Processossequenciaisdivergencia-Rocha-2022

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SISTEMÁTICA E EVOLUÇÃO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PROCESSOS SEQUENCIAIS DA DIVERGÊNCIA CITOGENÔMICA EM 
DONZELINHAS DO GÊNERO Stegastes JENYNS, 1840 (POMACENTRIDAE) DO 
ATLÂNTICO: VARIAÇÃO INTER E INTRAESPECÍFICA E ANÁLISE DE ZONA 
HÍBRIDA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MARSÍLIO SECUNDO PEREIRA DA ROCHA _______________________________________ 
Dissertação de Mestrado 
Natal/RN, setembro de 2022 
 
 
MARSÍLIO SECUNDO PEREIRA DA ROCHA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PROCESSOS SEQUENCIAIS DA DIVERGÊNCIA CITOGENÔMICA EM 
DONZELINHAS DO GÊNERO Stegastes JENYNS, 1840 (POMACENTRIDAE) DO 
ATLÂNTICO: VARIAÇÃO INTER E INTRAESPECÍFICA E ANÁLISE DE ZONA 
HÍBRIDA 
 
 
 
 
 
Dissertação apresentada ao curso de Pós-
graduação em Sistemática e Evolução, da 
Universidade Federal do Rio Grande do 
Norte, como requisito para à obtenção do 
título de Mestre em Sistemática e Evolução 
 
Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina 
 
 
 
 
 
 
 
NATAL-RN 
2022 
 
 
 Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN 
Sistema de Bibliotecas - SISBI 
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - Centro de 
Biociências - CB 
 
 Rocha, Marsílio Secundo Pereira da. 
 Processos sequenciais da divergência citogenômica em 
donzelinhas do gênero Stegastes Jenyns, 1840 (Pomacentridae) do 
Atlântico: variação inter e intraespecífica e análise de zona 
híbrida / Marsilio Secundo Pereira da Rocha. - 2022. 
 65 f.: il. 
 
 Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do 
Norte, Centro de Biociências, Programa de Pós-graduação em 
Sistemática e Evolução. Natal/RN, 2022. 
 Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina. 
 
 
 1. Citogenética de peixes - Dissertação. 2. Evolução 
cariotípica - Dissertação. 3. Citotaxonomia - Dissertação. 4. 
Inversões pericêntricas - Dissertação. 5. DNAr - Dissertação. I. 
Molina, Wagner Franco. II. Universidade Federal do Rio Grande do 
Norte. III. Título. 
 
RN/UF/BSCB CDU 575 
 
 
 
 
 
Elaborado por KATIA REJANE DA SILVA - CRB-15/351 
 
 
MARSÍLIO SECUNDO PEREIRA DA ROCHA 
 
 
PROCESSOS SEQUENCIAIS DA DIVERGÊNCIA CITOGENÔMICA EM 
DONZELINHAS DO GÊNERO Stegastes JENYNS, 1840 (POMACENTRIDAE) DO 
ATLÂNTICO: VARIAÇÃO INTER E INTRAESPECÍFICA E ANÁLISE DE ZONA 
HÍBRIDA 
 
Dissertação apresentada ao curso de Pós-
graduação em Sistemática e Evolução, da 
Universidade Federal do Rio Grande do 
Norte, como requisito para a obtenção do 
título de Mestre em Sistemática e Evolução 
 
 
Aprovada em: 22/08/2022 
 
BANCA EXAMINADORA 
 
______________________________________ 
Prof. Dr. Wagner Franco Molina 
Orientador(a) 
UNIVERSIDADE FERDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
 
______________________________________ 
Dr(a). Karlla Danielle Jorge Amorim 
Membro externo 
UNIVERSIDADE FERDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
 
______________________________________ 
Dr. Gideão Wagner Werneck Félix da Costa 
Membro externo 
UNIVERSIDADE FERDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
À minha família. 
 
AGRADECIMENTOS 
 
Agradeço a Deus por todas as coisas. 
A minha família por todo cuidado, incentivo, amor e amparo. Sou grato 
especialmente aos meus pais, Maria José Pereira da Rocha e Marcos Carlos Secundo 
da Rocha, que não economizaram esforços para que esse sonho fosse concretizado. 
Expresso minha gratidão a todos os amigos e colegas que me acompanharam 
durante essa jornada. Dedico especial carinho aos preciosos amigos de graduação: 
Arielly Chanttal Moreira Soares, Artur Gomes Guirra, Eduarda Faustino Gomes, 
Heloysa Farias da Silva, Jéssica Caroline Medeiros Silva e Milena Kelly Cruz Araújo 
do Nascimento. 
A todos os professores e mestres que fizeram parte da construção dessa 
fortaleza chamada de conhecimento. Especialmente ao Professor Dr. Max Rocha 
Quirino e ao Professor Dr. Thiago Emmanuel Araújo Severo. 
Agradeço a todos os colegas e amigos do LGRM por toda colaboração ao 
longo do desenvolvimento do presente trabalho. Sem essas mentes unidas nada disso 
seria possível. Agradeço especialmente ao Professor Dr. Wagner Franco Molina pela 
oportunidade de desenvolvimento dessa pesquisa sob sua supervisão e orientação. 
Ao Programa de Pós-graduação em Sistemática e Evolução pela assistência 
e orientação ao longo dessa trajetória. 
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) 
pela concessão da bolsa que foi fator chave para o desenvolvimento dessa pesquisa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Na Natureza, nada se cria, nada se perde, tudo se transforma. 
Antoine Lavoisier 
 
RESUMO 
 
A família Pomacentridae (donzelinhas) constitui um grupo de peixes extremamente 
diverso e abundante em regiões oceânicas tropicais e subtropicais. No Atlântico Sul 
Ocidental ocorrem quatro gêneros dos quais Stegastes é o mais representativo. 
Variações na coloração e sobreposição de caracteres merísticos tornam a taxonomia 
das espécies do gênero em certos casos incerta. Neste sentido, as formas insulares 
S. rocasensis, S. sanctipauli e S. fuscus trindadensis, têm merecido atenção quanto 
ao seu status taxonômico e relações com as espécies costeiras S. fuscus e S. 
variabilis. No corrente trabalho são apresentadas informações citogenômicas, por 
meio da hibridização in situ fluorescente de sequências DNAr da maioria das espécies 
do gênero Stegastes da costa Atlântica da América do Sul, incluindo as dos 
Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP), Atol das Rocas (AR) e Ilha de 
Trindade (IT). Adicionalmente, foram investigados os padrões cariotípicos em uma 
provável zona de hibridização das espécies S. fuscus e S. variabilis no litoral do Rio 
Grande do Norte, região Nordeste do Brasil. As espécies apresentaram 2n=48, com 
altos valores de NF (88-90). A heterocromatina tem distribuição similar, com blocos 
conspícuos nas regiões centroméricas e pericentroméricas. Os loci Ag-RONs são 
únicos, com exceção de S. variabilis, que apresentou sítios múltiplos. As amostras de 
S. rocasensis do AR e ASPSP (previamente S. sanctipauli), possuem cariótipos 
similares, e especificidades estruturais como um par de cromossomos portador de 
sítios DNAr 18S e 5S colocalizados, que corroboram a ausência de divergência 
citogenética entre elas. S. fuscus (trindadensis) da IT apresentou um arranjo sintênico 
dos sítios DNAr 18S e 5S adjacentes, em contraste com S. fuscus do litoral, no qual 
eram independentes, indicando uma variação conspícua que lhe confere um status de 
Unidade Evolutivamente Significativa. S. variabilis apresentou arranjos DNAr 18S e 
5S sintênicos em regiões transcricionalmente ativas, demonstrando que tal 
organização não impede sua funcionalidade gênica. Padrões citogenéticos de 
amostras de S. variabilis e S. fuscus em uma possível zona híbrida, não revelaram 
cariótipos intermediários, sugerindo um evento esporádico raro e não mantido 
contemporaneamente. Os padrões citogenéticos das espécies permitem clara 
distinção citotaxonômica nos níveis de espécie e categorias intraespecíficas (S. 
fuscus) e confirma uma evolução cromossômica, numericamente conservada, mas 
predominantemente modelada por múltiplas inversões pericêntricas ao longo da 
história evolutiva deste gênero. 
Palavras-Chave: Citogenética de peixes, evolução cariotípica, citotaxonomia, 
inversões pericêntricas, DNAr. 
 
ABSTRACT 
 
Pomacentridae (damselfishes) constitute an extremely diverse and abundant group of 
fishes in tropical and subtropical oceanic regions. In the western South Atlantic, the 
genus Stegastes is the most representative. Variations in coloration and overlapping 
meristic characters make the taxonomy ofthe Atlantic species of this genus in some 
cases imprecise. In this regard, the taxonomic status, and relationships of insular 
nominal forms, such as S. rocasensis, S. sanctipauli, and S. fuscus trindadensis, has 
received increasing attention. Thus, in the current study, we performed population and 
interspecific cytogenetic analyses, including the patterns of rDNA sequence 
organization, of Stegastes species endemic to the Western Atlantic coast, and the 
regions of São Pedro e São Paulo Archipelago (SPSPA), Rocas Atoll (RA) and 
Trindade Island (TI). Additionally, the karyotypic patterns of S. fuscus and S. variabilis 
were investigated in a probable hybridization zone on the coast of Rio Grande do 
Norte, Northeast region of Brazil. The species presented 2n=48, with high NC values 
(chromosome arms; 88-90). Heterochromatin showed similar interspecific distribution, 
with conspicuous blocks in the centromeric and pericentromeric regions. The Ag-RONs 
loci are unique, except for S. variabilis, which showed multiple sites. Samples of S. 
rocasensis from RA and SPSPA (previously S. sanctipauli), showed similar karyotypes 
and rDNA site arrangements. Stegastes fuscus (trindadensis) from TI showed a 
syntenic arrangement of the 18S and 5S rDNA sites, in contrast to the S. fuscus 
population from the coast, whose sites occur on different chromosomes. This 
conspicuous karyotypic variation indicates an Evolutionarily Significant Unit status for 
this island population. Stegastes variabilis showed transcriptionally active 18S and 5S 
syntenic rDNA arrangements, demonstrating that such organization does not impede 
its gene functionality. Added to molecular and morphological data, S. rocasensis/S. 
sanctipauli also share the same cytogenetic patterns, supporting that it is the same 
species. Population analyses of S. variabilis and S. fuscus in a hybridization zone did 
not reveal intermediate karyotypes, suggesting that hybridization in this region may be 
sporadic, rare, or time-limited events. Karyotypic evolution in Stegastes revealed 
conspicuous differentiation, with clear cytotaxonomic distinctiveness, markedly shaped 
by multiple pericentric inversions. Analyses of the dynamics of repetitive sequences in 
these species will contribute to elucidating the high level of chromosomal differentiation 
in this group of reef fishes. 
 
Keywords: Fish cytogenetics, karyotypic evolution, cytotaxonomy, pericentric 
inversions, rDNA. 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1 – Distribuições geográficas reportadas para as espécies Stegastes 
fuscus [■], Stegastes variabilis [■], Stegastes rocasensis [■], 
Stegastes rocasensis (ASPSP) [■] e Stegastes fuscus (IT) [■] 
(AquaMaps, 2019; GBIF Secretariat, 2021) no Oceano Atlântico 
Ocidental......................................................................................... 
 
 
 
 
15 
Figura 2 – Mapa dos locais de coleta das espécies S. fuscus, S. variabilis, S. 
rocasensis, S. rocasensis (ASPSP) e S. fuscus (IT). As ilustrações 
representam indivíduos juvenis de cada espécie. ASPSP - 
Arquipélago de São Pedro e São Paulo: AR – Atol das Rocas; FNA 
- Arquipélago de Fernando de Noronha; CRN – Costa do Rio 
Grande do Norte; IT – Ilha de Trindade........................................... 
 
