Revisão bbigrafica cromatografia UEL

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DANIELI PAULANI ALVES 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UMA REVISÃO BIBLIOGRÁFICA SOBRE O 
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO PARA 
DETERMINAÇÃO DE FUNGICIDAS EM MAÇÃ 
EMPREGANDO CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA 
EFICIÊNCIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Londrina 
2021 
 
DANIELI PAULANI ALVES 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UMA REVISÃO BIBLIOGRÁFICA SOBRE O 
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO PARA 
DETERMINAÇÃO DE FUNGICIDAS EM MAÇÃ 
EMPREGANDO CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA 
EFICIÊNCIA 
 
 
 
Trabalho de Conclusão de Curso 
apresentado ao Departamento de Química da 
Universidade Estadual de Londrina, como 
requisito parcial à obtenção do título de 
Bacharel em Química. 
 
Orientadora: Prof. Dra. Suzana Lucy Nixdorf. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Londrina 
2021 
 
DANIELI PAULANI ALVES 
 
 
 
 
UMA REVISÃO BIBLIOGRÁFICA SOBRE O 
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO PARA 
DETERMINAÇÃO DE FUNGICIDAS EM MAÇÃ 
EMPREGANDO CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA 
EFICIÊNCIA 
 
 
 
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado 
ao Departamento de Química da Universidade 
Estadual de Londrina, como requisito parcial à 
obtenção do título de Bacharel em Química. 
 
 
 
BANCA EXAMINADORA 
 
 
 
____________________________________ 
Orientadora: Prof. Dra. Suzana Lucy Nixdorf 
Universidade Estadual de Londrina - UEL 
 
 
 
____________________________________ 
Prof. Dra. Alessandra Maffei Monteiro 
Universidade Estadual de Londrina - UEL 
 
 
 
____________________________________ 
Prof. Dra. Maria Luiza Zeraik 
Universidade Estadual de Londrina – UEL 
 
 
 
 Londrina, 18 de Junho de 2021. 
 
AGRADECIMENTOS 
 
Agradeço primeiramente a Deus, pelo dom da vida, por ser a minha 
força e meu escudo em todos os momentos, pois sem a sua graça eu não seria capaz 
de alcaçar a conclusão deste curso. 
Agradeço à minha família, por serem meu pilar, pela oportunidade que 
sempre me deram de estudar e, por estarem ao meu lado e me fazer aceditar que eu 
tinha a força e as ferramentas necesárias para chegar até aqui. 
 Agradeço a Universidade Estadual de Londrina, por ter me 
proporcionado a estrutura necessária para que eu pudesse crescer academicamente 
e pessoalmente. 
Agradeço a todo corpo docente que contribuiram para a minha 
formação e, em especial, a minha orientadora prof.ª Drª. Suzana Lucy Nixdorf por todo 
incentivo e apoio tão importante, pois sem a sua ajuda e ensino, nada disso seria 
possível. 
Agradeço aos meus amigos, por terem sido fundamentais ao longo de 
toda a minha caminhada, dando incentivo e apoio em todos os momentos de 
dificuldades. 
Por fim, agradeço todas as pessoas que, de alguma forma, foram 
essenciais para que eu alcançasse este objetivo com o qual sempre sonhei. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“O homem não teria alcançado o possível se, 
repetidas vezes, não tivesse tentado o 
impossível” 
(Max Weber) 
 
ALVES, Danieli Paulani. Uma revisão bibliográfica sobre o Desenvolvimento e 
validação de método para determinação de fungicida em maçã empregando 
cromatografia líquida de alta eficiência. 59 f. Trabalho de Conclusão de Curso 
(Graduação em Química) – Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2021. 
 
 
RESUMO 
 
 
Os defensivos agrícolas, conhecidos como agrotóxicos ou pesticidas, têm sido 
aplicados em grande escala no mundo inteiro, e principalmente no Brasil, País 
predominantemente agrícola. Essas substâncias aumentam a produtividade agrícola, 
porém seus resíduos podem acarretar riscos à saúde humana. Portanto, a 
determinação confiável dos resíduos de pesticidas, normalmente presentes em 
matrizes complexas em baixas concentrações, depende de métodos analíticos 
validados, que englobem técnicas desde o preparo de amostra até sua detecção 
seletiva e sensível. Desta forma, este trabalho objetiva buscar subsídios teóricos para 
o desenvolvimento e validação de um novo método para quantificar carbendazim e 
tebuconazol, dois fungicidas aplicados no cultivo de maçã, feita por meio da 
cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao detector ultravioleta (HPLC-UV). 
Para avaliar os resultados encontrados na Revisão Bibliográfica realizada, recorreu-
se à literatura a fim de buscar conceitos fundamentais para alicerçar: o preparo de 
amostras empregando SPE e a microextração QuEChERS, assim como, os 
parâmetros e figuras de mérito, aplicados para a determinação e validação de um 
método analítico cromatográfico. Esse embasamento teórico aliado às condições 
analíticas da Pesquisa que empregou QuEChERS e cromatografia líquida acoplada a 
espectrometria de massas (HPLC-MS) com a adequada sensibilidade na 
quantificação dos resíduos de carbendazim e tebuconazol na maçã Gala, auxiliará no 
desenvolvimento futuro do método proposto. A análise aplicando UV para a 
determinação dos resíduos destes fungicidas na maçã brasileira ainda não está 
descrita na literatura. Desta maneira, a geração de alternativas que propiciem o 
monitoramento da qualidade visa contribuir, para que o consumidor usufrua dos 
benéficos dos bioativos da fruta, sem contudo, sofrer com os malefícios advindos dos 
resíduos de agrotóxicos. 
 
Palavras-chave: Fungicidas, QuEChERS, SPE, HPLC, maçã. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ALVES, Danieli Paulani. A literature review on the development and validation of 
a method for fungicide determination in apple using high performance liquid 
chromatography. 59 p. Undergraduate Work for Course Conclusion (Bachelor in 
Chemistry) – State University of Londrina, Londrina, 2021. 
 
ABSTRACT 
Agricultural defensives, known as pesticides, have been applied on a large scale 
worldwide, mainly in Brazil, where agriculture is dominant. These substances increase 
agricultural productivity, but their residues can represent risks to the human health. 
Therefore, the reliable determination of pesticide residues, normally present in 
complex matrices at low concentrations, depends on validated analytical methods, 
which encompass techniques from sample preparation to its selective and sensitive 
detection. Thus, this work aims to seek theoretical support for the development and 
validation of a new method to quantify carbendazim and tebuconazole, two fungicides 
applied in apple cultivation, made by high performance liquid chromatography coupled 
to an ultraviolet detector (HPLC-UV). To evaluate the results found in the bibliographic 
review carried out, the literature was used in order to search for fundamental concepts 
based upon the preparation of samples using SPE and QuEChERS microextraction, 
as well as for parameters and figures of merit, applied in the determination and 
validation of a chromatographic analytical method. This theoretical basis combined 
with the analytical conditions from the research using QuEChERS and liquid 
chromatography coupled to mass spectrometry (HPLC-MS) with adequate sensitivity 
quantitation residues of carbendazim and tebuconazole in Gala apple, will help in the 
future development of the proposed method. The analysis using UV to determine the 
residues of these fungicides in Brazilian apple is not yet described in the literature. In 
this way, the generation of alternatives that provide quality monitoring aims to 
contribute with the benefits of the fruit's bioactive consumption, without, however, 
promoting harm arising by the pesticide residues. 
 
Key words: Fungicides, QuEChERS, SPE, HPLC, apple. 
 
 
 
 
 
LISTA DE ILUSTRAÇÕES 
 
 FIGURA 1 – PRINCIPAIS ESTADOS BRASILEIROS PRODUTORES DE MAÇÃ ......................... 14 
Figura 2 – Distribuição espacial da produção mundial dos países por produção de 
maçã ...................................................................................................................... 15 
Figura 3 – Fórmula estrutural do Carbendazim ..................................................... 18 
Figura4 – Fórmula estrutural do Tebuconazol ..................................................... 19 
Figura 5 - Diagrama ilustrativo das principais partes de um cromatógrafo à líquido
 ............................................................................................................................... 23 
Figura 6 – Esquema da análise por espectrometria de massas ........................... 26 
Figura 7 - Componentes básicos de um espectrômetro de massas ..................... 26 
Figura 8 – Diagrama ilustrativo de um cromatógrafo a gás (GC-MS) ................... 28 
Figura 9 - Etapas da técnica de extração em fase sólida (SPE) ........................... 33 
Figura 10 - Esquema do procedimento geral do método QuEChERS .................. 36 
Figura 11- Etapas a serem realizadas para se fazer uma análise química ........... 46 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
 
Tabela 1 – Os treze maiores países produtores de maçã .......................................... 16 
Tabela 2- Tipos de pesticidas e seus organismos alvo .............................................. 17 
Tabela 3 - Propriedades físico-químicas do Carbendazim ......................................... 18 
Tabela 4 - Propriedades físico-químicas do Tebuconazol ......................................... 19 
Tabela 5 - Limites máximos tolerados no Brasil para alguns fungicidas ................. 20 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE EQUAÇÕES 
 
Equação 1 – Equação da reta que descreve a curva analítica ................................. 39 
Equação 2 – Equação do desvio padrão absoluto ...................................................... 41 
Equação 3 – Equação do desvio padrão relativo ........................................................ 41 
Equação 4 – Equação da recuperação da análise ...................................................... 43 
Equação 5 – Equação do limite de detecção ............................................................... 44 
Equação 6 – Equação do limite de quantificação ........................................................ 45 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 
 
