Aula 05 - Estudos Genicos Atualizada

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8 5BIOT-MT1
Biotecnologia
Profª. Drª Natássia Ribeiro
Estudos Gênicos
◼Estudos gênicos e genômicos: construção de bibliotecas de DNA e cDNA;
hibridização de ácidos nucleicos e sondas gênicas; amplificação de DNA por PCR;
sequenciamento de DNA; sequenciamento em larga escala.
◼ Ciências genômicas e sequenciamento de genomas completos: conceitos,
definições e desdobramentos; Transcriptomas e proteomas? Características. O
Projeto Genoma Humano: estratégias, descobertas, aplicações, desdobramentos
e questões éticas.
◼ Identificação genômica: sequências repetitivas e marcadores moleculares
utilizados em testes de paternidade e em identificação humana em geral; genética
forense; interpretação de resultados de testes.
Estudos gênicos e genômicos
◼ Genômica é o termo atribuído a todo e qualquer estudo
do genoma.
➢ O Genoma é o material genético dos seres vivos
transmitido à sua prole. É constituído pelo DNA.
Nos estudos de genômica se 
objetiva entender como os 
genes e a informação genética 
estão organizados dentro do 
genoma e como essa 
organização determina a sua 
função. 
Estudos gênicos e genômicos
◼ Dessa forma, a genômica permite o estudo de questões complexas
da genética molecular como, por exemplo, a manifestação do fenótipo
para características quantitativas como é o caso da maioria das
características da produção de animais, por exemplo.
Estudos gênicos e genômicos
◼ A Genômica Funcional utiliza os dados produzidos pelas análises
genômicas para descrever funções e interações dos genes e das
proteínas.
◼O foco da genômica funcional é compreender as funções do DNA
através dos genes, da transcrição, da tradução, e das interações
proteína-proteína. As técnicas mais usadas nessa área são a análise
da expressão diferenciada (Diferencial Display – DD), a análise serial
da expressão gênica (Serial Analysis of Gene Expression - SAGE) e os
microarranjos de DNA (Microarrays).
Disponível em: https://jornal.usp.br/ciencias/genomica-a-ciencia-que-
rompe-fronteiras-e-desafia-os-cientistas/
Estudos gênicos e genômicos
◼ Os genes controlam o desenvolvimento, o funcionamento e a
manutenção das células, sendo responsáveis por expressar
características que serão herdadas dos progenitores para seus filhos.
◼ Assim, as particularidades de cada organismo são conferidas por
seus genes.
◼ Enquanto um irmão herda do seu pai o gene que lhe dá a cor azul do
olho, o outro herda da sua mãe a cor castanha.
Estudos gênicos e genômicos
◼ E, apesar de um cachorro ser muito diferente de uma aranha, um
número surpreendente dos genes encontrados em seus genomas são
praticamente os mesmos.
◼ Os seres humanos e os camundongos, por exemplo, são espécies
muito semelhantes geneticamente, já que 99% dos genes humanos
foram mapeados em camundongos.
Estudos gênicos e genômicos
◼ Deste modo, ao mesmo tempo em que os genes explicam as
diferenças morfológicas ou funcionais entre as espécies, eles se
constituem na base comum que formula essas particularidades.
◼As diferenças entre um organismo e outro se dá pela maneira como
os nucleotídeos se distribuem ao longo da molécula de DNA.
Estudos gênicos e genômicos
◼ Cada indivíduo tem uma sequência, que difere significativamente de
espécie para espécie – e até mesmo dentro da mesma espécie, já que
os seres humanos são 99,9% idênticos (geneticamente falando), uma
pequena variação de 0,1% que faz cada um ser único.