 
 
 
 
23 
Figura 3 – Mapa dos locais de coleta dos espécimes de S. fuscus e S. 
variabilis da costa do Rio Grande do Norte, região Nordeste do 
Brasil................................................................................................ 
 
 
24 
Figura 4 – 
 
 
 
Figura 5 – 
 
 
 
 
Figura 6 – 
 
Figura 8 – 
 
 
Cariótipos das espécies de Stegastes por meio de coloração 
convencional com Giemsa (sítios Ag-RONs, em destaque), 
bandamento-C e hibridização in situ com sondas DNAr 18 e 5S. 
Barra = 5μm..................................................................................... 
Relações filogenéticas baseadas em dados moleculares de 
espécies da subfamília Microspathodontinae de diferentes regiões 
oceânicas, associadas às informações citogenéticas disponíveis. 
Adaptado de Souza et al. (2017) e McCord et al. 
(2021) ............................................................................................. 
Exemplares das espécies costeiras S. fuscus (a, c) e S. variabilis 
(b, d). a, b. Adultos. c, d. Juvenis. Barra=1cm................................ 
Metáfases exibindo variação de marcações Ag-RONs (3 a 6 sítios) 
em indivíduos de S. variabilis (Tabatinga a, b; Santa Rita c, d) e S. 
fuscus (Tabatinga e, f; Santa Rita g, h, i). Barra=5µm.................... 
 
 
 
 
33 
 
 
 
 
35 
 
45 
 
 
48 
 
 
LISTA DE GRÁFICOS 
 
Figura 7 – Frequência de sítios Ag-RONs em indivíduos de S. fuscus (azul 
listrado) e S. variabilis (vermelho listrado) da Praia de 
Tabatinga, Nísia Floresta – RN e S. fuscus (azul) e S. variabilis 
(vermelho) da Praia de Santa Rita, Extremoz – RN 
(direita)........................................................................................ 
 
 
 
 
46 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1 – Revisão dos dados citogenéticos da família Pomacentridae 
(Adaptado de Arai 2011) ................................................................ 
 
19 
Tabela 2 – Parâmetros cariotípicos e frequência populacional de sítios Ag-
RONs em S. fuscus e S. variabilis (Praia de Tabatinga, Nísia 
Floresta – RN), Nordeste do Brasil. * Representam valores modais 
para as espécies.............................................................................. 
 
 
 
47 
Tabela 3 – Parâmetros cariotípicos e frequência populacional de sítios Ag-
RONs em S. fuscus e S. variabilis (Praia de Santa Rita, Extremoz 
– RN), Nordeste do Brasil. * Representam valores modais para as 
espécies.......................................................................................... 
 
 
 
47 
 
 
 
 
 SUMÁRIO 
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 13 
1.1. Família Pomacentridae ..................................................................................... 13 
1.2. Filogenia e taxonomia do gênero Stegastes ..................................................... 16 
1.3. Aspectos citogenéticos em Pomacentridae ...................................................... 17 
1.4. Análise de sequências de DNA repetitivo em peixes ........................................ 20 
2. OBJETIVOS ..................................................................................................... 21 
2.1. Geral ................................................................................................................. 21 
2.2. Objetivos específicos ........................................................................................ 21 
3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 21 
3.1. Material ............................................................................................................. 21 
3.2. Métodos ............................................................................................................ 25 
3.2.1. Preparações Cromossômicas .......................................................................... 25 
3.2.1.1 Estimulação mitótica com lisados bacterianos e fúngicos e obtenção de 
cromossomos mitóticos ............................................................................................. 25 
3.2.1.2. Preparação das lâminas ............................................................................... 25 
3.2.2. Bandamentos cromossômicos ......................................................................... 26 
3.2.2.1. Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs) ...................... 26 
3.2.2.2. Detecção de heterocromatina constitutiva (bandamento C) ......................... 26 
3.2.2.3. HibridizaçãoFluorescente in situ (FISH) ...................................................... 26 
3.2.2.3.1. Obtenção das sondas para hibridização cromossômica ............................ 26 
3.2.2.3.2. Hibridização cromossômica ....................................................................... 27 
3.2.3. Classificação cromossômica e montagem cariotípica ..................................... 27 
3.2.4. Geoprocessamento e elaboração de figuras ................................................... 27 
4. CAPÍTULO I...................................................................................................... 29 
Processos carioevolutivos em espécies do gênero Stegastes do Oceano Atlântico . 29 
5. CAPÍTULO II ..................................................................................................... 42 
Polimorfismos de sítios ribossomais Ag-RONs em populações simpátricas costeiras 
de S. fuscus e S. variabilis do Atlântico Ocidental ..................................................... 42 
6. CONCLUSÕES GERAIS .................................................................................. 55 
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 57
Evolução citogenômica em donzelinhas 13 
1. INTRODUÇÃO 
1.1. Família Pomacentridae 
A família Pomacentridae (Percomorphaceae) constitui um grupo diversificado e 
característico de espécies recifais, constituído pelas subfamílias Microspathodontinae, 
Glyphisodontinae, Chrominae e Pomacentrinae, com 29 gêneros e 425 espécies 
(Fricke et al., 2022). Conhecidas como donzelinhas, suas espécies em geral de 
pequeno porte (4,5 a 45cm), estão distribuídas em regiões tropicais do Oceano 
Atlântico e regiões do Indo-Pacífico (Siqueira, 2016). Habitam principalmente águas 
costeiras rasas, embora possam ocupar habitats com substratos rochosos e recifes 
de corais de até 200m de profundidade (Menezes & Figueiredo, 1985; Lev 
Fishelson, 1998; Nelson et al., 2016; McCord et al., 2021). 
As donzelinhas possuem uma grande variedade de hábitos tróficos, que inclui 
desde o forrageamento pelágico de zooplâncton, alimentação bentônica de algas 
filamentosas, até predação de invertebrados (Aguilar-Medrano, 2011). Esse grupo 
também exibe uma extensa variedade de mecanismos reprodutivos, incluindo 
gonocoristas, com predeterminação do sexo, hermafroditismo protogínico e 
protândrico, e tipos bissexuais, que carregam primórdios de gônadas de ambos os 
sexos (Lev Fishelson, 1998). 
 Várias espécies de pomacentrídeos têm recebido particular atenção quanto ao 
seu status de conservação. Apesar da ampla distribuição e diversidade, fatores como 
mudanças climáticas, efeitos da aquicultura e outros distúrbios antropogênicos têm 
representado ameaças a algumas espécies (IUCN, 2021). De fato, cerca de 21 
espécies se enquadram em níveis críticos de ameaças e 75 delas apresentam status 
de dados deficientes (IUCN, 2021). 
No Atlântico Ocidental, a família Pomacentridae é composta pelos gêneros 
Abudefduf Forsskål, 1775 (1 sp.), Microspathodon Günther, 1862 (1 sp.), Chromis 
Cuvier, 1814 (5 spp.) e Stegastes Jenyns, 1840 (preliminarmente com 7 spp.), com 
ocorrência na costa e ilhas oceânicas do Atlântico Sul (Menezes et al., 2003; Souza 
et al., 2017). As espécies do gênero Stegastes apresentam grande representatividade 
em águas rasas de uma grande variedade de ambientes no Atlântico, que incluem 
desde recifes de coral, até lagoas costeiras próximas a regiões estuarinas (Menezes 
& Figueiredo, 1985). 
Evolução citogenômica em donzelinhas 14 
Em decorrência de variações locais ou ontogenéticas na coloração, bem como 
sobreposição de elementos seriais (escamas da linha lateral e operculares, raios 
duros e moles das nadadeiras), a identificação taxonômica de algumas espécies de 
Stegastes pode se mostrar complexa (Nelson et al., 2016). Divergências fenotípicas 
pouco conspícuas ocorrem até mesmo entre algumas espécies simpátricas e 
evolutivamente diferenciadas, como S. fuscus e S. variabilis (Araújo et al., 2003). 
Algumas formas insulares como S. rocasensis (Emery, 1972), presente no Atol 
das Rocas (AR) e Arquipélago de Fernando de Noronha (AFN), S. sanctipauli 
(Lubbock e Edwards, 1981), considerada endêmica do Arquipélago de São Pedro e 
São Paulo (ASPSP), e S. trindadensis (Gasparini, Moura & Sazima, 1999), endêmica 
da ilha de Trindade e Martim Vaz, devido aos seus padrões crípticos de diferenciação 
evolutiva, têm recentemente recebido maior atenção quanto ao seus status 
taxonômicos, relações filogenéticas e divergências genéticas (Souza et al., 2017). 
O Atlântico Ocidental abriga quatro espécies de Stegastes, que são S. fuscus 
(Cuvier, 1830), S. variabilis (Castelnau, 1855) e S. uenfi (Novelli, Nunan & Lima, 2000), 
costeiras, e S. pictus (Castelnau, 1855), com distribuição costeira e nas regiões 
insulares do Atol das Rocas e Arquipélago de Fernando de Noronha (Menezes et al., 
2003). Algumas espécies apresentam distribuição extensa, enquanto outras em 
regiões bem definidas (Figura 1). No litoral do Estado do Rio Grande do Norte foram 
registradas ocorrências de S. fuscus, S. pictus e S. variabilis (Garcia Jr., 2006). 
A sobreposição espacial de grandes efetivos populacionais de algumas 
espécies, como S. fuscus e S. variabilis no litoral do Atlântico Ocidental, poderiam 
favorecer eventos de hibridização entre essas espécies (Montanari et al. 2012). De 
fato, perfis genéticos intermediários de marcadores de DNA semi-arbitrários (RAPD) 
entre S. fuscus e S. variabilis foram identificados em uma localidade do litoral do 
Estado do Rio Grande do Norte, costa nordeste do Brasil, indicando uma possível 
zona de introgressão (Dias Jr. et al., 2007), desconhecida para o litoral do Atlântico 
Sul Ocidental. Como essas espécies divergem pela presença de um par de 
cromossomos acrocêntricos a mais no cariótipo de S. variabilis (Molina & Galetti, 
2004), análises populacionais com o uso de marcadores citotaxonômicos podem ser 
úteis na sua validação e na inferência das causas deste processo nesta região. 
 
 
Evolução citogenômica em donzelinhas 15 
 
Figura 1. Distribuição geográfica das espécies Stegastes fuscus [■], Stegastes 
variabilis [■], Stegastes rocasensis [■], Stegastes rocasensis (ASPSP) [■] e Stegastes 
fuscus (IT) [■] (AquaMaps, 2019; GBIF Secretariat, 2021) no Oceano Atlântico 
Ocidental. 
 