ABPM Associação Brasileira de Produtores de Maçã 
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária 
AOAC Association of Official Analytical Chemists 
API Ionização a pressão atmosférica 
BSTFA N, O-bistrifluoroacetamida 
CG Cromatografia Gasosa 
CG-MS Cromatografia Gasosa Acoplada ao Espectrômetro de Massa 
CLAE Cromatografia Liquida de Alta Eficiência 
CODEX Registro 
CV Coeficiente de variação 
C18 Sílica-octadecil 
d-SPE Extração em fase sólida dispersiva 
FAO Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação 
GARP Associação Grupo de Analistas de Resíduos de Pesticidas 
GCB Carbono grafitizado 
HPLC Cromatografia Líquida de Alta Performance 
HPLC-UV Cromatografia líquida de alta eficiência acoplado ao ultravioleta 
ICH Conferência Internacional sobre Harmonização de Requisitos Técnicos 
 para Registro de Produtos Farmacêuticos para Uso Humano 
INMETRO Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia 
LC-MS Cromatografia Líquida Acoplada ao Espectrômetro de Massa 
LD Limite de Detecção 
LDI Limite de Detecção do Instrumento 
LDM Limite de Detecção do Método 
LLE Extração líquido-líquido 
LQ Limite de quantificação 
LQI Limite de Quantificação do Instrumento 
LQM Limite de Quantificação do Método 
LMT Limites máximos tolerados 
MS Massas 
OMS Organização Mundial da Saúde 
P.A. Puro para Análise 
 
PSA Amina primária e secundária 
QuEChERS Abreviatura que corresponde a um método rápido, fácil, barato, eficaz, 
 robusto e seguro 
RSD Desvio Padrão Relativo 
s Desvio Padrão Absoluto 
SPE Extração em fase sólida 
TR Tempo de Retenção 
UV-VIS Ultravioleta-Visível 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 14 
1.1 Produção de maçã no Brasil e no mundo .................................................... 14 
1.2 Fungicidas .................................................................................................... 16 
1.3 Fungicidas de estudo ................................................................................... 17 
1.4 Legislação ........................................................................................................ 20 
1.5 História da Cromatografia ................................................................................ 21 
1.6 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ......................................................... 22 
1.7 Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas ........................ 25 
1.8 Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas ....................... 27 
1.9 Extração em fase sólida ................................................................................... 29 
1.10 QuEChERS .................................................................................................... 30 
 
2 OBJETIVO ............................................................................................................. 32 
 
3 METODOLOGIA .................................................................................................... 33 
3.1 Revisão bibliográfica dos procedimentos gerais de preparação de amostras 
utilizando SPE ....................................................................................................... 33 
3.1.1 Modo de “retenção do(s) analito(s) ........................................................ 34 
3.1.2 Modo de retenção dos interferentes .......................................................... 34 
3.1.3 Seleção do solvente .................................................................................. 35 
3.2 Revisão bibliográfica dos procedimentos gerais de preparação de 
microextração utilizando QuEChERS. ................................................................... 35 
3.3 Revisão bibliográfica dos parâmetros de desempenho analítico ..................... 38 
3.4 Justificativa da dissertação escolhida para a revisão bibliográfica .................. 45 
3.4.1 Materiais ................................................................................................ 46 
3.4.3 Preparo das soluções estoque .................................................................. 47 
3.4.4 Método analítico para a determinação de carbendazim e tebuconazol . 47 
 
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................ 51 
 
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 52 
ANEXO I - DESENVOLVIMENTO DE UMA METODOLOGIA PARA À QUANTIFICAÇÃO DE 
FUNGICIDAS EM MAÇÃS, EMPREGANDO QUECHERS, EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPE) E 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (HPLC-UV). .......................................... 57 
 
 14 
1 INTRODUÇÃO 
O uso de pesticidas, incluindo fungicidas, herbicidas e inseticidas, ainda é a 
principal estratégia para o combate e a prevenção de pragas agrícolas, buscando 
maior produtividade com menor custo. Depois da Segunda Guerra Mundial, com o 
desenvolvimento tecnológico e industrial ocorrido no século XX, houve o crescimento 
da produção dos pesticidas. A partir de 1960 a intensificação da exploração agrícola 
e pecuária conduziu aoaumento na sua produção e utilização no combate a pragas 
de lavoura (ECOBICHON, 1996). 
 
1.1 Produção de maçã no Brasil e no mundo 
 
O Brasil tornou-se um grande produtor de maçãs desde a metade dos anos 70, 
sendo os principais estados responsáveis por grande quantidade da produção: Santa 
Catarina, Rio Grande do Sul, São Paulo e Paraná, como mostra a Figura 1. 
Figura 1 – Principais estados brasileiros produtores de maçã 
 
Fonte: Cadeias Produtivas do Estado de Santa Catarina, 2019. 
 
 15 
Os dois maiores estados produtores brasileiros representam mais de 95% da 
produção total, sendo que Santa Catarina é responsável por cerca de 59% da 
produção nacional, enquanto o Rio Grande do Sul responde por outros 35% (BONETI, 
J. I. et al, 2006). 
De acordo com a Associação Brasileira de Produtores de Maçã (ABPM), de 
importador, o País passou a abastecer não apenas o consumo interno, como também 
a exportar 15% de sua colheita para mais de 40 países. Ainda segundo a ABPM, 
dados da Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (FAO) 
apontam o Brasil entre os 13 maiores produtores de maçã do mundo, como mostra a 
Figura 2. 
Figura 2 – Distribuição espacial da produção mundial dos países por produção de 
maçã 
 
Fonte: AtlasBig.com, 2020. 
Em todo o mundo são produzidas 89.565.973 toneladas de maçã por ano. A 
China é o maior produtor de maçã do mundo, com 44.448.575 toneladas de volume 
de produção por ano. Os Estados Unidos da América estão em segundo lugar, com 
4.649.323 toneladas de produção anual. A China e Estados Unidos da América 
produzem juntos mais de 50% do total mundial e, o Brasil produz 1.049.251 toneladas 
por ano, e está em décimo terceiro lugar, como mostra a Tabela 1. 
 16 
Tabela 1 – Os treze maiores países produtores de maçã 
 
País Produção 
(toneladas) 
Produção por 
pessoa (Kg) 
Área cultivada 
(hectare) 
Rendimento 
(kg/hectare) 
China 44 448 575 31,889 2 383 905 18 645,3 
EUA 4 649 323 14,185 130 552 35 612,8 
Polónia 3 604 271 93,779 177 203 20 339,8 
Turquia 2 925 828 36,206 173 394 16 873,9 
Índia 2 872 000 2,149 314 000 9 146,5 
Irão 2 799 197 34,238 238 638 11 729,9 
Itália 2 455 616 40,631 56 164 43 722,2 
Rússia 1 843 544 12,552 214 270 8 603,8 
França 1 819 762 27,041 49 618 36 675,4 
Chile 1 759 421 100,115 36 063 48 787,1 
Uzbequistão 1 120 209 34,306 101 726 11 012 
Ucrânia 1 099 240 26,009 91 600 12 000,4 
Brasil 1 049 251 5,008 33 981 30 877,6 
Fonte: AtlasBig.com, 2020. 
 
1.2 Fungicidas 
 
A história dos fungicidas foi dividida em quatro eras distintas, na qual em cada 
uma, houve predominância de um grupo sobre outro. Fungicidas são produtos 
químicos capazes de prevenir infecções de tecidos de plantas vivas, por fungos 
fitopatogênicos (AZEVEDO, 1993). Atualmente o conceito mais abrangente diz que 
fungicidas são compostos químicos empregados no controle de doenças causadas 
por fungos, bactérias e algas. Em alguns casos esses compostos químicos não matam 
os fungos, apenas inibem, temporariamente, a germinação dos esporos. O fenômeno 
de inibição temporária da germinação ou de crescimento fúngico é denominado 
"Fungistase" e os produtos com essas propriedades são "Fungistáticos". Em outros 
casos, os compostos químicos de ação fungitóxica, que inibem ou previnem a 
produção de esporos, sem afetar o crescimento vegetativo do micélio do fungo. 
 Fungicidas deste tipo são denominados "Anti-esporulantes". Cada produto 
fungicida é constituído por duas partes distintas: o ingrediente ou princípio ativo, que 
é responsável pela ação do produto, e o ingrediente inerte, que serve de veículo e 
 17 
diluente para o ingrediente ativo (AZEVEDO, 1987). Os fungicidas, pertencem a uma 
classe dos pesticidas (substâncias ou misturas que têm, como objetivo, impedir, 
destruir, repelir ou mitigar qualquer praga) e, de acordo com o organismo que se 
deseja eliminar ou controlar e, recebem uma denominação específica como pode se 
observar na Tabela 2. 
Tabela 2- Tipos de pesticidas e seus organismos alvo 
 
Tipo de pesticida Organismo alvo 
Inseticida Insetos 
Fungicida Fungos 
Herbicida Plantas 
Acaricida Ácaros 
Larvicida Larvas de insetos 
Bactericida Bactérias 
Nematicida Nematóides 
Raticida Roedores 
Algicida Algas 
Avicida Aves 
Moluscicida Caracóis, lesmas 
Nematicida Nematóides 
Cupicida Cupins 
Piscicida Peixes 
Fonte: Baird, C., Química Ambiental, 2011. 
 
1.3 Fungicidas de estudo 
 
Buscando maior produtividade por menor custo, vários defensivos agrícolas 
têm sido empregados. Foram selecionados para essa revisão, dois fungicidas: 
carbendazim e tebuconazol. Ambos estão relacionados na lista de agrotóxicos 
registrados para o cultivo da maçã no Brasil. 
 
