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DISCIPLINA MICROBIOLOGIA AMBIENTAL AULA 03 NUTRIÇÃO, METABOLISMO ENERGÉTICO DOS MICRORGANISMOS E MEIOS DE CULTURA AUTOR VIDEANNY VIDENOV ALVES DOS SANTOS E CYBELLE TEIXEIRA MARQUES TECNÓLOGO EM GESTÃO AMBIENTAL DISCIPLINA MICROBIOLOGIA AMBIENTAL AULA 03 NUTRIÇÃO, METABOLISMO ENERGÉTICO DOS MICRORGANISMOS E MEIOS DE CULTURA AUTOR VIDEANNY VIDENOV ALVES DOS SANTOS E CYBELLE TEIXEIRA MARQUES TECNÓLOGO EM GESTÃO AMBIENTAL GOVERNO DO BRASIL Presidente da República DILMA VANA ROUSSEFF Ministro da Educação JOSÉ HENRIQUE PAIM FERNANDES Diretor de Ensino a Distância da CAPES JOÃO CARLOS TEATINI Reitor do IFRN BELCHIOR DE OLIVEIRA ROCHA Diretor do Campus EaD/IFRN ERIVALDO CABRAL Diretora Acadêmica do Campus EaD/IFRN ANA LÚCIA SARMENTO HENRIQUE Coordenadora Geral da UAB /IFRN ILANE FERREIRA CAVALCANTE Coordenadora Adjunta da UAB/IFRN MARLI TACCONI Coordenadora do Curso de Tecnologia em Gestão Ambiental MARIA DO SOCORRO DIÓGENES PAIVA MICROBIOLOGIA AMBIENTAL AULA 03 Nutrição, Metabolismo energético dos microrganismos e Meios de cultura Professor Pesquisador/Conteudista VIDEANNY VIDENOV ALVES DOS SANTOS E CYBELLE TEIXEIRA MARQUES Diretora da Produção de Material Didático ROSEMARY PESSOA BORGES Coordenador da Produção de Material Didático LEONARDO DOS SANTOS FEITOZA Revisão Linguística HILANETE PORPINO DE PAIVA Coordenação de Design Gráfico LEONARDO DOS SANTOS FEITOZA Projeto Gráfico BRENO XAVIER Diagramação/ Ilustração ERIWELTON CARLOS M. DA PAZ INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA RIO GRANDE DO NORTE Campus EaD 5 INTEMPERISMO E SOLO APRESENTANDO A AULA Caro (a) aluno (a), nesta aula você conhecerá as exigências nutricionais dos microrganismos e as vias metabólicas de produção de energia utilizadas por eles. Mostraremos que a diversidade nutricional e metabólica dos microrganismos permite-lhes fazer coisas que não podemos fazer, como viver em ambientes sem gás oxigênio, utilizar compostos inorgânicos como alimento e utilizar a luz como fonte de energia. Nesta aula, examinaremos como o homem tem se beneficiado do metabolismo microbiano. Alguns produtos do metabolismo microbiano proporcionam a produção de alimentos como queijos e iogurtes. Você também verá que é possível cultivar os microrganismos em laboratório, o que nos permite identificar ou conhecer melhor as exigências nutricionais e metabólicas dos microrganismos. De qualquer forma, através desse conhecimento podemos determinar como controlar o crescimento dos microrganismos indesejáveis, bem como aprender a estimular o crescimento dos microrganismos benéficos e aqueles que queremos estudar. DEFININDO OBJETIVOS Ao final desta aula, você deverá ser capaz de: • Identificar as exigências nutricionais dos microrganismos; • Compreender a classificação dos microrganismos quanto as suas necessidades nutricionais; • Identificar as principais vias do metabolismo energético utilizadas pelos microrganismos; • Relacionar as exigências nutricionais dos microrganismos à utilização de meios de cultura para o seu cultivo; • Compreender a importância do cultivo de microrganismos em laboratório. 6 GEOLOGIA AMBIENTAL DESENVOLVENDO O CONTEÚDO EXIGÊNCIAS NUTRICIONAIS Necessidade de nutrientes para o crescimento e manutenção da vida microbiana Você conheceu na aula 02 a organização celular básica dos microrganismos. Agora reflita sobre o seguinte: a célula é construída a partir de quais substâncias? Comentamos na aula passada, que as estruturas celulares são compostas basicamente por proteínas, lipídeos, carboidratos e ácidos nucleicos. Até mesmo os vírus, que são seres acelulares, são formados por algumas dessas substâncias. Dessa forma, todos os organismos vivos necessitam desses materiais orgânicos para crescerem, se multiplicarem e se manterem vivos. Pois, eles são necessários para que uma nova célula possa ser montada e para que os processos celulares que mantêm a vida possam ocorrer. Os elementos básicos contidos nessas substâncias que constroem os organismos vivos são os átomos de carbono, nitrogênio, oxigênio, fósforo e enxofre, como já discutimos na aula 01. Por essa razão, tais elementos são nutrientes essenciais para o crescimento e desenvolvimento microbiano. Você imagina como os microrganismos obtêm esses elementos químicos? Essas exigências químicas, juntamente com as condições físicas que serão discutidas na próxima aula, são fornecidas pelo meio onde o organismo se encontra, estando presentes em compostos orgânicos e inorgânicos, permitindo assim o seu desenvolvimento. Aliás, os microrganismos são os seres mais versáteis e diversificados em suas exigências nutricionais (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 2009). Lembra-se que na aula passada comentamos que os microrganismos estão presentes em praticamente todos os ambientes da Terra, inclusive nos ambientes onde a existência de qualquer outo ser vivo seria impossível? Você arriscaria dizer por quê? Essa ampla distribuição geográfica deve-se, em grande parte, a diversidade de exigências nutricionais e de metabolismo. Alguns microrganismos podem se sustentar com poucas substâncias inorgânicas e, algumas delas, nem mesmo as plantas são capazes de utilizar. 