Estudos gênicos e genômicos
◼ “Quando falamos em diferenças genéticas, estamos falando somente
da composição da sequência de DNA comparada entre duas ou mais
espécies. Estamos indicando o número de nucleotídeos que são
diferentes entre uma espécie e outra. Outros fatores, como os que
envolvem formação e composição das proteínas, silenciamento e
ativação diferencial de genes, elementos reguladores do genoma e
algumas variações estruturais, não são considerados. Todos esses
fatores em conjunto levam à grande diversidade existente e influenciam
diretamente nas diferenças morfológicas vistas”,
Explica Tábita Hünemeier, professora do Instituto de Biologia (IB) da USP.
A informação genética de cada ser vivo, contida em seu DNA, é única. A sequência
completa do DNA de um organismo compõe o seu genoma.
Fonte: DvComun/Esalq/USP
Mutações; Sequenciamento
◼ A partir da genômica, área da ciência que estuda o genoma de um
organismo, muitas informações importantes são obtidas, como a
presença de mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 – genes de
suscetibilidade ao câncer de mama.
◼ Para obter essas informações, pesquisadores utilizam diversas
técnicas moleculares que se baseiam em extrair, amplificar, sequenciar
e analisar o material genético de um determinado organismo.
Mutações; Sequenciamento
◼ Inicialmente, é realizada a extração do DNA, que pode ser obtido de
qualquer região do corpo, a depender sempre da pergunta que se quer
responder. Após esse passo, é necessário amplificar esse DNA, para que seja
aumentado o número de cópias da molécula, facilitando as análises
subsequentes.
◼ Em seguida, é necessário sequenciar o genoma, que significa obter a ordem
dos nucleotídeos do DNA de uma determinada espécie – no caso do ser
humano, os seis bilhões de bases nitrogenadas.
◼ E por fim analisar os dados obtidos, seja com base em estudos já
publicados, ou inferir resultados pioneiros.
◼As descobertas com esse tipo de estudo são variadas, incluindo pesquisas
relacionadas à saúde, alimentação, extinção de espécies etc.
◼ Ao realizar a comparação genética de diferentes espécies, os cientistas descobriram,
por exemplo, quando a vida surgiu na Terra – há cerca de 3,5 bilhões de anos –, além
de concluírem que os genes são passados de geração a geração, e por processos
evolutivos, modificações ocorridas no DNA dão origem a novas espécies.
Estudos Genéticos
gene dihidrofolato redutase (DHFR)
Mutações; Sequenciamento
◼ Atualmente, o sequenciamento do genoma humano é considerado a parte
fácil do trabalho.
◼ Enquanto o custo do primeiro genoma humano foi de quase três bilhões de
dólares, hoje já é possível obtê-lo por menos de mil dólares.
◼ A parte difícil do trabalho é como desvendar o significado de uma sequência
de DNA, um grande desafio para os cientistas, que encontram muita
informação, a ponto de não saber o que fazer com ela.
◼ Afinal, são milhões de letras que contam sobre a vida de um organismo. Mas
as histórias escritas por essas letras não são simples de serem decifradas.
Mutações; Sequenciamento
◼ O sequenciamento de um DNA é só uma ponta do iceberg. Após sua
obtenção, são necessárias análises computacionais árduas para
identificar quais trechos da sequência correspondem a genes,
comparar a sequência com indivíduos da mesma espécie e de
espécies diferentes etc.
◼ Para a obtenção dessas informações, dentro da genética, há o
mundo das “ômicas”, como:
◼ a genômica, ciência que estuda o genoma de uma espécie a
partir da obtenção da sua sequência, com o objetivo de entender
a sua estrutura, organização e função.
Mutações; Sequenciamento
◼ Há também:
◼ A transcriptômica, que analisa as moléculas de RNA;
◼ A proteômica, que estuda as proteínas formadas pela
expressão gênica;
◼ A metabolômica, que estuda as pequenas moléculas
orgânicas, etc.
A integração de todas essas ferramentas tem permitido
resultados muito promissores.