 
 
 
 
Evolução citogenômica em donzelinhas 16 
Uma precisa identificação taxonômica contribui para uma melhor compreensão 
dos aspectos evolutivos, ecologia, conservação e biogeografia dos táxons (Dayrat, 
2005). Desta forma, grupos de espécies com definições taxonômicas pouco precisas, 
como Stegastes, podem ser beneficiados pelo uso de abordagens integrativas, 
associando padrões morfológicos, e de diversificação genética, abrangendo em 
sentido amplo a variação de sequências de DNA, de genomas e a citogenômica 
comparativa. Desta forma, comparações citogenéticas inter- e intra-populacionais 
podem contribuir na identificação taxonômica (citotaxonomia), das tendências 
evolutivas dos cariótipos, e da influência das divergências cromossômicas no 
estabelecimento de bloqueios pós-zigóticos (Motta-Neto et al., 2012). 
1.2. Filogenia e taxonomia do gênero Stegastes 
A filogenia e a sistemática dos Osteichthyes (peixes ósseos) têm sofrido 
alterações consideráveis nos últimos anos em decorrência do avanço dos dados 
morfológicos e moleculares. Inicialmente, as famílias Pomacentridae, Cichlidae, 
Labridae, Embiotocidae, Odacidae e Scaridae integravam a subordem Labroidei 
(Perciformes), com cerca de 235 gêneros e aproximadamente de 2.274 espécies, 
sendo Pomacentridae a terceira maior família (Nelson et al., 2016). 
Dados filogenéticos mais recentes inferidos a partir de análises de 
probabilidade máxima e Bayesiana, indicaram polifilia dos Labroidei tradicionais e 
separaram Labridae das linhagens Cichlidae,Embiotocidae e Pomacentridae 
(Wainwright et al., 2012). Assim, essas três famílias vêm sendo agrupadas dentro de 
um clado recém erigido, Ovalentaria, que abriga cerca de 27% dos Percomorpha e 
mais de 16% de todos os peixes com nadadeiras com raios, e desta forma designado 
por agrupar espécies com hábitos demersais, e com ovos adesivos com filamentos 
coriônicos (Wainwright et al., 2012; Hughes et al., 2018). 
Pomacentridae é um grupo monofilético dividido nos clados 
Microspathodontinae, Glyphisodontinae, Chrominae e Pomacentrinae. Esta última 
corresponde ao clado mais diverso, que abriga cerca de metade dos gêneros (52%) e 
quase metade das espécies (49%) da família (Tang et al., 2021). Em decorrência das 
incertezas atuais com relação a posição taxonômica da família em níveis superiores, 
para as discussões que se seguem considerou-se a classificação proposta por Nelson 
et al. (2016) (Pomacentridae, Perciformes). 
Evolução citogenômica em donzelinhas 17 
O gênero Stegastes inicialmente foi integrado entre os membros da subfamília 
Pomacentrinae (Nelson et al., 2016). Entretanto, a monofilia dos membros dos 
gêneros Hypsypops, Mecaenichthys, Microspathodon, Nexilosus, Parma, 
Plectroglyphidodon, Similiparma e Stegastes (Cooper et al., 2009; Frédérich et al., 
2013), levaram a criação de uma nova subfamília, Stegastinae (Cooper et al., 2009), 
renomeada posteriormente para Microspathodontinae (Cooper et al., 2016). 
Stegastes não compõe um grupo monofilético, em vez disso, as espécies se 
distribuem em dois clados distintos, um dos quais se agrupa em Plectroglyphidodon e 
o outro inclui a espécie-tipo, S. imbricatus (Cooper et al., 2009; Frédérich et al., 2013; 
Tang et al., 2021). Os dois grupos podem ser geralmente distinguidos pelo número de 
espinhos da nadadeira dorsal: 12 em Stegastes stricto sensu e 13 ou 14 em 
“Stegastes” associados a Plectroglyphidodon (Tang et al., 2021). 
As relações filogenéticas das espécies insulares do gênero Stegastes do 
Atlântico começam a ser mais bem compreendidas. Análises moleculares de genes 
mitocondriais (16S, COI e CytB), e nucleares (rag1 e rhod) não mostram divergências 
genéticas entre S. rocasensis (Atol das Rocas e Arquipélago de Fernando de 
Noronha) e S. sanctipauli (Arquipélago de São Pedro e São Paulo), e apenas 0,1% de 
divergência entre S. fuscus (costa do Atlântico Ocidental) e S. trindadensis (Ilha de 
Trindade) (Souza et al., 2017). Estes padrões genéticos sugerem a ocorrência de 
sinonímias neste grupo e justificam análises citogenéticas mais detalhadas que 
possam contribuir para esclarecer as relações de suas espécies. 
1.3. Aspectos citogenéticos em Pomacentridae 
A Ordem Perciformes configura-se como um modelo excepcionalmente útil 
para a compreensão da estrutura genética de populações de peixes marinhos, assim 
como no estabelecimento de seus padrões de evolução cariotípica (Molina, 2007). 
Membros da Ordem Perciformes apresentam um extenso conservadorismo diploide 
com 2n=48 de cromossomos acrocêntricos, padrão também observado em grupos 
basais e em clados recentes de Percomorpha, evidenciando um padrão 
simplesiomórfico para o grupo e um excelente cenário favorável a identificação de 
possíveis tendências cariotípicas entre os grupos (Galetti et al., 2000; Molina, 2007; 
Motta–Neto et al., 2019). 
Mudanças no número total de braços cromossômicos (Número Fundamental, 
NF) configuram-se como medidas estimativas de eventuais rearranjos cromossômicos 
Evolução citogenômica em donzelinhas 18 
(Molina, 2007). O padrão basal 2n=48 é amplamente observado nas espécies de 
Perciformes, entretanto, tendências para diversificação de cariótipo foram observadas 
ao longo da história evolutiva de alguns grupos, especialmente no número de braços 
cromossômicos. Apesar de apresentar 72% (188/261) das espécies cariotipadas com 
n=48, 74% (192/261) delas apresentam um número de braços cromossômicos maior 
que 48 (Molina & Galetti, 2004; Molina, 2007; Motta–Neto et al., 2019). 
A diversificação do cariótipo em Perciformes tem sido a associada a ocorrência 
frequente de múltiplos eventos de inversões pericêntricas (Galetti et al., 2000; Molina 
e Galetti, 2004). A família Pomacentridae destaca-se dentre os diversos exemplos de 
Perciformes cujo padrão cariotípico é visivelmente derivado com FN significativamente 
maior que 48, dado que uma quantidade significativa de informações está disponível 
sobre a citogenética básica deste grupo (Tabela 1). 
Dados citogenéticos estão disponíveis para cerca de 12% (50/425) das 
espécies de Pomacentridae (Tabela 1). Destas, 86% apresentam cariótipos 
numericamente conservados, com 2n=48, mas com diferenças significativas no 
número de braços cromossômicos (NF= 48<92) (Molina & Galetti, 2004; Molina, 
2007). Neste grupo os cariótipos são principalmente compostos por elementos 
bibraquiais, que contrastam com o cariótipo basal do grupo, 2n=48 cromossomos 
acrocêntricos (Galetti et al., 2000), e indica que inversões pericêntricas constituem o 
principal mecanismo de mudança cariotípica (Molina & Galetti, 2004). Inversões 
pericêntricas múltiplas de grande magnitude podem constituir mecanismos 
importantes de isolamento reprodutivo pós-zigótico, atuando no processo de 
especiação de espécies recifais, e em alguns casos possivelmente podem estar 
associadas a processos de especiação no gênero (Molina, 2007). 
Indefinições taxonômicas e diferentes tendências evolutivas nos padrões 
cariotípicos (Molina & Galetti, 2004; Molina et al., 2014; Getlekha et al., 2016a, 2018b), 
configuram Pomacentridae como um modelo adequado para análises da evolução 
cariotípica em peixes recifais. Assim, análises citogenômicas comparativas 
envolvendo as espécies do gênero Stegastes da costa Atlântica da América do Sul 
ajudam a esclarecer relações taxonômicas e filogenéticas dentro do grupo, bem como 
possíveis quebras de barreiras pós-zigóticas em áreas costeiras do Nordeste do 
Brasil. 
 
 
Evolução citogenômica em donzelinhas 19 
Tabela 1. Revisão dos dados citogenéticos da família Pomacentridae (Adaptado de 
Arai 2011). 
Subfamília/espécie 2n Cariótipo NF Ag-RONs Referências 
Amphiprioninae 
Amphiprion clarkii 48 14m+16sm+18st/a 78 – Arai & Inoue (1976) 
A. clarkii 48 12m+26sm+10st/a 86 – Arai & Inoue (1976) 
A. frenatus 48 14m+22sm+8st+4a 84 2 Arai & Inoue (1976) 
A. oceiiaris 48 14m+22sm+12st/a 84 – Arai & Inoue (1976) 
Chrominae 
Chromis chromis 48 48a 48 – Alvarez et al. (1980) 
C. chrysura 48 2m+46st/a 50 – Ojima (1980) 
C. fiavicauda 39 9m+6sm+24a 54 2 Molina & Galetti (2002) 
C. insolata 46 4m+6sm+36a 56 2 Molina & Galetti (2002) 
C. muitilineata 48 48a 48 2 Molina & Galetti (2002) 
C. ternatensis 48 48a 48 – Takai & Ojima (1999) 
C. viridis 48 48t 48 2 
Getlekha & Tanomtong 
(2020) 
Dascyllus aruanus 30 18m+2st+10a 50 2 Getlekha et al. (2016) 
D. carneus 48 2st+46a 50 2 Getlekha et al. (2016) 
D. melanurus 48 2st+46a 50 2 Getlekha et al. (2016) 
D. reticulatus 36 12m/sm+24a 48 2 Getlekha et al. (2016) 
D. trimaculatus 48 2st+46a 50 2 Getlekha et al. (2016) 
Pomacentrinae 
Abudefduf notatus 48 2m+2st+44a 50 – Arai & Inoue (1976) 
A. saxatilis 48 2m+2st+44a 52 2 Getlekha et al. (2016) 
A. coelestinus 48 2m+46a 50 2 Takai & Ojima (1987) 
A. sordidus 48 2m+2sm+2st+42a 52 – Hardie (2004) 
A. vaigiensis 48 2m+2st+44a 52 2 Getlekha et al. (2016) 
A. bengalensis 48 2m+2st+44a 52 2 Getlekha et al. (2016) 
A. sexfasciatus 48 2m+46a 50 2 Getlekha et al. (2016) 
Amblyglyphidodon curacao 48 6m+22sm+20st/a 76 2 Takai & Ojima (1986) 
Cheiloprion labiatus 48 26sm+22st/a 74 2 Takai & Ojima (1987) 
Chrysiptera cyanea 42 6m+16sm+2st+18a 64 2 Takai & Ojima (1995) 
C. hemicyanea 48 32sm+16st/a 80 – Takai & Ojima (1991) 
C. leucopoma 48 4m+22sm+6st+16a 74 2 Takai & Ojima (1995) 
C. rex 36 12m+10sm+14st/a 58 2 Takai & Ojima (1995) 
C. starcki 48 2m+10sm+36a60 2 Takai & Ojima (1987) 
Dischistodus prosopotaenia 48 – – 2 Takai & Ojima (1986) 
Microspathodon chrysurus 48 8m+22sm+12st+6a 78 2 Molina & Galetti (2004) 
Neoglyphidodon nigroris 48 8m+26sm+2st+12a 82 2 Molina & Galetti (2004) 
Neoglyphidodon oxyodon 48 2m+20sm+12st+14a 70 2 Takai & Ojima (1991) 
Pomacentrus alleni 48 48t 48 – Getlekha (2018) 
P. chrysurus 48 8m+22sm+12st+6a 78 2 Takai & Ojima (1991) 
P. coelestis 48 48a 48 2 Takai & Ojima (1986) 
P. moluccensis 48 10m+26sm+10st+2a 84 2 Takai & Ojima (1991) 
P. nagasakiensis 48 2m+46a 50 2 Takai & Ojima (1987) 
P. philippinus 48 8m+24sm+10st+6a 80 2 Takai & Ojima (1991) 
P. trilineatus 50 8m/sm+42st/a 58 – Rishi (1973) 
Evolução citogenômica em donzelinhas 20 
Continuação da Tabela 1. Revisão dos dados citogenéticos da família Pomacentridae. 
Subfamília/espécie 2n Cariótipo Ag-RONs Referências 
Microspathodontinae 
Plectroglyphidodon leucozonus 48 4st+44a 48 – Takai & Ojima (1986) 
P. lacrymatus 48 – 48 – Arai & Inoue (1976) 
Stegastes fuscus 48 20m+22sm+6a 90 2 Molina & Galetti (2004) 
S. fuscus de Trindade 48 20m+22sm+6a 90 2 Presente estudo 
S. insuiaris 48 14m+24sm+6st+4a 86 2 Nagpure et al. (2006) 
S. lividus 48 6m+24sm+18st/a 78 – Ojima (1983) 
S. nigricans 48 2m+2sm+44st/a 52 – Ojima (1983) 
S. pictus 48 14m+28sm+2st+4a 90 2 Molina & Galetti (2004) 
S. rocasensis do ASPSP 48 22m+22sm+4a 92 2 Presente estudo 
S. rocasensis 48 22m+22sm+4a 92 2 Molina & Galetti (2004) 
S. variabilis 48 18m+22sm+8a 88 2 Molina & Galetti (2004) 
 