1.3.1 Carbendazim 
 
O carbendazim constitui o ingrediente ativo mais utilizado do grupo dos 
fungicidas benzimidazóis (BOUDINA et al., 2003) contra grande variedade de 
 18 
doenças, como as causadas pelos fungos Ascomicetos spp., Basidiomicetos e 
Deuteromicetos spp., em culturas de frutas e vegetais (HUTSON e JEWESS, 1999). 
É um fungicida sistêmico, com ação preventiva e curativa, indicado no 
tratamento de doenças da parte aérea nas culturas de citros, feijão, soja e trigo, e no 
tratamento de sementes de algodão e soja. Sua intoxicação em humanos, ocasiona 
alterações respiratórias, náusea, vômito, diarreia, irritações nos olhos e pele 
(dermatite, coceira, vermelhidão, inchaço e ressecamento). Em animais estudos com 
animais após exposição subcrônica/crônica foi observada toxicidade hepática. A 
tireóide também é um órgão-alvo para este fungicida (MAPA, 2007). 
A fórmula estrutural do carbendazim está representada na Figura 3 e, na Tabela 
3 encontram-se suas propriedades físico-químicas. 
Figura 3 – Fórmula estrutural do Carbendazim 
 
Fonte: O próprio autor. 
Tabela 3 - Propriedades físico-químicas do Carbendazim 
 
Nome Metil-2-benzimidazol-carbamato (MBC 
Fórmula molecular C9H9N3O2 
Massa molar (g mol-1) 191,2 
Ponto de fusão (°C) 250 
Densidade (g mL-1) 0,27 
Solubilidade em água a 20°C (mg L-1) 28,0 mg L-1 (pH 4) 
8,0 mg L-1 (pH 7) 
7,0 mg L-1 (pH 8) 
Solubilidade em solventes orgânicos 300 mg L-1 (etanol e acetona) 
100 mg L-1 (clorofórmio) 
36 mg L-1 (benzeno) 
0,5 mg L-1 (hexano) 
Coeficiente de partição octanol/água 1,49 
Fonte: IPCS, 2006. 
 19 
1.3.2 Tebuconazol 
 
Fungicida sistêmico que apresenta um amplo espectro de ação. Pertencente 
ao grupo químico dos triazóis, o tebuconazol é mundialmente utilizado no controle de 
fungos patógenos de frutas, castanhas, cereais e verduras. Seus resíduos podem 
persistir nos frutos e outras partes vegetativas das plantas, tornando seu controle uma 
ação importante afim de garantir a preservação da saúde humana (YOU et al., 2016). 
Sua intoxicação em humanos, ocasiona irritação dermal leve, e não há 
evidência de toxicidade sistêmica. Baseado nos estudos de toxicidade animal do 
ingrediente ativo tebuconazol, pode haver efeitos tóxicos nos seguintes órgãos: baço, 
fígado, adrenal e cristalino dos olhos (MAPA, 2007). A fórmula estrutural do 
tebuconazol está representada na Figura 4 e, na Tabela 4 estão apresentadas suas 
propriedades físico-químicas. 
Figura 4 – Fórmula estrutural do Tebuconazol 
 
Fonte: O próprio autor. 
 
Tabela 4 - Propriedades físico-químicas do Tebuconazol 
 
Nome 1- (4-clorofenil) -4,4-dimetil-3- (1 H -
1,2,4-triazol-1-ilmetil) -3-pentanol 
Fórmula molecular C16H22ClN3O 
Massa molar (g mol-1) 307,8 
Ponto de fusão (°C) 105 
Densidade (g mL-1) 1,25 
Solubilidade em água a 20°C (mg L-1) 36 
Coeficiente de partição octanol/água 3,7 
Fonte: Pesticide Properties DataBase, 2018. 
 
 20 
1.4 Legislação 
 
Os limites máximos estabelecidos pela legislação, visam proteger os 
consumidores dos possíveis efeitos tóxicos que agentes contaminantes como as 
micotoxinas e resíduos de fungicidas podem ocasionar à saúde. A Agência Nacional 
de VigilânciaSanitária (ANVISA) determina através da RDC Nº 7de 18 de fevereiro de 
2011 os limites máximos tolerados (LMT) para fungicidas em alimentos (BRASIL, 
2011). Os limites máximos toleráveis encontram-se na Tabela 5. 
Tabela 5 - Limites máximos tolerados no Brasil para alguns fungicidas 
 
Fungicida LMT (µg mL-1) 
Captan 25,00 
Carbendazim 5,00 
Clorotalonil 1,00 
Epoxiconazol * 
Piraclostrobina 2,00 
Tebuconazol 0,10 
Tetraconazol 0,40 
Trifloxistrobina 0,05 
*Fungicida não autorizado para cultura da maçã. 
 Fonte: ANVISA, 2003. 
 
Uma vez que a economia do Brasil se baseia em grande parte na produção 
agrícola, o país é o quarto mercado de pesticidas mundial. O uso amplamente 
difundido de pesticidas pode resultar na presença de resíduos em alimentos, água e 
meio ambiente (CALDAS, SOUZA, 2000; PRESIBELLA, 2004). Sendo potencialmente 
tóxicos ao homem, a utilização de agrotóxicos no processo de produção agrícola e a 
consequente contaminação dos alimentos têm sido alvo de constante preocupação 
no âmbito da saúde pública (ANVISA, 2003). 
A qualidade do alimento reflete na saúde e qualidade de vida do indivíduo. A 
garantia de alimento livre de contaminantes é essencial para a prevenção de doenças, 
principalmente nos países em desenvolvimento, como o Brasil, onde parte da 
população enfrenta problemas de carência nutricional e de acesso ao sistema público 
de saúde (CALDAS, SOUZA, 2000). Segundo a Organização Mundial de Saúde 
(OMS), a cada ano ocorrem de 30 mil a 40 mil mortes devido a intoxicações por 
 21 
agrotóxicos. A exposição de pessoas aos agrotóxicos pode ser atribuída ao consumo 
de alimentos oriundos da produção agropecuária ou ao contato direto, no caso dos 
aplicadores rurais e ou manipuladores (ANVISA, 2003). 
Para a análise e monitoramento dos pesticidas em frutas, em que baixos limites 
de detecção são exigidos, na ordem de µg/L, é de fundamental importância à 
aplicação de técnicas de preparo de amostras para remoção de interferentes com 
instrumentação analítica de alta sensibilidade. 
Para determinar a presença de fungicidas em alimentos, pode-se utilizar a 
técnica: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), Cromatografia Liquida de 
Alta Eficiência acoplada ao Espectrômetro de Massas (LC-MS), Cromatografia 
Gasosa acoplada ao Espectrômetro de Massas (CG-MS), entre outros. 
 
1.5 História da Cromatografia 
 
A cromatografia é uma técnica analítica que teve sua origem no início do século 
XX, mas cuja utilização, ainda que não definida como técnica analítica remonta 
milênios. No ano de 1850, as técnicas de Cromatografia Líquida de Troca Iônica 
aparecem registradas na publicação do “Journal of Royal Agricultural Society” por Way 
através de um trabalho sobre o emprego de trocadores iônicos naturais. Em 1893, a 
Cromatografia foi utilizada como tal, pelo químico inglês Lester Reed, o qual publicou 
um trabalho nos “Procedures of Chemical Society” sobre a separação de sais 
orgânicos e inorgânicos pela passagem de suas soluções através de colunas 
contendo caulim; e pelo químico norte-americano David Talbot Day, que publicou em 
1897 um trabalho relatando suas experiências no que chamava “Difusão Fracionada” 
de amostras de petróleo (HARRIS, 2001). 
A técnica analítica teve seu início no ano de 1930 com a publicação de Tswett 
com o trabalho “Sobre uma nova categoria de fenômenos de adsorção e sua aplicação 
em análises biomédicas” junto à Sociedade de Ciências Naturais de Varsóvia. Os 
primeiros trocadores iônicos sintéticos datam de 1935 através dos trabalhos de Adams 
& Holmes no Departamento de Pesquisas Científicas e Industriais do Reino Unido. O 
ano de 1941 marca o início dos trabalhos em Cromatografia de Partição com a 
publicação de Martin & Synge sobre a análise de aminoácidos em hidrolisados de 
proteínas. Nesse mesmo ano, surge o primeiro relato formal de experiências de 
Cromatografia em fase gasosa. 
 22 
O trabalho de Eilbrecht & Chakhotin, estudantes da Universidade de Marburgo, 
na Alemanha, separando ácidos graxos pela passagem de seus vapores através de 
colunas contendo sílica gel, impregnado de CO2 como gás de arraste, o qual 
chamaram de “Destilação de Adsorção”, foi publicado por Hesse no “Liebigs Ann. 
Chem. O relato da construção do primeiro cromatógrafo gasoso cabe a Cremer no 
ano de 1950 na Universidade de Innsbuck, Áustria. O primeiro cromatógrafo gás-
líquido para uso em partição foi construído no ano de 1952 no Instituto Nacional de 
Pesquisas Médicas de Londres. A cromatografia de exclusão surge no ano de 1959 
com a publicação, por Porath & Flodin, na revista “Nature”, de um trabalho relatando 
a síntese de um gel de dextranas com ligações cruzadas (HARRIS, 2001). 
 
1.6 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 
 
Diferentemente da cromatografia gasosa, na qual todos os itens do 
cromatógrafo estão contidos em uma caixa “selada”, na cromatografia líquida, os 
equipamentos são, frequentemente, modulares. Assim, geralmente, é possível 
intercambiar um módulo de um equipamento (um detector, por exemplo) de uma 
marca por um equivalente de outra marca, o que permite que os equipamentos sejam 
montados com módulos provenientes de diferentes fabricantes, de acordo com o 
interesse do usuário. Isso permite ao usuário configurar um cromatógrafo líquido de 
acordo com as suas necessidades e preferências, e não de acordo com modelos 
rígidos preestabelecidos (LANÇAS, 2009). 
A Figura 5 ilustra um diagrama esquemático de um cromatógrafo à líquido de 
alta eficiência (CLAE do inglês HPLC – High performance liquid chromatography). O 
solvente, também denominado eluente ou fase móvel, acondicionado em um frasco 
apropriado, é impulsionado, ou aspirado, por uma bomba de alta pressão em direção 
à coluna. No caminho, a amostra é introduzida na fase móvel, por uma válvula de 
introdução de amostra (ou válvula de injeção) e arrastada para a coluna, na qual 
ocorre a separação. O efluente da coluna é direcionado para um detector, que acusa 
a presença dos analitos eluídos da mesma. O sinal gerado pelo detector é captado 
por um software apropriado, tratado no computador, e um cromatograma é gerado, 
mostrando a variação do sinal do detector em função do tempo de análise (SNYDER 
et.al; 2009). 
 
