células ósseas e do ligamento. Um nova 
inserção de tecido conjuntivo foi observada somente no grupo PDL(+), entretanto o osso 
alveolar foi quase completamente regenerado em ambos os grupos PDL(+) e PDL(-) e a 
quantidade de novo osso formado não foi estatisticamente diferente entre os grupos. Os 
autores concluíram que as células do ligamento periodontal de cães demonstravam a 
capacidade de se diferenciarem em linhagem de células osteobláticas e contribuírem para a 
regeneração periodontal. 
Inanç, Elçin e Elçin (2007) investigaram o potencial de diferenciação de células-tronco 
embrionárias (hESCs) quando co-cultivadas com fibroblastos do ligamento periodontal 
(hPDLF). Após serem expandidas e caracterizadas morfologicamente e 
imunohistoquimicamente, hESC foram co-cultivadas com hPDLF por 28 dias. Dois grupos 
foram determinados: (i) grupo de indução osteogênica com ácido ascórbico, β-glicerofosfato e 
dexametazona contendo as hESC num meio de diferenciação; e (ii) grupo de diferenciação 
espontânea com as hESC também num meio de diferenciação. Mudanças morfológicas nas 
células foram analisadas em um microscópio invertido, e a himunohistoquímica foi realizada 
em espécimes fixados nos dias 1 e 28 usando anticorpos para fosfatase alcalina, osteonectina, 
osteopontina, sialoproteína óssea (BSP), e osteocalcina (OSC). A reação em cadeia da 
polimerase transcriptase reversa foi utilizada para a detecção da ligação octamérica da 
proteína 4, BSP, e o nível de expressão da OSC no mRNA. A mineralização foi observada 
usando Alizarin Red, e as mudanças na superfície nas colônias foram demonstradas com 
microscopia eletrônica de varredura. Os resultados indicaram a viabilidade da diferenciação 
osteogênica das hESCs em co-cultura com hPDLF, e sugeriram o papel dos fibroblastos do 
ligamento periodontal no modelo de diferenciação. Os autores concluíram que avanços neste 
campo podem permitir a aplicação das hESCs na da engenharia tecidual periodontal, 
envolvendo regeneração óssea em áreas de destruição decorrente da doença periodontal. 
Ohta et al. (2008) criaram cavidades dentinárias nas raízes mesiais dos primeiros 
molares de ratos, os quais formam sacrificados 1, 3, 5, 7 e 14 dias após a cirurgia. Em cada 
um destes tempos de sacrifício, as secções foram marcadas histoquimicamente para CD44s, 
CD34, c-KIT, OCNE, cbfa-1 e 5-bromo-deoxiuridina usando anticorpos primários. Para 
análise morfométrica, os níveis de Cbfa-1 e PCNA células positivas foram calculados de um 
número total de células positivas/ 104 µ2 nas cavidades. Os resultados obtidos mostraram que 
células positivas para 5-bromo-2-deoxiuridina foram observadas no ligamento periodontal e 
tinham migrado para áreas de cicatrização. Um pequeno número de célulaspositivas para 
CD44s-, CD34- e c-KIT- foram observadas na medula óssea, mas nada foi observado no 
ligamento periodontal. Células positivas para CD44s- foram observadas somente em cavidade 
do osso alveolar no 5 dia após a cirurgia. Células positivas para CD23- e c-KIT- foram 
observadas somente na cavidade dentinária no 7 dia após a cirurgia. Os valores de Cbfa-1 e 
PCNA tenderam a mostrar um aumento no 7 dia após a cirurgia. Os autores puderam concluir 
que células-tronco mesenquimais e células-tronco hematopoiéticas na medula óssea não estão 
envolvidas na regeneração do periodonto. Células que migraram do ligamento periodontal 
residual regeneraram novo osso alveolar num estágio mais cedo, e a regeneração ao redor da 
dentina nas cavidades foi mais tardia que nas outras partes. 
 Seo et al. (2005) utilizaram o ligamento periodontal de humanos para testar a hipótese 
que o ligamento periodontal criopreservado conteria células-tronco pós-natais recuperáveis. 
Estas células mesenquimais indiferenciadas do ligamento periodontal preservadas pelo frio 
mantiveram as características normais das células mesenquimais do ligamento periodontal, 
incluindo a expressão do marcador de superfície celular STRO-1, a formação de colônias 
celulares, o potencial de diferenciação, a formação de cemento e tecido de regeneração 
semelhante ao ligamento periodontal, além de um cariótipo diplóide normal. Este estudo 
demonstrou que as células-tronco pós-natal podem ser recuperadas a partir de células do 
ligamento periodontal criopreservadas. Promovendo, desta forma, uma acessível prática 
clínica para a utilização de tecidos congelados para isolamento de células-tronco e 
regeneração tecidual. 