7 INTEMPERISMO E SOLO Principais elementos químicos como nutrientes para os microrganismos Como acabamos de discutir, alguns elementos químicos são nutrientes porque são necessários tanto para a produção dos componentes celulares como para as suas funções normais, sendo assim, elementos necessários para o crescimento e para a manutenção da vida microbiana. Conheça agora, através da tabela 1, um pouco mais sobre os principais elementos químicos ou fatores químicos (exigências nutricionais) importantes para formar as substâncias necessárias para a construção das estruturas celulares dos microrganismos. ELEMENTO QUÍMICO/ NUTRIENTE FONTES FUNÇÕES Carbono Pode ser obtido a partir de compostos orgânicos (carboidratos, inclusive a celulose, proteínas, lipídeos e álcoois) ou de compostos inorgânicos (gás carbônico - CO2; ou bicarbonato) presentes no hábitat natural. O carbono forma o esqueleto dos carboidratos, lipídeos e proteínas, que irão formar as estruturas celulares e podem servir como fonte de energia para os microrganismos. Nitrogênio Compostos orgânicos que contém nitrogênio; algumas bactérias utilizam nitrogênio atmosférico - N2; outras utilizam compostos inorgânicos nitrogenados como nitratos, nitritos ou sais de amônia. O nitrogênio é utilizado pelos microrganismos na construção dos aminoácidos, moléculas formadoras das proteínas, que irão formar as estruturas celulares e podem servir como fonte de energia. Hidrogênio Presente na água e em muitos compostos orgânicos. É utilizado pelos microrganismos na construção de moléculas de carboidratos, lipídeos e de proteínas, que irão formar as estruturas celulares e podem servir como fonte de energia. Tab. 01 - Elementos químicos como nutrientes, suas fontes e funções 8 GEOLOGIA AMBIENTAL Outros elementos essenciais podem ser requeridos pelos microrganismos, embora em quantidades muito pequenas, por isso, são chamados de elementos traços, como ferro, cobre, molibdênio e zinco (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). Eles funcionam como cofatores por serem necessários para ativar certas enzimas, possibilitando assim o acontecimento de reações químicas celulares necessárias à manutenção da vida. Ainda nesta aula descreveremos o papel das enzimas na célula. De acordo com Tortora, Funke e Case (2012), no caso de cultivo laboratorial de microrganismos, os elementos traços podem ser adicionados ao meio, mas eles costumam estar naturalmente na água da torneira, na água destilada e em outros Fo nt e: A ut or ia p ró pr ia ELEMENTO QUÍMICO/ NUTRIENTE FONTES FUNÇÕES Oxigênio Presente na água e em muitos compostos orgânicos. É utilizado na construção de moléculas de carboidratos,lipídeos e de proteínas, que irão formar as estruturas celulares e podem servir como fonte de energia. Fósforo Pode utilizar esse elemento a partir do íon inorgânico fosfato (PO4 -3), ou a partir de vários nutrientes que contenham este elemento. É necessário, para a síntese de ácidos nucléicos, dos fosfolipídeos das membranas celulares e da adenosina trifosfato (ATP), um composto que fornece energia para todas as atividades celulares. Enxofre Fontes naturais de enxofre. Incluem o íon inorgânico sulfato (SO4 -2), o sulfeto de hidrogênio e os aminoácidos contendo enxofre. É utilizado na produção de aminoácidos como cisteína, cistina e metionina, e para a síntese de vitaminas como biotina e tiamina, necessárias para o bom funcionamento celular. 9 INTEMPERISMO E SOLO componentes do meio de cultivo. Você percebeu que os microrganismos podem obter seus nutrientes utilizando fontes muito diversas? Essa característica tem proporcionado vários benefícios ao homem. Você saberia descrever algum desses benefícios? Comentaremos agora alguns deles. A versatilidade da fonte de carbono utilizada pelos microrganismos permite o emprego desses seres em uma extensa série de transformações úteis ao homem (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). Por exemplo, o uso de carboidratos por alguns microrganismos pode gerar álcool etílico e gás carbônico (CO2), importantes para a indústria de bebidas alcoólicas e para a panificação, respectivamente. Você imagina qual é a importância de compreender as exigências nutricionais dos diferentes microrganismos? Conhecer as exigências nutricionais permite manipular em laboratório as fontes nutricionais e, assim, selecionar, identificar e estudar microrganismos específicos (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 2009). Além disso, entendendo as condições necessárias para o crescimento microbiano, podemos determinar como controlar o crescimento de microrganismos que causam doenças ou deterioração de alimentos. Podemos, também, aprender como estimular o crescimento dos microrganismos benéficos e aqueles que queremos estudar (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). POR QUE A ÁGUA É IMPORTANTE PARA OS MICROORGANISMOS? Embora a água não seja um nutriente, ela é indispensável para o crescimento dos microrganismos, pois a maioria deles pode absorver nutrientes somente quando as substâncias químicas estão dissolvidas na água, passando em solução através da membrana plasmática. Como você sabe, a água é o solvente universal. Dessa maneira, vários nutrientes podem ser dissolvidos pela água; além disso, as reações químicas que mantêm a vida da célula ocorrem na solução aquosa que a preenche. Oxigênio atmosférico Como a água, o gás oxigênio ou oxigênio molecular (O2) não é um nutriente, mas 10 GEOLOGIA AMBIENTAL é importante para o processo de obtenção de energia a partir de compostos orgânicos