Mutações; Sequenciamento
◼ “A genética tem passado por várias revoluções nas últimas décadas, que foram
intensificadas nos últimos 10 anos. A meu ver, a grande revolução em relação à
genética médica é o Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
(CRISPR, na sigla em inglês) – que consiste em uma técnica capaz de editar o
genoma de uma determinada espécie –, pois pela primeira vez temos a
oportunidade de reverter os fenótipos afetados pela edição direta das regiões que
contém mutações patogênicas. Nesse contexto acho que teremos ainda mais
avanços, e com eles surgirão discussões éticas a respeitodos limites para o uso
dessa nova técnica”
(Tábita Hünemeier, professora do Instituto de Biologia (IB) da USP).
Biblioteca Genômica e de cDNA
Biblioteca Genômica
◼ É uma coleção de clones que representam a totalidade do genoma de um
determinado organismo
Características das Bibliotecas de DNA
◼ São usadas para principalmente para
procariotos
◼ Em eucariotos usa-se biblioteca genômica
para estudo de regiões reguladoras
◼ Independe do tipo de célula utilizada para
a obtenção do DNA
Biblioteca de cDNA
◼ É o conjunto de clones das seqüências
codificadoras que estão sendo expressas pela
célula naquele momento, obtido através da
clonagem de moléculas cópias do mRNA.
◼ É usada principalmente para células
eucarióticas.
◼ Varia de acordo com o tecido utilizado.
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◼ É a formação de molécula fita dupla,
através do pareamento de duas fitas de
DNA ou uma de DNA e outra de RNA
complementares, mas de origens
diferentes
◼ Hibridização  Renaturação
HIBRIDIZAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS
◼ Triagem de Bibliotecas Genômicas
◼ Diagnóstico molecular
◼ Tipagem molecular
◼ Teste de paternidade
◼ Medicina forense
Aplicações
Triagem de uma biblioteca
Conhecer parte da 
seqüência do gene
Seqüência completa do 
gene
Sonda de DNA Utilizar sonda de 
oligonucleotídeos derivado de 
uma proteína
Codon degenerado
Conhecer cerca de 6 aa 
contíguos
Anticorpos
1- Detecção do produto do gene pelo uso de anticorpos
Marcação da Sonda de DNA
•Radioativa: 32P 
•Não radioativa
• peroxidase, 
• fosfatase alcalina
SONDA de DNA
- Seqüência de DNA Marcada
Marcação da Sonda de DNA
•Enzimática: peroxidase, fosfatase alcalina
Desnaturação DNA
DNA fita simples
Ligação Fraca 
(DNA+ Peroxidase)
Sondas Covalentemente 
marcada com a enzima
+ peroxidase 
complexada com 
polimero positivo
+ glutaraldeído
2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização
1
2
3
456
Placas com Colônias 
contendo os 
plasmídeos
Lise das Bactérias – Desnaturação do DNA
SondaFilme de Raio - X
2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização
Caracterização da seqüência encontrada
• Seqüenciamento de DNA
• PCR
• Expressão da seqüência codificadora
Southern Blot - DNA
Northern Blot - RNA
Western Blot - Proteína
Análise do DNA e RNA por 
eletroforese em gel e "blotting".
◼ Várias técnicas foram desenvolvidas baseadas nas propriedades de
hibridação dos ácidos nucleicos visando a triagem e isolamento de
sequências específicas destas moléculas. A maioria destas técnicas,
trabalha com uma réplica do DNA de interesse imobilizado num
suporte sólido tal como uma membrana de nailon ou de nitrocelulose.
◼ Um destes métodos, desenvolvido na década de 70 por
E.M.Southern, tornou-se conhecido por "Southern blotting".
Análise do DNA e RNA por 
eletroforese em gel e "blotting".
◼ Nesta técnica o DNA é digerido com uma ou mais enzimas de restrição e os
fragmentos resultantes separados por eletroforese num gel de agarose.