 23 
Figura 5 - Diagrama ilustrativo das principais partes de um cromatógrafo à líquido 
 
Fonte: SNYDER et.al; 2009 
 
As técnicas cromatográficas de análise estão entre as principais técnicas de 
separação, especialmente na análise de substâncias presentes em matrizes 
complexas, tais como fluidos biológicos, produtos naturais, sedimentos de rio e outras. 
Isto se deve, principalmente, à sua capacidade de separação dos componentes 
presentes nas misturas em função da eficiência e do poder de resolução das colunas 
modernas (COLLINS, 2009). 
A cromatografia líquida foi definida na primeira década do século passado, 
pelos trabalhos do botânico russo, Mikhail S. Tswett. Seus estudos eram focalizados 
na separação de pigmentos em uma coluna empacotada com partículas, pigmentos 
estes extraídos de plantas usando solventes (COLLINS, 2009). Geralmente, atribui-
se a Csaba Horváth ao redor de 1970 a proposta da sigla HPLC (inicialmente 
significando “High Pressure Liquid Chromatography” e, posteriormente, com a 
evolução da técnica, “High Performance Liquid Chromatography”). 
Na cromatografia líquida moderna (HPLC ou CLAE), o uso de detectores como 
Índice de Refração, Ultravioleta, Espalhamento de luz, Fluorescência e outros, aliados 
a softwares dedicados, permitem a análise quantitativa dos componentes das misturas 
em concentrações extremamente baixas (KENKEL, 2002). 
Apesar de tais características, a utilidade desta técnica para identificação é 
bastante limitada (LANÇAS, 2009). Mesmo com a diversificação da seletividade dos 
ligantes utilizado nas colunas de diferentes polaridades, desenvolvimento de sistemas 
 24 
de índices de retençãoe outros artifícios, a análise qualitativa está sujeita a muitos 
erros, se utilizarmos apenas os tempos de retenção na identificação dos analitos. 
Apesar do tempo de retenção ser característico para um determinado 
composto, ele não é único, e vários compostos podem ter o mesmo tempo de retenção 
dependendo das condições cromatográficas empregadas (LANÇAS, 1993). Desta 
forma, pode haver coeluição de vários compostos, não estando o pico puro, e a 
atribuição na identificação como apenas um dos compostos pode ocorrer de maneira 
equivocada. A forma proposta para solucionar este problema, foi em se utilizar um 
detector fotométrico operando nas regiões ultravioleta e visível (UV-VIS) do espectro, 
no qual dois comprimentos de onda distintos eram monitorados (usualmente 220 nm 
e 254 nm). 
A razão entre o sinal obtido com um padrão analítico para os dois comprimentos 
de onda (A220/A254) deveria ser a mesma que a obtida para analito. Certamente, um 
grande inconveniente neste caso é a necessidade de conhecer-se o composto a ser 
identificado (ou, pelo menos, ter uma ideia de sua identidade) visando preparar uma 
solução do suposto padrão do composto, analisada pelo mesmo método sob as 
mesmas condições a fim de compará-lo com o composto-alvo (LENDIA, 2005). 
O desenvolvimento dos detectores UV-VIS de comprimento de onda variável, 
baseados nos espectrofotômetros ao invés dos fotômetros, permitiu a obtenção dos 
espectros completos de um pico cromatográfico nesta região espectral (LENDIA, 
2005). Apesar de um avanço em relação ao equipamento anterior, os espectros 
obtidos para uma grande quantidade de picos presentes em amostras complexas 
eram de pouco auxílio, devido à falta de especificidade dos mesmos e a similaridade 
entre vários dos compostos em análise. 
O desenvolvimento dos detectores baseados em arranjos de diodos 
(“Photodiode Array” - PDA) adicionou mais uma facilidade, levando em conta o uso de 
vários diodos para adquirir e armazenar dados de uma faixa espectral. 
Adicionalmente, o desenvolvimento de computadores rápidos, com boa memória e 
com custos compatíveis permitiram a geração de espectros tridimensionais, que 
conjuntamente com o uso de softwares apropriados possibilitam a determinação 
automática da pureza de picos cromatográficos. Apesar do grande avanço em relação 
 25 
à situação existente no início do desenvolvimento da técnica, a identificação dos picos 
cromatográficos ainda na era possível na maioria dos casos. Contudo, o 
desenvolvimento de novas ferramentas permitiu uma melhora no acoplamento entre 
a cromatografia líquida e a espectrometria de massas (LC-MS) (NIESSEN, 2006). 
 
1.7 Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas 
 
J.J. Thomson em 1907, construiu o primeiro espectroscópio de massas, no qual 
se obtinha imagens com forma parabólica. O instrumento foi usado na realização do 
seu trabalho sobre a análise de raios positivos (MASTER, 2005). Este pesquisador foi 
agraciado com o Prêmio Nobel em física em 1906 por ter descoberto o elétron em 
1898. Um dos seus alunos, F.W. Aston, utilizou a nova tecnologia de espectrometria 
de massas na descoberta de que muitos elementos são encontrados naturalmente 
como isótopos estáveis, por esse trabalho ele também ganhou o Prêmio Nobel em 
química em 1922 (MASTER, 2005). 
A espectrometria de massas (MS – Mass Spectrometry) é uma técnica 
microanalítica utilizada para obter informação sobre a massa molecular e sobre 
características estruturais da amostra, sendo uma das mais importantes ferramentas 
analíticas disponíveis aos cientistas. Essa é capaz de fornecer informação sobre: a 
composição elementar de amostras; a estrutura molecular; a composição qualitativa 
e quantitativa de misturas complexas; a estrutura e a composição de superfícies 
sólidas e as proporções isotópicas de átomos em amostras (EDMOND, 2007). 
 Nesta técnica, alguma forma de energia é transferida à amostra para causar a 
sua ionização. O requisito básico para uma análise por espectrometria de massas é a 
formação de íons livres em fase gasosa. A utilidade do método é ditada pelo processo 
de ionização. A aparência do espectro de massas de uma espécie molecular é 
altamente dependente do método de ionização usado. Os agentes ionizantes 
empregados, podem ser distribuídos em duas categorias: as que requerem a amostra 
em fase gasosa e os agentes que provocam a dessorção nas amostras sólidas ou 
liquidas (GROSS, 2004). 
Um resumo do processo integral da análise pela espectrometria de massas 
clássica está ilustrado na Figura 6, em que um espectro de massas típico 
frequentemente encontrado na literatura, no qual M representa as moléculas de um 
 26 
composto puro na fase gasosa. Após um processo de ionização o M+ se decompõe, 
criando íons de massas menores que aparecem no espectro de massas. 
Figura 6 – Esquema da análise por espectrometria de massas 
 
Fonte: WATER, 2008. 
 
A Figura 7, mostra um diagrama de blocos dos componentes principais de um 
espectrômetro de massas. Como pode ser observado na Figura 8, são três os 
componentes principais: uma fonte de íons, o analisador de massa e o detector. Na 
fonte de íons, os componentes de uma amostra são convertidos em íons pela ação 
de um agente ionizante. Os íons positivos ou negativos são imediatamente acelerados 
em direção ao analisador de massa. A função do analisador de massa é separar tais 
íons de acordo com a sua relação massa-carga (m/z). Os espectrômetros de massas 
podem ser classificados em várias categorias dependendo da natureza do analisador 
de massa. Finalmente um detector recebe os íons que foram separados pelo 
analisador, transformando a corrente de íons em sinais elétricos que são processados, 
armazenados na memória de um computador e mostrados em uma tela. 
Figura 7 - Componentes básicos de um espectrômetro de massas 
 
Fonte: EDMOND, 2007. 
 27 
Mesmo sendo um instrumento de detecção muito sofisticado, o HPLC é útil para 
remover as interferências da amostra, as quais iriam influenciar a ionização, pela 
supressão iônica. O desafio neste equipamento é eliminar o solvente, mantendo o 
nível de vácuo adequado no espectrômetro de massas, para que os íons gerados 
possam ser mantidos fase gasosa, função esta realizada pela interface, que transfere 
os íons para o sistema do espectrômetro de massas. 
A maioria dos instrumentos recorre a uma técnica de ionização a pressão 
atmosférica (API), em que a eliminação do solvente e as etapas de ionização ocorrem 
na fonte a pressão atmosférica. O espectrômetro de massas é o instrumento destinado 
a separar os íons em fase gasosa atendendo à sua razão massa carga (m/z). Por sua 
vez, o analisador é a peça principal deste equipamento, que utiliza os campos elétrico 
ou magnético, ou uma combinação de ambos, para deslocar os íons da região em que 
são produzidos até o detector, que amplifica o sinal. O analisador funciona sob vácuo, 
de modo a que os íons possam deslocar-se para o detector com rendimento suficiente 
(WATER, 2008). 
Com o desenvolvimento de interfaces de ionização à pressão atmosférica, mais 
aplicações em LC-MS foram surgindo, ampliando a utilização pela monitorização de 
compostos mais polares. Na atualidade o LC-MS é a técnica mais utilizada para a 
detecção e determinação de pesticidas (KUSTER et al., 2006). 
 
1.8 Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas 
 
A cromatografia a gás é definida como um método físico-químico de separação 
dos componentes de uma mistura. Nela, ocorre a distribuição entre duas fases, que 
estão em contato direto – a fase estacionária contida na coluna cromatográfica e a 
fase móvel denominada de gás de arraste, que a percorre, contendo os analitos a 
serem separados. Durante a passagem da fase móvel sobre a estacionária, os 
componentes do analito são distribuídos e retidos na fase estacionária conforme a sua 
afinidade físico-química, sendologo eluídos seletivamente em direção ao analisador, 
resultando em migrações diferenciais para cada analito, que são dados pelo Tempo 
de Retenção (TR), medido em minutos (ATKINS, 2013). 
As principais partes de um cromatógrafo a gás (Figura 8) são: o injetor, a coluna 
e o detector, que neste caso é o MS. A amostra, contendo os analitos, que pode ser 
líquida, gasosa ou sólida é introduzida no injetor. O uso de temperatura no sistema 
 28 
de injeção favorece a vaporização das amostras líquidas ou sólidas, sendo as 
amostras gasosas introduzidas diretamente. Os analitos no estado gasoso são 
carregados pelo gás de arrastre para a coluna. A coluna é constituída por um capilar 
de sílica fundida com diâmetro interno na ordem de 0,1 mm, contendo a fase 
estacionária ligada à sua parede interna podendo ser polar ou apolar, de acordo 
afinidade dos analitos. A coluna fica condicionada num forno resistivo programável. A 
programação da temperatura na coluna contribui para separação dos analitos devido 
as suas características, tais como, volatilidade, ponto de ebulição, massa molecular e 
estabilidade térmica. Cada espécie separada apresentará diferentes tempos de 
retenção, que após passarem pela coluna seguem para o detector (SASSINE et al; 
2004). 
Figura 8 – Diagrama ilustrativo de um cromatógrafo a gás (GC-MS) 
 
Fonte: Redígolo, 2020. 
 