realizados por certos microrganismos. Esse processo fornece uma grande quantidade de energia e, ao mesmo tempo, neutraliza (modifica) um gás potencialmente tóxico para a célula (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). Os microrganismos que utilizam o oxigênio, chamados de aeróbicos, produzem mais energia a partir dos nutrientes do que os microrganismos que não utilizam o oxigênio, denominados anaeróbicos. Os microrganismos que requerem oxigênio para viver são chamados de aeróbicos obrigatórios (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). Muitas bactérias têm desenvolvido a capacidade de continuar a crescer na ausência do oxigênio. Tais organismos são chamados de anaeróbicos facultativos. A Escherichia coli, bactéria encontrada no trato intestinal humano, e as leveduras são exemplos de microrganismos anaeróbicos facultativos (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). Os anaeróbicos obrigatórios são incapazes de utilizar o oxigênio para as reações produtoras de energia. Como não metabolizam o O2 , ele torna-se tóxico para a célula microbiana, levando a sua morte (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). VOCÊ SABIA? Alguma vez você já utilizou água oxigenada sobre um ferimento para evitar infecção do mesmo? Você sabe por qual motivo ela é utilizada como um agente antimicrobiano? A água oxigenada é o nome comercialmente conhecido da substância chamada de peróxido de hidrogênio (H2O2). Quando uma gota de peróxido de hidrogênio é colocada em um ferimento, certas enzimas das células do tecido humano o transformam em água e gás oxigênio; este último acaba matando as possíveis bactérias anaeróbicas como as do gênero Clostridium, que contém espécies que causam o tétano e o botulismo. 11 INTEMPERISMO E SOLO CLASSIFICAÇÃO DOS MICROORGANISMOS QUANTO AS EXIGÊNCIAS NUTRICIONAIS Todas as células necessitam de uma fonte de carbono e de energia para produzir seus componentes celulares e manterem o bom funcionamento da célula. Os microrganismos são organizados em grupos com base nessas exigências. Na natureza, a energia pode ser obtida a partir de três fontes: compostos químicos orgânicos, compostos químicos inorgânicos e luz, como você pode observar na figura 1 (MADIGAN et. al., 2010). ATIVIDADE 01 1.1. Quais substâncias constroem as células? Quais são os principais elementos químicos que formam essas substâncias? 1.2. De um modo geral, comente sobre a importância dos elementos químicos citados na questão 1 para os microrganismos. 1.3. Como os microrganismos obtêm os elementos químicos necessários para o seu crescimento? Cite exemplos. 1.4. O que são elementos traços? Liste os principais e explique a sua importância. 1.5. É correto afirmar que a água é um nutriente por ser indispensável para o crescimento dos microrganismos? Justifique a sua resposta. 1.6. Explique a importância de conhecer as exigências nutricionais dos diferentes microrganismos. 1.7. Explique a importância do gás oxigênio para a sobrevivência dos microrganismos aeróbicos obrigatórios, anaeróbicos facultativos e anaeróbicos obrigatórios. 12 GEOLOGIA AMBIENTAL Segundo Madigan et. al. (2010), os microrganismos podem ser divididos em três grupos conforme a fonte de energia utilizada, são eles: Quimiorganotróficos – aqueles organismos que utilizam compostos químicos orgânicos como fonte de energia. A energia é obtida a partir da degradação do composto para formar adenosina trifosfato (ATP). Molécula que pode ser utilizada para as diversas atividades celulares, tais como produção das substâncias que formam a célula, movimento, reprodução, entre outros. Muitas bactérias, fungos e protozoários são quimiorganotróficos. Quimiolitotróficos – são os organismos capazes de utilizar compostos inorgânicos como fonte de ATP. Apenas os seres procariotos são quimiolitotróficos, incluindo as espécies do domínio Bacteria e Archaea. Alguns compostos inorgânicos que podem ser utilizados pelos microrganismos citados são o gás hidrogênio (H2), o sulfeto de hidrogênio (H2S) e a amônia (NH3), compostos que outros seres vivos normalmente não conseguem utilizar como fonte de energia, o que explica, como já comentamos anteriormente, a existência de microrganismos nos ambientes mais improváveis. Fototróficos – são organismos que produzem ATP às custas da energia solar. Fo nt e: (M A D IG A N e t. al ., 20 10 , p . 3 9) . Fig. 01 - Classificação nutricional dos microrganismos baseada na fonte de enegia. 13 INTEMPERISMO E SOLO As células dos microrganismos fototróficos são coloridas porque contêm pigmentos que os permitem utilizar a energia solar como fonte de energia. A fotossíntese é um processo fototrófico, através do qual algas e cianobactérias obtém ATP com produção de oxigênio (O2). As bactérias púrpuras e verdes são fototróficas pelo fato de produzirem seu ATP a partir da energia solar, mas sem produzir O2. Lembre-se que estamos tratando nessa classificação apenas dos microrganismos. Ainda segundo Madigan et. al. (2010), levando-se em consideração a fonte de carbono utilizada, os microrganismos podem ser organizadosem dois grupos, são eles: Heterotróficos – quando eles obtém o carbono a partir de compostos orgânicos. Os microrganismos quimiorganotróficos são heterotróficos. Autotróficos – são os organismos que utilizam o dióxido de carbono (CO2) como sua fonte de carbono. A maioria dos microrganismos quimiolitotróficos e todos os fototróficos são autotróficos. Eles sintetizam matéria orgânica a partir do composto inorgânico CO2 para construir seu próprio organismo, beneficiando a si próprio e os quimiorganotróficos, os quais podem se alimentar diretamente dos autotróficos. PESQUISE Pesquise sobre a importância ambiental dos seres autotróficos. Utilizaremos essa informação na aula 04, na qual você conhecerá os microrganismos de interesse sanitário e ambiental. Registre a sua pesquisa. ATIVIDADE 02 1.1. Explique a classificação dos microrganismos baseada na fonte de energia utilizada por eles. Dê exemplos de microrganismos de cada grupo. 