◼ Os fragmentos de DNA dupla fita são visualizados por coloração com brometo de
etídio, denaturados ‘in situ" com hidróxido de sódio e transferidos para uma membrana
por capilaridade, com o auxílio de uma solução de alta concentração salina.
Análise do DNA e RNA por 
eletroforese em gel e "blotting".
◼ Tais condições permitem que o DNA seja retido na membrana no
ponto de contacto entre o gel e a membrana, criando portanto uma
réplica do gel.
◼ O DNA é covalentemente ligado à membrana usando-se calor ou luz
ultravioleta.
◼ Sondas de ácidos nucleicos (DNA ou RNA marcados
radioativamente) podem ser utilizadas para hibridar com o DNA
fixado na membrana e a posição na qual a ligação específica ocorrer
pode ser detectada por autoradiografia da membrana (Figura. 31).
(a) Electrophoresis of nucleic acids. (b) An agarose gel loaded with six digested 
DNAs and stained with ethidium bromide. The scale on the left corresponds to DNA 
size markers. (c) Transfer of nucleic acids to a nylon membrane by capillary action. 
(d) Southern blot of the agarose gel in (b) hybridized with a radio-labelled DNA 
probe. (The positions of the size markers are indicated.) 
Análise do DNA e RNA por 
eletroforese em gel e "blotting".
◼ O padrão de hidridação pode ser comparado diretamente com a região no
gel original que contém a sequência de DNA de interesse.
◼ Southern blotting é uma técnica tão poderosa que permite que as
informações obtidas sejam utilizadas para a construção de um mapa de
restrição de uma determinada parte do DNA clonado, por exemplo, para
identificar a região que contém o gene de interesse.
◼ Esta técnica possibilita também que as sondas de ácidos nucleicos sejam
utilizadas para diagnósticos de distúrbios genéticos, ensaiando-se o DNA
genômico dos indivíduos afetados e de seus familiares.
• Sonda: seqüência de DNA marcada
Transferência de DNA do gel para a membrana
Southern Blot
Análise do DNA e RNA por 
eletroforese em gel e "blotting".
◼ De modo análogo, moléculas de RNA também podem ser identificadas após
serem separadas por eletroforese, transferidas para nitrocelulose, sofrerem
hibridação com sondas de DNA ou RNA.
◼ Esta técnica de analisar RNA, por analogia ao Southern blotting, recebeu o
nome de Northern blotting.
◼ Esta técnica é útil como auxiliar na análise de clones de cDNA porque, o
tamanho do mRNA específico pode ser comparado com o tamanho dos
cDNAs clonados, revelando a integridade dos clones. Além disto, esta
técnica permite indicar em qual tecido ou tipo celular um determinado gene é
expresso ou quais são os fatores que regulam a sua expressão .
4. Geração de uma sonda marcada
pGEM-T
dATP
dGTP
dTTP
dCTP
1. Extração do DNA
2. Eletroforese do RNA
3. Transferência para a membrana
5. Hibridização
6. Visualização
Northern Blot – RNA
Método de análise 
de ácidos nucléicos
ANÁLISE DO CLONE RECOMBINANTE 
◼ Um passo crucial na Tecnologia do DNA recombinante é encontrar o
clone correto na mistura de clones que foi criada durante os
procedimentos da confecção da biblioteca genômica ou de cDNA.
◼ Embora seja relativamente fácil selecionar as colônias que abrigam os
vetores de clonagem usando os marcadores de resistência a antibióticos
que estão presentes nos vetores é muito mais difícil selecionar o clone
que contenha o gene de interesse.
ANÁLISE DO CLONE RECOMBINANTE 
◼ Note que no caso do vetor ser um plasmídeo deverão ser examinadas milhões
de colônias de bactérias crescidas em placas de petri contendo agar, para a
detecção daquela(s) colônia(s) que produza(m) pequenas quantidades da
proteina expressa pelo gene de interesse ou então que possua(m) o gene de
interesse sem qualquer expressão proteica que o caracterize.
