Trabalho-de-ConclusAúo-de-Curso---CAntia-Gabriela-de-Souza-Lacerda-BIBLIOTECA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
CURSO DE GRADUAÇÃO DE FARMÁCIA 
 
 
 
 
CÍNTIA GABRIELA DE SOUZA LACERDA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE FINGERPRINT POR 
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA PARA O EXTRATO 
HIDROETANÓLICO DAS FOLHAS DE Moringa oleifera 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
NATAL – RN 
2022 
 
CÍNTIA GABRIELA DE SOUZA LACERDA 
 
 
 
 
 
 
 
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE FINGERPRINT POR 
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA PARA O EXTRATO 
HIDROETANÓLICO DAS FOLHAS DE Moringa oleifera 
 
 
 
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso 
de Graduação em Farmácia do Centro de Ciências da 
Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do 
Norte, como requisito parcial para obtenção do título do 
grau bacharel em Farmácia. 
 
Orientadora: Profª Dra. Silvana Maria Zucolotto 
Langassner 
 
Co-orientadora: MSc. Larissa Marina Pereira Silva 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
NATAL – RN 
2022 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
CURSO DE GRADUAÇÃO DE FARMÁCIA 
 
 
CÍNTIA GABRIELA DE SOUZA LACERDA 
 
 
 
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE FINGERPRINT POR 
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA PARA O EXTRATO 
HIDROETANÓLICO DAS FOLHAS DE Moringa oleifera 
 
 
 
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso 
de Graduação em Farmácia do Centro de Ciências da 
Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do 
Norte, como requisito parcial para obtenção do título do 
grau bacharel em Farmácia. 
 
 
 
Aprovado em: 
 
Banca Examinadora 
 
__________________________ 
Profª. Silvana Maria Zucolotto Langassner, Drª, UFRN 
 
__________________________ 
Julia Morais Fernandes, Drª, Université de Paris 
 
__________________________ 
Prof. Leandro de Santis Ferreira, Dr., UFRN 
 
AGRADECIMENTOS 
 
Agradeço à Universidade Federal do Rio Grande do Norte por ter me permitido a 
oportunidade de desenvolvimento acadêmico e pessoal, ao Grupo de Pesquisa em Produtos 
Naturais Bioativos por todas as experiências e por sempre me ajudarem quando necessitei. 
A minha orientadora, Professora Silvana, que me acolheu no início do curso e viu 
potencial em meu desenvolvimento. A minha co-orientadora, Larissa, que desde sempre me 
incentivou e apoiou nos momentos em que me sentia mais insegura. Vocês são inspiração 
para mim. 
A todos os professores pelas correções e ensinamentos, que me permitiram apresentar 
um melhor desempenho no meu processo de formação profissional ao longo do curso. 
Aos meus colegas de curso, com quem convivi intensamente durante os últimos anos, 
pela troca de experiências que me permitiram crescer não só no âmbito pessoal, como também 
no âmbito profissional. 
Aos meus amigos, que me apoiaram em todas as circunstâncias, com quem dividi 
meus melhores e piores momentos e sempre tinham tempo para me escutar e aconselhar. 
A minha família, minha mãe Rejane, meus irmãos João Emanuel e Lígia e ao meu 
companheiro de vida, Ronnier, que sempre me apoiaram nos momentos mais difíceis e 
compartilharam comigo minhas tristezas e alegrias. Dedico a vocês todo o meu sucesso. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMO 
 
Moringa oleifera Lam. é uma árvore de pequeno a médio porte e uma das 13 espécies 
pertencentes à família Moringaceae de único gênero. Devido ao seu amplo e antigo uso 
popular em diferentes regiões, esta espécie vem sendo estudada para tratamento de várias 
doenças. No entanto, faz-se necessário estabelecer parâmetros de controle de qualidade, visto 
que, não consta monografia desta espécie na Farmacopeia Brasileira. Um dos parâmetros 
exigidos no controle de qualidade dos fitoterápicos é a caracterização do perfil cromatográfico 
e a análise quantitativa do marcador em toda a cadeia produtiva. Neste contexto, o presente 
trabalho teve como objetivo desenvolver e validar uma metodologia de análise por 
Cromatografia em Camada Delgada para aplicação no controle de qualidade do extrato 
hidroetanólico das folhas de Moringa oleifera. Para tanto, foram utilizadas amostras 
autênticas, colhidas na Escola Agrícola de Jundiaí e que sofreram diferentes tratamentos: 
processadas em nitrogênio líquido “quenching” e secas em estufa a 40 °C. A amostra 
comercial de folhas secas utilizada foi obtida do centro comercial de Natal – Rio Grande do 
Norte. Os marcadores utilizados foram a isovitexina e vitexina, flavonoides que já foram 
identificados nessa espécie. O método foi desenvolvido com foco na caracterização do perfil 
flavonoídico, como método qualitativo, de identificação. Dessa forma, foram testadas várias 
fases móveis para obter um cromatograma com um perfil cromatográfico satisfatório. A fase 
móvel escolhida foi composta de acetato de etila: acetona: ácido acético: água (60:20:15:10, 
v/v/v/v). Os parâmetros avaliados foram a seletividade, precisão e robustez, seguindo as 
normas preconizadas pela RDC 166/2017. Para o parâmetro seletividade, foram utilizadas as 
amostras autênticas, comercial e os padrões comerciais. Foram observados os mesmos perfis 
cromatográficos para as amostras autênticas, porém a amostra comercial mostrou-se com o 
perfil diferente. A partir dos resultados obtidos, pode-se concluir que o método é seletivo, pois 
permitiu detectar um perfil cromatográfico diferente dos perfis encontrados para as amostras 
autênticas e permitiu separação das bandas de interesse, que são os padrões. Para o parâmetro 
precisão, foram escolhidos a repetibilidade e a precisão intermediária. A IN nº4, de 2014 
preconiza que os DPR (%) entre as análises sejam inferiores a 15%. O método foi considerado 
preciso porque atendeu a essa especificação. Para o parâmetro de robustez, foram feitas 
pequenas alterações em algumas condições cromatográficas, sendo utilizado como critério de 
aceitação a variabilidade ≤ 0,1 para os resultados do fator de retenção. O método foi 
considerado robusto, pois todos os fatores de retenção ficaram dentro do intervalo proposto. 
Portanto, o método desenvolvido e validado por CCD para caracterizar o perfil flavonoídico e 
o fingerprint do extrato hidroetanólico das folhas de Moringa oleifera se mostrou seletivo, 
preciso e robusto. 
 
PALAVRAS CHAVE: Controle de qualidade; fitoterapia; perfil cromatográfico; Moringa 
oleifera 
 
 
 
 
 
 
 
ABSTRACT 
 
Moringa oleifera Lam. is a small to medium-sized tree and one of 13 species belonging to the 
Moringaceae family of a single genus. Due to its wide and ancient popular use in different 
regions, this species has been studied for the treatment of various diseases. However, it is 
necessary to establish quality control parameters, since there is no monograph of this species 
in the Brazilian Pharmacopoeia. One of the parameters required in the quality control of 
herbal medicines is the characterization of the chromatographic profile and the quantitative 
analysis of the marker throughout the production chain. In this context, the present work 
aimed to develop and validate an analysis methodology by Thin Layer Chromatography for 
application in the quality control of the hydroethanolic extract of Moringa oleifera leaves. For 
that, authentic samples were used, collected at Escola Agrícola de Jundiaí and which 
underwent different treatments: processed in liquid nitrogen “quenching” and dried in an oven 
at 40 °C. The commercial sample of dry leaves used was obtained from the commercial center 
of Natal - Rio Grande do Norte. The markers used were isovitexin and vitexin, flavonoids that 
have already been identified in this species. The method was developed focusing on the 
characterization of the flavonoid profile, as a qualitative identification method. In this way, 
several mobile phases were tested to obtain a chromatogram with a satisfactory 
chromatographic profile. The mobile phase chosen was composed of ethyl acetate:acetone: 
acetic acid: water (60:20:15:10, v/v/v/v). The parameters evaluated were selectivity, precision 
and robustness, following the standards recommended by RDC 166/2017. For the selectivity 
parameter, authentic samples, commercial samples and commercial standards were used. The 
same chromatographic profiles were observed for the authentic samples, however the 
commercial sample showed a different profile. From the results obtained, it can be concluded 
that the method is selective, as it allowed detecting a chromatographic profile different from 
the profiles found for the authentic samples and allowed the separation of the bands of 
interest, which are the standards. For the precision parameter, repeatability and intermediate 
precision were chosen. IN nº4, of 2014 recommends that the DPR (%) between the analyzes 
be less than 15%. The method was considered accurate because it met this specification. For 
the robustness parameter, small changes were made in some chromatographic conditions, 
being used as acceptance criterion the variability ≤ 0.1 for the results of the retention factor. 
The method was considered robust, as all retention factors were within the proposed range. 
Therefore, the method developed and validated by CCD to characterize the flavonoid profile 
and fingerprint of the hydroethanolic extract of Moringa oleifera leaves proved to be 
selective, accurate and robust. 
 