1.2. Explique a classificação dos microrganismos baseada na fonte de carbono utilizada por eles. Dê exemplos de microrganismos de cada grupo e comente sobre a importância dos microrganismos autotróficos. 14 GEOLOGIA AMBIENTAL METABOLISMO ENERGÉTICO DOS MICRORGANISMOS Metabolismo microbiano Os organismos vivos realizam inúmeras reações químicas utilizando-se de compostos orgânicos e inorgânicos existentes na natureza com a finalidade de produzir energia na forma de ATP para realizar trabalho, nesse caso, as atividades celulares, tais como movimento, produção de substâncias que compõem as estruturas celulares, crescimento e reprodução. O somatório de todas essas reações químicas celulares é definido como metabolismo, sendo ele a fonte de obtenção de energia e a chave para a manutenção da vida (VERMELHO et. al., 2011). Podemos afirmar, ainda, que o metabolismo é a soma dos processos anabólicos (anabolismo), também conhecidos como processos de síntese, com gasto de energia, e os processos catabólicos (catabolismo), estes são os grandes responsáveis pela geração de energia na célula através da quebra de moléculas orgânicas complexas, como proteínas e carboidratos, em compostos mais simples, como aminoácidos e monossacarídeos (VERMELHO et. al., 2011; TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). Você saberia dizer ao menos uma reação de síntese ou de degradação que ocorre em nossas células? Elas também ocorrem nas células microbianas. Exemplos de processos anabólicos são as produções de proteínas a partir de aminoácidos, de ácidos nucleicos a partir de nucleotídeos, e de polissacarídeos a partir de açúcares simples, também chamados de monossacarídeos (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). Na verdade, a célula é muito dinâmica, está sempre realizando reações catabólicas e anabólicas. Através do catabolismo ocorre a degradação das moléculas complexas, liberando os blocos construtivos para as reações anabólicas e formando o ATP, necessário para que as reações de síntese aconteçam. Veja, na figura 2, na próxima página, o papel do ATP nas reações anabólicas e catabólicas. NÃO ESQUEÇA! As vias catabólicas são úteis não somente para liberar energia, mas também para fornecer as moléculas mais simples, precursores a partir dos quais a célula pode produzir suas proteínas, lipídeos, polissacarídeos (carboidratos) e ácidos nucleicos. 15 INTEMPERISMO E SOLO É importante que você saiba que as reações químicas na célula não ocorrem de maneira espontânea. Elas acontecem por intermédio de um grupo de proteínas chamadas enzimas. Estas são altamente específicas quanto às reações que realizam. Ou seja, cada enzima realiza um único tipo de reação química. Essa especificidade está relacionada à estrutura tridimensional da molécula enzimática. A forma da enzima apresenta um encaixe praticamente perfeito para a substância ou substâncias que ela modificará, podendo realizar, assim, a reação química em questão (MADIGAN et. al., 2010). Já comentamos nesta aula que os microrganismos podem ser encontrados nos ambientes mais improváveis devido a sua diversidade nutricional e metabólica. Você imagina por qual razão outros seres não conseguem viver nesses ambientes? É importante que você compreenda que as vias metabólicas da célula são determinadas por suas enzimas, que por sua vez são determinadas pela constituição genética da célula (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). Como cada ser vivo tem uma constituição genética característica da sua espécie, isso implica na possibilidade da existência de certas enzimas em um organismo, mas em outro não. O que explicaria o fato de algumas bactérias poderem utilizar, por exemplo, gás hidrogênio (H2) e amônia (NH3) como fonte de energia, conseguindo, assim, viver em ambientes com pouca possibilidade de outra forma de vida. Fig. 02 - O papel do ATP nas reações anabólicas e catabólicas. O ATP liberado da quebra (catabolismo) das moléculas complexas é utilizado na união (anabolismo) de moléculas simples para formar moléculas complexas. Fo nt e: A ut or ia p ró pr ia . 