◼ Será discutida a situação mais comum onde a proteina não é expressa e a
análise será feita através da própria presença do DNA de interesse no fago ou
na bactéria.
O uso de sondas moleculares de ácidos 
nucleicos para identificar o gene de 
interesse
◼ Como pode ser detectado um gene de interesse entre as colônias
da biblioteca genômica ou de cDNA, se este gene não é
expresso?
◼ Quando o DNA em solução aquosa é aquecido à 100° C, ou exposto à pH alto, as
bases complementares que normalmente seguram as duplas hélices juntas são
dissociadas em duas fitas simples. Este processo é chamado de denaturação.
◼ Estas mesmas fitas simples poderão se reassociar se forem conservadas à 65° C, por
longos períodos, num processo chamado de renaturação (ou hibridação, quando a
associação ocorre entre ácidos nucleicos de diferentes origens).
◼ Reações de hibridação ocorrem entre qualquer duas cadeias de ácidos nucleicos de fita
simples (DNA:DNA, RNA:DNA ou RNA:RNA) desde que tenham sequências de
nucleotídeos complementares.
O uso de sondas moleculares de ácidos 
nucleicos para identificar o gene de 
interesse
◼ Esteprincípio da hibridação molecular é fundamental para caracterizar DNAs
recombinantes quando o gene de interesse não é expresso.
◼ Sondas de ácidos nucleicos (fragmentos de ácido nucleico marcados
radioativamente, geralmente com 32P) são utilizadas para localizar clones,
numa biblioteca genômica ou de cDNA, que carreguem uma sequência de
DNA de interesse.
◼ Após a confecção da biblioteca genômica (ou de cDNA) os fagos carregando
DNA recombinante são espalhados juntamente com uma suspensão de
bactérias numa placa de petri contendo meio de cultura sólido.
O uso de sondas moleculares de ácidos 
nucleicos para identificar o gene de 
interesse
◼ Uma vez visualisadas as placas de lise (ou as colônias, no caso do vetor ser
um plasmídeo) é preparada uma réplica de cada placa de petri com uma
membrana de náilon ou de nitrocelulose. Este processo permite a
transferência de uma porção de fagos de cada placa de lise (ou de bactérias
de cada colônia) para a membrana, de tal maneira que o padrão das placas
de lise da placa de petri original seja mantido na membrana.
O uso de sondas moleculares de ácidos 
nucleicos para identificar o gene de interesse
◼ Para identificar qual das placas de lise porta o gene de interesse esta
membrana é tratada para expor e desnaturar o DNA das colônias ali
presentes e incubado com uma solução de DNA ou RNA fita simples,
marcado radioativamente e complementar ao gene de interesse para
permitir a hibridação.
◼ Dois polinucleotídeos simples
fitas somente irão se hibridar se
forem complementares.
Triagem de uma biblioteca
genômica ou de cDNA, construídas
no fago g , com uma sonda
molecular para encontrar um clone
de interesse. Esta triagem é feita
espalhando-se os fagos
previamente incubados numa
cultura de bactérias, em várias
placas de agar. Depois que as
placas de lise tornam-se visíveis,
são feitas as réplicas em
membrana de nitrocelulose, seu
DNA é exposto e hibridizado com a
sonda molecular. A posição do
clone recombinante de interesse é
identificada através de
autoradiografia. O DNA é isolado
dos fagos presentes na placa de
lise positiva, identificada na placa
de petri original e submetido à
análises posteriores
O uso de sondas moleculares de ácidos 
nucleicos para identificar o gene de 
interesse
◼ Esta sonda molecular radioativa pode ser parte de um gene já clonado para o
qual se procura o gene total, pode ser o DNA de um gene vizinho ao gene de
interesse, pode ser o RNA de genes que são expressos em tecidos
específicos ou em estágios específicos do ciclo celular, ou mesmo o gene de
uma outra espécie que codifica para a mesma proteína.
