A1 BIOTECNOLOGIA- DANIELA RIBEIRO

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UNIVERSIDADE VEIGA DE ALMEIDA 
Disciplina Biotecnologia 2023.1 
Prof: Gustavo Paris 
TRABALHO 1 - A1 
 
Nome do aluno: Daniela de Souza Ribeiro 
Curso: Biomedicina 
Polo: Tijuca 
Turno: Noite 
 
1) O que são organismos geneticamente modificados (OGM)? Qual 
característica define um organismo como OGM? 
R: Atualmente a tecnologia avança cada vez mais, e cada vez são construídas coisas 
antes impossíveis de ser realizadas. São através de modificações nos organismos 
vivos que são possíveis criar algum tipo de benefício ou característica vantajosa. 
Esses organismos geneticamente modificados (OGM) são organismos vivos que 
tiveram uma ou mais características modificadas no gene, ou a introdução de genes 
nesse material. Isso se dá através da manipulação genética de trechos de seu 
genoma alterados no RNA/DNA recombinante ou engenharia genética. O objetivo 
disso, é mudar o aparecimento de determinada característica como: cor, tamanho, 
resistência, e etc. Em suma, os com essas modificações a uma mudança no material 
genético que não aconteceria antes. 
 
 
 
 
 
2) Pesquise 3 exemplos do uso da biotecnologia em qualquer atividade ou 
produto, explicando seu uso e qual vantagem a biotecnologia trouxe para 
aquela atividade ou produto. 
Produto Atividade Vantagem da Biotecnologia 
 
 
1. Produtos 
alimentícios para 
intolerantes ao 
glúten (doença 
celíaca) 
 
 
 
 
Área da 
Alimentação 
A biotecnologia tem avançado na pesquisa e 
desenvolvimento de trigo geneticamente 
modificado (GM) sem glúten na Europa, com o 
objetivo de ajudar pessoas com doença 
celíaca, uma reação imunológica que provoca 
sensibilidade permanente ao glúten encontrado 
em cereais como trigo, centeio e cevada. Essas 
pesquisas buscam identificar quais partes das 
proteínas do trigo podem irritar esses 
indivíduos e eliminá-las do grão. Até que o trigo 
GM esteja amplamente disponível, a indústria 
alimentícia costuma usar combinações de 
várias farinhas, como féculas e aditivos como a 
goma xantana, para produzir alimentos sem 
glúten. A biotecnologia oferece uma promessa 
de aliviar o sofrimento dos pacientes com 
doença celíaca, além de permitir a produção 
mais eficiente e acessível de alimentos sem 
glúten, tornando-os mais acessíveis a um 
número maior de pessoas. 
 
 
 
2. Vacinas 
 
 
 
 
 
 
 
Área da 
Saúde 
A biotecnologia aplicada ao desenvolvimento 
de vacinas é a capacidade de criar vacinas 
mais seguras e eficazes. Com as técnicas de 
biotecnologia, é possível desenvolver vacinas 
que são mais específicas para o patógeno, 
evitando efeitos colaterais indesejados e 
melhorando a eficácia. Além disso, a 
biotecnologia permite a produção em larga 
escala de vacinas, o que é crucial para alcançar 
a imunização em massa da população. Outra 
vantagem é a capacidade de desenvolver 
vacinas para doenças que antes eram 
consideradas incuráveis ou difíceis de tratar, 
abrindo novas possibilidades no tratamento de 
doenças infecciosas e outras doenças 
crônicas. 
 
3. Biopesticidas 
 
 
 
Área da 
Agricultura 
os biopesticidas microbianos são um exemplo 
de como a biotecnologia pode trazer vantagens 
na agricultura. Além de serem menos tóxicos 
do que os pesticidas químicos, eles são 
específicos para determinadas pragas, o que 
reduz o impacto ambiental e a possibilidade de 
efeitos colaterais em organismos não-alvo. 
Além disso, o uso de biopesticidas microbianos 
pode reduzir a dependência dos agricultores 
em relação aos pesticidas químicos, que 
podem ter um custo mais elevado e gerar 
resistência nas pragas, tornando-se menos 
eficazes ao longo do tempo. 
 