KEYWORDS: Quality control; phytotherapy; chromatographic profile; Moringa oleifera 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE SIGLAS 
 
AcOEt Acetato de Etila 
CCD Cromatografia em Camada Delgada 
EAJ Escola Agrícola de Jundiaí 
HPTLC Cromatografia em Camada Delgada de Alta Fficiência 
IN Instrução Normativa 
MeOH Metanol 
MF Medicamento Fitoterápico 
PNPIC Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares 
PNBIO Grupo de Pesquisa em Produtos Naturais Bioativos 
PNPMF Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos 
PTF Produto Tradicional Fitoterápico 
RDC Resolução Diretoria Colegiada 
RF Fator de retenção 
RENAFITO Relação Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos 
RENISUS Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse para o SUS 
SUS Sistema Único de Saúde 
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
FIGURA 1. - Distribuição da Moringa oleifera no Brasil............................................................ 15 
FIGURA 2. - Testes exigidos no laudo de controle de qualidade exigido pela RDC nº. 
26/2014 .......................................................................................................................................... 19 
FIGURA 3. - Perfil cromatográfico de espécies do gênero Equitesum ........................................ 21 
FIGURA 4. Processo de extração para amostra autêntica de Moringa oleifera ........................... 26 
FIGURA 5. Preparação das replicatas para ensaio de Repetibilidade e Precisão Intermediária .. 28 
FIGURA 6. Perfil cromatográfico para análise da Seletividade................................................... 31 
FIGURA 7. Estruturas da Vitexina e Isovitexina ......................................................................... 33 
FIGURA 8. Perfil cromatográfico para avaliação do parâmetro Precisão: Repetibilidade .......... 34 
FIGURA 9. Perfil cromatográfico para avaliação do parâmetro Precisão: Precisão 
intermediária .................................................................................................................................. 37 
FIGURA 10. Perfil cromatográfico para avaliação da Robustez: Mudança de fase móvel ......... 41 
FIGURA 11. Perfil cromatográfico para avaliação da robustez: Tempo e configuração de 
saturação ........................................................................................................................................ 42 
FIGURA 12. Influência da umidade e temperatura em uma amostra autêntica de Rizoma de 
Black cohosh .................................................................................................................................. 43 
FIGURA 13. Perfil cromatográfico para avaliação da Robustez: Pré eluição da placa ............... 43 
FIGURA 14. Perfil cromatográfico para avaliação da Robustez: Tipo de câmara: béquer ......... 44 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
TABELA 1. Condições utilizadas para análise do parâmetro robustez ........................................ 29 
TABELA 2. Fases móveis testadas durante o processo de desenvolvimento do método ............. 30 
TABELA 3. Análise do parâmetro Seletividade em triplicata ...................................................... 32 
TABELA 4. Análise do parâmetro Precisão: Repetibilidade ........................................................ 36 
TABELA 5. Média, Desvio Padrão (DP) e Desvio Padrão Relativo (DPR) das zonas: 
Repetibilidade ................................................................................................................................ 36 
TABELA 6. Análise do parâmetro Precisão: Precisão Intermediária ........................................... 38 
TABELA 7. Média, Desvio Padrão (DP) e Desvio Padrão Relativo (DPR) das zonas: Precisão 
intermediária .................................................................................................................................. 39 
TABELA 8. Faixa de aceitação para os parâmetros analisados na Robustez ............................... 40 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE QUADROS 
 
QUADRO 1. Condições Sistema cromatográfico selecionado para validação do método 
de Cromatografia em Camada Delgada para Moringa oleifera ............................................... 27 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 13 
2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................................ 15 
2.1 Moringa oleifera ...................................................................................................................... 15 
2.2 POLÍTICAS PÚBLICAS NA ÁREA DE PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS 
NO BRASIL .................................................................................................................................. 17 
2.3 CONTROLE DE QUALIDADE E RDC Nº 26 DE MAIO DE 2014 ..................................... 18 
2.4 VALIDAÇÃO DE CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA ................................. 20 
3. OBJETIVOS ............................................................................................................................ 24 
3.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................................ 24 
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................................. 24 
4 METODOLOGIA ..................................................................................................................... 25 
4.1 MATERIAL VEGETAL ......................................................................................................... 25 
4.2 OBTENÇÃO DO EXTRATO ................................................................................................. 25 
4.3 PREPARO DA AMOSTRA E PADRÕES PARA ANÁLISE ............................................... 26 
4.4 DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ................................................................................. 26 
4.5 SISTEMA CROMATOGRÁFICO .......................................................................................... 27 
4.6 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ................................................................................................27 
4.6.1 Seletividade ......................................................................................................................... 28 
4.6.2 Precisão ................................................................................................................................ 28 
4.6.3 Robustez .............................................................................................................................. 29 
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................. 30 
5.1 DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ................................................................................. 30 
5.2 SELETIVIDADE ..................................................................................................................... 31 
5.3 PRECISÃO .............................................................................................................................. 34 
5.3.1 Repetibilidade ..................................................................................................................... 34 
5.3.2 Precisão intermediária ....................................................................................................... 37 
5.4 ROBUSTEZ ............................................................................................................................ 39 
6. CONCLUSÃO .......................................................................................................................... 46 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................... 47 
13 
 
1. INTRODUÇÃO 
O uso de plantas medicinais para o tratamento de doenças vem sendo relatado há 
muitos anos. Em todas as sociedades antigas, como a egípcia, africana e chinesa, há algum 
tipo de registro desse conhecimento e uso. Para que se chegasse à conclusão sobre os 
benefícios de uma planta para determinada condição, o homem utilizava as próprias 
experiências empíricas, observando como se sentia e como os animais se comportavam e 
usavam determinadas plantas medicinais. Com o passar dos anos e juntamente com o 
desenvolvimento da sociedade, todos esses conhecimentos somados à sabedoria popular 
fizeram parte da criação da fitoterapia moderna. Uma das plantas que possui registros antigos 
de uso por parte da população é a Moringa oleifera (BORGES, SALES, 2018). 
Moringa oleifera Lam. é uma árvore de pequeno a médio porte, e uma das 13 espécies 
pertencentes à família Moringaceae de único gênero. É uma planta nativa da Ásia e África, de 
rápido e fácil cultivo e amplamente cultivada em regiões tropicais e subtropicais do mundo, 
tendo ampla distribuição pelo mundo (VARGAS-SÁNCHEZ; GARAY-JARAMILLO; 
GONZÁLEZ-REYES, 2019). No Brasil, essa espécie tem ocorrência em praticamente todas 
as regiões, se destacando principalmente no Nordeste (FLORA DO BRASIL, 2020). 
Popularmente, a espécie M. oleifera é conhecida como “moringa”, “acácia branca”, “árvore 
rabanete de cavalo”, “cedro”, “moringueiro” e “quiabo de quina” (PAULA, 2017). 
Devido ao seu amplo e antigo uso popular em diferentes países, essa espécie vem 
sendo estudada para tratamento de várias doenças, como cardiovasculares, neurológicas, 
gastroenterológicas, inflamatórias, diabetes e câncer (LIN; ZHANG; CHEN, 2018; 
VARGAS-SÁNCHEZ; GARAY-JARAMILLO; GONZÁLEZ-REYES, 2019). Embora seja 
uma planta amplamente difundida e utilizada em diferentes apresentações (fresca, cozida ou 
folhas secas), ainda há carência de estudos de controle de qualidade, além de ser uma planta 
que não consta monografia na Farmacopeia Brasileira, sendo uma abertura ainda maior para 
falhas no controle e garantia de qualidade. 
No ano de 2006, a utilização de plantas medicinais e fitoterápicos como forma de 
tratamento terapêutico ganhou maior amparo legal após a publicação da Portaria 971 (em 03 
de maio de 2006), que dispõe sobre a Política Nacional de Práticas Integrativas e 
Complementares e do Decreto 5.813 (em 22 de junho de 2006), que inseriu a Fitoterapia nos 
serviços do Sistema Único de Saúde (BRASIL, 2006a; BRASIL, 2006b). 
Entretanto, para que possa ser assegurado o uso seguro e eficaz de fitoterápicos, faz-se 
necessário o deferimento do registro sanitário. Para uma indústria farmacêutica obter o 
registro para comercialização de um fitoterápico, há uma série de requisitos para 
14 
 
comprovação da eficácia, segurança e qualidade. No que diz respeito à qualidade, a 
determinação do perfil cromatográfico da droga vegetal, do derivado vegetal e do produto 
acabado, constitui um dos parâmetros de qualidade exigidos pela legislação vigente (BRASIL, 
2014a). A RDC nº 26/2014 dispõe sobre o registro sanitário de Medicamentos Fitoterápicos e 
o registro/notificação de Produtos Tradicionais Fitoterápicos. Os resultados dessa análise 
devem ser apresentados no laudo da droga vegetal, derivado vegetal e do produto acabado. 
Nos três laudos é exigido como parâmetro de identidade e qualidade o perfil cromatográfico 
com comparativo, através de imagem eletrônica para que possa ser garantida a identidade da 
matéria prima (BRASIL, 2014a). 
Embora o perfil cromatográfico para o controle de qualidade seja um dos requisitos 
exigidos para registro e comercialização de fitoterápicos, não é uma atividade analítica fácil 
de ser realizada, uma vez que tratam-se de matrizes complexas com uma ampla variedade de 
substâncias químicas, no qual fatores como cultivo, circunstâncias climáticas, armazenamento 
e processo extrativo podem alterar a matéria prima vegetal, acarretando contaminação ou 
descaracterização com fitoterápico (por exemplo: variações no perfil e/ou no teor dos 
compostos) (TRIPATHY et al., 2015). 
Assim, a análise do perfil cromatográfico de cada etapa da cadeia produtiva é de 
extrema importância como uma forma de garantir a estabilidade da matéria-prima durante a 
produção e para obtenção de um produto acabado com qualidade (KOLL et al., 2003). Nesse 
contexto, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver e validar uma metodologia por 
Cromatografia em Camada Delgada para aplicação no controle de qualidade do extrato de 
Moringa oleifera. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
15 
 
2. REVISÃO DE LITERATURA 
 
2.1. Moringa oleifera 
A espécie Moringa oleifera Lam. é uma árvore que pertence à família Moringaceae. 
Ela originou-se no Himalaia, porém é ampla e facilmente cultivada em regiões tropicais e 
subtropicais, sendo amplamente distribuída pelo mundo (VARGAS-SÁNCHEZ; GARAY-
JARAMILLO; GONZÁLEZ-REYES, 2019). No Brasil, a espécie M. oleifera é encontrada 
nas regiões Norte, Centro-Oeste, Sudeste e Nordeste, sendo nesse último distribuída em quase 
todos os estados (FLORA DO BRASIL, 2020). Na figura 1 há uma representação de sua 
distribuição. 
 
FIGURA 1. Distribuição da Moringa oleifera no Brasil 
 
Fonte: Flora do Brasil, 2020. 
 