 
1.4. Análise de sequências de DNA repetitivo em peixes 
Os genomas eucarióticos contêm um grande número de DNA repetitivos, 
caracteristicamente com notável variação de tamanho (Polleys & Freudenreich, 2021). 
Inicialmente, essa grande quantidade de DNA intergênico foi tratada como “lixo 
genômico”, devido a sua natureza predominantemente repetitiva e por não ter 
qualquer função mais evidente (Zaha et al., 2014). Desde então, essa fração do DNA 
teve sua importância reconhecida em muitos dos processos que moldam o genoma e 
controlam a atividade de seus genes (Biémont & Vieira, 2006). 
Os DNAs repetitivos incluem as sequências de satélite, minissatélites e 
microssatélites e repetições dispersas, como transposons e retrotransposons 
(Charlesworthe et al. 1994). Também fazem parte da diversidade de DNAs repetitivos 
no genoma eucariótico as famílias multigênicas, que codificam moléculas importantes 
de RNAs ribossômicos, e as sequências repetitivas não codificantes em tandem, 
encontradas nos centrômeros e telômeros (Martins, 2007). 
Estudos cromossômicos, e particularmente a aplicação de hibridização in situ, 
têm mapeado sequências repetitivas de DNA nos cromossomos, evidenciando a 
origem, tendências evolutivas e suas funções no genoma (Biscotti et al., 2015). Dessa 
forma, esses marcadores são capazes de responder questões biológicas de maneira 
Evolução citogenômica em donzelinhas 21 
eficiente, além de contribuir amplamente para investigações evolutivas populacionais 
e relacionadas a biologia da conservação (Sunnucks, 2000). 
A comparação da natureza e localização das sequências entre espécies muito 
ou pouco relacionadas indica seus processos de origem, mudanças e amplificação 
(Biscotti et al., 2015). Em peixes marinhos, o mapeamento de sequências repetitivas 
nos cromossomos tem sido utilizado como parâmetro delimitador de espécies (Molina 
& Galetti, 2004), identificação de polimorfismos populacionais (Amorim et al., 2017) e 
caracterização de cromossomos sexuais (Martins, 2007), sendo ferramenta 
importante na compreensão da evolução cariotípica de diferentes grupos. 
 
2. OBJETIVOS 
2.1. Geral 
O presente trabalho visou estabelecer os processos que regem a divergência 
citogenômica das espécies do gênero Stegastes do Atlântico Sul, analisar as 
mudanças associadas aos processos de especiação insular, e investigar uma possível 
zona híbrida entre as espécies S. fuscus e S. variabilis, por meio de análises 
cromossômicas comparativas e mapeamento de diferentes classes de DNA repetitivo 
nos cromossomos. 
2.2. Objetivos Específicos 
Para alcançar os objetivos propostos foram mapeados e comparados os 
arranjos citogenômicos do DNA ribossomal [DNAr 18S e DNAr 5S] nas espécies S. 
fuscus, S. variabilis, S. rocasensis (Atol das Rocas), S. rocasensis (af. S. sanctipauli, 
ASPSP) e S. fuscus (af. S. trindadensis, IT). 
Adicionalmente foi quantificado o polimorfismo do número de sítios Ag-RONs e 
prospecção de híbridos nas espécies S. fuscus e S. variabilis da costa do Rio Grande 
do Norte por meio de análises citogenéticas populacionais. 
 
3. MATERIAL E MÉTODOS 
3.1. Material 
Tendo em vista incertezas taxonômicas envolvendo as espécies insulares de 
Stegastes, as espécies nominais S. sanctipauli e S. trindadensis serão mencionadas 
respectivamente nos grupos com maior aproximação genética (sensu Souza et al. 
Evolução citogenômica em donzelinhas 22 
(2017), como S. rocasensis (=sanctipauli) (ASPSP) e S. fuscus (=trindadensis) (IT). 
Assim, foram realizadas análises citogenéticas em indivíduos de S. rocasensis (n=8), 
provenientes de Atol das Rocas (3º51'56.93"S, 33º48'7.412"O), S. rocasensis (n=7), 
do Arquipélago de São Pedro e São Paulo (0º55'1.132"N, 29º20'42.958"O) e S. fuscus 
do Arquipélago de Trindade e Martim Vaz (20º30'39.024"S, 29º18'40.867"O), bem 
como nas espécies costeiras S. fuscus e S. variabilis coletados na costa do Rio 
Grande do Norte (6º1'2.406"S, 35º6'31.072"O), região nordeste do Brasil (Figura 2). 
Análises citogenéticas foram realizadas adicionalmente em indivíduos de S. fuscus 
(n=26) e S. variabilis (n=14) coletados em simpatria em dois pontos do litoral do 
Estado do Rio Grande do Norte, nas praias de Santa Rita (Extremoz–RN - 
5°41'40.8"S, 35°11'47.6"O), provável zona de hibridização (Dias Jr. et al., 2007) e 
Tabatinga (Nísia Floresta–RN - 6°03'00.2"S, 35°06'29.2"O) (Figura 3). As espécies 
foram coletadas com permissão do Instituto Chico Mendes de Conservação da 
Biodiversidade-ICMBio (Proc. #19135-10), e os procedimentos experimentais 
seguiram as normas do Comitê de Ética no uso de Animais, da Universidade Federal 
do Rio Grande do Norte (Proc. #044/2015). 
 
 
Evolução citogenômica em donzelinhas 23 
 
Figura 2. Mapa dos locais de coleta das espécies S. fuscus, S. variabilis, S. 
rocasensis, S. rocasensis (ASPSP) e S. fuscus (IT). As ilustrações representam 
indivíduos juvenis de cada espécie. ASPSP - Arquipélago de São Pedro e São Paulo: 
AR – Atol das Rocas; CRN – Costa do Rio Grande do Norte; IT – Ilha de Trindade. 
 
 
 
Evolução citogenômica em donzelinhas 24 
 
Figura 3. Mapa dos locais de coleta dos espécimes de S. fuscus e S. variabilis da 
costa do Rio Grande do Norte, região Nordeste do Brasil. 
 
 
Evolução citogenômica em donzelinhas 25 
3.2. Métodos 
3.2.1. Preparações Cromossômicas 
3.2.1.1. Estimulação mitótica com lisados bacterianos e fúngicos e obtenção de 
cromossomos mitóticos 
Para incrementar a taxa de divisão celular todos os indivíduos foram 
submetidos a um estímulo mitótico in vivo, por meio da inoculação intramuscular (entre 
a linha lateral e na nadadeira dorsal), e intraperitoneal, de uma solução de um 
complexo de antígenos bacterianos e fúngicos atenuados (Broncho-Vanxom® 0,7 
mg/mL), na proporção de 1 ml para 50 g de peso corporal, por um período de 24 horas, 
de acordo com Molina et al. (2010). 
A obtenção de cromossomos mitóticos seguiu o método preparação in vitro 
descrito por Gold et al. (1990). Brevemente, após os espécimes serem sacrificados 
com uma superdosagem do anestésico do Eugenol (C10H12O2), fragmentos dos rins 
anteriores foram removidos e dissociados em 10 ml de meio de cultura RPMI 1640 
com uso de seringa de vidro. A suspensão celular foi transferida para tubos de 
centrífuga, e adicionada 125 μl de colchicina (0,025%)por 30 minutos em temperatura 
ambiente. O material foi centrifugado por 10 minutos a 1.000 rpm, sobrenadante 
removido e acrescido 10 ml de solução hipotônica de KCl (0,075 M), mantido por 28 
minutos a temperatura ambiente. O material foi centrifugado por 10 minutos a 1.000 
rpm, ressuspendido e fixado em metanol e ácido acético (3:1), durante três ciclos de 
centrifugação a 1.000 rpm por 10 minutos, e conservado à -20°C em tubos Eppendorf 
de 1,5ml para posterior análise. 
3.2.1.2. Preparação das lâminas 
Um total de 100 μl de suspensão celular foi gotejado sobre lâminas de vidro 
recobertas com um filme de água destilada à 60ºC. Em seguida, as lâminas foram 
secas à temperatura ambiente e coradas com solução de Giemsa (5%), diluída em 
tampão fosfato (pH 6,8), durante 8 minutos. As lâminas foram analisadas em 
microscópio óptico (1000X), e as melhores metáfases (consideradas quanto ao 
espalhamento e definição dos cromossomos) foram fotografadas através do sistema 
de captura digital DP73 Olympus acoplado a fotomicroscópio de epifluorescência 
BX50 Olympus sob aumento de 1000X. 
 
Evolução citogenômica em donzelinhas 26 
3.2.2. Bandamentos cromossômicos 
3.2.2.1. Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs) 
As RONs foram identificadas através da técnica de impregnação por prata, 
proposta por Howell e Black (1980). Sobre lâminas com as preparações mitóticas 
foram depositados 300 μl de solução de gelatina (1 g de gelatina incolor acrescido de 
50 ml de água e 0,5 ml de ácido fórmico), 300 μl de nitrato de prata (AgNO3) 50% e 
150 μl água destilada que foram homogeneizados, recoberta com lamínula e incubada 
em estufa à 60ºC até que o filme da solução alcançasse uma coloração âmbar. As 
lâminas foram lavadas em água destilada, secas ao ar e analisadas em microscópio 
óptico sob aumento de 1000X. 
3.2.2.2. Detecção de heterocromatina constitutiva (bandamento C) 
A heterocromatina constitutiva foi identificada pelo método proposto por 
Sumner (1972). Lâminas com preparações mitóticas mantidas em estufa à 37°C por 
5-15 dias foram imersas em solução de HCl 0,2N à temperatura ambiente, por 15 
minutos, lavadas em água destilada e secas ao ar. Em seguida, foram imersas em 
solução de 2XSSC a 60°C por 15 minutos, lavadas em água destilada e secas. 
Posteriormente, as lâminas foram incubadas em uma solução hipersaturada de 
Ba(OH)2.8H2O 5% por 1 minuto e 20 segundos à 42°C, lavadas imediatamente com 
HCl 0,2N, incubadas em solução de 2XSSC à 60ºC por um período de 30 minutos, 
secas ao ar, e coradas com Giemsa 5% durante 5 minutos. 
3.2.2.3. Hibridização Fluorescente in situ (FISH) 
3.2.2.3.1. Obtenção das sondas para hibridização cromossômica 
As sondas DNAr 5S (200 pb) e 18S (1400 pb), foram obtidas pela reação em 
cadeia da polimerase (PCR) a partir do DNA nuclear de Stegastes variabilis (Teleostei, 
Perciformes), utilizando-se os iniciadores A 5’-TAC GCC CGA TCT CGT CCG ATC-3’ 
e B 5’- CAG GCT GGT ATG GCC GTA AGC-3’ (Pendás et al., 1994), NS1 5’-GTA 
GTC ATA TGC TTG TCT C-3’ e NS8 5’-TCC GGT GCA TCA CCT ACG GA-3’ (White 
et al., 1990), respectivamente. O DNAr 18S foi marcado com digoxigenina-11-dUTP e 
a sonda de DNAr 5S foi marcado com biotina-14-dATP, por nick translation, de acordo 
com as especificações do fabricante (Bionick Labeling System, Invitrogen). 
 
