1- Espectrofotometria

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Bioquímica Clínica
Espectrofotometria
O conhecimento da absorção de luz pela matéria é a forma mais usual de determinar a concentração.
A maioria dos métodos utilizados na disciplina envolve a determinação espectrofotométrica de compostos corados (cromóforo) obtido pela reação entre o composto a ser analisado e o reagente (reagente cromogênico).
Composto a ser analisado + reagente cromogênico -> Produto de cor.
A zona de espectro abaixo de 380nm é denominada UV e acima de 750 é IF.
· Quando um feixe de luz monocromática atravessa uma solução com moléculas absorventes, parte da luz é absorvida pela solução e parte é transmitida. 
A absorção depende de fatores como, a) a concentração das moléculas absorventes. 
b) Espessura da Solução (Caminho ótico)
1. A intensidade da cor da solução é proporcional a concentração das moléculas absorventes de luz. 
2. Quanto mais concentrada for a solução, maior será a absorção de luz
3. A cor da solução é determinada pela cor da luz transmitida.
Lei de Lambert
Lambert observou a relação entre a transmissão e a espessura da camada do meio absorvente. 
	“ A intensidade da luz emitida decresce exponencialmente à medida que a espessura do meio absorvente aumenta aritmeticamente”. 
Sendo expressa da seguinte fórmula:
Considerando que: 
I = Intensidade da luz transmitida
Io = Intensidade da luz incidente
X = Coeficiente de absorção
1 = Espessura do meio absorvente
Lei de Beer
Beer observou a relação existente entre a transmissão e a concentração do meio onde passa o feixe. 
	“ A intensidade de um feixe de luz monocromático decresce exponencialmente à medida que a concentração da substância absorvente aumenta aritmeticamente”
Sendo expressa pela fórmula: 
Considerando que: 
I = Intensidade da luz transmitida
IO = Intensidade da luz incidente
Ko = Constante denominada coeficiente de absorção
C = Concentração do meio absorvente
Lei de Lambert-Beer
São tratadas simultaneamente, a quantidade de luz absorvida ou transmitida por uma determinada solução depende da concentração do soluto e da espessura da solução. 
· Limitações
Nem todas as reações colorimétricas seguem essa lei, sendo válidas para: 
1. As soluções a serem analisadas estejam diluídas (baixas concentrações)
2. Não devem estar presentes na mesma solução mais de uma substância absorvente de luz. 
3. O aumento da concentração é acompanhado pelo aumento crescente e proporcional de A, até o limite.
4. As soluções concentradas deixam de existir a proporcionalidade linear
5. O limite da linearidade é o limite da concentração em que a lei é válida. 
Na prática, a lei é realizada pelo emprego de espectros, onde são lidas as absorbâncias de uma solução teste e de uma solução padrão.
Os fotômeros servem para medir a intensidade da luz e são usadas para determinar a concentração de soluções coradas. 
· A luz é fornecida por uma lâmpada, fracionada por um prisma ou rede de difração nos comprimentos que a compõe. O comprimento é encaminhado para a solução contida em u recipiente transparente. 
· Parte dessa luz é absorvida, e parte é transmitida. A redução da intensidade luminosa é medida pelo detector, pois o sinal elétrico de saída depende da intensidade da luz incidida.
· O sinal é amplificado e visualizado no galvanômetro, e lido como uma absorbância sendo proporcional à concentração da substância existente. 
Esse resultado é referente à capacidade do composto em absorver luz.
1. O melhor comprimento para determinada solução é aquele que há maior absorção, portanto, menor transmissão de luz. 
Maior absorbância e menor transmitância
Absorbância (A) – Quantidade de luz Absorvida
Transmitância (T) – Fração total da luz transmitida. 
Sendo que A e T são inversamente relacionadas. 
Método Colorimétrico – Enzimática Colorimétrica
Método de análise que se baseia na comparação da cor produzida por uma reação, com cor padrão.
	A intensidade da cor infere-se na concentração de terminado analito. 
O método mais seguro é verificar a coloração de uma reação através do uso do espectro. 
Método Cinético
Usado quando o analito é uma enzima
A atividade da enzima analisada é feita por meio da reação dela com um composto químico (substrato) gerando um produto.
A reação é acoplada a uma reação colorimétrica, a medida que a conversão enzimático ocorre, o produto é gerado. Leituras sucessivas em intervalos iguais devem ser feitas. 
Método Cinético Enzimático
Semelhante ao anterior, porém o analito não é uma enzima, e sim um substrato a ser utilizado por uma enzima. 
	O produto da primeira reação pode ser captado por outras enzimas, acoplada a uma reação colorimétrica de uma liberação de gás ou formação de precipitado.