3) Utilizando seus conhecimentos sobre bioinformática e a base de dados 
genéticos do NIH (Instituo Nacional de Saúde americano - 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore ), descubra quantos exons o gene 
COL1A1 de Homo sapiens (humanos) possui e quais são os primeiros 20 
nucleotídeos de sua sequência genética? (uma vez na página do gene, clique 
em “FASTA” para obter a sequência genética). 
 
N° de exons: 51 
Copie os 20 primeiros nucleotídeos da sequência aqui: 
 
(Sequência de 20 primeiros nucleotídeos em vermelho) 
GCAGACGGGAGTTTCTCCTCGGGGTCGGAGCAGGAGGCACGCGGAGTGTGA
GGCCACGCATGAGCGGACG 
CTAACCCCCTCCCCAGCCACAAAGAGTCTACATGTCTAGGGTCTAGACATGTTC
AGCTTTGTGGACCTCC 
GGCTCCTGCTCCTCTTAGCGGCCACCGCCCTCCTGACGCACGGCCAAGAGGA
AGGCCAAGTCGAGGGCCA... 
 
 
4) O que são plasmídeos? Quais características tornam esse tipo de DNA útil 
para o processo de clonagem? 
R: São tipos de DNA presente em vários tipos de bactérias, essa sequencia de DNA 
que a bactéria carrega não faz parte do DNA cromossonal (extracromossômica) dela. 
Os plasmídeos, são utilizados como vetores de clonagem, eles transportam genes ou 
fragmentos de um DNA a ser clonado para dentro da célula hospedeira. No processo 
de clonagem, os plasmídeos são utilizados como vetores para clonar o fragmento de 
DNA. Suas características são: DNA circular pequeno; são replicados independente 
do cromossomo (conseguem gerar várias cópias independentes); são naturalmente 
transferidos entre bactérias (maneira que a bactéria faz transferência genética) e 
aceitam inserções de DNA, que carregam para dentro da célula e se replicam. Além 
disso, os plasmídeos possuem sítios de restrição, que são locais onde enzimas de 
restrição podem cortar o DNA em pontos específicos, permitindo a inserção de 
fragmentos de DNA a serem clonados. Eles também possuem um gene de seleção, 
que confere à célula a capacidade de crescer em um meio contendo um antibiótico 
específico, permitindo a seleção de células que incorporaram o plasmídeo contendo 
o gene de interesse. Essas características tornam os plasmídeos uma ferramenta útil 
na clonagem de genes e manipulação genética. 
 
5) Uma das atividades que geram dificuldades ao trabalhar com manipulação 
genética é unir 2 fitas de DNA entre si, como por exemplo, unir o DNA do 
plasmídeo ao DNA de um gene de interesse. Para esse procedimento muitas 
vezes utiliza-se enzimas de restrição nos 2 DNAs, causando digestão de suas 
pontas e depois essas pontas são interligadas pela DNA ligase. 
a) Por que o uso de enzimas de restrição que geram pontas coesivas é mais 
indicado em relação às que geram pontas cegas? 
R: Porque as pontas cegas são mais susceptíveis a erros, já que cortam ambas as 
fitas de DNA por igual, permitindo uma torção da molécula da hora da religação. As 
pontas coesivas são mais indicadas porque cortam a fita por desigual gerando pontas 
complementares, que no processo de clonagem facilitam que as pontas sejam 
interligadas novamente. 
b) Qual potencial problema o uso de pontas cegas pode trazer no processo de 
juntar 2 fitas duplas de DNA? 
R: O uso de pontas cegas pode trazer um potencial problema no processo de juntar 
duas fitas duplas de DNA, pois as pontas cegas cortam as duas fitas igualmente, o 
que pode permitir a torção da molécula de DNA durante a religação. Isso pode resultar 
na introdução de erros ou dificultar a ligação correta das duas fitas, comprometendo 
o sucesso do processo de manipulação genética. Por isso, o uso de enzimas de 
restrição que geram pontas coesivas é mais indicado, pois elas cortam as fitas por 
desigual e geram pontas complementares, facilitando a interligação das duas fitas 
novamente. 
 