16 GEOLOGIA AMBIENTAL Vias de degradação de nutrientes A maioria dos microrganismos utiliza os carboidratos como sua fonte principal de energia celular, principalmente do açúcar glicose. Eles também podem utilizar lipídeos e proteínas para a produção de energia (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). A obtenção de energia a partir dos açúcares pode ser através do metabolismo aeróbico - respiração aeróbica - e/ou do metabolismo anaeróbico - respiração anaeróbica e fermentação - (VERMELHO et. al., 2011). Agora, conheça um pouco mais sobre cada via de obtenção de energia pelos microrganismos. Respiração aeróbica É uma série de reações de degradação da glicose na presença do gás oxigênio, que ocorrem em uma membrana com geração de ATP e de CO2. Muitas dessas reações liberam elétrons e, na via metabólica em questão, o aceptor final de elétrons é o O2, ou seja, é a última substância dessa via a receber os elétrons que foram perdidos (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). A equação geral da respiração aeróbica é: A respiração aeróbica tem uma grande vantagem sobre a fermentação: produz uma quantidade bem maior de energia. Através da respiração aeróbica, 1 molécula de glicose gera 38 moléculas de ATP, enquanto que pela fermentação, 1 molécula de glicose gera apenas 2 moléculas de ATP. Por essa razão, os microrganismos aeróbicos crescem bem mais rápido do que os anaeróbicos. Respiração anaeróbica É uma série de reações de degradação da glicose na ausência do O2, que ocorrem em uma membrana com geração de ATP (produção abaixo de 38 ATP e acima 2 ATP). O aceptor final de elétrons é uma molécula inorgânica, diferente do O2, podendo ser um íon nitrato ou sulfato. Muitos procariotos realizam essa via metabólica para a obtenção de energia, por exemplo, as bactérias essenciais para os ciclos do nitrogênio Glicose + 6O2 + 38 ADP + Pi 6 CO2 + 38 ATP + 6 H20 17 INTEMPERISMO E SOLO e do enxofre na natureza. Algumas bactérias utilizam carbonato (CO3 -2) para formar metano (CH4) (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). Fermentação Algumas espécies de bactérias e de leveduras podem degradar açúcares simples em ambientes sem gás oxigênio para obter ATP, produzindo álcool etílico e gás carbônico (fermentação alcoólica) ou ácido láctico (fermentação lática). A equação geral da fermentação alcoólica, segundo Marzzoco e Torres (2013) é: A equação geral da fermentação lática, ainda, segundo Marzzoco e Torres (2013) é: A capacidade das leveduras de realizar fermentação alcoólica é a base da indústria de bebidas alcoólicas. O etanol produzido é o álcool das bebidas alcoólicas. O CO2 produzido pelas leveduras do fermento biológico causa o crescimento da massa do pão (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). Você sabia que a coalhada que fazemos em casa é o resultado do metabolismo fermentativo de algumas bactérias? As bactérias da espécie Streptococcus lactis realizam a fermentação lática.A capacidade de S. lactis de produzir ácido láctico como produto da fermentação é de grande importância na indústria de laticínios (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 2009). As bactérias fermentam o açúcar do leite, produzindo ATP como fonte de energia, para as suas atividades celulares, e o lactato. Este é um ácido e, por essa razão, reduz o pH do leite, que adquire um sabor azedo. O pH mais baixo desnatura as proteínas do leite, ou seja, elas desenrolam- se e acabam se interligando formando os coágulos de proteínas, conhecidos como coalho, a partir do qual se obtém a coalhada, o iogurte e o queijo. A desnaturação de uma proteína consiste na perda de sua estrutura tridimensional, o que significa dizer que a proteína perde a sua forma, a qual é responsável pela função que ela Glicose + 2 ADP + Pi 2 Etanol + CO2 + 2 ATP + 2 H20 Glicose + 2 ADP + Pi 2 Lactato + 2 ATP + 2 H20 18 GEOLOGIA AMBIENTAL desempenha na célula, seja ela uma atividade enzimática, estrutural, entre outras. A figura 3 ilustra a desnaturação protéica. Vale ressaltar que as leveduras são anaeróbicas facultativas, ou seja, caso o ambiente tenha O2, ela consegue sobreviver porque metaboliza o gás oxigênio, realizando a respiração aeróbica e não mais a ferm entação. Outro exemplo de anaeróbico facultativo é a bactéria encontrada no trato intestinal humano, a Escherichia coli. Fo nt e: (T O RT O RA ; F U N KE ; C A SE , 2 01 2) Fig. 03 - Desnaturação de uma proteína. NÃO ESQUEÇA! A fermentação é mais que um processo de obtenção de energia. Ela, também, corresponde a um processo de geração de produtos úteis aos seres humanos. VOCÊ SABIA? As gorduras são lipídeos constituídos de ácidos graxos e glicerol. Os microrganismos produzem enzimas chamadas de lipases que quebram as gorduras nos seus componentes, ácidos graxos e glicerol. Muitas bactérias que degradam ácidos graxos para obter energia podem utilizar as mesmas enzimas para degradar produtos do petróleo, sendo benéficas quando crescem em derramamento de óleo em corpos d’água, sendo úteis como biorremediadoras nesse tipo de desastre ambiental (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). 19 INTEMPERISMO E SOLO Testes bioquímicos e identificação de microrganismos Na aula passada, discutimos que alguns microrganismos, como protozoários, podem ser identificados microscopicamente pela análise de suas características morfológicas. Entretanto, em algumas situações, como no caso da identificação das bactérias, além da análise morfológica, existe a necessidade de realizar uma variedade de métodos que testam as suas necessidades nutricionais, reações metabólicas e outras características, uma vez que a maioria dos organismos procariotos são morfologicamente parecidos entre si e praticamente não apresentam variações de tamanho e de forma. O conhecimento do conjunto das reações catabólicas permite classificar e identificar os microrganismos, através da análise de uma determinada substância que é produzida, ou ainda, pela detecção de enzimas específicas necessárias para a realização de reações nos