Silvério et al.(2008) realizaram um estudo de revisão da literatura focando na 
caracterização in vitro e in vivo das células mesenquimais derivadas de tecidos dentais, e seu 
potencial para promover regeneração dos tecidos periodontais. Os primeiros resultados 
enfatizaram a necessidade de investigações adicionais para determinar a eficácia da expansão 
ex-vivo de células mesenquimais no reparo das estruturas dentais e tecidos periodontais. 
Mesmo com as limitações de cada estudo, as células mesenquimais indiferenciadas do 
ligamento periodontal mostraram uma habilidade de formarem estruturas semelhantes ao 
cemento radicular e ligamento periodontal. Contudo, como estas células são heterogêneas 
devido a sua capacidade de se proliferarem e se diferenciarem em células formadoras do 
tecido periodontal, mais estudos são necessários para investigar a função destas células no 
processo de regeneração. Além disto, células percursoras do folículo dental humano de 
terceiros molares podem ser no futuro, geneticamente modificada in vitro então elas estarão 
hábeis para se diferenciarem em células do tecido periodontal antes de serem transplantadas in 
vivo. Apesar de novos estudos serem necessários para colocar em prática estas terapias 
alternativas, neste momento o melhor entendimento das células-tronco e seus possíveis papéis 
na regeneração tecidual podem ajudar a desenvolver novas abordagens para um tratamento 
mais previsível dos defeitos periodontais. 
Trubiani et al. (2008) utilizaram células mesenquimais indiferenciadas do ligamento 
periodontal de humanos que foram induzidas a osteogênese, semeadas em arcabouços tri-
dimensionais biocompatíveis (esponja de fibrina, substitutos de derivados ósseos) e 
examinadas usando microscopia de luz e eletrônica de varredura e transmissão. Observações 
morfológicas mostraram crescimento extensivo da biomassa celular cobrindo parcialmente os 
arcabouços após 4 semanas de incubação no meio de mineralização. Estes resultados 
indicaram que o ligamento periodontal pode ser facilmente e eficientemente uma fonte 
autológa de células mesenquimais indiferenciadas com uma grande capacidade de expansão e 
habilidade de se diferenciarem em células osteogênicas que podem colonizar e crescerem 
conectadas ao arcabouço biocompatível. 
 Células-tronco adultas multipotentes têm sido isoladas de vários tecidos não neurais. 
Techawattanawisal et al. (2007) relataram pela primeira vez o isolamento de células 
mesenquimais indiferenciadas derivadas do ligamento periodontal com características de 
células-tronco neurais primitivas. Células mesenquimais multipotentes do ligamento 
periodontal de ratos foram cultivadas utilizando sistema de cultura formadora de neurosferas. 
As células foram dissociadas enzimaticamente e cultivadas em meio básico livre de soro 
contendo EGFe β-FGF. Esferas livres expressando, GFAP e vimentina foram formadas em 7 
dias de cultura. Em adição, as esferas expressaram RNAm de fatores de transcripção 
associados à crista neural: Twist, Slug, Sox2 e Sox9. As esferas derivadas do ligamento 
periodontal diferenciaram-se em miotubos multinucledos, células semelhantes a neurônios 
NFM-positivas, células semelhantes a astrócitos e a oligodentrócito Análise da formação de 
colônias de metilcelulose revelou que uma simples célula do ligamento periodontal poderia 
formar uma esfera numa freqüência e aproximadamente 0,01 % do total de células. Estes 
dados indicam que as esferas derivadas do ligamento periodontal contêm células-tronco 
adultas multipotentes capazes de se diferenciarem em ambas as linhagens neural e 
mesodermal, o que sugere que o ligamento periodontal pode ser uma nova fonte de células-
tronco adultas multipotentes, e estas células possam ser usadas no tratamento de várias 
doenças tais como doenças neuronais degenerativas e distrofia muscular. 