O GC da Figura 8 é constituído de dois compartimentos separados: um contém 
o cromatógrafo a gás e outro o espectrômetro de massas (MS). O GC é composto por: 
injetor da amostra, coluna cromatográfica e forno resistivo programável. O MS está 
formado por: fonte de íons, analisador de massas quadrupolar e detector de íons. O 
 29 
MS funciona sob alto vácuo, obtido por meio de bomba turbomolecular e bomba 
mecânica de pré-vácuo. 
O CG-MS é um método rápido que fornece informações valiosas sobre a 
análise de produtos naturais usado para analisar misturas orgânicas e bioquímicas 
complexas, pesticidas e compostos orgânicos voláteis e semivoláteis no meio 
ambiente. A principal desvantagem do uso do GC-MS na sua incapacidade em 
analisar compostos não voláteis, polares ou termicamente lábeis, sendo necessária a 
derivatização para aumentar a volatilidade e a estabilidade térmica desses compostos 
(REDÍGOLO, 2020). 
O uso de um sistema de HPLC em conjunto com a realização de técnicas de 
preparo de amostra, como extração líquido-líquido (LLE - liquid-liquid extraction) 
(BARCELÓ, 1992), extração em fase sólida (SPE - solid phase extraction) 
(BALINOVA, 1993; SCHÜLEIN, 1995) e, a extração de multirresíduos QuEChERS, 
são escolhas mais comuns para análise de agrotóxicos em alimentos. 
 
1.9 Extração em fase sólida 
 
A extração em fase sólida (SPE, solid phase extraction) se tornou um dos 
principais métodos de extração de solutos de amostras líquidas nas últimas décadas 
(LANÇAS, 2007). Dentre os principais atrativos da SPE podem ser destacados o alto 
fator de concentração dos solutos, a possibilidade de realização de inúmeras 
extrações simultâneas e a redução do uso de solventes orgânicos, comparada a 
técnicas de extração com solventes (EIROA, 2016). Amostras ambientais que 
apresentam concentrações de contaminantes em níveis traço estão entre as principais 
aplicações da SPE (LINDSEY, 2001). Mesmo com a existência de técnicas altamente 
sofisticadas, os níveis de concentração (HUO, 2012) de contaminantes orgânicos em 
amostras de águas superficiais ou subterrâneas normalmente se encontram abaixo 
dos limites de detecção destas técnicas, tornando-se necessária a pré-concentração 
dos compostos, além de seus isolamentos da matriz da amostra antes de efetuar a 
medida analítica (EIROA, 2016). 
A técnica de extração em fase sólida (SPE) é baseada nos mecanismos de 
separação da cromatografia líquida de baixa pressão e é usualmente empregada com 
o propósito de isolar analitos presentes em uma matriz complexa (LANÇAS, 2004). 
Para o isolamento e pré-concentração de agrotóxicos, a amostra aquosa é percolada 
 30 
por um cartucho contendo o sorvente, onde os analitos são retidos para posterior 
eluição com uma pequena quantidade de solvente orgânico adequado (RIAL-OTERO 
et al., 2007). 
 
1.10 QuEChERS 
 
Para a determinação de pesticidas, algumas técnicas de limpeza e pré-
concentração da amostra são amplamente utilizadas. O método QuEChERS (do 
inglês, Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe – Rápido, simples, econômico, 
efetivo, robusto e seguro) o qual foi proposto por Anastassiades et al. (2003), tem sido 
amplamente difundido na determinação de resíduos de agrotóxicos em alimentos. 
Esta técnica, tem sido bastante utilizada na atualidade, visando a extração de 
multirresíduos de agrotóxicos em produtos agrícolas e, baseia-se na extração com 
acetonitrila dos compostos presentes no alimento, otimizada pela adição de sais 
anidros. Uma etapa de limpeza (do inglês clean-up), envolvendo um método de 
extração em fase sólida dispersiva (d-SPE) auxilia na remoção de interferentes de 
matriz. O método QuEChERS, tem se mostrado eficiente para isolar analitos de 
pesticidas de matrizes alimentares, e seu uso conjunto com técnicas cromatográficas 
tem permitido a determinação destes compostos mesmo em baixas concentrações. 
Além disso, essa é uma técnica de preparo de amostra que busca a miniaturização, 
ou seja, a redução no consumo de solventes, na geração de resíduos, no tempo de 
análise e, consequentemente, promove a diminuição no custo da análise e menor 
manipulação da amostra. (JIANG, Y. et al, 2009) 
Considerando os possíveis benefícios à saúde, as frutas têm sido consumidas 
por grande parte da população, o que torna necessário o desenvolvimento de métodos 
que sejam capazes de determinar a concentração dos resíduos de pesticidas, a fim 
de atestar a qualidade do produto. Contudo, a maioria dos métodos atuais destinados 
à análise de frutas empregam equipamentos de alto valor, como o LC-MS e o GC-MS, 
que nem sempre estão disponíveis nos laboratórios. (RODRIGUES et al., 2011) 
A técnica de HPLC foi selecionada neste trabalho de revisão bibliográfica para 
a análise de pesticidas, considerando-se a possibilidade de se obter uma separação 
eficiente dos compostos, com rapidez, seletividade, sensibilidade e mais baixo custo 
em relação à instrumentação, comparando-se a espectrometria de massas. As 
técnicas de preparo das amostras QuEChERS e SPE foram escolhidas visando o seu 
 31 
potencial em extrair e pré-concentrar os fungicidas em amostras reais que possuem 
baixa detecção. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 32 
2 OBJETIVO 
 Este trabalho objetiva buscar o embasamento na fundamentação teórica dos 
princípios envolvidos, discorrendo sobre técnicas aplicadas de extração (SPE e 
QuEChERS) e cromatográficas (LC-MS e GC-MS), para subsidiar o futuro 
desenvolvimento e validação de um método para quantificar os fungicidas 
carbendazim e tebuconazol aplicados no cultivo de maçã por cromatografia líquida de 
alta eficiência acoplada ao ultravioleta (HPLC-UV). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 33 
3 METODOLOGIA 
 Para avaliar os resultados encontrados na Revisão bibliográfica, fez-se 
necessário buscar na literatura os conceitos fundamentais para a obtenção do preparo 
de amostras utilizando SPE e a microextração QuEChERS e dos parâmetros para a 
determinação e validação de um método analítico. 
 
3.1 Revisão bibliográfica dos procedimentos gerais de preparação de amostras 
utilizando SPE 
 
A utilização da SPE com o objetivo de concentrar a amostra segue o 
procedimento de que, após a passagem de um determinado volume de amostra 
(normalmente elevado), os analitos presentes na amostra em quantidades reduzidas 
vão ficar retidos na fase sólida. Em seguida, os analitos retidos são eluidos utilizando 
um volume reduzido de outro solvente, obtendo-se uma solução final mais 
concentrada nesses analitos (SUPELCO,1998). Como regra geral, a extração em 
fase sólida processa-se em quatro etapas: condicionamento, aplicação da amostra, 
lavagem/secagem e eluição, como mostra a Figura 9. 
Figura 9 - Etapas da técnica de extração em fase sólida (SPE) 
 
Fonte: SUPELCO, 1998 
 
 
 
 
 
 34 
3.1.1 Modo de “retenção do(s) analito(s) 
 
a) Condicionamento do material adsorvente: Este passo tem como objetivo ativar ou 
solvatar o enchimento de modo a favorecer a sua interação com os componentes da 
amostra. No caso de colunas de fase reversa o condicionamento com um solvente 
orgânico como metanol ou acetonitrila é importante para obter resultados 
reprodutíveis. Na ausência de condicionamento, o solvente da amostra, que é 
geralmente aquoso, não consegue penetrar nos poros do adsorvente e molhar a sua 
superfície. Por esta razão apenas uma pequena parte da superfície do adsorvente fica 
disponível para interagir com o analito. Pela mesma razão é importante não deixar 
secar o adsorvente entre o condicionamento e a aplicação da amostra. 
b) Aplicação da amostra: Nesta fase, de passagem através do adsorvente, ocorre a 
retenção dos analitos. Deve controlar-se a quantidade de amostra aplicada e também 
o fluxo de passagem através do adsorvente para evitar o equilíbrio incompleto entre 
os analitos e o adsorvente. 
c) Limpeza do material adsorvente: Este passo tem como objetivo a remoção de 
eventuais interferentes da matriz. Esses interferentes são removidos por passagem 
de um solvente de lavagem através da fase sólida. 
d) Secagem para remoção total do solvente de lavagem. 
e) Eluição dos compostos em estudo retidos no enchimento, selecionando um 
solvente de polaridade adequada e que tenha a capacidade de quebrar as interações 
analito-adsorvente e garanta a eluição dos analitos (SUPELCO, 1998). 
3.1.2 Modo de retenção dos interferentes 
a) Fase de condicionamento (pode não conter). 
b) Aplicação da amostra: Nesta fase de passagem através do adsorvente, ocorre a 
retenção dos interferentes, enquanto os compostos em estudo, atravessam a fase 
sólida sem que sejam retidos. 
c) A limpeza do adsorvente com solvente de lavagem deve ser feita para arrastar 
pequenas quantidades de amostra, que estejam ainda presentes no cartucho de fase 
sólida. 
 35 
d) Secagem do adsorvente, a fim de recolher o restante solvente de lavagem, que 
pode conter uma pequena quantidade de amostra (SUPELCO, 1998). 
3.1.3 Seleção do solvente 
Os solventes em SPE são utilizados nas etapas de condicionamento, lavagem e 
eluição. Deste modo, a sua utilização tem diversas finalidades, tais como: condicionar 
a fase sólida; dissolver a amostra a processar e transportar os solutos, favorecendo a 
sua adsorção; eliminar o material indesejável presente no enchimento por lavagem 
sem eluir os analitos; e eluir os compostos a analisar removendo-os da fase sólida 
sem eluir os componentes da matriz (HENRIQUES, 2008). 
A escolha destes solventes obedece a vários critérios. Um deles é que ele seja 
compatível (miscível ou, pelo menos, solúvel, sem interagir quimicamente) com outros 
solventes usados previamente no processo de SPE. 
 Este passo tem como objetivo a remoção de eventuais interferentes da matriz e, 
esses interferentes, são removidos por passagem de um solvente de lavagem através 
da fase sólida. 
 