processos catabólicos. Por exemplo, análises químicas dos produtos da fermentação (CO2 e ácido láctico) são úteis para identificar os microrganismos (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). Para realizar o teste da fermentação, é necessário um meio contendo proteína, um único carboidrato, um indicador de pH e um tubo de Durham invertido para capturar gás, como você pode observar na figura 4. Você conhecerá um pouco mais sobre esses materiais na aula 05, sobre normas de segurança, materiais e vidraria de laboratório. Bactérias inoculadas no tubo podem utilizar a proteína ou o carboidrato como fonte de carbono e energia. Se elas catabolizam o carboidrato e produzem ácido, o indicador de pH muda de cor. Alguns microrganismos produzem gás, assim como ácido, a partir da degradação do carboidrato. A presença de uma bolha no tubo de Durham indica a formação do gás (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). Veja, na figura 4, na próxima página, o teste de fermentação. Você se lembra do que comentamos na aula passada sobre qual é a importância de identificar-se um microrganismo? Lembre-se, identificar um ser microscópico com base em suas caraterísticas, sejam metabólicas, nutricionais ou morfológicas, é importante para entender e densenvolver métodos de controle das atividades microbianas. 20 GEOLOGIA AMBIENTAL Fig. 04 - Teste de fermentação. (a) Um tubo de fermentação sem microrganismo contendo o carboidrato manitol. (b) Staphylococcus epidermidis cresceu na proteína, mas não utilizou o carboidrato. (c) Staphylococcus aureus produziu ácido a partir do manitol (detectado pela mudança de cor). (d) Escherichia coli produziu ácido e gás a partir do manitol. O gás é captado no tubo invertido de Durhan. Fo nt e: (T O RT O RA ; F U N KE ; C A SE , 2 01 2) . ATIVIDADE 03 1.1. O que você entende por metabolismo? 1.2. Qual é a importância do catabolismo? Reflita como ocorre a sua interação com o anabolismo. 1.3. Comente sobre o papel das enzimas no metabolismo energético. 1.4. Que tipo de nutrientes os microrganismos degradam para obter energia? 1.5. Diferencie as três vias do metabolismo energético que podem ser realizadas pelos microrganismos, inclusive no que diz respeito à quantidade de energia produzida. Cite exemplos de microrganismos que utilizam cada via. 1.6. Comente como o homem se beneficia do metabolismo fermentativo realizado pelas leveduras e por certas bactérias. 1.7. Comente como certas bactérias que, ao metabolizarem lipídeos como fonte de energia, podem proporcionar benefícios ambientais. 21 INTEMPERISMO E SOLO MEIOS DE CULTURA Nos ambientes naturais, os microrganismos se encontram, quase sempre, sob forma de populações mistas (VERMELHO et. al., 2011). Muitas vezes é necessário isolá- los dessas misturas para identificar microrganismos que são de interesse em campos como microbiologia de alimentos, clínica e da água, por exemplo, para saber se uma praia urbana está contaminada com bactérias patogênicas. Para isso, necessitamos de um meio de cultura que contenha as condições que facilitem o crescimento do microrganismo desejado. Mas, o que é um meio de cultura? O meio de cultura é um material nutritivo utilizado para promover o crescimento de microrganismos em laboratório, devendo fornecer os nutrientes indispensáveis ao seu crescimento (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 2009; VERMELHO et. al., 2011). Algumas bactérias podem crescer bem em qualquer meio de cultura, outras requerem meios especiais, e outras que não podem crescer em meios artificiais. O agente causador da hanseníase é um exemplo de microrganismo que deve ser cultivado em células vivas ou em um hospedeiro vivo como o camundongo (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). Classes de meios de cultura Duas grandes classes de meios de cultura são utilizados em microbiologia, os meios quimicamente definidos e os meio complexos, como você pode ver na tabela 2. Meio quimicamente definido Um meio quimicamente definido é aquele cuja composição exata é conhecida. Normalmente é utilizado para o crescimento dos microrganismos autotróficos (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). O meio definido é preparado pela adição na água de quantidades precisas de compostos químicos orgânicos ou inorgânicos. A fonte de carbono é de importância fundamental em qualquer meio de cultura, uma vez 1.8. Explique como os microrganismos podem ser identificados com base no seu metabolismo energético. 22 GEOLOGIA AMBIENTAL que todas as células necessitam de carbono para sintetizarem novo material celular. Um meio definido simples geralmente contém uma única fonte de carbono. Veja na tabela 2 a composição nutricional de um meio definido simples para a bactéria Escherichia coli. A natureza da fonte de carbono e sua concentração dependem do organismo a ser cultivado (MADIGAN et. al., 2010). Algunsmicrorganismos requerem um ou mais fatores de crescimento para se desenvolverem, sendo necessário adicioná-los ao meio de cultura (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). Esses fatores são substâncias que a célula não consegue produzir, mas são essenciais para sua sobrevivência, devido ao fato de que certas enzimas só funcionam se estiverem unidas a eles. Segundo Madigan et. al. (2010), os fatores de crescimento para os microrganismos são as vitaminas, aminoácidos, purinas e pirimidinas. Quando