Zhou et al. (2008) investigaram a diferença dos marcadores de superfície celular em 
diferentes células periodontais, tais como osteoblastos alveolares (AOs), fibroblastos do 
ligamento peridontal (PDLFs) e fibroblastos gengivais (GFs), e seus potencias de 
diferenciação em fenótipos osteogênicos e adipogênicos. Estas células periodontais foram 
isoladas e a expressão padrão do antígeno de superfície foi analisada pela citometria fluida e 
as caracterizações moleculares e hitológicas das induções osteogênicas e adipogênicas foram 
monitoradas pela reação de cadeia da transcriptase reversa, Western blot e 
imunocitohistologia. Os resultados mostraram que os fenótipos celulares dos AOs foram 
verificados pela alta expressão de CD29 e CD49a, enquanto PDLFs mostraram 
distintivamente baixos níveis de CD63 e CD73. Em indução adipogênica, limitados AOs 
formaram células semelhantes a adipócitos de formato cúbico, enquanto PDLFs formaram 
células semelhantes a adipócitos fusiformes. Todos os três tipos celulares expressaram genes 
osteorelacionados a linha de base. Os AOs demonstraram maior habilidade osteogênica, 
seguidos dos PDLFs e GFs. Através deste estudo, pôde-se concluir que células no osso 
alveolar e ligamento periodontal possuem progenitoras osteogênicas e adipogênicas, 
indicando a possibilidade de sua aplicação para regeneração dos tecidos periodontais. 
Choi (2000), em um estudo piloto, cultivaram células do ligamento periodontal de cães 
e investigaram se essas células eram capazes de formar uma nova inserção do ligamento 
periodontal quando utilizadas sobre a superfície de implantes de titânio. Os implantes com as 
células cultivadas do ligamento periodontal foram colocados nas mandíbulas dos cães. Após 3 
meses de cicatrização, o exame histológico revelou que em algumas superfícies do implante, 
uma camada com tecido semelhante ao cemento com inserção de fibras colágenas tinha sido 
alcançada.Estes resultados demonstraram que células cultivadas do ligamento periodontal 
podem formar tecidos semelhantes a um verdadeiro ligamento periodontal ao redor do titânio, 
o qual têm sido o biomaterial mais utilizado atualmente em implantodontia através do 
processo de osseointegração. 
2.4 Osseointegração 
O advento da osseointegração, fenômeno descrito por Brånemark no final dos anos 60, 
refletiu em avanços notáveis na reabilitaçãode pacientes com perdas dentárias. Ao descrever 
a possibilidade de integração entre um material metálico e o tecido ósseo, o pesquisador sueco 
lançou as bases de uma das áreas mais estudadas pela comunidade odontológica. (NETO, 
2005). 
A reposição de elementos dentários por meio de uma raiz artificial que pode sustentar 
uma prótese gerou uma expectativa positiva de impacto funcional e psicossocial aos 
pacientes, uma vez que a reabilitação com implantes osseointegrados é capaz de melhorar a 
capacidade mastigatória e a satisfação estética dos pacientes (ADELL et al, 1981; LOCKER, 
1998). 
Além das funções reabilitadoras, os implantes osseointegrados possuem a propriedade 
de manter a função, forma e volume ósseo nas regiões onde estiverem instalados, pois 
desempenham a função de estimular a produção de matriz óssea calcificada podendo muitas 
vezes aumentar a densidade óssea na região onde foi inserido o implante. Os implantes atuam 
na biologia óssea local como se fossem uma raiz dental, estimulando a remodelação óssea de 
forma equilibrada (DAVIES, 2003) 
Com a evolução da implantodontia, vários materiais têm sido testados com o objetivo 
de aprimorar os resultados, sejam eles no que tangem a aceleração do processo de 
osseointegração, estabilidade óssea, gengival e estética. Durante as últimas décadas, implantes 
metálicos têm sido os mais freqüentemente utilizados, sendo que o titânio, em sua forma 
comercial pura, se tornou o material de escolha para a fabricação de implantes em cirurgia 
oral e craniofacial (HURÉ et al., 1996). 
2.4.1 Titânio (Ti)
Dentre muitos materiais possíveis, o titânio (Ti) é atualmente considerado o material 
de escolha para a confecção dos implantes intraósseos, pois esse metal possui características 
físicas e químicas excepcionais que permitem a sua instalação nos tecidos vivos sem que haja 
incompatibilidade entre eles. Propriedades físicas como seu coeficiente elástico, de 
deformação e sua resistência à tração são diferentes do tecido ósseo, porém não influenciam 
no sucesso deste tipo de tratamento. Sua grande resistência à fratura possibilita resistir aos 
esforços necessários para uma boa função mastigatória. Quimicamente o titânio é um metal 
muito estável, embora haja uma pequena formação de óxidos em sua superfície, que facilita a 
deposição e adesão da matriz extracelular na interface osso-implante. Estes óxidos se formam 
durante o processo de corte, limpeza e esterilização do implante e ficam aderidos à superfície 
não sendo liberados para o meio. As propriedades supracitadas permitem a cicatrização e a 
manutenção da adesão das estruturas teciduais à superfície do titânio (HANSSON et al, 1983). 