3.2 Revisão bibliográfica dos procedimentos gerais de preparação de microextração 
utilizando QuEChERS. 
 
A Figura 10, ilustra um esquema resumido indicando como funciona o método 
QuEChERS, com as etapas descritas detalhadamente na sequência. 
 
 36 
Figura 10 - Esquema do procedimento geral do método QuEChERS 
 
Fonte: Adaptado de MAJOR (2007). 
 
3.2.1 Homogeneização da amostra 
 
Pelo fato do método QuEChERS usar uma quantidade de amostra reduzida no 
preparo de amostra, muito menor do que outros métodos, é necessário que a amostra 
esteja bem homogeneizada. Por essa razão, é necessária a aplicação de 
procedimentos de trituração e homogeneização da amostra nesta etapa, de modo que 
algumas gramas sejam suficientes para representar uma amostragem equivalente a 
quilogramas. Em especial, isto se faz necessário no procedimento de trituração, pois 
esta garante uma maximização da superfície de contato, pelo maior contato com o 
solvente de extração, produzindo uma melhor eficiência extrativa (MAJOR, 2007). 
 
3.2.2 Extração líquido-líquido 
 
Na etapa de extração líquido-líquido, dois componentes são essenciais: o 
solvente para extração e o sal para o efetuar o efeito salting-out. Comumente, o 
solvente mais usado é a acetonitrila, pelas vantagens que agrega ao método, como a 
sua alta miscibilidade com a água, facilitando o processo de extração em amostras 
com alto teor de água, e sua capacidade de minimizar o efeito de interferentes muito 
lipofílicos. Outra característica vantajosa da acetonitrila, está na sua facilidade em 
 37 
remover a água residual por meio de um agente secante como o sulfato de magnésio 
(MgSO4) (MAJOR, 2007). 
Apesar do amplo uso da acetonitrila como solvente de extração e, 
consequentemente, de análise, ela possui algumas desvantagens em relação ao seu 
uso em cromatógrafos gasosos. A primeira é a grande expansão que sofre ao se 
vaporizar, o que pode levar a problemas de linearidade. Outra desvantagem é em 
relação a sua volatilidade, a qual é menor quando comparada a outros solventes 
orgânicos e, por essa razão, aumenta o tempo de retenção na coluna (MASTOVSKA, 
2004). 
Com relação ao salting-out, os sais mais comuns usados no procedimento são 
o sulfato de magnésio (MgSO4) e o cloreto de sódio (NaCl). O MgSO4, além de 
favorecer o deslocamento de analitos mais polares para a fase orgânica, facilita a 
separação entre as fases orgânica e aquosa durante a partição entre os solventes. O 
NaCl, por sua vez, também auxilia na migração dos analitos mais polares para a fase 
orgânica (MAJOR, 2007). 
 
3.2.3 Extração em fase sólida 
 
Na etapa de extração em fase sólida, o uso de uma combinação de agentes 
sorventes é fundamental para a eficiência na eliminação de interferentes. O 
procedimento padrão desta etapa, consiste na adição de uma alíquota do extrato 
obtido na etapa anterior à um frasco contendo uma pequena quantidade do sorvente. 
A mistura é, então, agitada para promover a homogeneização e, consequentemente, 
facilitar o processo de remoção dos interferentes de matriz. 
O fato da extração em fase sólida no QuEChERS, usar apenas uma pequena 
alíquota do extrato, promove uma redução no tempo de trabalho e no consumo de 
reagentes, o que contribui significativamente como vantagens para o método. De 
forma geral, três agentes sorventes são usados: MgSO4, PSA (amina primária e 
secundária) e C18 (sílica-octadecil). 
A função do MgSO4 é remover a água residual, enquanto o PSA e o C18 são 
usados para adsorver compostos mais lipofílicos, como ácidos graxos, vitaminas e 
pigmentos (MAJOR, 2007). Contudo, a proporção dos agentes sorventes varia 
conforme a constituição da amostra, sendo que em alguns casos, outros agentes, 
como o carbono grafitizado (GCB), podem ser adicionados. 
 38 
 
3.2.4 Análise 
 
Após a extração em fase sólida, a amostra está pronta para ser analisada. 
Considerando que o procedimento do QuEChERS utiliza acetonitrila, as duas formas 
mais difundidas de análise são a cromatografia gasosa (GC) e a cromatografia líquida 
de alta eficiência (HPLC). Ambas as técnicas, as quais algumas vezes são acopladas 
com espectrômetros de massas, são altamente eficientes na separação e detecção 
de vários compostos orgânicos. Alguns procedimentos extras, como a adição de ácido 
fórmico na alíquota a ser analisada, podem ser feitos para melhorar a sensibilidade 
na detecção pelo espectrômetro de massas (MAJOR, 2007). 
 Apesar do procedimento do QuEChERS ser validado, uma outra vantagem do 
método é a sua flexibilidade com relação às condições em que elepode ser feito. 
Dependendo da natureza da amostra, os solventes e sais de extração e os 
componentes da fase sólida podem ser variados, conforme a necessidade. Essa 
versatilidade do método tem gerado estudos que mostram sua potencialidade na 
análise de vários compostos em vários tipos de matrizes. Contudo, o QuEChERS 
ainda é majoritariamente aplicado na detecção de pesticidas em alimentos. 
 
3.3 Revisão bibliográfica dos parâmetros de desempenho analítico 
 
a) Seletividade 
Um método analítico é considerado seletivo quando é capaz de produzir respostas 
para vários analitos, mas também é capaz de distinguir a resposta de um analito das 
dos outros (INMETRO, 2007). A seletividade avalia o grau de interferência de 
espécies, como outro ingrediente ativo, substâncias endógenas, impurezas e produtos 
de degradação, bem como, outros compostos de propriedades similares que podem 
estar presentes na amostra (PASCHOAL, 2008). 
A seletividade de um método analítico pode ser avaliada de duas formas: 
I) Comparando-se a matriz isenta dos agrotóxicos com a matriz adicionada com os 
padrões dos agrotóxicos, para verificar a existência de coeluição destes compostos 
junto à interferentes da matriz; 
II) Utilizando-se detectores de arranjo de diodos e espectrômetros de massas, que 
permitem comparar o espectro do pico obtido na amostra com o espectro do padrão 
puro e, no caso da espectrometria de massas, é possível selecionar as transições 
 39 
entre os íons dos analitos e de fragmentos específicos de seus íons (PASCHOAL, 
2008). 
b) Linearidade e faixa linear 
A linearidade trata-se da capacidade de um método analítico de produzir 
resultados que sejam diretamente proporcionais à concentração do analito, em uma 
dada faixa de concentração (INMETRO, 2007). A faixa linear de um método é definida 
como o intervalo entre os níveis inferior e superior de concentração do analito no qual 
foi demonstrado ser possível a determinação com precisão, exatidão e linearidade 
exigidas sob as condições especificadas para o ensaio (INMETRO, 2007). A 
linearidade é expressa através da correlação entre o sinal medido (área ou altura do 
pico cromatográfico) e a massa / ou concentração da substância a ser quantificada 
(PASCHOAL, 2008). Essa correlação pode ser expressa matematicamente como uma 
equação de reta denominada curva analítica. 
A estimativa dos coeficientes de uma curva analítica, a partir de um conjunto 
de medições experimentais, pode ser efetuada usando o método matemático 
conhecido como regressão linear (PASCHOAL, 2008). A equação da reta que 
descreve uma curva analítica pode ser expressa pela Equação 1. 
Equação 1 – Equação da reta que descreve a curva analítica 
 
𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 
 
Em que, y é a resposta medida - altura ou área do pico; x é a concentração do analito; 
a é o coeficiente angular - inclinação da curva; e b é o coeficiente linear - intersecção 
da curva com o eixo y. 
A partir da regressão linear, além dos coeficientes de regressão a e b, também 
é possível calcular o coeficiente de correlação r. Este parâmetro permite avaliar a 
qualidade da curva obtida, pois quanto mais próximo de 1,0, menor a dispersão do 
conjunto de pontos experimentais e, menor a incerteza dos coeficientes de regressão 
estimados (PASCHOAL, 2008). A ANVISA recomenda um coeficiente de correlação 
maior ou igual a 0,990 e o INMETRO, valores acima de 0,90. 
As curvas analíticas podem ser construídas utilizando-se os seguintes 
métodos: 
 40 
I) Padronização Externa: compara a área da substância a ser quantificada na 
amostra com as áreas obtidas com soluções de concentrações conhecidas 
preparadas a partir de um padrão; 
II) Padronização Interna: consiste na preparação de soluções padrão de 
concentrações conhecidas da substância de interesse, às quais se adiciona a mesma 
quantidade conhecida de um composto chamado de padrão interno; 
III) Adição Padrão: é realizada adicionando-se quantidades conhecidas da 
substância de interesse que está sendo analisada às quantidades conhecidas da 
amostra, antes de seu preparo (PASCHOAL, 2008). 
Tanto o método de padronização externa, quanto o de padronização interna, 
possibilitam que as curvas analíticas sejam construídas com superposição da matriz, 
ou seja, pela adição do padrão da substância de interesse, em diversas 
concentrações, em uma matriz similar à amostra e isenta dessa substância, 
relacionando as áreas obtidas com as concentrações dos padrões para a construção 
da curva. Este método é usado para compensar o efeito da matriz ou de possíveis 
interferentes no sinal dos analitos. 
A interferência da matriz pode ser determinada sobrepondo-se as curvas 
obtidas pela padronização interna ou externa com e sem superposição da matriz. A 
obtenção de retas paralelas indica que a matriz não interfere no sinal do analito, mas 
se as retas se cruzarem, a matriz está interferindo nas determinações e torna-se 
necessário realizar a quantificação usando o método da superposição da matriz 
(PASCHOAL, 2008). 
Outra forma de se avaliar a linearidade da curva analítica é por meio do cálculo 
dos resíduos estatísticos, isto é, medidas de quanto as áreas teóricas se afastam das 
áreas experimentais. Para isso, calculam-se as diferenças entre os valores teóricos e 
experimentais (resíduos estatísticos) e constrói-se um gráfico dos resíduos 
estatísticos versus concentração teórica. 
Para validar a curva analítica, os resíduos estatísticos devem estar distribuídos 
de forma aleatória entre valores positivos e negativos, não apresentando nenhuma 
tendência (CHEMKEYS, 2009). Uma maneira alternativa de se estabelecer a 
linearidade é plotando-se um gráfico da razão entre a resposta do detector e a 
concentração versus o log da concentração. A linha obtida deve ser horizontal em toda 
a faixa de concentração avaliada, com desvios positivos e negativos para baixas e 
altas concentrações, respectivamente. Traçando-se duas linhas paralelas a 95 e 
 41 
105% da linha obtida, os pontos de intersecção delimitam a faixa linear do método 
(CHEMKEYS, 2009). 
 