um microrganismo tem necessidade de muitos fatores de crescimento ele é chamado de fastidioso. Meio quimicamente definido para Escherichia coli Meio quimicamente definido para Leuconostoc mesenteroides Meio complexo Escherichia coli e Leuconostoc mesenteroides Glicose - 5 g Glicose - 25 g Glicose - 15 g Fosfato de amônio monobásico (NH4H2FO4) - 1 g Fosfato de potássio (KH2PO4) - 0,6 g Extrato de leveduras - 5 g Cloreto de sódio (NaCl) - 5 g Cloreto de amônio (NH4Cl) - 3 g Peptona - 5 g Sulfato de magnésio (MgSO4) - 0,2 g Sulfato de magnésio (MgSO4) - 0,1 g Fosfato de potássio (KH2PO4) - 2 g Fosfato de potássio dibásico (K2HPO4) - 1 g Fosfato de potássio dibásico (K2HPO4) - 0,6 g Água - 1 litro Água - 1 litro Acetato de sódio - 25 g pH 7 Tab. 02 - Exemplos de meios de cultura quimicamente definido e complexo 23 INTEMPERISMO E SOLO Meio Complexo A maioria das bactérias e dos fungos é cultivada rotineiramente em meios complexos feitos de nutrientes como extratos de leveduras (células de leveduras), de carnes ou de plantas (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). Nos meios complexos, as necessidades de energia, carbono, nitrogênio e enxofre dos microrganismos em cultura são fornecidas essencialmente pelas proteínas. Alguns microrganismos conseguem utilizar diretamente as proteínas, outros não. No último caso, as proteínas têm que ser parcialmente digeridas por ácidos ou enzimas a moléculas menores, denominadas peptonas, que podem ser utilizadas pela maioria das bactérias. Vitaminas e outros fatores de crescimento são fornecidos pelos extratos de carne e de leveduras (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). Fo nt e: A da pt ad o de M ad ig an e t. al . ( 20 10 ). Meio quimicamente definido para Escherichia coli Meio quimicamente definido para Leuconostoc mesenteroides Meio complexo Escherichia coli e Leuconostoc mesenteroides Glicose - 5 g Aminoácidos 1 - 100 a 200 µg de cada Coloração do meio complexo - colorido devido à presença dos extratos e das peptonas Coloração no meio definido - transparente Purinas e pirimidinas 2 - 10 mg de cada Vitaminas3 - 0,01 a 1 mg de cada Água - 1 litro pH 7 1 Alanina, arginina, asparagina, aspartato, cisteína, glutamato, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina. 2 Adenina, guanina, uracila e xantina. 3 Biotina, folato, ácido nicotínico, piridoxal, piridoxamina, piridoxina, riboflavina, tiamina, pantotenato e ácido p-aminobenzóico. 24 GEOLOGIA AMBIENTAL Agora, com base no que foi descrito sobre os meios de cultura e observando os exemplos dados na tabela 2 (composição de dois meios quimicamente definidos e um meio complexo), qual seria o microrganismo mais exigente do ponto de vista nutricional? Obviamente é a bactéria Leuconostoc mesenteroide, pois, dentre os meios definidos, ela cresce apenas no meio que contém vários nutrientes orgânicos e fatores de crescimento, sendo considerada um organismo extremamente fastidioso, ou seja, nutricionalmente exigente, como você pode observar na segunda coluna da tabela; enquanto que a bactéria Escherichia coli possui uma exigência nutricional simples, apresentando um excelente crescimento no meio definido simples, o exibido na primeira coluna da tabela. Observe que a única fonte de carbono utilizada por ela é a glicose, o que reflete sua capacidade de sintetizar todos os seus constituintes celulares orgânicos a partir de um único composto contendo carbono. O meio complexo possibilita crescimento abundante das duas bactérias. Em situações particulares, especialmente na microbiologia clínica ou de saúde pública, frequentemente, é necessário detectar a presença de microrganismos específicos, associados com doenças ou saneamento deficiente (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). Para essa tarefa, os meios são produzidos de modo a se tornarem seletivos ou diferenciais, ou ambos. Um meio seletivo contém compostos que impedem o crescimento de microrganismos indesejados, mas permitem o crescimento do micróbio de interesse (MADIGAN et. al., 2010). Por exemplo, se adicionarmos o antibacteriano estreptomicina em um meio de cultura, as bactérias não sobreviverão e os fungos poderão crescer. Por outro lado, se adicionarmos um antifúngico ao meio, apenas as bactérias poderão crescer nele. O pH do meio também pode ser manipulado através da adição de certas substâncias para obtermos um meio seletivo, uma vez que os fungos sobrevivem em IMPORTANTE! Os diferentes microrganismos podem exibir exigências nutricionais extremamente diferentes. 25 INTEMPERISMO E SOLO pH ácido, em torno de 5,6, enquanto a maioria das bactérias não. Os meios diferenciais facilitam no processo de diferenciar as colônias de um microrganismo desejado em relação a outras colônias crescendo na mesma placa, baseando, muitas vezes, na capacidade de um microrganismo em particular produzir determinadas substâncias (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). A adição de um carboidrato e um indicador de pH ao meio de cultura permitem evidenciar as colônias de microrganismos que produzam ácidos ao fermentar aquele carboidrato, pois a cor do indicador se modificará devido o meio ao redor da colônia ter se tornado ácido. Veja na figura 5 um exemplo da identificação de uma colônia de bactéria pelo uso de um meio diferencial. Fig. 05 - Meio diferencial. As colônias de Escherichia coli, fermentadoras de lactose, se apresentam vermelhas, enquanto que colônias de espécies não fermentadoras, como dos gêneros Shigella e Salmonella, não mudam a sua cor original. ATIVIDADE 04 1.1. Defina meio de cultura. 