Evolução citogenômica em donzelinhas 27 
3.2.2.3.2. Hibridização cromossômica 
A hibridização in situ com fluorescência (FISH) foi realizada de acordo com 
Pinkel et al. (1986). Os cromossomos metafásicos foram tratados com RNAse 
(20μg/ml em 2×SSC), por 1 hora à 37°C, e posteriormente com pepsina (0,005% em 
HCl 10mM) à 37°C por 10 minutos. Em seguida, foram fixados com formaldeído à 1% 
por 10 minutos e desidratados em etapas de 5 minutos em uma série alcoólica 
(70%/85%/100%). As lâminas contendo os cromossomos metafásicos foram 
incubadas em 70% formamida/2×SSC à 72°C, por 5 minutos e novamente 
desidratadas em uma série alcoólica (70%/85%/100%) por 5 minutos cada. A solução 
de hibridização, consistindo em 50% de formamida, 2×SSC, 10% de sulfato dextrano 
e a sonda desnaturada (5 ng/μl), em um volume final de 30 μl, foi depositada sobre a 
lâmina e a hibridização realizada por 16h à 37°C. As lavagens pós-hibridização foram 
efetuadas em 15% formamida/0.2×SSC à 42°C, por 20 minutos, seguidas de lavagens 
em 0,1×SSC à 60°C por 15 minutos e em Tween 20 0,5%/4×SSC por 5 minutos à 
temperatura ambiente, e posteriormente incubada por 15 minutos na solução de 
bloqueio 5% NFDM/4xSSC, em seguida lavadas em (Tween 20 0,5%/4×SSC) por 15 
minutos. Os sinais de hibridização das sondas foram detectados usando anti-
digoxigenina rodamina conjugada (Roche®, Mannheim, Alemanha) para a sonda 
DNAr 18S e streptavidina-FITC conjugado (Roche®, Mannheim, Alemanha) para a 
sonda DNAr 5S. Os cromossomos foram contracorados com Vectashield/DAPI (1,5 
μg/ml) (Vector® Laboratories, Newark, CA, USA). 
3.2.3. Classificação cromossômica e montagem cariotípica 
Os cromossomos foram categorizados com base na razão entre os braços em 
metacêntricos, submetacêntricos e acrocêntricos, seguindo os critérios estabelecidos 
por Levan et al. (1964). Os cariótipos foram preparados por meio de ferramentas de 
seleção e transformação e ajustados com o plugin filtro do camera raw (ajuste de 
contraste, clareamento, filtros monocromáticos e textura), ferramentas do programa 
Adobe Photoshop 2021 (Adobe™). 
3.2.4. Geoprocessamento e elaboração de figuras 
As bases cartográficas dos mapas de distribuição e dos pontos de coleta das 
espécies foram geradas com as ferramentas de geoprocessamento do software QGIS 
Evolução citogenômica em donzelinhas 28 
3.20.2 (Odense). Os dados utilizados para as demarcações de distribuição geográfica 
foram obtidos da base de dados do AquaMaps (Kaschner et al., 2019). As ilustrações 
dos indivíduos juvenis de Stegastes (Figura 2), as demarcações de distribuição 
(Figura 1) e a filogenia de dados concatenados (Figura 5), foram elaboradas com as 
ferramentas de vetorização e desenho do software Inkscape 1.1.1. 
 
Evolução citogenômica em donzelinhas 29 
4. CAPÍTULO I 
Processos carioevolutivos em espécies do gênero Stegastes do Oceano 
Atlântico 
 
Resumo 
As donzelinhas (Pomacentridae) se destacam por extrema diversidade e importante 
papel ecológico nos recifes de coral. Nesta família, os gêneros Abudefduf, 
Microspathodon, Chromis e Stegastes ocorrem no Atlântico Sul Ocidental, sendo o 
último o mais representativo. Diferenças sutis na coloração entre formas adultas e 
juvenis podem gerar imprecisões na taxonomia de Stegastes. Sob essa perspectiva, 
o status taxonômico das formas insulares S. rocasensis, S. sanctipauli e S. fuscus 
trindadensis, têm sido questionados, indicando a necessidade de uma taxonomia 
integrativa. Desta forma, comparações citogenéticas interregionais e análises de 
aspectos microestruturais dos cromossomos foram obtidas por meio de técnicas 
citogenéticas convencionais e hibridização in situ fluorescente de sequências DNAr 
em cinco das sete espécies do gênero Stegastes da costa Atlântico Sul, com vistas a 
uma melhor definição taxonômica e de suas relações filogenéticas. Todas as espécies 
apresentaram 2n=48, com NF entre 88 e 90. As regiões heterocromáticas 
apresentaram blocos conspícuos nas regiões centroméricas e pericentroméricas. Os 
loci Ag-RONs são únicos, com exceção de S. variabilis, que apresentou sítios 
múltiplos. Espécimes de S. rocasensis do Atol das Rocas e São Pedro e São Paulo 
(previamente S. sanctipauli), revelaram similaridades cariotípicas em todos os 
aspectos analisados, o que corrobora a similaridade cariotípica entre elas. Stegastes 
fuscus da Ilha de Trindade (S. fuscus trindadensis) revelou um arranjo colocalizado 
de sítios DNAr 18S e 5S, diferente da população de S. fuscus da costa, indicando uma 
variação conspícua que lhe confere um status de Unidade Evolutivamente 
Significativa(ESU). Arranjos DNAr 18S e 5S sintênicos foram observados em regiões 
transcricionalmente ativas em S. variabilis, revelando atividade gênica apesar das 
condições de sintenia. Os dados cariotípicos aqui apresentados corroboram a 
distinção citotaxonômica nos níveis de espécie e categorias intraespecíficas (S. 
fuscus) e confirma uma evolução cromossômica, numericamente conservada, mas 
modelada por múltiplas inversões pericêntricas ao longo da história evolutiva do 
grupo. 
Palavras-chave: Citogenética de peixes, carioevolução, inversões pericêntricas, 
rearranjos cromossômicos, DNAr. 
 
 
 
 
 
Evolução citogenômica em donzelinhas 30 
Introdução 
Dentre as numerosas famílias de peixes no ambiente marinho, as donzelinhas 
(Pomacentridae, Perciformes), ocupam uma posição de destaque por sua diversidade 
e papel ecológico nas comunidades recifais do Oceano Atlântico e regiões do Indo-
Pacífico (Lev Fishelson, 1998; Ceccarelli et al., 2001; Blanchette, 2019). Esse grupo 
demonstra um rico repertório etológico, desde uma marcante territorialidade, até 
agrupamentos sociais frequentemente regulados por estratégias sexuais (Myrberg, 
1972; Lev Fishelson, 1998). 
O gênero Stegastes é o mais diversificado no Atlântico Ocidental, ocupando 
águas rasas de uma grande variedade de ambientes, que incluem recifes de coral até 
lagoas costeiras próximas a regiões estuarinas (Menezes & Figueiredo, 1985). Quatro 
espécies têm sido reportadas ao longo da costa do Atlântico Sul Ocidental S. fuscus 
(Cuvier, 1830), S. pictus (Castelnau, 1855), S. uenfi (Novelli, Nunan & Lima, 2000) e 
S. variabilis (Castelnau, 1855) (Menezes et al., 2003). Adicionalmente, algumas 
espécies foram reportadas como endêmicas de ambientes insulares da região Meso-
Atlântica, como S. rocasensis (Emery 1972), presente no Atol das Rocas (AR), 
arquipélago de Fernando de Noronha (AFN) e no arquipélago de São Pedro e São 
Paulo e S. fuscus da ilha de Trindade e Martim Vaz (Souza et al., 2017). 
Mudanças de coloração durante o desenvolvimento e sobreposições de 
elementos seriais (número de escamas operculares e da linha lateral, raios moles e 
duros das nadadeiras) torna a taxonomia do grupo complexa (Nelson et al., 2016; 
Souza et al., 2017). Abordagens morfológicas, associadas a análises de genes 
mitocondriais e nucleares entre espécies costeiras e insulares de Stegastes no 
Atlântico ocidental, apresentaram incongruências quanto ao status taxonômico das 
espécies insulares S. rocasensis, S. sanctipauli (S. rocasensis (ASPSP) e S. 
trindadensis (S. fuscus (IT) (Souza et al., 2017). 
Comparações citogenéticas inter e intra populacionais contribuem para a 
delimitação taxonômica (citotaxonomia), reconhecimento dos padrões de evolução 
cariotípica, e inferências sobre o papel das divergências cromossômicas numérico-
estruturais em relação a bloqueios pós-zigóticos (Motta-Neto et al., 2012). 
O conjunto de espécies do gênero Stegastes por variada distribuição 
geográfica, representatividade nos ambientes recifais e indefinições taxonômicas, 
constitui um bom modelo de estudo da evolução cariotípica em regiões recifais. Neste 
Evolução citogenômica em donzelinhas 31 
estudo, análises citogenéticas com bandamentos convencionais e mapeamento de 
sequências DNAr foram realizadas em espécies costeiras e insulares com taxonomia 
controversa para validar seus status taxonômicos e inferir sobre sua evolução 
cariotípica. 
Material e métodos 
Análises citogenéticas foram realizadas em S. rocasensis, do Atol das Rocas 
(3º51'56.93"S, 33º48'7.412"O) (n=8), na espécie nominal S. sanctipauli, do 
Arquipélago de São Pedro e São Paulo (0º55'1.132"N, 29º20'42.958"O) (n=7) e na 
espécie nominal S. trindadensis do Arquipélago de Trindade e Martim Vaz 
(20º30'39.024"S, 29º18'40.867"O) (n=4), e em S. fuscus (n=4) e S. variabilis (n=4), da 
costa do Rio Grande do Norte (6º1'2.406"S, 35º6'31.072"O), região nordeste do Brasil 
(Figura 2). 
Os espécimes foram submetidos à estimulação mitótica, por meio da 
inoculação intraperitoneal de complexos de antígenos fúngicos e bacterianos de 
acordo com Molina et al. (2010). Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir da 
suspensão de porções do tecido renal anterior de acordo com a técnica in vitro 
proposta por Gold et al. (1990). Cerca de 100 μl de suspensão celular foi gotejado 
sobre lâminas de vidro recobertas com um filme de água destilada à 60ºC. Em 
seguida, as lâminas foram secas à temperatura ambiente e coradas em seguida com 
solução de Giemsa (5%), diluída em tampão fosfato (pH 6,8), durante 8 minutos, 
sendo novamente secas. As regiões heterocromáticas foram evidenciadas por meio 
da técnica de bandamento C (Sumner, 1972) e as regiões organizadoras de nucléolos 
(RONs) identificadas por meio da técnica de impregnação por nitrato de prata, de 
acordo com Howell & Black (1980). As sondas DNAr 5S e 18S, foram obtidas pela 
reação em cadeia da polimerase a partir do DNA nuclear de Stegastes variabilis 
(Teleostei, Perciformes) (Pendas et al., 1994; White et al., 1990). A hibridização in situ 
fluorescente (FISH) foi realizada de acordo com Pinkel et al. (1986). 
Resultados 
As espécies apresentaram 2n=48, com diferentes fórmulas cariotípicas. Assim, 
S. variabilis apresentou um cariótipo formado 18 cromossomos metacêntricos, 22 
submetacêntricos e 8 acrocêntricos (NF=88); S. fuscus e S. fuscus (IT)possuíam 20 
Evolução citogenômica em donzelinhas 32 
cromossomos metacêntricos, 22 submetacêntricos e 6 acrocêntricos (NF=90); e S. 
rocasensis e S. rocasensis (ASPSP) exibiram 22 cromossomos metacêntricos, 22 
submetacêntricos e 4 acrocêntricos (NF=92) (Figura 4). 
Stegastes fuscus e S. fuscus (TI) apresentaram sítios Ag-RONs localizados no 
braço curto do par 11, submetacêntrico, enquanto em S. rocasensis e S. rocasensis 
(ASPSP), estes se localizavam no braço curto do par 12, submetacêntrico. Em S. 
variabilis, ao contrário das demais, os sítios Ag-RONs são múltiplos, localizados nos 
braços curtos dos pares 10 e 11, submetacêntricos (Figura 4). As regiões 
heterocromáticas estavam distribuídas nas porções centroméricas e 
pericentroméricas na maioria dos pares cromossômicos (Figura 4). 
O mapeamento de sequências DNAr 18S e 5S revelou sítios exclusivamente 
localizados nos braços curtos dos cromossomos portadores. Em S. fuscus, ocorreu 
um único locus 18S, localizado no par 11 e um sítio 5S no par 18. Por outro lado, dois 
sítios 18S foram identificados em S. variabilis, S. fuscus (TI), S. rocasensis e S. 
rocasensis (ASPSP). Em S. variabilis sítios 18S estavam sobre o par 10, colocalizado 
com um sítio DNAr 5S, e no par 17, e um sítio 5S estava localizado no par 11. Em S. 
fuscus (TI) o duplo-FISH mapeou sítios DNAr 18S no par 12, co-localizados com um 
sítio DNAr 5S, e no par 22, além de um sítio 5S no par 16. Em S. rocasensis e S. 
rocasensis (ASPSP), sítios 18S ocorreram no par 12, colocalizado com um sítio DNAr 
5S, e no par 13 (Figura 4). 
 