M. oleifera é uma planta que apresenta de pequeno a médio porte, com crescimento 
rápido e com capacidade de resistir a períodos de secas e sobreviver em solos pobres a 
alagados. Essa espécie é popularmente conhecida como “moringa”, “acácia branca”, “árvore 
rabanete de cavalo”, “cedro”, “moringueiro” e “quiabo de quina” (PAULA, 2017) e possui as 
sinonímias Guilandina moringa L., Hyperanthera moringa (L.) Vahl; Moringa zeylanica 
Burmann (TPL, 2010). 
Praticamente todas as partes da M. oleifera, como as folhas, frutos, flores e raízes, são 
usadas com fins nutricionais, medicinais ou cosméticos (VARGAS-SÁNCHEZ; GARAY-
JARAMILLO; GONZÁLEZ-REYES, 2019). As folhas, parte mais utilizada da planta, 
contêm muitos nutrientes, como betacaroteno, vitaminas B, C e E, alguns minerais, como 
cálcio, ferro, potássio, magnésio, aminoácidos essenciais e não essenciais e carboidratos 
16 
 
(FALOWO et al., 2018). As folhas se destacam pelo seu elevado teor de proteína e alta 
concentração de compostos fenólicoscomo os flavonoides (LEONE et al., 2015). 
Diversos estudos já têm relatado e identificado os flavonoides nas folhas da espécie M. 
oleifera. Pereira et al., (2019) cita o ácido clorogênico, quercetina, quercetina-3-O-glicosídeo 
(isoquercetina), quercetina-3-O-(6’O-malonil-glicosídeo), e canferol-3-glicosídeo. Um estudo 
prévio do grupo de Pesquisa em Produtos Naturais Bioativos (PNBio), cujos resultados ainda 
não foram publicados, caracterizou oito compostos flavonoídicos com características polares, 
sendo eles o ácido quínico, vicenina-2, vitexina, isovitexina, quercetina-3-O-hexose, 
quercetina-3-O-acetil-hexose, canferol-3-O-hexose e canferol-3-O-acetil-hexose. 
Além de todas as propriedades nutricionais e do seu longo histórico de uso para esse 
fim, a espécie M. oleifera vem sendo bastante usada na medicina tradicional para o tratamento 
de várias doenças em todo o mundo, sendo também estudada para doenças cardiovasculares, 
neurológicas, gastroenterológicas, inflamatórias, diabetes e câncer (LIN; ZHANG; CHEN, 
2018; VARGAS-SÁNCHEZ; GARAY-JARAMILLO; GONZÁLEZ-REYES, 2019). Essa 
gama de aplicações pode ser explicada em virtude da grande quantidade de fitoquímicos 
presentes nas diversas partes dessa espécie. Além dos flavonoides, é relatada a presença de 
alcaloides, saponinas, sacarídeos, glucosinolatos, taninos, ácidos fenólicos e glicosídeos 
nitrílicos. Todos esses fitoconstituintes podem contribuir para as variadas atividades 
farmacológicas da M. oleifera (MOHANTY et al., 2020). 
Embora a M. oleifera seja amplamente utilizada para o tratamento de diversos 
distúrbios, ainda há carência de estudos com relação ao controle de qualidade dessa espécie. 
Muitos dos produtos de modo geral que contêm moringa, como suplementos ou alimentos, 
não é possível garantir a qualidade da matéria prima ou produto acabado que está 
comercializado, pela falta de instalações de controle de qualidade, podendo ocorrer 
adulterações e falhas na qualidade do insumo, e por não ser uma exigência da área de 
alimentos apresentar o controle de perfil cromatográfico, assim como do teor do marcador 
(SIERRA-CAMPOS et al., 2020). No entanto, para medicamentos fitoterápicos registrados na 
ANVISA, é exigido a comprovação da qualidade do produto acabado. Especificamente em 
relação à moringa, um fator agravante é que não há monografia farmacopeica disponível para 
a espécie M. oleifera, abrindo um gargalo ainda maior no quesito qualidade. 
 
 
 
 
17 
 
2.2. POLÍTICAS PÚBLICAS NA ÁREA DE PLANTAS MEDICINAIS E 
FITOTERÁPICOS NO BRASIL 
O uso de plantas medicinais e fitoterápicos para o tratamento de inúmeras doenças 
ganhou um maior respaldo legal após a publicação da Portaria n° 971 (em 03 de maio de 
2006) e do Decreto nº 5.813 (em 22 de junho de 2006). Ambos, respectivamente, tratam da 
Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares (PNPIC) e a Política Nacional de 
Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF) (BRASIL 2006 a, b). 
A publicação da PNPIC regulamenta e institucionaliza no Sistema Único de Saúde 
(SUS) os serviços que envolvem a fitoterapia como um todo. Essa política veio com o 
objetivo de atender a necessidade que havia de conhecer, incorporar e implementar 
conhecimentos e costumes que já vinham sendo aplicados na rede pública de alguns locais do 
país, não só no âmbito da fitoterapia, como também da medicina tradicional 
chinesa/acupuntura, homeopatia, medicina antroposófica e crenoterapia. A PNBIC traz, entre 
suas diretrizes, a elaboração da Relação Nacional de Plantas Medicinais e de Fitoterápicos. 
Essa política foi institucionalizada com o objetivo de garantir o acesso a plantas medicinais e 
fitoterápicos aos usuários do SUS (BRASIL, 2006a). 
 A PNPMF foi institucionalizada com o objetivo de garantir à população o acesso 
seguro e uso racional das plantas medicinais e fitoterápicas, contemplando o uso sustentável 
da biodiversidade e o desenvolvimento da cadeia produtiva. As ações dessa política visam à 
melhoria do acesso da população aos fitoterápicos, ao desenvolvimento industrial e 
tecnológico, além da valorização e preservação desses conhecimentos e costumes tradicionais 
e etnobotânicos associados às comunidades tradicionais e indígenas (BRASIL, 2006b). 
Um dos avanços provenientes da institucionalização das políticas nacionais 
relacionadas à fitoterapia foi a publicação da Relação Nacional de Plantas Medicinais de 
Interesse para o SUS (RENISUS) no ano de 2009. Essa lista contempla 71 espécies de plantas 
nativas ou exóticas de uso medicinal popular e que carecem de mais pesquisas. As plantas que 
passarem por essas pesquisas e obtiverem suas indicações validadas, passarão a fazer parte da 
Relação Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (RENAFITO), relação que subsidia a 
prescrição de fitoterápicos nos serviços de saúde do SUS. O objetivo da RENISUS é fomentar 
as pesquisas e investigações que possam resultar em fitoterapia a ser disponibilizada para a 
população com segurança, eficácia e qualidade (BRASIL, 2009). 
Para a seleção dessas espécies para a assistência e atenção farmacêutica com plantas 
medicinais e fitoterapia, foram utilizados muitos critérios, cabendo destacar que já fossem 
largamente usadas pela população regional, apresentassem evidências etnofarmacológicas de 
18 
 
indicação e uso e dispusesse de dados farmacológicos e toxicológicos na literatura (BRASIL, 
2012). Contudo, ainda se faz necessário estudos para a validação das informações já 
mencionadas e para a confirmação da segurança, qualidade e eficácia para que essas espécies 
possam obter o registro sanitário. Entre os requisitos, consta o perfil cromatográfico da droga 
vegetal ou derivado vegetal em todas as etapas da cadeia produtiva (BRASIL, 2014a). 
 
2.3. CONTROLE DE QUALIDADE E RDC Nº 26 DE MAIO DE 2014 
A Resolução da Diretoria Colegiada - RDC nº 26, de 13 de maio de 2014 (RDC nº 
26/2014) dispõe sobre o registro de Medicamentos Fitoterápicos e o registro/notificação de 
Produtos Tradicionais Fitoterápicos. A RDC nº 26/2014 delineou fitoterápico em duas 
categorias: Medicamentos Fitoterápicos (MF) e Produtos Tradicionais Fitoterápicos (PTF). Os 
MF são obtidos com a utilização exclusiva de matérias primas ativas vegetais, no qual sua 
segurança e eficácia são comprovadas com base em evidências clínicas e que sejam 
caracterizados pela constância de sua qualidade e reprodutibilidade. Os PTF também são 
obtidos com o uso exclusivo de matérias primas ativas vegetais, porém, sua segurança e 
efetividade devem ser fundamentadas em dados de uso seguro e efetivo expostos na literatura 
técnica e científica das monografias de fitoterápicos europeias, ou baseadas em dados de uso 
tradicional por um período mínimo de 30 anos (BRASIL, 2014a). 
A RDC nº 26/2014 determina premissas mínimas para que seja feito o registro e 
renovação de registro do MF e para registro, renovação de registro e notificação do PTF. 
Todos os requisitos estão abarcados nos relatórios técnicos, de estudo de estabilidade, de 
produção e controle de qualidade. Um exemplo de exigência é o padrão de qualidade e 
identidade botânica e química e as provas de efetividade e eficácia (BRASIL, 2014a). A 
figura 2 exemplifica as análises exigidas no laudo de controle de qualidade para droga 
vegetal, derivado vegetal e produto acabado relacionados ao estudo fitoquímico e ensaios de 
pureza. 
 
 
 
 
 
 
 
 
19 
 
FIGURA 2. Testes exigidos no laudo de controle de qualidade exigido pela RDC nº. 26/2014 
 
Fonte: autoria própria usando o BioRender. 
 