O comportamento osseointegrador do titânio pode também ser otimizado através da 
compreensão das características da superfície sobre as respostas biológicas iniciais (adesão 
celular, proliferação, diferenciação, produção de matriz extracelular, maturação e calcificação 
óssea) (KASEMO, 2002). Diferentes superfícies têm diferentes propriedades de adsorção, e 
estas diferenças estão intimamente relacionadas com aspectos de biocompatibilidade e 
osseointegração (MEACHIM, WILLIAMS, 1993). 
Vários trabalhos têm sido realizados com as mais diferentes abordagens a fim de 
investigar detalhadamente todos os possíveis efeitos da superfície do titânio sobre o 
comportamento das células. 
Maeda et al. (2007) mostraram que a adesão e proliferação celular e a diferenciação 
osteogênica de células-tronco mesenquimais de camundongos em disco de titânio foram 
significativamente similares a aqueles na superfície plástica de cultura, elegendo o titânio 
como um excelente material para o uso no reparo de tecido duro no campo da engenharia de 
tecido ósseo. 
2.4.2 Características superficiais e respostas celulares 
Dentre as etapas pré-clinicas do desenvolvimento de uma nova superfície, os ensaios 
com cultura de células proporcionam um ambiente semelhante ao fisiológico com as 
vantagens de poder controlar fatores bioquímicos, determinar a citotoxicidade do material e a 
expressão fenotípica do tipo celular investigado (DELIGIANNI et al., 2001).
A interação das células e um biomaterial, ou biocompatibilidade, depende das 
propriedades de superfície do material, tais como a energia superficial (hidrofilicidade), 
textura, rugosidade e composição química. Estas propriedades determinam como as moléculas 
biológicas vão aderir à superfície e, mais particularmente, determinam a orientação das 
moléculas aderidas. Elas também determinam o comportamento celular no contato. A 
comparação do comportamento de diferentes tipos de células mostra que elas reagem 
diferentemente de acordo com a energia superficial (hidrofilicidade ou molhabilidade), 
rugosidade e composição química das superfícies (KASEMO, 2002; STIEHLER et al., 2007; 
BOYAN et al. 2002). 
O termo “adesão” no biomaterial engloba diferentes fenômenos: a fase de adsorção, a 
qual ocorre rapidamente e envolve pequenas ligações físico-químicas entre as células e o 
material, tais como ligações iônicas, força de Van der Walls, etc., e a fase de adesão, que 
ocorre lentamente envolvendo moléculas biológicas, tais como proteínas da matriz celular, 
proteínas de membrana celular e proteínas do citoesqueleto, as quais interagem juntas para 
induzir sinal de transdução, promovendo a ação dos fatores de transcripção e 
consequentemente regulando a expressão gênica. Esta fase é a mais importante, pois a 
qualidade desta adesão influenciará na morfologia e na capacidade para proliferação e 
diferenciação das células (ANSLME, 2000). 
Características hidrofóbicas e hidrofílicas de um material são de grande importância 
para a adesão celular. A adesão celular é geralmente melhor em superfícies hidrofílicas. 
Quando inserido no meio biológico, o material é condicionado pelos componentes do fluido 
biológico. O pH, composição iônica, energia de ligação, temperatura, grupo funcional de 
proteínas são fatores determinantes para adsorção protéica. A energia da superfície pode 
influenciar a adsorção protéica e o arranjo estrutural das proteínas no material. O papel 
principal das proteínas ósseas é atrair as células ósseas. Quando ocorrem mudanças 
conformacionais destas devido a superfícies hidrofóbicas e/ou baixa energia superficial, sua 
afinidade com o receptor da superfície celular das células ósseas é diminuída, atraindo 
fibroblastos e formando tecido fibroso em torno do material (ANSELME, 2000). 
A molhabilidade, avaliada pela medição do ângulo de contato de um líquido com a 
superfície do material, sofre influência da rugosidade superficial do titânio, o que interfere na 
resposta inicial do hospedeiro principalmente no que diz respeito à adsorção de proteínas 
plasmáticas, as quais desempenham um processo importante na sinalização para a migração 
de células indiferenciadas para a superfície do material (RUPP et al. 2004). 