 
 
6) Desenvolva os primers forward e reverso para a sequência do gene da 
INSULINA (sequência no final) de forma a gerar um produto de PCR que pegue, 
no mínimo, a partir do 1° exon até o final do 3°exon. Lembre-se de respeitar as 
regras para o desenho otimizado de um primer (aula 5), com exceção das regras 
de formação de estruturas secundárias. 
ATENÇÃO: Não esqueça de colocar a direção das fitas nas suas respostas. 5’ -
> 3’ 
R: Primer Forward: 5' - ATGCCCACCCCCGACGCCAC - 3' 
Primer complementar: TGAGTGCCATTGGCTAGGTGCACG 
O primer reverso: 5' CGTGCACCTAGCCAATGGCACTCA 3' 
 
7) Visando produzir um OGM capaz de produzir INSULINA, após amplificação do 
genecompleto da INSULINA, é necessário agora uni-lo com o plasmídeo pBR322 
(mapa no final). 
a) Qual(is) enzima(s) de restrição você usaria, tanto no gene da insulina quanto 
no plasmídeo, para criar um DNA recombinante de forma a unir ambas as 
sequências? 
R: Com relação à união do gene da insulina com o plasmídeo pBR322, existem 
diversas opções de enzimas de restrição que poderiam ser utilizadas. 
Algumas das opções mais comuns são: EcoRI, XhoI e HindIII. 
-A enzima EcoRI reconhece a sequência GAATTC e gera extremidades coesivas de 
5' AATT e 3' TTAA; 
-A enzima XhoI reconhece a sequência CTCGAG e gera extremidades coesivas de 
5' CG e 3' AG; 
-A enzima HindIII reconhece a sequência AAGCTT e gera extremidades coesivas de 
5' AGCTT e 3' TCGA; 
No entanto, a escolha da enzima de restrição ideal para a união das sequências deve 
levar em consideração as restrições do sistema de expressão que se pretende utilizar 
e possíveis limitações na clonagem do gene da insulina. 
Desenhe como ficariam as pontas do plasmídeo pBR322 e do gene de 
interesse após o processamento com a enzima de restrição de sua escolha. 
R: Com a enzima de restrição EcoRI, as pontas do plasmídeo pBR322 e do gene da 
insulina ficariam da seguinte forma: 
Plasmídeo pBR322: 
 5'-GAATTC-3' 3'-CTTAAG-5' 
Gene da insulina: 5'-GAATTC-3' 3'-CTTAAG-5' 
 
 
 