 
Evolução citogenômica em donzelinhas 33 
 
Figura 4. Cariótipos das espécies de Stegastes por meio de coloração convencional 
com Giemsa (sítios Ag-RONs, em destaque), bandamento-C e hibridização in situ com 
sondas DNAr 18 e 5S. Barra = 5μm. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Evolução citogenômica em donzelinhas 34 
Discussão 
 
As espécies de Stegastes revelam notável variação estrutural dos seus 
cariótipos, determinada pela ocorrência de múltiplos eventos de inversões 
pericêntricas (Molina & Galetti, 2004; presente trabalho) e notável dinâmica da 
organização de sequências DNAr. Como resultado desta dinâmica evolutiva, seus 
cariótipos exibem elevados números de cromossomos bibraquiais, que contrastam 
com o padrão basal inferido para Percomorpha, constituído por 2n=48 cromossomos 
acrocêntricos (Motta-Neto et al., 2019). Embora Pomacentridae possua diversificação 
quanto ao valor diploide (2n=28/50), 86% das espécies de analisadas revelam 
conservadorismodiploide (2n=48) (Molina & Galetti, 2004; Arai, 2011). Os cariótipos 
das espécies, por outro lado, se mostram conspicuamente modelados por inversões 
pericêntricas, promotoras de consideráveis diversificações no NF, que varia de 52 a 
92 (Arai, 2011; Molina, 2007). 
De fato, valores elevados de NF é uma condição particularmente presente nas 
espécies de Stegastes (NF=52-92), que sugere acúmulo progressivo de inversões 
pericêntricas, que as colocam como fator promotor principal de diferenciação em 
relação a outros membros da família (Molina & Galetti, 2004). 
Inúmeras evidências recentes apontam inversões como mecanismos 
adaptativos importantes em diversas espécies de peixes, associando-as a eventos 
adaptativos que permitiram a colonização de variados habitats e que interferiram na 
evolução de diferentes grupos (Wellenreuther & Bernatchez, 2018; Sena & Molina, 
2007; Almeida et al., 2017; Galetti et al., 2000; Molina & Galetti, 2004a, b). 
As formas insulares de S. rocasensis, com origem filogenética mais recente 
(Souza et al., 2017), apresentam maior número de braços cromossômicos em relação 
a espécies costeiras. Esta condição pode indicar que inversões pericêntricas tem 
maior chance de se fixar em pequenos demes populacionais. Os indivíduos de S. 
fuscus da Ilha de Trindade e Martim Vaz possuem uma fórmula cariotípica similar aos 
indivíduos de S. fuscus da costa, mas com evidências de diversificação cariotípica 
incipiente em isolamento, relacionada a organização do DNAr. 
Estudos integrativos por meio de abordagens morfométricas e moleculares, 
consideraram S. rocasensis e S. sanctipauli (S. rocasensis (ASPSP)) como 
sinonímias, preservando-se a identificação original como S. rocasensis (Souza et al., 
2017). Esta condição é suportada pelas presentes análises cariotípicas, que 
Evolução citogenômica em donzelinhas 35 
demonstram o compartilhamento de um mesmo cariótipo (22m+22sm+4a) entre os 
indivíduos do Atol das Rocas e do Arquipélago de São Pedro e São Paulo. De forma 
semelhante, a pequena variação genética entre S. fuscus e S. fuscus de Trindade 
(Souza et al., 2017), é acompanhada pelo compartilhamento de cariótipos similares 
(2n= 20m+22sm+6a), entre essas formas. 
 
Figura 5. Relações filogenéticas baseadas em dados moleculares de espécies da 
subfamília Microspathodontinae de diferentes regiões oceânicas, associadas às 
informações citogenéticas disponíveis. Adaptado de Souza et al. (2017) e McCord et 
al. (2021). 
 
Os dados citogenéticos associados à filogenia molecular, indicam que S. 
variabilis representa a condição mais basal das espécies do Atlântico, com cariótipo 
18m+22sm+8a (Figura 5). De fato, as espécies do Atlântico apresentam os maiores 
valores de NF, em relação às de outras áreas, sugerindo uma possível associação 
adaptativa destes eventos a colonização dos espaços oceânicos nesta região. Em 
relação a condição de S. nigricans (2m+2sm+44a), distribuído ao longo do Indo-
Pacífico (Allen & Emery, 1985), e com menor valor de NF conhecido para o gênero 
(NF=52), S. variabilis difere pela ocorrência de pelo menos 14 eventos de inversões 
pericêntricas. Sob a mesma perspectiva, S. fuscus (20m+22sm+6a) divergem por pelo 
menos 15 inversões e S. rocasensis (22m+22sm+4a), por 16 rearranjos deste tipo. 
Evolução citogenômica em donzelinhas 36 
Sítios Ag-RONs únicos presentes em S. fuscus, nas duas populações de S. 
rocasensis, e S. fuscus da Ilha de Trindade constituem um estado cariotípico basal, 
compartilhado com outros teleósteos marinhos (Gornung, 2013). Contudo, a 
ocorrência de sítios múltiplos em S. variabilis revela uma condição particular, 
associada à dinâmica destas sequências para a espécie. 
A heterocromatina constitutiva tem importante influência na diversificação do 
cariótipo em muitos grupos de peixes (Mantovani et al., 2000; Molina, 2007). Tanto 
variações qualitativas, quanto quantitativas da heterocromatina (Caputo et al., 1997), 
atuaram na modelagem cariotípica dos peixes. Estas modificações evolutivas são 
particularmente percebidas em alguns grupos de peixes Neotropicais, como 
Characiformes (Sampaio, 2016; Toma et al., 2019), e apresentam grandes traços de 
diversificação nos autossomos, bem como variáveis níveis de heterocromatinização 
envolvidos na diferenciação de cromossomos sexuais (Artoni et al., 1999). 
A variação na quantidade e heterogeneidade da heterocromatina em 
Pomacentridae poderia estar correlacionada com a diversificação cariotípica do grupo 
(Molina & Galetti, 2002). O bandamento C mostrou uma distribuição parcialmente 
conservada quanto ao tamanho e disposição da heterocromatina nas espécies de 
Stegastes. Um conteúdo homogêneo e em pequena quantidade de heterocromatina 
aparece associado a outras características cariotípicas, como sítios Ag-RONs únicos, 
e associado a algum nível de restrição à dinâmica de sequências ribossomais no 
cariótipo (Molina, 2007). Contudo, o mapeamento com sondas de DNA repetitivos 
merece maior investigação para estabelecer possíveis associações entre os níveis de 
heterogeneidade das regiões heterocromáticas com a diversificação cariotípica no 
gênero Stegastes. 
A utilização combinada de mapeamento por aplicação do duplo FISH aos genes 
18S e 5S possibilita traçar sua evolução, bem como uma melhor condição como 
marcador citotaxonômico mesmo em grupos com alto conservadorismo cariotípico 
(Artoni et al., 2015). Em eucariotos, os grandes genes de RNAr 45S são transcritos 
pela enzima nucleolar RNA polimerase I, enquanto os genes 5S são transcritos longe 
do nucléolo pela RNA polimerase III não nucleolar, assim tem sido proposto que tais 
divergências funcionais exigiriam diferentes localizações físicas entre os grandes 
arranjos de DNAr e 5S (Martins & Galetti, 2001). Nos vertebrados, o padrão de 
distribuição de sítios DNAr 45S e 5S em cromossomos distintos indica uma evolução 
independente e representa a condição mais frequente (Gornung, 2013). Entretanto, 
Evolução citogenômica em donzelinhas 37 
o arranjo colocalizado de sequências 18S/5S coincidentes com marcações Ag-RONs 
observados em todas as espécies com exceção de S. fuscus, indica que essa 
organização sintênica circunvizinha (18S/5S) mantêm suas atividades gênicas. 
Em geral sítios DNAr 18S são coincidentes com marcações Ag-RONs, contudo 
essa condição não ocorreu em nenhuma das formas insulares, como S. rocasensis, 
S. rocasensis (ASPSP) e S. fuscus da Ilha de Trindade, bem como na espécie costeira 
S. variabilis. Essas espécies apresentaram dois loci DNAr 18S, um dos quais co-
localizado com sítios 5S (respectivamente pares 12, 12, 11 e 10) que exibe sítio Ag-
RON e um em outro cromossomo sem indícios de atividade transcricional. 
Embora em geral seja incomum, eventualmente os sítios 5S e 18S podem 
alcançar arranjos sintênicos (Amorim et al., 2016; Calado et al., 2014). De fato, os 
genes ribossomais podem apresentar rearranjos em um mesmo cromossomo, não 
necessariamente co-localizados (Fujiwara et al., 1998), podendo ocupar posições 
circunvizinhas ou arranjos interpassados (Artoni et al., 2015). Essa condição ilustra a 
ocorrência de outros mecanismos de diversificação cariotípica e dinâmica evolutiva 
que pode passar despercebida através de métodos citogenéticos convencionais, com 
ocorrência esporádica em vários grupos de Percomorpha, como Haemulidae e 
Labridae (Motta-Neto et al., 2019; Amorim et al., 2016). 
Polimorfismos do DNAr 5S constituem marcadores citogenéticos úteis no 
esclarecimento de aspectos evolutivos entre espécies (Ferreira et al., 2006; Biscotti et 
al., 2015). A família multigênica que codifica o 5S RNAr consiste em uma sequência 
de codificação altamente conservada de 120 pares de bases (pb), que é separada de 
cada unidade de transcrição por um espaçador variável não transcrito (NTS) (Ferreira 
et al., 2006). Variações no NTS devido a inserções/deleções, mini-repetições e 
pseudogenestêm sido frequentemente caracterizadas em vários organismos, e essas 
variações podem representar marcadores valiosos para a caracterização de 
populações ou espécies (Ferreira et al., 2006). 
Os padrões citogenéticos comparativos reforçam a hipótese de sinonímia entre 
as formas de S. rocasensis. Além disso, apontam uma diversificação cariotípica 
populacional incipiente em S. fuscus da Ilha de Trindade, em relação às populações 
costeiras de S. fuscus. O conjunto de dados citogenéticos apresentado lança luz sobre 
o processo de divergência cariotípica incipiente e dinâmicos nos ambientes insulares, 
reforçando o papel das inversões pericêntricas na diversificação cariotípica deste 
gênero. 
Evolução citogenômica em donzelinhas 38 
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Evolução citogenômica em donzelinhas 42 
5. CAPÍTULO II 
Polimorfismos de sítios ribossomais Ag-RONs em populações simpátricas 
costeiras de S. fuscus e S. variabilis do Atlântico Ocidental 
Resumo 
Pomacentridae apresenta uma alta diversidade cariotípica, incluindo variações no 
número diploide, morfologia cromossômica e número de braços cromossômicos. No 
Atlântico as relações filogenéticas dos Stegastes apresentam algumas indefinições 
taxonômicas em decorrência da marcante variação de coloração e sobreposição de 
elementos seriais. Divergências fenotípicas pouco conspícuas ocorrem mesmo entre 
algumas espécies estritamente simpátricas e evolutivamente diferenciadas, como S. 
fuscus e S. variabilis. Estas espécies apresentam intensa sobreposição de habitat, 
similaridade morfológica na fase adulta, e são homoploides, com diferenças na 
estrutura do cariótipo (S. fuscus - 2n=20m+22sm+6a, NF=90; S. variabilis - 
2n=18m+22sm+8a, NF=88), o que poderia favorecer eventos de hibridização. Aqui, 
foram investigados os padrões cariotípicos e polimorfismo das regiões Ag-RON nas 
espécies S. fuscus e S. variabilis em duas regiões costeiras, uma das quais uma 
provável zona de hibridização ao longo do litoral do Rio Grande do Norte, região 
Nordeste do Brasil. As análises realizadas nos indivíduos de S. fuscus e S. variabilis 
da praia de Tabatinga não revelaram diferenças no valor diploide (2n=48) e número 
de acrocêntricos para S. fuscus (6 acrocêntricos) e S. variabilis (8 acrocêntricos), com 
valores modais de dois e quatro sítios Ag-RONs para as espécies. Padrões 
citogenéticos na praia de Santa Rita, uma possível zona híbrida de S. variabilis e S. 
fuscus, não revelaram cariótipos intermediários, contudo, apresentaram dois valores 
modais de sítios Ag-RONs entre os indivíduos de S. variabilis, um com quatro sítios e 
outro com três, intermediário com S. fuscus (dois sítios). A presença de dois pares 
portadores das RONs, em S. variabilis é o primeiro registro de sítios múltiplos em 
Pomacentridae e os dados obtidos sugerem a necessidade de investigações 
adicionais na possível zona híbrida, para esclarecer possível introgressão 
interespecífica entre essas espécies. 
 