Atribui-se à rugosidade de superfície um papel importante no desempenho clínico do 
biomaterial na osseointegração tornando, portanto, a caracterização de superfície do 
biomaterial um aspecto necessário para a interpretação adequada do efeito da rugosidade para 
a aposição óssea. A rugosidade da superfície do implante foi descrita como um dos fatores 
que favorecem a interação do material com os componentes plasmáticos e celulares 
responsáveis pela sinalização e iniciação da deposição de matriz extracelular por células 
ósseas e influenciam diretamente a cicatrização no sítio de colocação e posteriormente a 
osseointegração (ALBREKTSON et al. 1981), propiciando a aplicação precoce de carga 
mecânica sobre esses implantes, além de assegurar estabilidade a longo prazo, que é o 
objetivo primordial de qualquer material para uso protético. 
Alguns estudos encontrados na literatura têm comparado o efeito de várias superfícies 
em estudos in vitro. Embora não se saiba qual a rugosidade ideal para um materialpara 
implantação no tecido ósseo, há larga concordância de que a topografia é um poderoso 
modulador do comportamento celular e, portanto, um fator de influência direta na 
performance clínica do material. 
Buser et al. (1991) e Frazolin et al. (2008), em estudos experimentais comparando 
diferentes tipos de superfície, concluíram que os melhores resultados foram os das superfícies 
texturizadas. Deligiannni et al. (2001), Anselme et al.(2002) e Keller (1998) observaram que 
células da medula óssea e osteoblastos cultivados em diferentes superfícies de titânio, se 
aderem e respondem melhor em superfícies com maior rugosidade. Os estudos de Perizzolo, 
Lacifield e Brunette (2001), Sul et al. (2002) e Sena et al. (2003) também indicaram que a 
proliferação de células osteobálsticas pode ser melhor em superfícies rugosas. 
Entretanto, Lange et al. (2002), em seus experimentos com células osteoblásticas MG-
63, Huang et al. (2004) , com as U-2 OS, e Cochran et al. (1994) e Gay et al. (2007) com 
células do ligamento periodontal, mostraram que a adesão e proliferação celular foi melhor 
em superfícies de titânio lisas quando comparadas com as rugosas. 
Anselme (2000), Faghihi et al. (2006), Guehennec et al. (2007) analisaram a adesão, 
proliferação e diferenciação de células osteoblásticas da calvária de ratos (MC3T3-E1) e 
células osteoblásticas humanas em superfícies de titânio Ti6A14V com variadas rugosidades, 
e observaram que textura superficial do biomaterial influenciava na resposta celular e que a 
rugosidade influencia na adesão e proliferação das células à superfície do titânio. 
As alterações superficiais resultam em variações não apenas nos aspectos físicos do 
material, mas também em sua composição química. Superfícies obtidas por diferentes tipos de 
tratamento podem apresentar características topográficas semelhantes embora com 
desempenho biológico distintos, sugerindo que há grande probabilidade de não apenas a 
alteração topográfica como também a modificação na estrutura química da superfície, possam 
ter efeito na resposta celular. 
Santiago et al. (2005) em seu experimento com células osteoblásticas de camundongo, 
analisaram amostras de titânio comercialmente puro (Ti) com diferentes propriedades de 
superfície por meio de ataques químico e físicos, e os resultados sugeriram que os tratamentos 
utilizados foram favoráveis às respostas biológicas. 
Wang et al (2008) mostraram que os métodos de tratamentos químicos de superfície 
do titânio utilizados em seu estudo influenciavam positivamente na adesão, proliferação e 
diferenciação das células-tronco mesenquimais da medula de coelhos.
A diferenciação dos efeitos químicos e topográficos da superfície não está clara. 
Entretanto é unânime entre os pesquisadores que as propriedades físico-químicas das 
superfícies dos implantes exercem um papel fundamental no sucesso do fenômeno biológico 
da osseointegração. As interações moleculares e celulares que norteiam o destino biológico 
dos implantes ocorrem nos estágios iniciais da cicatrização (AMARANTE, 2001). 
Na busca por superfícies que melhorem as respostas biológicas e supram à necessidade 
de obter uma rápida osseointegração, várias pesquisas têm sido desenvolvidas, modificando 
estas superfícies pelos processos mais variados (SILVA, 2005) que envolvem métodos 
mecânicos, químicos, e físicos de tratamento de superfície, tais como: a aspersão com plasma 
de titânio, jateamento com óxido de titânio, deposição a laser de carbeto de titânio, 
condicionamento ácido, e outros (XUANYONG, PAUL, CHUANXIAN, 2004). 