c) Precisão 
A precisão é um termo geral para avaliar a dispersão de resultados entre 
ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra sendo, amostras 
semelhantes ou padrões, em condições definidas (INMETRO, 2007). A precisão é 
avaliada usualmente pela estimativa do desvio padrão absoluto (s) e através da 
estimativa do desvio padrão relativo (RSD), também conhecido como coeficiente de 
variação (CV). Em métodos de análise de traços ou impurezas são aceitos CV de até 
20%, dependendo da complexidade da amostra (PASCHOAL, 2008). O s e o CV 
podem ser obtidos utilizando-se as Equações 2 e 3, respectivamente. 
Equação 2 – Equação do desvio padrão absoluto 
 
𝑠 = √
 𝛴(𝑋𝑖 − 𝑋𝑚é𝑑)2
𝑛 − 1
 
 
 
Em que, Xméd é a média aritmética de um pequeno número de medições; Xi é o valor 
individual de uma medição; e n é o número de medições. 
Equação 3 – Equação do desvio padrão relativo 
 
𝑅𝑆𝐷 (%)𝑜𝑢 𝐶𝑉 (%) = 
𝑠
𝑋𝑚é𝑑
 𝑥 100 
 
A precisão é normalmente determinada para condições específicas de 
medição, de forma que é geralmente expressa em termos de: 
I) Repetitividade: grau de concordância entre os resultados de medições 
sucessivas de um mesmo mensurando, efetuadas sob as mesmas condições de 
medição, que compreendem um mesmo procedimento de extração, mesmo 
observador, mesmo instrumento, mesmo local e repetições em um curto espaço de 
tempo (INMETRO, 2007). 
Segundo o INMETRO, para se determinar a repetitividade de um método é 
necessário realizar sete ou mais repetições para o cálculo da CV (%) (INMETRO, 
2007). Segundo a Conferência Internacional sobre Harmonização de Requisitos 
Técnicos para Registro de Produtos Farmacêuticos para Uso Humano (ICH) e a 
 42 
ANVISA, para o cálculo da CV (%) são necessárias nove repetições (três níveis, três 
repetições em cadaum) (ANVISA, 2003; ICH, 2005). 
II) Precisão Intermediária: Refere-se à precisão avaliada sobre a mesma 
amostra, sendo, amostras idênticas ou padrões, utilizando o mesmo método, no 
mesmo laboratório ou em laboratórios diferentes, mas definindo exatamente as 
condições a variar (uma ou mais), como diferentes tempos, diferentes analistas ou 
diferentes equipamentos (INMETRO, 2007). O número de ensaios necessários para 
o cálculo da CV (%), segundo a ICH e a ANVISA, são os mesmos recomendados para 
a repetitividade (ANVISA, 2003; ICH, 2005). 
III) Reprodutibilidade: grau de concordância entre as mesmas medidas 
efetuadas sob condições variadas de medição, como mudança de laboratórios, 
operadores e equipamentos (INMETRO, 2007). A reprodutibilidade não é avaliada 
em validações rotineiras realizadas em um único laboratório, pois a sua avaliação só 
é requerida para procedimentos analíticos que serão enquadrados, por exemplo, em 
farmacopeias, procedimentos do CODEX, entre outros (PASCHOAL, 2008). 
 
d) Exatidão 
A exatidão de um método é definida como sendo a concordância entre o 
resultado de um ensaio e o valor de referência aceito como convencionalmente 
verdadeiro (INMETRO, 2007). Os processos mais utilizados para avaliar a exatidão 
de um método são: 
I) Materiais de Referência Certificados: são materiais acompanhados de um 
certificado que possui o valor de concentração de uma dada substância, ou outra 
grandeza para cada parâmetro e uma incerteza associada. Os valores da média e da 
estimativa do desvio padrão obtidos pelo laboratório para uma série de replicatas da 
mesma amostra padrão, devem ser comparados com os valores certificados do 
material de referência, para verificar a exatidão do método (RIBANI, 2004). 
II) Comparação de Métodos: consiste na comparação entre resultados obtidos 
empregando-se o método em desenvolvimento e os resultados conseguidos através 
de um método de referência, avaliando-se o grau de proximidade entre os resultados 
obtidos pelos dois métodos, ou seja, o grau de exatidão do método testado em relação 
ao de referência (RIBANI, 2004). 
 III) Ensaios de Recuperação: A recuperação (R) é definida como a proporção 
da quantidade da substância de interesse, presente ou adicionada na proporção 
 43 
analítica do material teste, que é extraída e passível de ser quantificada (IUPAC, 
2002). Ela deve ser avaliada na faixa de concentração esperada para o composto de 
interesse, pois a dispersão dos resultados tende a aumentar com a diminuição da 
concentração. 
Segundo a ICH e a ANVISA é necessário no mínimo nove determinações, 
envolvendo um mínimo de três níveis de concentração para a determinação da 
exatidão. A Associação Grupo de Analistas de Resíduos de Pesticidas (GARP) 
recomenda que se trabalhe nos níveis de adição de 1, 2 e 10 vezes o valor do limite 
de quantificação. 
O intervalo aceitável de recuperação para a análise de resíduos geralmente é de 
80 a 120%, com precisão de ± 20% (TOLOSA, 1996). Mas, dependendo da 
complexidade da amostra, esta faixa pode ser de 70 a 130% com precisão de ± 15%. 
A recuperação pode ser calculada utilizando-se a Equação 4. 
Equação 4 – Equação da recuperação da análise 
 
𝑅 (%) = 
𝐶1
𝐶2
 𝑥 100 
 
Sendo que, C1 é a concentração determinada na amostra fortificada e C2 é a 
concentração adicionada à amostra. 
IV) Adição Padrão: este método é usado quando for difícil ou impossível obter uma 
matriz sem a substância de interesse. No método de adição padrão, quantidades 
conhecidas da substância de interesse são adicionadas em diferentes níveis numa 
amostra que já contenha quantidades desconhecidas da substância, antes do 
procedimento de preparo da amostra (RIBANI, 2004). 
 
e) Limite de detecção 
O limite de detecção (LD) representa a menor concentração da substância em 
exame que pode ser detectada e declarada com um intervalo de confiança, em que a 
concentração do analito é maior que zero (INMETRO, 2007). O limite de detecção do 
instrumento (LDI) é definido como a concentração do analito que produz um sinal de 
três a cinco vezes a razão sinal/ruído do instrumento (INMETRO, 2007). O limite de 
detecção do método (LDM) é definido como a concentração mínima de uma 
substância medida e declarada com 95 ou 99% de confiança, tendo a concentração 
 44 
do analito maior que zero. O limite de detecção pode ser determinado por três métodos 
diferentes: 
I) Visual: o LD é determinado através da adição de concentrações conhecidas do 
analito à matriz, de tal modo que se possa determinar o menor nível em que o analito 
realmente pode ser detectado (ICH, 2005) 
II) Relação Sinal/Ruído: o LD é determinado através da comparação entre a 
medição dos sinais de amostras com baixas concentrações conhecidas do analito na 
matriz e um branco dessas amostras. Assim, é estabelecida uma concentração 
mínima na qual a substância pode ser facilmente detectada. A relação sinal/ruído pode 
ser de 5:1, 3:1 ou 2:1, proporções geralmente aceitas como estimativas do limite de 
detecção (ICH, 2005). 
III) Baseado em Parâmetros da Curva Analítica: o LD é determinado através de 
parâmetros da curva analítica de acordo com a Equação 5 (RIBANI, 2004). 
Equação 5 – Equação do limite de detecção 
 
𝐿𝐷 = 3,3 𝑥 
𝑠
𝑎
 (𝐸𝑞. 5) 
 
Em que, s é a estimativa do desvio padrão da resposta do coeficiente linear da 
equação da reta da curva analítica, a é a inclinação ou coeficiente angular da equação 
da reta da curva analítica. 
 
a) Limite de quantificação 
O limite de quantificação (LQ) é a menor concentração do analito que pode ser 
determinada com um nível aceitável de precisão e exatidão. O limite de quantificação 
do instrumento (LQI) é definido como a concentração do analito que produz um sinal 
de seis a dez vezes a razão sinal/ruído do equipamento. O limite de quantificação do 
método (LQM) é determinado a partir do LQI e do fator na qual a amostra é 
concentrada durante o processo de extração, denominado fator de concentração 
(INMETRO, 2007). Os mesmos critérios usados para a determinação do LD podem 
ser adotados para o LQ, utilizando a relação 10:1, ou seja, o LQ pode ser calculado 
pelo método visual, sinal/ruído (10:1) ou baseado na curva analítica, utilizando-se a 
Equação 6 (CHEMKEYS, 2009). 
 
 45 
Equação 6 – Equação do limite de quantificação 
 
𝐿𝑄 = 10 𝑥 
𝑠
𝑎
 
 
Em que, s a estimativa do desvio padrão da resposta do coeficiente linear da equação 
da reta da curva analítica e a a inclinação ou coeficiente angular da equação da reta 
da curva analítica. 
 
b) Robustez 
Diz-se que um método é robusto quando ele se revelar praticamente insensível a 
pequenas variações que possam ocorrer quando esse está sendo executado. A 
robustez de um método cromatográfico pode ser avaliada pela variação de parâmetros 
como a composição e a vazão da fase móvel em HPLC, natureza do gás de arraste 
em GC, programação de temperatura, bem como tempo de agitação, extração, entre 
outros (RIBANI, 2004). 
 