Palavras-chave: Citogenética de peixes, Polimorfismos Ag-RONs, DNA ribossomal, 
citotaxonomia, hibridização. 
 
 
 
 
 
Evolução citogenômica em donzelinhas 43 
Introdução 
A família Pomacentridae apresenta uma alta diversidade cariotípica, incluindo 
variações no número diploide, morfologia cromossômica e número de braços 
cromossômicos (Molina & Galetti, 2004a, b; Molina, 2007; Arai, 2011). Dentre seus 
grupos, alguns clados, como Chrominae se caracterizam por notáveis polimorfismos 
numérico-estruturais (Molina & Galetti, 2002; Getlekha et al., 2016), enquanto outros 
como Microspathodontinae, exibem 2n conservados, mas diversificações claramente 
associadas a inversões pericêntricas (Molina & Galetti, 2004a, b). 
Incluído no clado Microspathodontinae, o gênero Stegastes constitui um grupo 
diverso, cujos cariótipos têm 2n=48, mas que exibem uma ampla variação do número 
de braços cromossômicos (FN=56-92) (Molina & Galetti, 2004a, b). No Atlântico as 
relações filogenéticas dos Stegastes apresentam algumas indefinições taxonômicas 
em decorrência da marcante variação de coloração e sobreposição de elementos 
seriais (número de escamas operculares e da linha lateral, raios moles e duros das 
nadadeiras) (Souza et al., 2017). Divergências fenotípicas pouco conspícuas ocorrem 
mesmo entre algumas espécies estritamente simpátricas e evolutivamente 
diferenciadas, como S. fuscus e S. variabilis (Araújo et al., 2003). 
Dentro da área de sobreposição espacial e ecológica das espécies costeiras S. 
fuscus e S. variabilis, na praia de Santa Rita, localidade do litoral do Estado do Rio 
Grande do Norte, costa nordeste do Brasil, foram identificados por marcadores RAPD, 
perfis genéticos intermediários entre essas espécies, que sugeriam uma zona de 
introgressão (Dias Jr. et al., 2007). 
A hibridização não é um fenômeno incomum em ambientes marinhos. Cerca 
de 111 híbridos putativos foram relatados entre espécies de peixes em ambientes 
naturais, envolvendo 173 espécies em 17 famílias, sendo dois terços desses híbridos 
relatados entre peixes de recifes de corais tropicais (He et al., 2019). Vários processos 
têm sido propostos para explicar a abundância de hibridização de peixes em 
ambientes marinhos, dentre eles: a fertilização externa, a competição por áreas de 
desova limitadas, o contato secundário de táxons irmãos recentemente divergidos, a 
sobreposição espacial ou alimentar em espécies parentais, a raridade de uma ou 
ambas as espécies parentais e ausência de acasalamento seletivo (Montanari et al., 
2012). 
Evolução citogenômica em donzelinhas 44 
Apesar de rara entre representantes de Pomacentridae (He et al., 2019), a 
hibridização foi reportada para os gêneros Abudefduf (Coleman et al., 2014), 
Amphiprion (Gainsford et al., 2015) Dascyllus (He et al., 2019) e Stegastes (Mullen et 
al., 2012). Espécies de donzelinhas de recife de coral (Pomacentridae) oferecem uma 
oportunidade única para investigar a interação entre ecologia, história de vida e a 
evolução e manutenção dos limites das espécies em sistemas marinhos porque são 
permanentemente territoriais, exibem comportamento agressivo óbvio relacionado à 
defesa do território e a qualidade do território está diretamente ligada ao sucesso 
reprodutivo (Mullen et al., 2012). 
Além da similaridade morfológica na fase adulta, do ponto de vista cariotípico, 
S. fuscus e S. variabilis são homoploides, com 2n=48, mas diferem na estrutura do 
cariótipo, no qual S. fuscus apresenta 20m+22sm+6a (FN = 90) e dois sítios Ag-RONs 
(par 11), enquanto S. variabilis possui 18m+22sm+8a (FN = 88) e quatro sítios Ag-
RONs (pares 10 e 11) (Molina & Galetti, 2004; Capítulo 1). Essa distinção cariotípica 
em pelo menos um evento de inversão pericêntrica possibilitaria evidenciar eventos 
de introgressão, pela ocorrência de eventos de hibridizaçãoentre essas espécies no 
litoral do Estado do Rio Grande do Norte através da identificação de número 
intermediário de cromossomos acrocêntricos ou de sítios Ag-RONs entre as duas 
espécies. 
A identificação de uma zona híbrida em uma espécie de peixe marinho, como 
a entre S. fuscus e S. variabilis (Dias Jr. et al., 2007) é uma condição inédita para o 
Atlântico Ocidental. Sua caracterização, compreensão das causas e definição dos 
padrões citogenéticos envolvidos forneceria dados sobre os processos de divergência 
evolutiva e das bases de sua ocorrência. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Evolução citogenômica em donzelinhas 45 
Material e métodos 
Foram analisadas amostras de S. fuscus e S. variabilis (Figura 6) provenientes 
das praias de Santa Rita (Extremoz–RN; 5º41'38.702"S, 35º11'48.754"O) e Tabatinga 
(Nísia Floresta–RN; 6º3'8.251"S, 35º6'28.624"O) (Figura 5). Um total de 40 indivíduos, 
consistindo em 26 de S. fuscus, e 14 de S. variabilis, foram coletados durante um 
período de dois meses. A captura envolveu métodos de pesca convencionais como 
redes e vara e anzol para captura de espécimes de diferentes faixas etárias. 
 
Figura 6. Exemplares das espécies costeiras S. fuscus (a, c) e S. variabilis (b, d). a, 
b. Adultos. c, d. Juvenis. Barra=1cm. 
 
Os espécimes foram submetidos à estimulação mitótica, por meio da inoculação 
intraperitoneal de complexos de antígenos fúngicos e bacterianos de acordo com 
Molina et al. (2010). Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir da suspensão 
de porções do tecido renal anterior de acordo com a técnica in vitro proposta por Gold 
et al. (1990). Cerca de 100 μl de suspensão celular foi gotejado sobre lâminas de vidro 
recobertas com um filme de água destilada à 60ºC. Em seguida, as lâminas foram 
secas à temperatura ambiente e coradas em seguida com solução de Giemsa (5%), 
diluída em tampão fosfato (pH 6,8), durante 8 minutos, sendo novamente secas. As 
regiões organizadoras de nucléolos (RONs) foram identificadas por meio da técnica 
de impregnação por nitrato de prata, preconizada por Howell & Black (1980). Pelo 
menos 30 metáfases foram analisadas para cada indivíduo. 
 
 
Evolução citogenômica em donzelinhas 46 
Resultados 
As análises realizadas nas populações de S. fuscus e S. variabilis da praia de 
Tabatinga revelaram mesmo valor diploide (2n=48) e número de cromossomos 
acrocêntricos compatíveis para S. fuscus (6 acrocêntricos) e S. variabilis (8 
acrocêntricos). A grande maioria das metáfases avaliadas para indivíduos de S. 
fuscus de Tabatinga e Santa Rita apresentaram dois sítios Ag-RONs localizados no 
braço curto do par 11 (94% e 88%, respectivamente), com 6% e 12% das metáfases 
restantes, apresentando respectivamente, entre três, quatro e seis sítios. 
Os indivíduos de S. variabilis das praias de Tabatinga e Santa Rita, mostraram 
maior polimorfismo de sítios Ag-RONs que S. fuscus. A maioria das metáfases exibiu 
quatro sítios Ag-RONs (80,4% e 54,6%, respectivamente), localizados nos braços 
curtos dos pares 10, e 11. Um total de 20% e 45% das metáfases restantes, 
respectivamente dos indivíduos de Tabatinga e Santa Rita, apresentaram dois e três 
sítios (com 35% de frequência em Santa Rita) (Figura 8). Os dados estão detalhados 
nas Tabelas 2 e 3. 
 
Figura 7. Frequência de sítios Ag-RONs em indivíduos de S. fuscus (azul listrado) e 
S. variabilis (vermelho listrado) da Praia de Tabatinga, Nísia Floresta – RN e S. fuscus 
(azul) e S. variabilis (vermelho) da Praia de Santa Rita, Extremoz – RN (direita). 
 
Evolução citogenômica em donzelinhas 47 
Tabela 2. Parâmetros cariotípicos e frequência populacional de sítios Ag-RONs em S. 
fuscus e S. variabilis da Praia de Tabatinga, Nísia Floresta – RN, Nordeste do Brasil. 
* valores modais. 
 