Como pode ser observado na figura 2, percebe-se que o perfil cromatográfico é apenas 
uma parte de uma quantidade de testes e ensaios exigidos para o registro de medicamentos e 
produtos tradicionais fitoterápicos. Uma das exigências do registro do MF e PTF é a 
apresentação do certificado de análise da droga vegetal, derivado vegetal e do produto 
acabado. Nos trêscasos, é exigido o perfil cromatográfico com comparativo, através de 
imagem eletrônica para que possa ser garantida a identidade da matéria prima e a análise 
quantitativa do marcador específico para a espécie. Marcadores podem ser definidos como 
constituintes ou grupos de constituintes quimicamente definidos, estando presentes em 
drogas, fitoterápicos ou outros medicamentos advindos de ativos de origem natural. Essas 
substâncias são utilizadas como referência para o controle de qualidade em toda a cadeia 
produtiva, desde a matéria prima vegetal até o fitoterápico acabado (produto final) (BRASIL, 
2019). 
Nesse contexto, é possível selecionar marcadores ativos para algumas espécies e 
relacioná-los com a atividade farmacológica geral do fitoterápico. Porém, a atividade 
terapêutica não pode ser atribuída exclusivamente a esses marcadores, tendo em vista que 
trata-se de uma matriz complexa com diversos fitoconstituíntes. Além disso, quando os 
marcadores ativos são desconhecidos ou indisponíveis para análise rotineira, seleciona-se os 
marcadores analíticos, que possuem a função principal de controle de qualidade da cadeia 
20 
 
produtiva. Todavia, monitorar quantitativamente o conteúdo dos marcadores não garante a 
uniformidade e controle de qualidade, o que gera a necessidade de métodos complementares 
como o monitoramento dos perfis cromatográficos da droga vegetal até o fitoterápico pronto, 
a fim de avaliar aspectos importantes da qualidade (KLEIN-JUNIOR et al., 2021). 
A droga vegetal refere-se à planta medicinal ou suas partes, que apresenta substâncias 
responsáveis pela ação terapêutica, após processo de secagem, podendo estar em sua forma 
íntegra, rasurada, triturada ou pulverizada. O derivado vegetal é o produto de extração da 
planta medicinal ou droga vegetal, podendo estar em diversas formas, como extrato, óleo 
essencial, tintura etc. Importante destacar que tanto a droga vegetal como o derivado vegetal 
podem ser registrados como MF ou PTF, como também podem ser utilizados como insumo 
farmacêutico ativo para ser aplicado em uma formulação. Dessa forma, se faz extremamente 
importante os ensaios como o perfil cromatográfico em toda a cadeia produtiva, para que se 
possa ter o controle de qualidade em todas as etapas do processo, embora seja apenas um dos 
processos exigidos para o registro de fitoterápicos (BRASIL, 2014a). 
 
2.4. VALIDAÇÃO DE CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA 
O controle de qualidade de plantas medicinais e fitoterápicos é uma atividade analítica 
desafiadora, porque tudo que há naquela preparação pode ser considerado substância ativa 
com atividade terapêutica, visto que são matrizes complexas com uma extensa classe de 
fitoquímicos com variabilidade natural (KOLL et al., 2003; REICH, SCHIBLI, DEBATT, 
2008). Dessa forma, o fingerprint (impressão digital) de todo o perfil cromatográfico é de 
extrema importância para o controle de qualidade, pois cada banda do cromatograma fornece 
dados fundamentais. Nesse contexto, se faz necessário abordar novas técnicas e métodos que 
possam ser validados e auxiliem na identificação e comprovação da qualidade da amostra em 
questão (KOLL et al., 2003). 
O perfil cromatográfico pode ser definido como o padrão cromatográfico de 
constituintes característicos, obtido através de condições definidas e que possibilita a 
identificação do material vegetal em estudo e a diferenciação de outras espécies (BRASIL, 
2014a). A figura 3 exemplifica como esse perfil cromatográfico se apresenta para matrizes 
complexas em cromatografia em camada delgada, onde cada banda corresponde a um ou mais 
compostos da espécie vegetal estudada. 
 
 
 
21 
 
FIGURA 3. Perfil cromatográfico de espécies do gênero Equitesum 
 
Fonte: WAGNER, BLADT, 1996. 
 
Ao analisar a figura 3, observa-se que a cromatografia em camada delgada (CCD) é 
uma ferramenta ideal para a análise de plantas medicinais e fitoterápicos. Em quase todas as 
farmacopeias oficiais a CCD é a técnica preconizada para identificação de matérias primas 
botânicas (KOLL et al., 2003). Além disso, a CCD está presente em todas as monografias de 
plantas medicinais da Farmacopeia Brasileira 6ª edição como critério de identificação e 
controle de qualidade (BRASIL, 2019). 
Algumas vantagens do uso da CCD podem ser citadas, como identificação e controle 
de qualidade de plantas medicinais e fitoterápicos, acompanhamento de toda a cadeia de 
fabricação do fitoterápico, desde a planta fresca ou seca até o produto acabado, bem como o 
controle de qualidade do produto acabado (KOLL et al., 2003). Além disso, essa técnica 
permite uma migração diferencial de uma matriz complexa de substâncias que resulta em um 
perfil cromatográfico distinto, de acordo com determinadas condições cromatográficas, como 
observado na figura 3 (MUYUMBA et al., 2021). Somado a isso, constitui uma técnica fácil, 
de baixo custo, rápida e versátil. 
A validação analítica pode ser definida como uma avaliação sistemática de um método 
através de ensaios experimentais a fim de comprovar e fornecer evidências objetivas de que as 
exigências específicas para seu uso planejado são atendidas. Dessa forma, a validação deve 
demonstrar que o método analítico em questão produz resultados confiáveis e é adequado à 
22 
 
finalidade a que se destina, de forma documentada e mediante critérios objetivos (BRASIL, 
2017). 
Antes de iniciar a validação propriamente dita, se faz necessário observar alguns 
parâmetros, como a fase estacionária, aplicação da amostra, preparação do solvente, 
desenvolvimento do cromatograma, derivatização e documentação. Para a validação 
qualitativa, são avaliados três parâmetros principais: seletividade, precisão e robustez (KOLL 
et al., 2003). 
A seletividade do método analítico deve ser determinada através da capacidade de 
identificar ou quantificar a substância de interesse na presença de componentes que podem 
estar presentes na amostra, como impurezas e componentes da matriz (BRASIL, 2017). Dessa 
forma, para validação qualitativa por CCD, ela pode ser determinada comparando o perfil 
cromatográfico da amostra com um material fitoterápico autêntico, com marcadores ou 
compostos ativos que são conhecidos ou desconhecidos da amostra, ou ainda com materiais 
adulterantes que podem estar contidos nessa amostra. Todas as amostras são dispostas lado a 
lado em uma única placa e as bandas relevantes são avaliadas quanto ao número, cor, 
intensidade e posição relativa. Bandas relevantes podem ser descritas como as que retratam os 
marcadores aceitos ou compostos ativos (KOLL et al., 2003). 
A precisão de um método deve analisar a proximidade entre os resultados obtidos 
através dos ensaios com as amostras preparadas conforme descrito na técnica analítica a ser 
validada. Dessa forma, esse parâmetro deve ser validado por meio da repetibilidade, da 
precisão intermediária ou da reprodutibilidade. A repetibilidade, também chamada de precisão 
intra-ensaio, irá analisar as amostras nas mesmas condições operacionais, com o mesmo 
analista e instrumentação, em uma única corrida analítica (BRASIL, 2017). Para tanto, é 
recomendado que sejam avaliadas nove determinações (três concentrações em triplicata de 
cada concentração) ou ainda pode ser avaliado com seis determinações com 100% da 
concentração de teste (BRASIL, 2017). 
A precisão intermediária, também conhecida como precisão intralaboratorial, é obtida 
através do mesmo procedimento em material de teste idêntico, porém em dias diferentes (no 
mínimo, dois dias) e com analistas distintos. Nesse caso, devem ser utilizadas as mesmas 
concentrações do teste de Repetibilidade. A reprodutibilidade, conhecida como precisão 
interlaboratorial, avalia a precisão obtida com a mesma técnica em material de teste idêntico 
ou padronizado entre os laboratórios, através de estudos colaborativos. Geralmente esse 
parâmetro não é aplicado à padronização demetodologia (ICH, 2005; BRASIL, 2017; 
RENGER; VÉGHB; FERENCZI-FODOR, 2011). 
23 
 
A robustez de um método deve indicar a sua capacidade em resistir a pequenas 
modificações intencionais das condições analíticas das quais estão sendo validadas. Assim, 
modificações na temperatura, umidade, cuba cromatográfica e até mesmo placas 
cromatográficas de diferentes fabricantes podem ser feitas para analisar o quão robusto é o 
método em validação (ICH, 2005; BRASIL, 2017). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
24 
 
3 OBJETIVOS 
 
3.1 OBJETIVO GERAL 
 Desenvolver e validar um método de caracterização do fingerprint do perfil 
flavonoídico para o extrato hidroetanólico das folhas da espécie Moringa oleifera por 
Cromatografia em Camada Delgada. 
 
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
● Padronizar preparação do extrato e aplicações na placa cromatográfica; 
 
● Desenvolver o método analítico e padronizar o sistema cromatográfico; 
 
● Comparar amostras autênticas com amostra adquirida em centro comercial; 
 
● Validar os parâmetros de seletividade, precisão e robustez da técnica de CCD a fim de 
facilitar a identificação da espécie no controle de qualidade. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
25 
 
4. METODOLOGIA 
 
4.1. MATERIAL VEGETAL 
As folhas para a amostra autêntica de Moringa oleifera foram obtidas no município de 
Macaíba, Rio Grande do Norte, na Escola Agrícola de Jundiaí, da Universidade Federal do 
Rio Grande do Norte (UFRN), nas seguintes coordenadas: lat: -5.900133 long: - 35.357028. O 
material vegetal foi coletado, catalogado e identificado mediante autorização do Sistema 
Nacional de Gerenciamento do Patrimônio Genético e Conhecimento Tradicional Associado 
(SISGEN), sob número A618873. Foi depositada exsicata sob número 25426 no herbário do 
Centro de Biociências da UFRN. A amostra comercial das folhas de M. oleifera foi obtida no 
centro comercial da cidade de Natal, Rio Grande do Norte. 
 