3.4 Justificativa da dissertação escolhida para a revisão bibliográfica 
 
Foram consultados em quatro plataformas (SciELO, Portal de Periódicos da 
CAPES, Google Acadêmico e a Biblioteca Digital de Teses e Dissertações), artigos 
científicos, teses e dissertações em relação ao tema abordado neste trabalho. A 
revisão bibliográfica da metodologia e dos resultados obtidos que confirmem a 
eficiência do método aplicado para a determinação dos fungicidas carbendazim e 
tebuconazol em maçã, utilizando o HPLC, foi feita através da análise de dissertação 
apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos 
da Universidade Federal de Pelotas, cujo título da pesquisa está relacionada a análise 
dos fungicidas utilizados que são aplicados em maçãs, por meio de um HPLC-MS. 
Devido à importância de uma análise química, é necessário que essa análise seja 
feita de forma sistemática,a fim de se minimizar qualquer forma de contaminação e 
perdas do analito que possa comprometer a confiabilidade do resultado final. De modo 
geral, a análise de uma amostra pode ser dividida em quatro etapas, conforme 
esquematizado na Figura 11, e cada uma dessas etapas devem ser executadas de 
forma cuidadosa para garantir a confiabilidade do resultado após a análise. 
 
 46 
Figura 11- Etapas a serem realizadas para se fazer uma análise química 
 
Fonte: Adaptado de MITRA (2003). 
 
3.4.1 Materiais 
 
Para validação do método foram utilizadas maçãs do tipo Gala adquiridas no 
comércio local de Pelotas - RS, sendo selecionados frutos sadios, isentos de injurias, 
podridões e contendo pedúnculo. Para avaliação dos resíduos de fungicidas foram 
adquiridas amostras de maçã de acordo com a oferta de cada estabelecimento, 
realizando coletas em 9 estabelecimentos comerciais (supermercados e feiras) do 
município de Pelotas-RS. 
As maçãs foram picadas, descartando-se o pedúnculo, as sementes e a parte 
central, em seguida, foram trituradas em uma centrífuga para sucos e 5,0 mL foram 
separados para a extração QuEChERS. Foram utilizados os reagentes de grau 
analítico para análise (p.a.), sulfato de magnésio anidro (MgSO4), ácido acético glacial 
e ácido clorídrico da marca Vetec. Utilizou-se também, cloreto de sódio (NaCl), 
carbonato de sódio (Na2CO3), ambos da marca Synth, amina primária secundária 
(PSA) da marca Sigma Aldrich, Acetonitrila grau HPLC da marca AppliChem, ácido 
fórmico e reagente de derivatização N, O-bistrifluoroacetamida (BSTFA) da marca 
Sigma Aldrich. Os padrões analíticos utilizados para a análise dos fungicidas foram: 
tebuconazol (CAS: 107534-96-3) e carbendazim (CAS: 10605-21-7) 
 
3.4.2.Preparo do extrato (QuEChERS) 
 
 47 
Para a validação do método, as maçãs selecionadas foram lavadas em água 
corrente e imersas em solução clorada com uma concentração de 200 mg L-1, por um 
tempo de 15 min. Em seguida foram novamente lavadas em água corrente, e cortadas, 
sendo descartadas a parte central e as sementes. Os pedaços foram triturados e 
centrifugados em uma centrífuga para sucos (Walita). 
O suco obtido foi imediatamente utilizado para o preparo do extrato. Para a 
extração, adicionou-se 15 mL de acetonitrila em 5 mL de suco, em um tubo de 
polipropileno de 50 mL para uma centrífuga. Após a agitação em vórtex por 20 s uma 
mistura de 4,0 g de MgSO4, 1,0 g NaCl e 0,5 g Na2CO3 foram adicionadas à solução, 
que foi imediatamente agitada novamente em vórtex por um tempo de 30 s. A mistura 
foi centrifugada a 1878 x g durante 5 min, e o sobrenadante foi transferido para um 
tubo de centrifuga de 50 mL, contendo 400 mg de PSA e 1200 mg de MgSO4. 
A mistura foi agitada em vórtex por 30 s, e centrifugada (2935x g durante 5 min), o 
sobrenadante foi transferido para um tubo de 15 mL e posto em uma centrífuga, onde 
foi adicionado 100 µL de ácido acético glacial. O extrato foi armazenado sob 
refrigeração a uma temperatura de -4ºC (KHARANDI; BABRI & AZAD, 2013). 
3.4.3 Preparo das soluções estoque 
As soluções estoques dos fungicidas foram preparadas na concentração de 1 mg 
mL-1 a partir da dissolução de 10 mg do padrão seco, pesado (em uma balança 
analítica de precisão), em 10 mL de acetonitrila grau HPLC. 
 
3.4.4 Método analítico para a determinação de carbendazim e tebuconazol 
 
A análise dos fungicidas, foi baseada no método descrito por Luz et al., (2016). Foi 
utilizado um cromatógrafo a líquido de ultra-alta eficiência (Shimadzu, Prominence) 
acoplado a espectrômetro de massas de alta resolução (tipo quadrupolo-tempo de 
vôo) (Brucker Impact HD), com fonte de ionização electrospray. Os compostos foram 
separados por uma coluna de fase reversa Shimpack XR-ODS C18 (75 mm x 2,0 mm; 
2,2 µm). 
Para eluição dos compostos foi utilizado um gradiente com as soluções de ácido 
fórmico em água (0,1% v/v, fase móvel A) e ácido fórmico em acetonitrila (0,1% v / v, 
 48 
fase móvel B). O gradiente iniciou com 10% B, mantido por 2 min, passou a 50% B 
em 7 min e 100% B aos 22 min, permanecendo nessa condição até 25 min e; aos 27 
min voltou-se a condição inicial (10% B), permanecendo assim por 3 min. Inicialmente 
o espectrômetro de massas foi operado nos modos positivo e negativo, e após a 
identificação do melhor modo de ionização, passou a ser utilizado apenas no modo 
positivo. 
A faixa de massas selecionada para obtenção dos espectros foi de m/z 50 a 1200. 
O potencial do capilar foi 4500 V com pressão do nebulizador de 40 psi, fluxo de gás 
de secagem (N2) de 9 L min-1 e temperatura da fonte 180ºC. Para a calibração foi 
utilizada uma solução de formiato de sódio (10 mM). Os dados foram analisados pelo 
software Data analysis 4.0 (Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha), a partir da 
identificação da relação massa/carga (m/z), considerando a adição de um próton 
[M+H]+ e a possibilidade da formação de outros. O processamento das curvas de 
calibração foi realizado utilizando o software Quanty Analysis (Bruker Daltonics, 
Bremen, Alemanha). 
A linearidade foi atribuída ao coeficiente de determinação (R²), calculado para a 
equação linear da reta. As concentrações máximas utilizadas para a obtenção da 
linearidade do tebuconazol e do carbendazim foram de 2500 ηg mL-1 e a mínima 4,88 
ηg mL-1. 
 
3.4.5 Análise dos fungicidas por HPLC-MS em maçã 
 
Os fungicidas carbendazim e tebuconazol, foram detectados apenas no modo 
positivo de ionização. O fungicida carbendazim possui uma relação massa/carga (m/z 
[M+H]) de 192,0767 e um tempo de retenção de 1,29 min. O fungicida tebuconazol, 
possui uma relação massa/carga (m/z [M+H]) de 308,1524 e um tempo de retenção 
de 12,71 min. A seletividade do método foi confirmada pela ausência de íons 
interferentes de mesma relação massa/carga no mesmo tempo de retenção. 
A linearidade foi avaliada a partir da equação da reta utilizando um modelo 
linear. O carbendazim em solvente, possui uma equação de reta igual a y = 273,3x + 
18170 com R2 0,997 e na matriz y = 213,8x + 6445 com R2 0,998. Por outro lado, o 
tebuconazol em solvente, possui uma equação de reta igual a y = 1506x – 1126 com 
R2 0,999 e na matriz y = 1549x–5369 com R2 0,999. 
 49 
Os LD = 1,18 e LQ = 3,57 foram obtidos para o carbendazim em solução e LD 
= 1,60 e LQ = 4,80 na matriz. Por outro lado, o tebuconazol em solução apresentou 
LD = 0,20 e LQ = 0,61 e na matriz LD = 0,54 e LQ = 1,64. O teste de recuperação para 
o carbendazim (Média ± DP = 95,7 ± 17,5) e (Média ± DP = 95,4 ± 3,4) para o 
tebuconazol. 
A repetitividade (CV%) e precisão intermediária (CV%) foram obtidas em três 
faixas (baixo, médio e alto), sendo: carbendazim com repetitividade (CV%) de 1,1 
(baixo) 0,6 (médio) e 0,3 (alto) e precisão intermediária (CV %) 4,5 (baixo) 3,5 (médio) 
e 2,3 (alto). O tebuconazol, apresentou repetitividade (CV%) de 0,1 (baixo) 0,2 (médio) 
e 0,1 (alto) e precisão intermediária (CV %) 0,9 (baixo) 0,3 (médio) e 0,0 (alto). 
O efeito de matriz (%), também foi obtido em três faixas (baixa, média e alta) 
de concentração para os fungicidas, sendo: carbendazim -14,6 (baixo) -34,2 (médio) 
e -31,6 (alto) e, tebuconazol -7,4 (baixo) 10,3 (médio) e 1,9 (alto). O efeito de matriz 
pode ser classificado como: baixo (inferior à ± 20%); médio (maior que ± 20% e menor 
que ± 50%); alto (maior que ±50%). 
Aproximadamente 55% das amostras apresentavam contaminação por 
carbendazim com concentração acima do limite de quantificação do equipamento, isto 
é, continham mais que 4,65 ηg mL-1 da substância e, o tebuconazol apresentou 
concentrações inferiores ao limite de quantificação do equipamento, apresentando 
menos 1,64 ηg mL-1. 
Desta forma, a partir das técnicas utilizadas para verificação da seletividade e 
pureza, pode-se concluir que as condições de extração, limpeza e instrumentação 
foram satisfatórias e os métodos foram seletivos para os analitos estudados.