b) E explique como você selecionaria as bactérias que foram corretamente 
transformadas, ou seja, estão produzindo insulina ao final da transformação? 
R: Para selecionar as bactérias que foram corretamente transformadas e estão 
produzindo insulina ao final da transformação, é necessário utilizar uma seleção 
adequada. Uma possibilidade é a utilização de um antibiótico presente no plasmídeo 
pBR322 como um marcador de seleção. O plasmídeo pBR322 possui dois genes de 
resistência a antibióticos, um para ampicilina e outro para tetraciclina. Outra 
alternativa é a realização de ensaios bioquímicos para detectar a produção de insulina 
nas bactérias transformadas, como a utilização de um ensaio ELISA para detectar a 
presença da proteína no meio de cultura ou em células individuais. Portanto, é 
possível selecionar as bactérias transformadas utilizando um meio de cultura 
contendo ampicilina ou tetraciclina, que irá permitir apenas o crescimento das 
bactérias que incorporaram o plasmídeo contendo o gene da insulina. 
8) Para desenvolver um OGM que produza a proteína INSULINA, 2 cientistas 
desenharam 2 projetos diferentes: 
O cientista 1 vai adicionar sítios de restrição na ponta 5’ dos primers, 
amplificar cada exon separadamente e depois cortar com a enzima de 
restrição BamHI de modo a formar pontas coesivas. Assim, junto com a DNA 
ligase, as pontas coesivas vão conectar os exon entre si no final do 
procedimento. 
Primers: Sítio de restrição da BamHI + primer do exon 
Exon1 Primer forward: 5’ [GGATCC]ATGCCCACCC 3’ 
Exon1 primer reverso: 3’ CCGGTAGTAC[GGATCC] 5’ 
Exon2 primer forward: 5’ [GGATCC] TCACAGCGG 3’ 
Exon2 primer reverso: 3’ CCACAAACTC[GGATCC] 5’ 
Exon3 primer forward: 5’ [GGATCC]GAGCTATGCC 3’ 
Exon3 primer reverso: 3’ GGTAACCGATC[GGATCC] 5’ 
Desenhe/escreva como ficará a sequência final, depois de tratada com a 
BamHI e com a DNA ligase: 
 
Para cada exon, os primers forward e reverse possuem sítios de restrição para a 
enzima de restrição BamHI na ponta 5'. A amplificação será realizada 
separadamente para cada exon. Após a amplificação, o produto será tratado com a 
enzima de restrição BamHI para formar pontas coesivas. Em seguida, os exons 
serão ligados com a DNA ligase nas pontas coesivas. 
 
Exon 1: 
5' GGATCC JATGCCCACCC 3' --amplificação--> 5' GGATCC JATGCCCACCC 3' 
3' CCGGTAGTAC GGATC c 5' --amplificação--> 3' CCGGTAGTAC GGATC c 5' 
tratamento com BamHI - 
5' GGATCC JATGCCCACCC 3' 
3' CCGGT AGTAC GGATC c 5' 
 
Exon 2: 
5' GGATCC TCACAGCGG 3' --amplificação--> 5' GGATCC TCACAGCGG 3' 
3' CCACAAACTC GGATC c 5' --amplificação--> 3' CCACAAACTC GGATC c 5' 
tratamento com BamHI - 
5' GGATCC TCACAGCGG 3' 
3' CCACA AACTC GGATC c 5' 
 