4.2. OBTENÇÃO DOS EXTRATOS 
As folhas da amostra autêntica de M. oleifera foram submetidas a processamento com 
nitrogênio líquido “quenching” imediatamente após a coleta, tendo em vista, que este trabalho 
faz parte de uma tese de doutorado em andamento no Grupo de Pesquisa em Produtos 
Naturais Bioativos, da UFRN, cujo objetivo é realizar uma abordagem metabolômica. O 
processo de extração foi adaptado da mesma tese em andamento. Ao chegar ao laboratório, as 
folhas foram pulverizadas com nitrogênio líquido e foram submetidas à extração com 
etanol:água (80:20, v/v) na proporção de 1:10 (m/v) através de ultrassom por 13,5 minutos. 
Em seguida, o extrato foi seco sob pressão reduzida em rotaevaporador (45 ºC). Após, o 
extrato foi submetido a banho maria por 25 minutos (50 ºC) para retirada de qualquer resíduo 
de solvente que possa ter ficado no extrato e logo em seguida, foi levado para estufa para 
máxima concentração por 50 minutos (50 ºC). Essa amostra autêntica foi utilizada em todo o 
processo de validação do método, desde seletividade até a robustez. 
O mesmo procedimento foi realizado para obtenção do extrato de outras duas amostras 
que serão utilizadas no parâmetro seletividade. Nessa segunda amostra autêntica, as folhas da 
M. oleifera não passaram por processamento em campo ou no laboratório com nitrogênio 
líquido. Elas foram secas em estufa a 40 ºC e trituradas em moinho de facas, procedimento 
tradicional empregado na secagem de plantas medicinais. Para essa amostra, o mesmo 
procedimento de extração citado anteriormente foi feito. Para a amostra comercial, as folhas 
secas foram pulverizadas em liquidificador industrial e seguiu-se com o mesmo protocolo de 
extração. A figura 4 apresenta o processo de extração da amostra autêntica para validação do 
método. 
26 
 
FIGURA 4. Processo de extração para amostra autêntica processada com nitrogênio líquido “quenching” de 
Moringa oleifera 
 
Legenda: Procedimento similar foi utilizado para extração da amostra comercial e amostra autêntica de folhas 
secas em estufa, única diferença é na primeira etapa, no qual foram pulverizadas com liquidificador industrial e 
moinho de facas, respectivamente. Fonte: Adaptado de SILVA, integrante do grupo de pesquisa em Produtos 
Naturais Bioativos (resultados ainda não publicados). 
 
4.3. PREPARO DA AMOSTRA E PADRÕES PARA ANÁLISE 
As amostras autênticas de diferentes processamentos e comercial foram preparadas da 
mesma forma e na mesma concentração de 20 mg/mL, utilizando como solvente o metanol. 
Os marcadores utilizados foram a isovitexina e a vitexina (Sigma-Aldrich
®
), também 
utilizando o metanol como solvente. 
 
4.4. DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO 
O desenvolvimento do método foi direcionado para validar um fingerprint voltado 
para o perfil flavonoídico, visto que já há relatos na literatura para a presença dessas 
substâncias na espécie e o foco do grupo de pesquisa em Produtos Naturais Bioativos é obter 
um extrato otimizado rico em flavonoides para o tratamento de doenças inflamatórias 
crônicas. Aspectos como a fase móvel, fase estacionária e a derivatização foram analisados 
para que o método fosse validado conforme esse enfoque. Foram testadas várias fases móveis, 
geralmente, misturas entre acetato de etila (AcOEt), metanol (MeOH), ácido(acético e 
27 
 
fórmico) e água. Foram feitas várias tentativas de alteração da proporção de ácido e água na 
composição da fase móvel, para obter um cromatograma com boa resolução. 
 
4.5. SISTEMA CROMATOGRÁFICO 
A cromatografia em camada delgada (CCD) foi realizada em placas de papel alumínio 
de 20 cm x 20 cm recobertas com sílica gel 60 F254 (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha). As 
amostras e padrões foram aplicados com auxílio de capilares de vidro. Foram feitas três 
aplicações para as amostras dos extratos das folhas da M. oleifera e duas aplicações para os 
marcadores. Após a aplicação, adicionou-se a placa em uma cuba de vidro (20 cm x 20 cm) 
previamente saturada com a fase móvel por 10 minutos. A fase móvel utilizada foi acetato de 
etila: acetona: ácido acético: água, na proporção de 60:20:15:10 (v/v/v/v). Finalizada a 
eluição, borrifou-se a solução reveladora Reagente Natural A 0,5% para evidenciar a presença 
dos compostos de interesse. A observação foi feita através de câmara escura com luz 
ultravioleta com comprimento de onda de 365 nm. As zonas de interesse foram marcadas para 
posterior cálculo do fator de retenção (Rf). Todas as placas foram fotodocumentadas. No 
Quadro 1 é possível observar o resumo do sistema cromatográfico utilizado. 
 
Quadro 1. Sistema cromatográfico selecionado para validação do método de Cromatografia em Camada 
Delgada para Moringa oleifera 
Fator Condição cromatográfica 
Fase estacionária Placas adsorventes de papel alumínio revestidas com 
sílica gel F254 
Fase móvel acetato de etila: acetona: ácido acético: água 60:20:15:10 
(v/v/v/v) 
Aplicação Manual (três aplicações para os extratos e duas 
aplicações para os padrões) 
Câmara Cuba cromatográfica (20 cm x 20 cm), calha dupla 
Tempo de saturação 10 minutos, sem a utilização de papel filtro 
Revelador Reagente natural A 0,5% 
Comprimento de onda 365 nm 
Fonte: autoria própria. 
 
4.6. VALIDAÇÃO PARCIAL DO MÉTODO 
 Os parâmetros avaliados nessa validação parcial foram a seletividade, precisão e 
robustez. Todos os parâmetros foram analisados de acordo com o que preconiza a RDC 166 
de 24 de julho de 2017. 
28 
 
4.6.1 Seletividade 
A seletividade do método foi avaliada através da comparação visual do perfil 
cromatográfico da amostra autêntica das folhas processadas com nitrogênio líquido, amostra 
autêntica das folhas secas em estufa, amostra comercial e marcadores isovitexina e vitexina. A 
cor, intensidade, fator de retenção e número de bandas foi avaliado. A análise foi feita em 
triplicata e foi calcula 
da média, desvio padrão e desvio padrão relativodo Rf para as bandas de interesse. As 
bandas de interesse analisadas e estudadas foram as que dizem respeito aos marcadores. 
 
4.6.2 Precisão 
A precisão indica o grau de proximidade dos resultados, através do cálculo do desvio 
padrão relativo obtido de diferentes análises. Esse parâmetro pode ser avaliado através da 
repetibilidade e precisão intermediária ou reprodutibilidade (BRASIL, 2017). Para este 
trabalho, foram escolhidos a repetibilidade e a precisão intermediária para comprovar a 
precisão do método. 
A repetibilidade foi avaliada através da preparação e aplicação de 6 replicatas 
independentes da amostra do extrato concentrado, como ilustra a figura 1. O parâmetro foi 
executado em triplicata com as mesmas replicatas, no mesmo dia, no mesmo laboratório, com 
o mesmo analista e utilizando a mesma instrumentação. Foram calculados os fatores de 
retenção (Rf) de 3 zonas das placas e calculados a média, desvio padrão e desvio padrão 
relativo. 
 
FIGURA 5. Preparação das replicatas para ensaio de Repetibilidade e Precisão Intermediária 
 
 Fonte: autoria própria usando BioRender 
 
A precisão intermediária foi avaliada através da repetição do teste de repetibilidade, 
com as mesmas amostras utilizadas na repetibilidade, 3 dias diferentes, em mesmo 
29 
 
laboratório, com analista e instrumentação diferentes. Para esse parâmetro, também foi 
avaliado 3 zonas da placa e calculados os Rfs dessas zonas. 
 
4.6.3 Robustez 
A robustez é um parâmetro realizado no desenvolvimento do método analítico que 
indica a sua capacidade em resistir a pequenas e deliberadas variações das condições 
analíticas (BRASIL, 2017). Dessa forma, a tabela 1 indica o que foi alterado para que esse 
método pudesse ser validado. 
 
TABELA 1. Condições utilizadas para análise do parâmetro robustez. 
Fator Condição do método Condição alterada 
Fase móvel 
Acetato de etila : acetona : ácido 
acético : água (60:20:15:10, v/v/v/v) 
Acetato de etila: acetona: ácido acético: 
água (60:20:14:10, v/v/v/v) 
Acetato de etila: acetona: ácido acético: 
água (60:20:16:10,v/v/v/v) 
Tipo de câmara Cuba cromatográfica Béquer 
Papel filtro para saturação Não 20 minutos com papel filtro 
Tempo de saturação 10 minutos sem papel filtro 20 minutos sem papel filtro 
Pré-eluição da fase estacionária Não 
Metanol 
Fase móvel proposta no método 
Fonte: autoria própria 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
30 
 
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
5.1 DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO 
 Várias fases móveis foram testadas a fim de obter uma boa separação cromatográfica. 
A tabela 2 mostra com detalhes as fases móveis testadas durante a fase de desenvolvimento do 
método. 
 
TABELA 2. Fases móveis testadas durante o processo de desenvolvimento do método. 
Número Fase móvel Composição (v/v/v/v/v) 
1 Acetato de etila: ácido fórmico: água 80:10:10 
2 Acetato de etila: ácido fórmico: metanol: água 100:15:16:5 
3 Acetato de etila: ácido fórmico: água 80:12:10 
4 Acetato de etila: ácido fórmico: metanol: água 100:15:13:4 
5 Acetato de etila: ácido fórmico: metanol: água 100:16:16:4 
6 Acetato de etila: ácido fórmico: ácido acético: metanol: água 100:8:8:14:3 
7 Acetato de etila: ácido acético: metanol: água 100:16:15:3 
8 Acetato de etila: ácido fórmico: metanol: água 100:17:15:3 
9 Acetato de etila: ácido acético: metanol: água 100:17:13:4 
10 Acetato de etila: ácido acético: água 80:12:10 
11 Acetato de etila: ácido fórmico: ácido acético: água 34:3,5:1,5:7 
12 Acetato de etila: ácido fórmico: ácido acético: água 90:3,5:5,1:5,9 
13 Acetato de etila: ácido fórmico: ácido acético: água 34:4,5:2,5:7 
14 Acetato de etila: ácido fórmico: ácido acético: água 34:5,5:3,5:7 
15 Acetato de etila: ácido fórmico: metanol: água 100:5:2:6 
16 Acetato de etila: ácido acético: metanol: água 100:15:13:4 
17 Acetato de etila: ácido acético: metanol: água 100:17:15:3 
18 Acetato de etila: ácido acético: metanol: água 100:18:10:4 
19 Acetato de etila: ácido acético: metanol: água 100:19:8:3 
20 Clorofórmio: metanol: água 61:32:7 
21 Acetato de etila: acetona: ácido acético: água 60:20:10:10 
22 Acetato de etila: acetona: ácido acético: água 60:20:12:10 
23 Acetato de etila: acetona: ácido acético: água 60:20:13:10 
24 Acetato de etila: acetona: ácido acético: água 60:20:14:10 
25 Acetato de etila: acetona: ácido acético: água 60:20:15:10 
Fonte: autoria própria 
 
Como observado na tabela 2, a maioria das fases móveis foram testadas 
principalmente modificando as quantidades de ácido e água. Como descrito anteriormente, a 
maioria dos compostos flavonoídicos das folhas da M. oleifera são polares, com açúcares 
ligados as agliconas. Com o intuito de fazer com que as substâncias não ficassem retidas na 
fase estacionária polar, foi necessário utilizar fase móvel tivesse com um poder de eluição 
maior em relação a polaridade do adsorvente. O ácido usado na fase móvel, para esse caso, foi 
com a finalidade de melhorar a resolução sem coeluição e diminuição da assimetria e fator de 
cauda. 
Dentre todas as fases móveis testadas, a de número 25 (acetato de etila: acetona: ácido 
acético: água 60:20:15:10,(v/v/v/v)) apresentou o resultado mais satisfatório. Os resultados 
31 
 
obtidos com as outras fases móveis testadas foram insatisfatórias para a separação e resolução 
das bandas do cromatograma. O reagente escolhido para fazer a derivatização das 
cromatoplacas foi o Reagente Natural A 0,5%, justamente porque o direcionamento do 
método era visualizar o perfil flavonoídico. 
 