2.4.3 Tratamento de superfície 
Dentre os métodos de tratamento da superfície pode-se citar a nitretação iônica ou 
nitretação a plasma, que apresenta excelentes propriedades mecânicas, estabilidade química e 
biocompatibilidade quando aplicada ao titânio (PARK et al., 2003). 
2.4.3.1 Nitretação iônica 
A nitretação iônica (ion-nitriding) é um processo de tratamento termoquímico, usado 
para endurecimento superficial de metais ferrosos e um crescente número de materiais não 
ferrosos como ligas de titânio e alumínio (MICHEL et al.,1995), pela obtenção de uma 
camada de nitretos, que eleva a resistência ao desgaste das superfícies tratadas (NICOLETO, 
TUCCI, ESPOSITO, 1996). 
Além dos fatores ambientais, várias são as vantagens desta técnica sobre as 
convencionais. As mais importantes são: baixa temperatura de tratamento, melhor controle da 
espessura da camada, tempo de tratamento inferior, uniformidade na espessura da camada, 
nitretação de partes da peça, mais economia (ALVES Jr, 1995). 
Este processo, também conhecido como nitretação por plasma, consiste em ionizar um 
gás ou mistura gasosa, contendo nitrogênio, através de uma descarga luminescente, gerada por 
uma diferença de potencial entre a amostra (catodo) e o anodo, em uma atmosfera a baixa 
pressão. Os íons produzidos no plasma são acelerados em direção a amostra (catodo), 
chocando-se com ela e fornecendo energia suficiente para aquecê-la até a temperatura de 
nitretação (O’BRIEN J.M.; GOODMAN D, 1991). 
 Figura 1. Esquema básico de um equipamento para nitretação iônica (ALVES Jr, 1995). 
O conceito básico no uso da nitretação iônica para melhorar as propriedades 
superficiais de uma liga de titânio é fundamentado na possibilidade de formar nitretos ou 
carbetos abaixo da superfície da liga. Os nitretos e carbetos de titânio são materiais duros que 
melhoram as propriedades tribológicas da superfície, ou seja: aumentam a resistência ao 
desgaste e a dureza superficial (YILBAS, 1996). 
Pereira (2008) com o objetivo de melhorar as propriedades tribológicas da superfície 
do titânio usado em implantes dentais, particularmente sua resistência ao desgaste, 
investigaram o efeito da nitretaçäo em plasma sobre as referidas propriedades de amostras de 
titânio. A análise dos dados obtidos indicou que a nitretaçäo em plasma aumenta a resistência 
superficial do titânio. 
Com modelo de linhagem celular (L929 fibroblastos de ratos), Abidzina et al. (2007) 
observaram que a adesão celular à superfície do titânio é favorecida pelo tratamento de 
superfície com irradiação iônica de baixa energia (plasma). 
Neto (2005) utilizou amostras de titânio nitretadas a plasma a fim de analisar suas 
propriedades de superfícies e puderam concluir que as superfícies nitretadas apresentaram 
melhores resultados no que se refere a molhabilidade e rugosidade que as amostras sem 
tratamento, e que tanto a adesão como a proliferação de células (linhagem Osteo-1) nas placas 
nitretadas foram superiores às placas sem tratamento. 
3 OBJETIVOS 
3.1 Objetivo geral: 
• O presente estudo tem como objetivo avaliar, através de experimentos in vitro
utilizando cultura celular, a capacidade de adesão das células mesenquimais 
provenientes da medula óssea de camundongos e do ligamento periodontal de 
ratos quando postas em contato com diferentes superfícies de Titânio (polida e 
tratada por plasma). 
3.2 Objetivos específicos: 
• Analisar a capacidade de adesão das células mesenquimais da medula óssea de 
camundongos sobre as superfícies de titânio polidas e tratadas por nitretação 
iônica (plasma). 
• Analisar a capacidade de adesão das células mesenquimais do ligamento 
periodontal de ratos sobre as superfícies de titânio polidas e tratadas por 
nitretação iônica (plasma). 