Tabela 3. Parâmetros cariotípicos e frequência de sítios Ag-RONs em S. fuscus e S. 
variabilis na Praia de Santa Rita, Extremoz – RN, Nordeste do Brasil. 
* valores modais. 
S. fuscus/ID 2n* Acrocêntricos* 
sítios Ag-RONs 
Total 
2 3 4 5 6 
5446 48 6 39 - - - - 40 
5447 48 6 14 - - - - 14 
5448 48 6 52 - 05 - - 57 
5450 48 6 07 - - - - 07 
5478 48 6 49 - - - - 49 
5479 48 6 31 02 02 - 03 38 
5480 48 6 30 01 - - 02 33 
5487 48 6 52 - - - - 52 
Total 
274 03 07 0 05 289 
94% 1% 2% 0% 2% 100% 
S. variabilis/ID 
5441 48 8 04 01 40 - - 45 
5442 48 8 06 03 41 - - 50 
5443 48 8 05 - 19 - - 24 
5444 48 8 03 - 46 - 01 50 
5445 48 8 01 - 15 - - 16 
5449 48 8 01 01 29 - - 31 
5451 48 8 02 27 12 - 41 
5482 48 8 05 - 35 - - 40 
5489 48 8 04 - 26 - 30 
Total 
31 32 263 0 01 327 
9,5% 9,8% 80,4% 0,0% 0,3% 100% 
S. fuscus/ ID 2n* Acrocêntricos* 
sítios Ag-RONs 
Total 
2 3 4 5 6 
5436 48 6 39 0 0 - 0 39 
5437 48 6 37 06 0 - 08 51 
5493 48 6 31 0 0 - 04 35 
5494 48 6 29 09 0 - 01 39 
5495 48 6 38 0 0 - 0 38 
5496 48 6 11 0 0 - 0 11 
5497 48 6 07 0 0 - 0 07 
5498 48 6 13 0 0 - 0 13 
5499 48 6 11 0 0 - 0 11 
5500 48 6 08 0 0 - 0 08 
5503 48 6 36 0 0 - 03 39 
5504 48 6 30 01 01 - 0 32 
5505 48 6 14 05 01 - 02 22 
5506 48 6 27 01 02 - 01 31 
5507 48 6 22 03 0 - 02 27 
5508 48 6 61 03 09 - 02 75 
5509 48 6 35 0 0 - 01 36 
5510 48 6 14 0 0 - 0 14 
Total 
463 28 13 0 24 528 
88% 5% 2% 0% 5% 100% 
S. variabilis/ID 
5438 48 8 05 04 41 - - 50 
5439 48 8 01 0 25 - - 26 
5440 48 8 06 01 37 - - 44 
5485 48 8 06 44 0 - - 50 
5486 48 8 01 20 04 - 01 26 
Total 
19 69 107 0 01 196 
9,7% 35,2% 54,6% 0,0% 0,5% 100% 
Evolução citogenômica em donzelinhas 48 
 
Figura 8. Metáfases exibindo variação de marcações Ag-RONs (3 a 6 sítios) em 
indivíduos de S. variabilis (Tabatinga a, b; Santa Rita c, d) e S. fuscus (Tabatinga e, 
f; Santa Rita g, h, i). Barra=5µm. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Evolução citogenômica em donzelinhas 49 
Discussão 
Genes ribossomais constituem uma das classes de DNA repetitivo mais 
investigadas em estudos de evolução cariotípica em peixes (Martins & Galetti, 2001). 
Os genes do RNA ribossômico em uma célula eucariótica formam clusters com uma 
estrutura altamente repetitiva e fazem parte do nucléolo no qual o RNAr é transcrito, 
processado e montado com proteínas “r” em ribossomos, esta organização é 
conservada entre a maioria dos organismos eucarióticos (Kobayashi, 2014). 
Uma das classes de DNAr é representada pelo DNAr 45S que codifica os RNAr 
18S, 5.8S e 26S/28S e a outra, representada pelo DNAr 5S, codifica o RNAr 5S, 
elemento da maior subunidade dos ribossomos. Os genes de RNAr 45S 
correspondem às regiões organizadoras nucleolares (RONs) (Martins & Galetti, 2001). 
A estrutura, número, tipo, tamanho e morfologia de uma região organizadora 
nucleolar (RON) podem ser específicos para populações, espécies e subespécies 
(Britton-Davidian, 2012). Essas regiões podem ser detectadas por meio da 
impregnação por prata, marcando proteínas nucleolares envolvidas com a atividade 
transcricional dos genes ribossomais que correspondem às RONs transcricionalmente 
ativas (Santani et al., 2002). Assim, a coloração Ag-RON é frequentemente usada 
para identificar variações intra- e interespecíficas (Britton-Davidian, 2012). 
Como o número e a posição dos clusters de DNAr são muitas vezes específicos 
da espécie, esses caracteres cromossômicos têm sido amplamente utilizados em 
reconstruções sistemáticas e filogenéticas (Britton-Davidian, 2012). Polimorfismos 
interespecíficos e intraespecíficos em RONs foram bem documentados em grupos 
como Characiformes (Hashimoto et al., 2010), Tetraodontiformes (Martinez et al., 
2010) e Siluriformes (Porto et al., 2014), revelando ampla variação no número de 
RONs por genoma, na localização cromossômica e nos tamanhos relativos dos sítios. 
Diante da maior frequência de polimorfismos envolvendo estas regiões, elas 
são particularmente úteis como marcadores citotaxonômicos e em estudos 
citogenéticos populacionais. Entre os Percomorpha, é comum a presença de RONs 
únicas, embora RONs múltiplas ocorram com relativa frequência em alguns gruposde 
peixes (Gornung, 2013). 
Sítios ribossomais em apenas um par de cromossômicos, como observado em 
S. fuscus, pode representar a condição ancestral para a família (Molina & Galetti, 
2004). A presença de dois pares portadores das RONs, em S. variabilis é o primeiro 
Evolução citogenômica em donzelinhas 50 
registro de sítios múltiplos em Pomacentridae, e indica uma maior dinâmica evolutiva 
destas regiões e condição apomórfica apresentada por S. variabilis. 
O crossing-over desigual tem sido apontado como um dos mecanismos que 
promovem o heteromorfismo das RONs (Mandrioli, 1999). A ocorrência de 
recombinação somática entre sítios de DNAr homólogos e não homólogos são 
difundidas em leveduras (Huang & Keil, 1995). O mesmo fenômeno foi descrito em 
outros eucariotos, como Drosophila (Tartof, 1974; Frankham et al., 1980, Lyckegaard 
& Clark, 1991), primatas (Arnheim et al., 1980) e em plantas como Triticum estivum 
(Gerlach et al., 1980) e Allium (Schubert & Wobus, 1985). 
A ação dos elementos transponíveis pode ter papel relevante na dinâmica de 
sítios DNAr, promovendo sua variação em número, tamanho, e disposição nos 
cromossomos (Shishido et al., 2000, Cai et al., 2006, Datson & Murray, 2006). Maiores 
informações sobre a organização e presença destes elementos nas espécies de 
Stegastes, ainda são necessárias e poderão esclarecer a dinâmica diferencial destas 
regiões entre as duas espécies. 
Surpreendentemente, percebe-se uma notável variação na frequência destes 
sítios entre indivíduos de S. variabilis das duas localidades analisadas. De fato, nos 
indivíduos de Santa Rita, o provável ponto de hibridização entre essa espécie e S. 
fuscus, a amostra de S. variabilis exibe claramente dois valores modais, com três ou 
quatro sítios Ag-RONs. O mesmo ocorre com alguns indivíduos de S. variabilis da 
praia de Tabatinga. 
Apesar da ocorrência do valor modal de três sítios Ag-RONs em ambas as 
localidades para S. variabilis, a frequência dessa variação apresentou-se de maneira 
mais acentuada na praia de Santa Rita. Em Tabatinga os valores alcançaram cerca 
de 9,8% de ocorrência (Tabela 2), já em Santa Rita os valores modais de três sítios 
margearam 35% dos dados (Tabela 3), evidenciando um maior índice de variação 
nessa região. Embora cariótipos com cromossomos acrocêntricos intermediários entre 
os presentes nas duas espécies não tenham sido detectados, a frequência de 
indivíduos com valor modal de três sítios Ag-RONs, valor intermediário aos 
apresentados pelas duas espécies, ainda deixam em aberto o questionamento de que 
hibridizações entre S. fuscus (2 sítios Ag-RONs) e S. variabilis (4 sítios Ag-RONs) 
possam ocorrer nesta região. 
Estudos mais detalhados envolvendo ferramentas de confirmação molecular se 
mostram necessários, considerando que a existência de uma provável zona de 
Evolução citogenômica em donzelinhas 51 
hibridização pode indicar fatores ambientais alterados como apontam Montanari et al. 
(2012) e Mullen et al. (2012). Além disso, a confirmação desses eventos e a 
identificação de ferramentas para o estudo dos processos envolvidos podem gerar 
contribuições valiosas para o entendimento da resiliência e biodiversidade dos 
ambientes recifais (He et al., 2019). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Evolução citogenômica em donzelinhas 52 
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Evolução citogenômica em donzelinhas 55 
6. CONCLUSÕES GERAIS 
 
• Apesar do notável dinamismo cariotípico Stegastes exibe conservadorismo 
diploide, indicando que as inversões pericêntricas tiveram papel ativo na 
diversificação cromossômica do grupo. 
• As divergências cariotípicas entre as espécies, dentre as quais o número de 
cromossomos acrocêntricos, permite seu uso como eficiente característica 
taxonômica. 
• As espécies do Oceano Atlântico exibem cariótipos com maior número de 
elementos bibraquiais, sobretudo em S. rocasensis, sugerindo que inversões 
pericêntricas tiveram papel importante nos processos especiativos nesta região 
oceânica. 
• A frequência de sítios DNAr 18S mostra-se em geral, maior e não coincidente 
com marcações Ag-RONs (sítios ativos), indicando a presença de sítios DNAr 
não funcionais. 
• As espécies S. variabilis, S. rocasensis e S. fuscus, incluindo a população da 
Ilha de Trindade apresentam arranjos 18S/5S sintênicos sobre um par 
cromossômico foi frequente entre as espécies do Atlântico, e demonstra que 
esta organização do DNA não impede a funcionalidade gênica destes genes 
nestas espécies. 
• A ocorrência de sítios Ag-RONs múltiplos em S. variabilis e sítios DNAr 18S 
múltiplos em todas as espécies, exceto S. fuscus, representa uma condição 
insuspeita para a família e gênero e revela que os sítios DNAr destas espécies 
apresentam uma dinâmica evolutiva maior que do que se acreditava. 
• As similaridades citogenéticas apoiam que S. rocasensis do Atol das Rocas e 
Arquipélago São Pedro e São Paulo, e de S. fuscus do litoral e da Ilha de 
Trindade constituam ainda entidades taxonômicos comuns. 
• É necessária uma maior prospecção de sequências repetitivas nos cariótipos 
das espécies de Stegastes para responder sobre seu papel na marcante 
diversificação cariotípica das espécies deste gênero. 
• Análises cariotípicas e da frequência de sítios Ag-RONs em S. fuscus e S. 
variabilis em uma zona híbrida não demonstraram variações cromossômicas 
no número de elementos acrocêntricos em relação a estas espécies de outra 
Evolução citogenômica em donzelinhas 56 
localidade, mas a presença de um valor modal de sítios Ag-RONs 
intermediários entre elas suscita maiores estudos para confirmar a ocorrência 
deste processo nesta região. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Evolução citogenômica em donzelinhas 57 
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
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