5.2 SELETIVIDADE 
 A seletividade do método foi avaliada levando em consideração as duas amostras 
autênticas (processadas com nitrogênio líquido e seca em estufa), a amostra comercial e os 
padrões isovitexina e vitexina. Esse teste foi feito em triplicata e os resultados para padrão de 
bandas, coloração, intensidade e fator de retenção (Rf) estão expressos na tabela 2. A figura 6 
ilustra o perfil cromatográfico obtido para a análise do parâmetro seletividade. 
 
FIGURA 6. Perfil cromatográfico para análise da Seletividade 
 
Legenda: 1: Amostra autêntica processada com nitrogênio; 2: Amostra autêntica seca em estufa; 3: amostra 
comercial; 4: isovitexina; 5: vitexina. Observação na luz UV 365 nm. Fonte: autoria própria. 
 
O critério de aceitação utilizado para esse parâmetro foi a detecção e separação dos 
marcadores de todos os outros fitoconstituintes, além de analisar e comparar as amostras e 
padrões utilizados com a amostra autêntica no que diz respeito ao padrão das bandas 
formadas, cor, intensidade e fator de retenção (Rf) como propõe KOLL et al., (2003) As 
bandas relevantes devem ser semelhantes em todas as amostras. Para essa validação parcial, 
as bandas relevantes escolhidas foram as que correspondem aos marcadores isovitexina e 
vitexina. A tabela 3 mostra com detalhes os resultados encontrados para as triplicatas, 
apresentando a média, desvio padrão e desvio padrão relativo. 
 1 2 3 4 5 
32 
 
TABELA 3. Análise do parâmetro Seletividade em triplicata. Medição do Rf das bandas de interesse, que diz 
respeito aos marcadores isovitexina e vitexina. Rf: Fator de retenção; DP: Desvio Padrão; DPR: Desvio Padrão 
Relativo 
Amostras Padrão das bandas Coloração Intensidade Rf Média (Rf) DP DPR (%) 
Autêntica 
processada com 
nitrogênio 
Barra Verde Forte 0,8214 
0,8214 0,0057 0,6959 
Barra Verde Forte 0,8214 
Barra Verde Forte 0,8313 
Autêntica seca 
em estufa 
Barra Verde Forte 0,8313 
0,8313 0,0121 1,4495 
Barra Verde Forte 0,8193 
Barra Verde Forte 0,8434 
Isovitexina Barra Verde Forte 0,8313 
0,8313 0,0172 2,0666 
Barra Verde Forte 0,8095 
Barra Verde Forte 0,8434 
Vitexina Barra Verde Forte 0,8434 
0,8434 0,0165 1,9512 
Barra Verde Forte 0,8214 
Barra Verde Forte 0,8536 
Comercial - - - - 
- - - - - - - 
- - - - 
Fonte: autoria própria. 
 
 Analisando ocromatograma (figura 6) pode-se observar que as amostras autênticas 
processada em nitrogênio líquido e seca em estufa (marcação 1 e 2 na figura 6) obtiveram 
perfis bastantes semelhantes do ponto de vista qualitativo mesmo em decorrência do 
processamento diferente, apresentando um fator de retenção de 0,8214 e 0,8313, 
respectivamente, para as bandas de interesse. Observa-se que o padrão das bandas, a 
coloração e intensidade também foram semelhantes (tabela 2). 
As substâncias isovitexina e vitexina foram escolhidas para essa validação por já 
terem sido caracterizadas no extrato hidroetanólico das folhas da M. oleifera na tese de 
doutorado em andamento (resultados não publicados), no grupo de Pesquisa em Produtos 
Naturais Bioativos. A isovitexina e a vitexina apresentaram Rf de 0,8313 e 0,8434, 
respectivamente, como também, com os outros aspectos semelhantes A justificativa para esse 
fator de retenção ser tão próximo está associada a estrutura química de ambas, como é 
observado na figura 7, pois tratam-se de flavonoides C-glicosídeos, isômeros de posição. A 
vitexina apresenta uma molécula de açúcar ligada na posição 8 do anel A e a isovitexina 
apresenta uma molécula de açúcar ligada na posição 6 do anel A. 
 
 
 
33 
 
FIGURA 7. Estruturas da Vitexina e Isovitexina 
 
Fonte: LOPES (2013). 
 
A isovitexina (apigenina-6-C-glicosídeo) é um isômero da vitexina (apigenina-8-C-
glicosídeo) e contém um 6-C-glicosídeo em comparação com o 8-C-glicosídeo da vitexina 
(HE et al., 2016). Desse modo, por serem tão estruturalmente semelhantes e devido à técnica 
de CCD não ser a mais sensível para diferenciar substâncias, não é possível afirmar que as 
manchas verdes que são visualizadas no perfil cromatográfico das amostras autênticas 
processada com nitrogênio líquido e secas em estufa são apenas uma substância, pois o Rf 
delas é muito próximo e pode ocorrer sobreposição de bandas. 
O que chama atenção nesse cromatograma é o fato da amostra comercial não estar 
semelhante com o perfil cromatográfico das amostras autênticas. Não observa-se manchas 
verdes, indicando provavelmente que não há a presença de isovitexina e vitexina, além das 
outras bandas não corresponderem em padrão, coloração, intensidade e Rf. A impressão 
digital não é semelhante e uma das sugestões é que pode ser uma adulteração ou outra espécie 
sendo vendida como M. oleifera. Esse fato nos mostra como é importante termos acesso a 
técnicas rápidas, de baixo custo e acessíveis para identificar adulterações, como a CCD. 
Porém, não podemos afirmar que de fato seja uma adulteração, devemos levar em 
consideração outros aspectos como tempo de maturação da planta, método de secagem das 
folhas, fatores bióticos e abióticos, tipo de terreno em que essa planta foi cultivada e 
concentração dos metabólitos na planta. Todos esses fatores podem influenciar na produção 
dos metabólitos e levar para uma via sintética diferente, podendo mudar a composição da 
espécie. Além disso, ainda há o fato da técnica de CCD não ser um método quantitativo, que 
consiga identificar substâncias com concentrações mais baixas. Assim, para comprovar uma 
adulteração ou não, é necessário a utilização de outras técnicas mais sensíveis, como o CLAE 
(Cromatografia Líquida de Alta Eficiência). 
Analisando todos os parâmetros propostos, observa-se que o método é seletivo para 
amostras de folhas de M. oleifera, visto que conseguiu manter o padrão cromatográfico para 
34 
 
duas amostras com tratamentos diferentes. O nitrogênio líquido tem a capacidade de parar o 
metabolismo da planta quando aplicado imediatamente após a coleta. Dessa forma, embora as 
amostras autênticas tenham sofrido diferentes processamentos e tenham sido coletadas em 
diferentes épocas, o método se mostrou seletivo e conseguiu identificar as bandas de interesse, 
bem como identificar o fingerprint e perfil cromatográfico semelhante entre as amostras 
autênticas. Além disso, o método conseguiu distinguir uma amostra com perfil cromatográfico 
diferente. 
 
5.3 PRECISÃO 
 
5.3.1 Repetibilidade 
 A repetibilidade do método foi avaliada levando em consideração o método proposto 
por REICH, SCHIBLI, DEBATT (2008) e BRASIL (2017), onde 6 replicatas a 100% da 
concentração do teste foram aplicadas em paralelo, juntamente com os padrões isovitexina e 
vitexina, em três placas distintas. A análise ocorreu em um mesmo dia, com o mesmo analista, 
instrumentação e mesmo laboratório. A figura 8 apresenta o perfil cromatográfico obtido para 
esse parâmetro da validação. 
 
FIGURA 8. Perfil cromatográfico para avaliação do parâmetro Precisão: Repetibilidade 
 
 R1 R2 R3 R4 R5 R6 7 8 
Z3 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Z2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Z1 
a 
35 
 
 
 
Legenda: R1-R6: amostras de concentração 100%; 7: isovitexina; 8: vitexina. Z1: Zona 1; Z2: Zona 2; Z3: Zona 
3. 8a, 8b e 8c: observadas na luz UV 365nm. Fonte: autoria própria. 
 
 Foram escolhidas 3 zonas estratégicas da cromatoplaca (figura 8) para que pudessem 
ser calculados os fatores de retenção (Rf) dessas bandas e houvesse a comparação desses 
valores. As três zonas correspondem ao início, meio e fim da placa, sendo as últimas 
consideradas também as bandas de interesse. A RDC nº166/2017 recomenda que os valores 
relativos à validação da precisão sejam expressos como desvio padrão relativos (DPR%). Para 
esse trabalho, foi adotado como critério de aceitação que o DPR entre as determinações seja 
inferior a 15%, que é um critério estabelecido pela Instrução Normativa nº4 de 2014 
(BRASIL, 2014b). Os resultados obtidos se encontram nas tabelas 4 e 5. 
 