4 METODOLOGIA 
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade 
Federal do Rio Grande do Norte - UFRN (pareceres nº 022/07 e 102/08) e foi dividido em 
duas etapas. Na primeira foi realizado o preparo das amostras através do tratamento de 
superfície das placas de titânio no Labplasma (Departamento de Física da UFRN). Na 
segunda foi realizado um ensaio in vitro com células isoladas da medula óssea de 
camundongos e do ligamento periodontal de ratos e cultivadas sobre as placas de titânio 
tratadas e a superfície controle (plástico).Esta etapa foi realizada no laboratório de cultura de 
células do Departamento de Bioquímica do Centro de Biociências da UFRN. 
4.1 Preparo das amostras 
De acordo com a literatura, o número de amostras utilizadas não têm sido elucidado 
em nenhum dos estudos analisados, presumindo-se que o número das amostras de titânio não 
influencia nos resultados de adesão celular. Assim sendo, o número de amostras deste 
experimento foi determinado aleatoriamente. 
As amostras de titânio foram preparadas segundo o protocolo estabelecido no 
Labplasma (Departamento de Física da UFRN). Doze discos de titânio grau II ASTM F86 nas 
dimensões de 15mm de diâmetro por 1,5mm de espessura, foram embutidas em resina 
poliéster e lixados gradualmente com lixas de SiC, de abrasividade 220, 360, 400, 600, 1200 e 
2000 água corrente e depois polidas (politriz AROTEC, modelo APL-2 e série 212560, 
BRASIL) com pano de polimento OP-CHEM, sílica coloidal e água oxigenada (H2O2) 20Vol. 
até um acabamento final de 0,04μm. 
Em seguida, as amostras foram desembutidas e limpas em banho de ultrasom com 
acetona por 10 minutos com objetivo de remover contaminantes que pudessem interferir no 
processo de nitretação iônica. As amostras foram secadas em temperatura ambiente e 
colocadas no sistema de nitretação a plasma. 
 
4.1.1 Protocolo de Nitretação 
Após o polimento e limpeza, seis amostras foram colocadas em uma câmara de aço 
inoxidável (reator), com 400 mm de diâmetro e 400 mm de comprimento, hermeticamente 
fechada para receber o tratamento de superfície. Foi utilizada a configuração no reator de 
plasma para nitretação em gaiola catódica. 
Internamente, a câmara possuia um eletrodo em forma de disco, sobre o qual foi 
colocada a amostra. Inicialmente foi feito um vácuo no reator até uma pressão de 10-1 mbar e 
então foi introduzido hidrogênio com um fluxo de 12sccm, como gás de arraste de impurezas, 
até uma pressão de 1,6 mbar por 20 minutos. Após esta etapa, o N2 a 3sccm foi introduzido 
até conseguir uma atmosfera de trabalho estável em torno de 680V, 0,5 miliampére (mA), 
temperatura de 450ºC e pressão de nitretação de 2,5mbar. Nestas condições as amostras foram 
nitretadas por 60minutos. 
As atmosferas do plasma foram configuradas obedecendo um fluxo de gases de 
15sccm (tabela 1). 
Tabela 1. Parâmetros de tratamento com plasma de nitrogênio. 
Grupo 
experimental 
Atmosfera do 
plasma 
Tempo de 
tratamento 
Pressão do 
plasma 
Temperatura do 
plasma 
Fluxo do gás 
total 
Polidas - - - - - 
Gaiola catódica N20%H80% 1h 2,5mbar 450°C/17.5mA 15sccm 
 
Figura 2. Equipamento para nitretação iônica Figura 3. Esquema do equipamento para nitretação 
 iônica em gaiola catódica (SOUSA, et al.2008). 
4.2 Caracterização das amostras 
Depois de terminado o tratamento de superfície, as amostras foram seqüencialmente 
submetidas a ensaio de caracterização superficial como segue: 
4.2.1Composição de camada 
A composição da camada superficial foi avaliada pela difração de raios-X. 
4.2.2 Textura superficial 
Uma amostra de cada grupo foi submetida à microscopia eletrônica de varredura 
(MEV) para análise das características de textura superficial em ampliações de 25, 100 e 200 
vezes. 
4.2.3 Rugosidade 
Para análise da rugosidade foi mensurado o parâmetro Ra, utilizando um rugosímetro 
modelo SURTRONIC 3, (Taylor-Hobson Inc, USA) com cut-off igual a 0.25. As medidas 
foram tomadas em três direções diferentes, em ângulos de aproximadamente 1200 com 
dispersão nestas três direções inferior a 10%. 