Exon 3: 
5' GGATCC GAGCTATGCC 3' --amplificação--> 5' GGATCC GAGCTATGCC 3' 
3' GGTAACCGATC GGATC c 5' --amplificação--> 3' GGTAACCGATC GGATC c 5' 
tratamento com BamHI - 
5' GGATCC GAGCTATGCC 3' 
3' GGTA ACCGATC GGATC c 5' 
Sequência final após tratamento com BamHI e ligação dos exons: 
5' GGATCC JATGCCCACCC TCACAGCGG GAGCTATGCC 3' 
3' CCGGT AGTAC GGATC c CCACA AACTC GGATC c GGTA ACCGATC GGATC 
c 5' 
 Com base na sequência final produzida, a proteína INSULINA será 
corretamente produzida? Justifique. 
R: A sequência final produzida contém o gene da insulina, com os três exons 
conectados. No entanto, para que a proteína insulina seja corretamente produzida, é 
necessário que a sequência final contenha também os sítios de início e fim de 
tradução, assim como as regiões não codificantes necessárias para o processamento 
pós-traducional, como a clivagem do peptídeo sinal. Portanto, é necessário verificar 
se os primers foram desenhados para incluir essas regiões na amplificação dos 
exons. Além disso, é necessário realizar ensaios adicionais para confirmar a 
expressão e atividade da proteína insulina produzida pelo OGM. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Já o cientista 2 adotou outra estratégia, e inseriu no primer uma sequência 
complementar ao exon seguinte, e inserindo o sítio de restrição da BamHI 
somente nas pontas que vão se ligar ao vetor (pBR322), dessa forma: 
Primers: Região complementar ao exon seguinte + primer do exon 
Exon1 Primer forward: 5’ [GGATCC]ATGCCCACCC 3’ 
[GGATCC] = sítio de restrição BamHI 
Exon1 primer reverso: 3’ CCGGTAGTAC[AGTGTCGCC] 5’ 
Exon2 primer forward: 5’ TCACAGCGG 3’ 
Exon2 primer reverso: 3’ CCACAAACTC[CTCGATACGG ] 5’ 
Exon3 primer forward: 5’ GAGCTATGCC 3’ 
Exon3 primer reverso: 3’ GGTAACCGATC[GGATCC]5’ 
[GGATCC] = sítio de restrição BamHI 
Esse cientista também realizou cada reação de PCR individualmente, e após 
amplificação do DNA, ele adicionou uma etapa em que utiliza 5’ exonucleases para 
tratar os fragmentos amplificados, e depois a DNA polimerase + DNA ligase para 
unir os exons. No final, preparou o vetor pBR322 e a fita com todos os exons unidos 
com a enzima de restrição BamHI, para unir a sequência de exons com o vetor, e na 
presença de DNA ligase. 
a) Desenhe/escreva a sequência gerada após a etapa de amplificação por 
PCR para cada um dos exons. 
R: Sequências geradas após a amplificação por PCR para cada um dos exons, 
utilizando os primers descritos pelo cientista 2: 
Exon 1: 
5' GGATCCATGCCCACCC 3' 
3' AGTGTCGCCGGTAGTAC 5' 
Exon 2: 
5' TCACAGCGG 3' 
3' CCGATACGGAGTTTGTGG 5' 
Exon 3: 
5' GAGCTATGCC 3' 
3' GGATCCGATCGGTTACC 5' 
 
Nas sequências dos primers para cada exon, o cientista 2 inseriu uma região 
complementar ao exon seguinte, permitindo a ligação dos exons na etapa final. Além 
disso, o sítio de restrição BamHI foi adicionado somente nas pontas que vão se ligar 
ao vetor pBR322. Na etapa final, após amplificação e tratamento com exonucleases, 
os exons foram ligados entre si com a DNA ligase, e depois ligados ao vetor com a 
enzima de restrição BamHI. 
Desenhe/escreva a sequencia resultante após a etapa de ligação dos exons 
entre si. 
R: A sequência resultante após a etapa de ligação dos exons entre si ficará da 
seguinte forma: 
5’- GGATCCATGCCCACCCCACAAACTCCTCGATACGGGAGCTATGCC -3’ 
Observe que as regiões complementares dos primers para cada exon permitem a 
ligação dos exons entre si, formando uma única sequência contínua. Além disso, o 
sítio de restrição BamHI adicionado somente nas pontas que vão se ligar ao vetor 
pBR322 permitirá a inserção da sequência de exons no vetor, com a ajuda da 
enzima de restrição BamHI. 
b) Com base na sequencia final produzida, a proteína insulina será 
corretamente produzida? Justifique. 
R: A partir da sequência final produzida, não é possível afirmar com certeza se a 
proteína insulina será corretamente produzida, pois outros fatores podem influenciar 
a produção e estruturada proteína, como a expressão gênica, a tradução do RNA 
mensageiro em proteína, o processamento pós-traducional e a dobramento da 
proteína. Portanto, além de verificar se a sequência final produzida contém os 
elementos necessários para a produção da proteína insulina, é necessário realizar 
testes adicionais para verificar a expressão e atividade da proteína produzida e avaliar 
se ela possui a estrutura e função esperadas.