 
 
 
 R1 R2 R3 R4 R5 R6 7 8 
 R1 R2 R3 R4 R5 R6 7 8 
Z3 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Z2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Z1 
b 
Z3 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Z2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Z1 
c 
36 
 
TABELA 4. Análise do parâmetro Precisão: Repetibilidade. Medição do Rf de bandas de três zonas. R1 a R6: 
amostras na concentração 100%. Z1: Zona 1; Z2: Zona 2; Z3: Zona 3. Rf: Fator de retenção; DP: Desvio Padrão; 
DPR: Desvio Padrão Relativo. 
Replicatas Zonas Figura 8a (Rf) Figura 8b (Rf) Figura 8c (Rf) Média (Rf) DP DPR (%) 
R1 Z1 0,3571 0,3529 0,3536 0,3536 0,0023 0,6364 
Z2 0,607 0,6 0,5976 0,6 0,0049 0,8140 
Z3 0,8452 0,847 0,8536 0,847 0,0044 0,5222 
R2 Z1 0,3571 0,3529 0,3536 0,3536 0,0023 0,6364 
Z2 0,619 0,6 0,5976 0,6 0,0117 1,9540 
Z3 0,8333 0,8353 0,8415 0,8353 0,0043 0,5119 
R3 Z1 0,369 0,3571 0,3658 0,3658 0,0062 1,6835 
Z2 0,607 0,607 0,61 0,607 0,0017 0,2853 
Z3 0,8333 0,8333 0,8415 0,8333 0,0047 0,5681 
R4 Z1 0,369 0,3571 0,378 0,369 0,0105 2,8411 
Z2 0,6309 0,607 0,609 0,609 0,0133 2,1772 
Z3 0,8452 0,8333 0,8414 0,8414 0,0061 0,7224 
R5 Z1 0,3765 0,369 0,378 0,3765 0,0048 1,2807 
Z2 0,6235 0,619 0,61 0,619 0,0069 1,1105 
Z3 0,847 0,8333 0,8415 0,8415 0,0069 0,8193 
R6 Z1 0,3765 0,369 0,378 0,3765 0,0048 1,2807 
Z2 0,6235 0,619 0,61 0,619 0,0069 1,1105 
Z3 0,8352 0,8452 0,8537 0,8452 0,0093 1,0956 
Fonte: autoria própria. 
 
 Conforme tabela 4, foram medidos os Rfs das três zonas para cada replicata, nas três 
placas avaliadas, totalizando um n de 18 replicatas para que fossem analisados os Rfs. Foi 
feita a média, desvio padrão e desvio padrão relativo para cada zona da replicata. Observa-se 
que nenhum DPR ultrapassou 3%. Entretanto, para que o resultado aparesente-se mais 
fidedigno, fez-se a média, desvio padrão e desvio padrão relativo das zonas de cada replicata, 
juntando as zonas correlacionadas das 3 placas. O resultado está expresso na tabela 5. 
 
TABELA 5. Média, Desvio Padrão (DP) e Desvio Padrão Relativo (DPR) das zonas 1, 2 e 3 das 6 replicatas nas 
três placasdistintas. Rf: Fator de retenção. 
Zona Média (Rf) DP DPR (%) 
1 0,3674 0,0030 0,8300 
2 0,6080 0,0043 0,7051 
3 0,8415 0,0019 0,2285 
Fonte: autoria própria. 
 
 De acordo com a tabela 5, observa-se que o DPR não ultrapassou 1%, indicando que o 
método atende ao critério de aceitação da IN nº4 (BRASIL, 2014b), onde os valores de 
DPR% não podem ultrapassar 15%. Esses resultados nos mostram que a repetibilidade para o 
37 
 
parâmetro da precisão é confiável e que não houve variação significativa que interfira na 
qualidade do método. 
 
5.3.2 Precisão Intermediária 
 A precisão intermediária da metodologia foi estudada com base no método proposto 
por REICH, SCHIBLI, DEBATT (2008) e BRASIL (2017) no qual o mesmo experimento da 
repetibilidade foi repetido durante 3 dias. Para esse parâmetro, foram usadas as mesmas 
replicatas utilizadas no teste de repetibilidade, no mesmo laboratório, porém com analistas 
distintos. Os perfis cromatográficos obtidos para os três dias estão expressos na figura 9. 
 
FIGURA 9. Perfil cromatográfico para avaliação do parâmetro Precisão: Precisão intermediária 
 
 
 R1 R2 R3 R4 R5 R6 7 8 
 R1 R2 R3 R4 R5 R6 7 8 
Z3 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Z2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Z1 
a 
Z3 
 
 
 
 
 
 
 
 
Z2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Z1 
b 
38 
 
 
Legenda: R1-R6: amostras de concentração 100%; 7: isovitexina; 8: vitexina. Z1: Zona 1; Z2: Zona 2; Z3: Zona 
3. 9a, 9b e 9c foram observadas na luz UV 356 nm. 
 
 Ao observar os cromatogramas, percebemos que a zona 1 apresentou-se menos intensa 
na fotodocumentação, entretanto foi possível observar na câmara escura na luz UV 365 nm. 
Por serem diferentes analistas, percebe-se que a placa 9a está com coloração menos intensa do 
que as placas 9b e 9c (figura 9), porém isso pode ser explicado justamente por se tratar de 
outro analista que conduziu o experimento. O momento de aplicação é extremamente 
importante para obter um bom resultado cromatográfico. O mesmo desenho experimental da 
repetibilidade foi utilizado para determinar a precisão intermediária, com a diferença dos dias 
e analistas diferentes. Isso significa que as mesmas zonas foram escolhidas para calcular o 
fator de retenção. Esses resultados encontram-se nas tabelas 6 e 7. 
 
TABELA 6. Análise do parâmetro Precisão: Precisão Intermediária. Medição do Rf de bandas de três zonas. R1 
a R6: amostras na concentração 100%. Z1: Zona 1; Z2: Zona 2; Z3: Zona 3. Rf Fator de retenção; DP: Desvio 
Padrão; DPR: Desvio Padrão Relativo. 
Replicatas Zonas Figura 9a (Rf) Figura 9b (Rf) Figura 9c (Rf) Média (Rf) DP DPR (%) 
R1 Z1 0,3415 0,4167 0,3214 0,3415 0,0502 14,7100 
Z2 0,5976 0,6548 0,5714 0,5976 0,0426 7,1368 
Z3 0,8415 0,8809 0,8214 0,8415 0,0303 3,5968 
R2 Z1 0,3415 0,4167 0,3214 0,3415 0,0502 14,7100 
Z2 0,5976 0,6548 0,5833 0,5976 0,0378 6,3310 
Z3 0,8415 0,8809 0,8214 0,8415 0,0303 3,5968 
R3 Z1 0,3415 0,4048 0,3333 0,3415 0,0391 11,4579 
Z2 0,5976 0,6548 0,5833 0,5976 0,0378 6,3310 
Z3 0,8293 0,8809 0,8214 0,8293 0,0323 3,8966 
R4 Z1 0,3658 0,3928 0,3333 0,3658 0,0298 8,1444 
Z2 0,6098 0,6548 0,5714 0,6098 0,0417 6,8454 
Z3 0,8293 0,8809 0,8095 0,8293 0,0369 4,4449 
R5 Z1 0,3658 0,3928 0,3452 0,3658 0,0239 6,5259 
 R1 R2 R3 R4 R5 R6 7 8 
Z3 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Z2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Z1 
c 
39 
 
Z2 0,5976 0,6428 0,5833 0,5976 0,0311 5,1972 
Z3 0,8293 0,9048 0,8214 0,8293 0,0460 5,5517 
R6 Z1 0,3658 0,3928 0,3452 0,3658 0,0239 6,5259 
Z2 0,6098 0,6548 0,5833 0,6098 0,0361 5,9276 
Z3 0,8415 0,9048 0,8333 0,8415 0,0391 4,6499 
Fonte: autoria própria. 
 
 Analisando a tabela 6, percebe-se que o DPR para cada zona das três placas ficou um 
pouco mais elevado do que os valores encontrados para a repetibilidade. Isso pode ser 
facilmente explicado devido à diferença de analista e diferenças ambientais. Embora o DPR 
tenha apresentado um valor mais alto, o mesmo critério de aceitação da repetibilidade é 
utilizado na precisão intermediária, no qual determina-se que o valor de DPR entre as análise 
seja inferior a 15% (BRASIL, 2014b). 
 
TABELA 7. Média, Desvio Padrão (DP) e Desvio Padrão Relativo (DPR) das zonas 1, 2 e 3 das 6 replicatas. Rf: 
Fator de retenção. 
Zona Média (Rf) DP DPR (%) 
1 0,3537 0,0122 3,4575 
2 0,5976 0,0042 0,6989 
3 0,8354 0,0062 0,7388 
Fonte: autoria própria. 
 
A tabela 7 traz a média, desvio padrão e desvio padrão relativo para cada zona das 
replicatas das três placas distintas. Mais uma vez, observa-se que o DPR não ultrapassou 4%, 
indicando que o método está em conformidade com o critério de aceitação proposto pela IN 
nº4 (BRASIL, 2014b), onde os valores de DPR% não podem ultrapassar 15%. 
Os resultados encontrados na repetibilidade e na precisão intermediária nos apontam 
que o método proposto é preciso e reprodutível, visto que atendeu todos os critérios de 
aceitação impostos. As pequenas variações encontradas no DPR não são suficientes para 
anular a qualidade e precisão do método. 
 
5.3 ROBUSTEZ 
 Para avaliação do parâmetro robustez, examinou-se o impacto de pequenas e 
deliberadas variações nas condições analíticas do método no fator de retenção das bandas de 
interesse e no perfil cromatográfico como um todo. Foram feitas alterações na fase móvel, 
câmara usada para a eluição, tempo e configuração de saturação e pré-eluição da fase 
estacionária. Esses parâmetros foram escolhidos porque são alterações que podem ocorrer 
normalmente na rotina de um laboratório que vá utilizar essa metodologia validada. 
40 
 
REICH, SCHIBLI, DEBATT (2008) propõe como critério de aceitação uma 
variabilidade para os fatores de retenção ≤ 0,05. Entretanto, essa proposta é para o HPTLC 
(cromatografia em camada delgada de alta eficiência). Neste trabalho, como trata-se de CCD 
e há um maior risco de influências ambientais, optou-se por deixar como critério de aceitação 
uma variabilidade ≤ 0,1 para os resultados do fator de retenção. Foram usadas como 
referência as médias dos Rfs da amostra autêntica com folhas processadas com nitrogênio 
líquido “quenching”, isovitexina e vitexina encontradas no parâmetro seletividade. A tabela 8 
expõe os valores de critério de aceitação propostos. 
 