4.2.4 Molhabilidade 
Após o tratamento a plasma, cinco amostras de cada grupo experimental foram 
submetidas ao ensaio de molhabilidade. A técnica utilizada foi a determinação do ângulo de 
contato estático ou técnica da gota séssil para cada uma das amostras e mensurada por dois 
observadores. As amostras foram colocadas em uma superfície plana e utilizando uma 
micropipeta digital de volume ajustável funcionando com uma solução fisiológica, 
posicionada de forma perpendicular e muito próxima à superfície depositando 0,25mL da 
solução sobre a superfície da amostra. 
De forma a padronizar o teste e por serem gotas muito pequenas, foram feitos 
acompanhamento da mudança do ângulo por 01 seg., 30 seg. e 60 seg. 
4.3 Esterelização das amostras 
Em seguida, todas as amostras (nitretadas em gaiola catódica e polidas) foram 
acondicionadas em placas de cultura de 24 poços de 2cm2 de área e esterilizadas por radiação 
gama no DEN (Departamento de Energia Nuclear da UFPE – Universidade Federal de 
Pernambuco). A dose total de radiação por amostra foi de 25 kGy, liberada a uma dose 
média de 8,993 kGy/h (2h 46minutos a uma distância de 50mm), em irradiador 
GAMMACELL 220 Excel (MDS Nordion, Ca). 
4.4 Cultura de células 
4.4.1 Obtenção das células da medula óssea de camundongos 
Foi realizada a extração da medula óssea de dois camundongos albinos machos Swiss, 
com 2 meses de idade, com peso em média de 28,5 g, procedentes do Laboratório de 
Cronobiologia do Departamento de Morfologia da UFRN, seguindo-se o protocolo de 
Maniatopoulos, Sodek e Melcher (1988). Os animais, depois de anestesiados, foram 
dissecados sob condições assépticas para remoção dos fêmures e tíbias. 
Os ossos recém-dissecados foram mantidos em um tubo cônico contendo PBS (pH 
7.4), até que foi feita a remoção de toda porção de tecido muscular aderido aos ossos. Com 
auxílio de uma tesoura de ponta reta foram feitos cortes nas epífises dos ossos (figura 4) e, 
utilizando uma seringa de 1mL, a medula foi extraída através da inserção da agulha no canal 
medular e posterior lavagem do canal utilizando meio de cultura básico α-MEM enriquecido 
com 50 mg/L de Sulfato de Gentamicina e 2 mg/L de Anfotericina B (Cultilab, Brasil) e 
suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Gibco) (figura5). 
 
Figura 4. Corte das epífises ósseas. Figura 5. Extração da medula. 
4.4.2 Cultivo das células da medula óssea 
A medula extraída foi cultivada em meio básico (α-MEM contendo antibióticos e 
suplementado com 10% de FBS), por 72 horas, em atmosfera úmida com 5% de CO2 a 37ºC. 
Após esta etapa, o meio foi trocado - o que possibilitou a remoção das células não-aderidas da 
cultura - e incubado novamente por três dias em meio básico. Depois dessas etapas as células 
foram tripsinizadas em 0,25% de Tripsina contendo 1mM de EDTA (Gibco) e uma alíquota 
de 0,1 mL foi retirada para se fazer a contagem das células na Câmara de Neubauer, 
utilizando o método da exclusão de células coradas pelo Azul de Trypan. 
4.4.3 Obtenção das células do ligamento periodontal de ratos 
Para obtenção do ligamento periodontal dois ratos albinos, machos, saudáveis, da 
linhagem Wistar com quatro meses de idade, pesando em média 250 gramas (figura 6), 
obtidos do biotério do Departamento de Farmacologia do Centro de Biociências da 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, foram sacrificados com dose letal do 
anestésico (Ketamina) administrado por via intramuscular. 
Seguindo-se o protocolo de Akizuki et al.(2005), em uma câmara de fluxo laminar e 
sob condições assépticas os animais foram dissecados para remoção dos elementos dentários 
(incisivos), os quais foram imediatamente mantidos em um meio básico α-MEM contendo 50 
mg/L de Sulfato de Gentamicina e 2 mg/L de Anfotericina B (Cultilab, Brasil) (figura 7). 
 
 Figura 6. Rato Wistar. Figura 7. Incisivos no meio básico α-MEM. 
 
O ligamento periodontal foi removido através da raspagem delicada da superfície 
radicular com o uso de uma lâmina de bisturi (figuras 8 e 9) e encubado em uma solução de 
tripsina/EDTA (0,25% de Tripsina contendo 1 mM de EDTA – Cultilab/Brasil) por 10 
minutos. Em seguida,