1.2. Diferencie meio quimicamente definido de meio complexo. 1.3. Com qual finalidade o meio diferencial é utilizado? E o seletivo? Fo nt e: A da pt ad o de V er m el ho e t. al . ( 20 11 ). 26 GEOLOGIA AMBIENTAL LEITURAS COMPLEMENTARES 1. Leia o texto intitulado “Atividade enzimática” disponível na plataforma Moodle. Sua leitura proporcionará uma melhor compreensão sobre a função da enzima, a sua especificidade e a importância da forma da proteína para a sua funcionalidade. 2. Leia também o texto presente no livro de Microbiologia de Brock, 12ª edição, dos autores Madigan et. al. (2010), intitulado “Os produtos da fermentação por leveduras e o efeito Pasteur”. O texto retrata a obtenção de produtos úteis ao homem através da fermentação e discute a modificação do padrão metabólico das leveduras de acordo com a presença ou não do gás oxigênio. O texto encontra-se na plataforma Moodle. RESUMINDO Os microrganismos são muito diversificados nas suas exigências nutricionais, mas compartilham com todas as células vivas a necessidade de elementos químicos essenciais como nutrientes e de uma fonte de energia para produzir as substâncias que irão formar as estruturas celulares ou que participarão das reações químicas que mantém o funcionamento celular. Todos os microrganismos requerem nitrogênio, hidrogênio, oxigênio, enxofre e fósforo, além de outros elementos, para a construção de componentes celulares. Os microrganismos podem ser classificados em grupos nutricionais baseados na sua fonte de energia e na sua principal fonte de carbono. As células microbianas podem obter a energia necessária para essas atividades pela degradação dos nutrientes por três viascatabólicas, 27 INTEMPERISMO E SOLO a respiração aeróbica, a respiração anaeróbica ou a fermentação, havendo maior produção de energia através da respiração aeróbica. Os padrões nutricionais e metabólicos são uteis na identificação de certos microrganismos, especialmente, bactérias e leveduras. Para auxiliar nessa identificação e, em alguns casos, para compreender melhor as exigências nutricionais e metabólicas desses seres, meios de cultivo microbiológicos são utilizados, podendo ser quimicamente definido ou complexo. Os meios com uma finalidade específica incluem meios seletivos e meios diferenciais. AVALIANDO SEUS CONHECIMENTOS 1. Quais elementos químicos são essenciais para os microrganismos? Relacione essas exigências nutricionais ao estilo de vida de alguns microrganismos que se proliferam rapidamente em corpos d´água contaminados com matéria orgânica. 2. Considere que você inoculou 100 células anaeróbicas facultativas em um meio de cultura contendo gás oxigênio. Você então inoculou 100 células da mesma espécie em um meio com condições anaeróbicas. Após 24h, em qual dos meios haverá um maior número de colônias de microrganismos? Justifique sua resposta. 3. O frasco A contém células de levedura em um meio com sais e glicose incubado a 30°C com oxigenação. O frasco B contém células de levedura em um meio com sais e glicose incubado a 30°C em condições anaeróbicas. As leveduras são anaeróbicas facultativas. Com base no descrito, responda: 28 GEOLOGIA AMBIENTAL LEMBRE-SE Composto inorgânico: molécula que não contém carbono ou hidrogênio. Composto orgânico: molécula que contém carbono e hidrogênio. Esterilização: remoção de todos os microrganismos. Fosfolipídeos: lipídeo composto de glicerol, dois ácidos graxos e um grupo fosfato. Hospedeiro: organismo que abriga outro ser. Inocular: Introduzir microrganismos em um meio de cultura. Pirimidinas: classe de bases de ácidos nucleicos que inclui uracila, timina e citosina. Purinas: classe de bases de ácidos nucleicos que inclui adenina e guanina. a. Qual cultura produziu mais ATP? Justifique. b. Qual cultura produziu mais álcool? Justifique. 4. Por que o meio descrito a seguir não pode ser considerado um meio quimicamente definido: glicose, 5 gramas (g); NH4Cl, 1g; KH2PO4, 1g; MgSO4, 0,3g; extrato de levedura, 5g; água destilada, 1 litro? 5. Explique a importância de conhecermos as exigências nutricionais e metabólicas dos microrganismos. 29 INTEMPERISMO E SOLO CONHECENDO AS REFERÊNCIAS MADIGAN, M. T. et. al. Microbiologia de Brock. 12. ed. Porto Alegre: Artmed, 2010. MARZZOCO, A.; TORRES, B. B. Bioquímica Básica. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013. PELCZAR JÚNIOR., M. J.; CHAN, E. C. S.; KRIEG, N. R. Microbiologia: conceitos e aplicações. Tradução de Sueli Fumie Yamada, Tania Ueda Nakamura, Benedito Prado Dias Filho. 2. ed. São Paulo: Pearson Makron Books, 2009. v. 1. TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. Tradução de Aristóbolo Mendes da Silva et. al. 10. ed. Porto Alegre: Artmed, 2012. TRABULSI, L. R.; ALTERTHUM. Microbiologia. 5. ed. São Paulo: Atheneu, 2008. VERMELHO, A. B. et. al. Práticas de Microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2011. LISTA DE FIGURAS Fig. 01 - (MADIGAN et. al., 2010, p. 39) Fig. 02 - Autoria própria. Fig. 03 - (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). Fig. 04 - (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). Fig. 05 - Adaptado de Vermelho et. al. (2011).
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