TABELA 8. Faixa de aceitação para os parâmetros analisados na Robustez. 
Substâncias Média encontrada na seletividade Intervalo aceito: ≤ 0,1 
Amostra autêntica (folhas 
processadas com nitrogênio) 
0,8214 0,7214 a 0,9214 
Isovitexina 0,8313 0,7313 a 0,9313 
Vitexina 0,8434 0,7434 a 0,9434 
Fonte: autoria própria. 
 
 Importante ressaltar que em todos os ensaios para analisar a robustez, foi utilizado 
como parâmetro principal a banda de interesse que corresponde aos padrões isovitexina e 
vitexina. Assim, todos os fatores de retenção calculados e explanados a seguir dizem respeito 
as bandas de coloração verde. Conforme tabela 8, para a amostra autêntica das folhas 
processadas com nitrogênio, utilizou-se como base a média encontrada no parâmetro da 
seletividade e o intervalo aceito para os cálculos de Rf podem variar de 0,7214 a 0,9214. Já 
para a isovitexina, a média encontrada foi de 0,8313 e o intervalo aceito vai de 0,7313 a 
0,9313. Para a vitexina, a média foi de 0,8434 e o critério de aceitação varia de 0,7434 a 
0,9434. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
41 
 
FIGURA 10. Perfil cromatográfico para avaliação da Robustez: Mudança de fase móvel 
 
Legenda: 10a: acetato de etila : acetona : ácido acético : água (60:20:14:1, v/v/v/v). 10b: acetato de etila : 
acetona : ácido acético : água (60:20:16:10, v/v/v/v) 1: Amostra autêntica; 2: isovitexina; 3: vitexina. 
Observação em luz UV 365nm. Fonte: autoria própria.A figura 10 expõe os cromatogramas obtidos com a mudança na fase móvel, onde foi 
alterada a proporção do ácido acético. Para essa análise, foram encontrados para a amostra 
autêntica, isovitexina e vitexina os valores de Rfs de 0,7976, 0,7857 e 0,7976 para a fase 
móvel com menos ácido acético (acetato de etila: acetona: ácido acético: água 60:20:14:10, 
v/v/v/v) e 0,8095, 0,7857 e 0,7976 para a fase móvel com maior quantidade de ácido acético 
(acetato de etila: acetona: ácido acético: água, 60:20:16:10, v/v/v/v). Analisando esses fatores 
e observando os cromatogramas (fig. 10), percebe-se que não houve diferença entre os fatores 
de retenção e que os mesmos ficaram dentro do intervalo proposto como critério de aceitação. 
O padrão das bandas e a coloração também não apresentaram diferenças significativas, 
demonstrando que nesse quesito, o método está um passo a mais de ser robusto. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 1 2 3 R4 1 2 3 
 a b 
42 
 
FIGURA 11. Perfil cromatográfico para avaliação da robustez: Tempo e configuração de saturação 
 
Legenda: 11a: 20 minutos sem utilização de papel filtro. 11b: 20 minutos utilizando papel filtro. 1: Amostra 
autêntica; 2: isovitexina; 3: vitexina. Observação em luz UV 365nm. Fonte: autoria própria. 
 
A figura 11 apresenta o perfil cromatográfico para o parâmetro de tempo e 
configuração da saturação. A figura 11a (20 minutos de saturação sem a presença do papel 
filtro) apresentou valores de 0,8675 para a amostra autêntica, 0,8554 para isovitexina e 0,8675 
para a vitexina. A figura 11b apresenta o cromatograma para a configuração com 20 minutos 
de saturação com o papel filtro e apresentou valores de fator de retenção de 0,7229 para a 
amostra autêntica, 0,7349 para isovitexina e 0,7349 para a vitexina. Esses valores encontram-
se dentro da margem preconizada pelo critério de aceitação. Além disso, o padrão das bandas, 
sua coloração e intensidade permanecem semelhantes, indicando que não houve alteração no 
perfil cromatográfico. 
Um fato curioso do cromatograma 11b é que os Rfs apresentaram-se um pouco abaixo 
da média utilizada como referência. KOLL et al., (2003) observaram que a umidade relativa 
do ar e a temperatura do ambiente podem influenciar significativamente nos valores de Rf 
Eles observaram que o valor de Rf diminui com o aumento de temperatura e diminuição da 
umidade. A figura 12 mostra os resultados encontrados para mostrar a influência da 
temperatura e umidade em um estudo de validação com rizomas de Black cohosh. 
 
 
 
 1 2 3 R4 1 2 3 
a b 
43 
 
FIGURA 12. Influência da umidade e temperatura em uma amostra autêntica de Rizoma de Black Cohosh 
 
Legenda: 1: 27 °C, 52% de umidade; 2: 28 °C, 50% de umidade; 3: 30 °C, 48% de umidade; 4: 31 ºC, 47% de 
umidade; 5: 32 °C, 46% de umidade. Fonte: KOLL et al. (2003). 
 
 O laboratório no qual foram feitos os ensaios para a validação parcial da metodologia 
não possui equipamento específico para verificar temperatura e umidade, dessa forma, não foi 
feito esse controle para observar o quão iria interferir nos valores de Rf ou não. Assim, 
sugere-se que a alteração no Rf ocorreu devido à temperatura e umidade. 
 
FIGURA 13. Perfil cromatográfico para avaliação da Robustez: Pré eluição da placa 
 
Legenda: 13a: Pré eluição com fase móvel utilizada em condições normais. 13b: Pré eluição com metanol. 1: 
Amostra autêntica; 2: Isovitexina; 3: Vitexina. Observação em luz UV 365nm. Fonte: autoria própria 
 
 1 2 3 1 2 3 
a b 
44 
 
A figura 13 apresenta o cromatograma para o parâmetro de pré-eluição da fase 
estacionária. Foram encontrados os valores de Rf 0,8795, 0,8795 e 0,8916 para amostra 
autêntica, isovitexina e vitexina para a placa previamente eluída com metanol. Já para a placa 
previamente eluída com a fase móvel utilizada nos outros ensaios, foram encontrados os 
mesmos valores de Rf de 0,8809 para amostra autêntica, isovitexina e vitexina. Observa-se 
que o perfil cromatográfico como um todo está semelhante ao que é esperado e observa-se 
alguns pontos de arraste e aparente diminuição da resolução das bandas. Isso provavelmente 
ocorreu no momento de borrifar o revelador Reagente Natural A 0,5%, Esses resultados 
também estão de acordo com o esperado e em conformidade com os critérios de aceitação pré 
definidos. 
 
FIGURA 14. Perfil cromatográfico para avaliação da Robustez: Tipo de câmara: béquer 
 
Legenda: 1: Amostra autêntica; 2: isovitexina; 3: vitexina. Observação em luz UV 365nm. Fonte: autoria 
própria 
 
 A figura 14 apresenta o perfil cromatográfico encontrado para a amostra autêntica, 
isovitexina e vitexina na mudança do tipo de câmara cromatográfica. Nesse caso, foi feita a 
eluição em um béquer de vidro de 1000 mL. Os resultados de fator de retenção encontrados 
foram de 0, 8916 para a amostra autêntica e isovitexina e 0,9146 para a vitexina. O padrão das 
bandas e a coloração do perfil também não se modificaram. Os Rfs permaneceram na faixa de 
intervalo proposta como critério de aceitação. 
 1 2 3 
a 
45 
 
 Observando os dados encontrados e tendo em vista que os valores de Rf não sofreram 
variações significativas, conclui-se que o método é robusto a pequenas variações, não 
modificando o perfil cromatográfico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
46 
 
6. CONCLUSÕES 
 
● O perfil cromatográfico é parte de um rol de exigências para o registro de 
medicamentos fitoterápicos e produtos naturais fitoterápicos, portanto, não é possível 
concluir sobre o controle de qualidade apenas utilizando a técnica de cromatografia 
em camada delgada. 
● O método desenvolvido para a identificação de extrato das folhas Moringa oleifera foi 
validado e se mostrou seletivo, preciso e robusto. 
● O parâmetro de seletividade se mostrou eficaz, visto que, a mesma espécie sob 
condições de processamento diferentes obtiveram perfis cromatográficos semelhantes 
e conseguiu identificar um perfil cromatográfico diferente em uma amostra comercial 
de folhas de M. oleifera. 
● O método em questão é preciso, visto que, tanto o parâmetro da repetibilidade quanto 
da precisão intermediária obtiveram valores de desvio padrão relativo entre os ensaios 
menores que 15%, como preconiza a IN nº 4, de 2014. 
● O método se mostrou robusto, visto que não houve diferenças significativas nos 
valores Rf frente às alterações feitas nas condições cromatográficas. 
● Por fim, espera-se que mais estudos na área de controle de qualidade de plantas 
medicinais sejam realizados e incluídos nos compêndios oficiais a fim de garantir que 
um produto seguro chegue às mãos dos consumidores. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
BORGES, F. V.; SALES, M. D. C. Políticas Públicas de Plantas Medicinais e Fitoterápicos 
no Brasil: Sua História no Sistema de Saúde. Pensar acadêmico, v. 16, n. 1, p. 13-27, 2018. 
 
BRASIL 2006a. Ministério da Saúde. Portaria nº. 971, de 03 de maio de 2006. Aprova a 
Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares (PNPIC) no Sistema Único de 
Saúde. DOU. Poder Executivo, Brasília, DF, 04 mai. 2006. 
 
BRASIL 2006b. Presidência da República. Decreto n°. 5813 de 22 de junho de 2006. Aprova 
a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos e dá outras providências. DOU. 
Poder Executivo, Brasília, DF, 23 jun. 2006. 
 
BRASIL 2009.