◼ Neste último caso, a reação de hibridação pode ser realizada em baixa
temperatura (420C ao invés de 650C) e em baixa concentração de sal (baixa
estringência) para permitir a hibridação mesmo entre DNAs que tenham
algumas bases não complementares.
O uso de sondas moleculares de ácidos 
nucleicos para identificar o gene de 
interesse
◼ Genes que respondem a um mesmo mecanismo de regulação podem
ser identificados numa biblioteca de cDNA por hibridação diferencial.
Isto é, genes expressos em tecidos específicos, em estágios
específicos do desenvolvimento ou do ciclo celular e genes regulados
por fatores de crescimento são adequados para serem analisados por
este tipo de abordagem.
O uso de sondas moleculares de ácidos 
nucleicos para identificar o gene de interesse
Para esta identificação é necessário produzir duas populações celulares (ou extrair mRNA de 
dois diferentes tecidos) uma na qual eles não se expressam e outra na qual eles se expressam. 
Suponha por exemplo, que uma biblioteca de cDNA seja preparada usando o mRNA isolado de 
células tratadas com fatores de crescimento. Esta biblioteca é plaqueada e transferida para 
dois conjuntos de membranas de nitrocelulose. Um conjunto é ensaiado com DNA marcado 
radioativamente preparado por transcrição reversa do RNA das células tratadas com os fatores 
de crescimento. O outro conjunto de filtros é hibridado com cDNA preparado de células não 
tratadas. Clones positivos identificados por hibridizar mais fortemente com a primeira sonda 
codificam mRNAs induzíveis pelos fatores de crescimento. 
Clonagem de
genes
regulados por
fatores de
crescimento
através de
hibridação
diferencial.
Esta
estratégia é
utilizada para
clonar uma
família de
genes que
são induzidas
quando
células
quiescentes
são
estimuladas a
crescer pela
adição dos
fatores de
crescimento
O uso de sondas moleculares de ácidos 
nucleicos para identificar o gene de 
interesse
◼ Quando o DNA a ser clonado expressa uma proteina cuja sequência
é conhecida pode-se inferir a sequência de um trecho de DNA que
lhe deu origem e sintetizar oligonucleotídeos que lhe sejam
complementares para serem utilizados como sondas moleculares.
◼ Estes nucleotídeos devem ter pelo menos 17 a 20 nucleotídeos de
comprimento para ser específico para a sequência procurada.
O uso de sondas moleculares de ácidos 
nucleicos para identificar o gene de 
interesse
◼ Um problema enfrentado para sintetizar estes oligonucleotídicos é a
degenerecência do código genético. Alguns aminoácidos são
codificados por quatro ou mesmo seis diferentes códons e portanto
mesmo um pequeno polipeptídeo pode ter sido codificado por várias
sequências de DNA.
◼ Para contornar este problema as sondas oligonucleotídicas são
algumas vezes sintetizadas como uma mistura de todas as possíveis
combinações dos códons que são traduzidas naquela sequência
proteica.
◼ Uma destas sequências é correta e irá hibridar com o clone de
interesse, mas a possível hibridação dos outros oligonucleotídeos
com sequências sem interesse pode levar a obtenção de clones
falsos positivos.
O uso de sondas moleculares de ácidos 
nucleicos para identificar o gene de 
interesse
◼ Uma variação deste método é utilizar o menor número possível de
oligonucleotídeos como sonda, escolhendo a região da proteina que
contém o menor número possível de códons degenerados (por
exemplo, metionina é somente codificada pelo códon AUG). Deve-se
levar em conta também qual é o códon de uso mais frequente para
cada aminoácido, na espécie que está sendo analisada
Questões ENADE 
Biotecnologia 
QUESTÃO 6 (2010)
◼ Microrganismos, como a bactéria Helicobacter pylori, são usados como marcadores de migração
de populações e ancestralidade de diversos povos por possuírem altas taxas de mutação em
seus HouseKeeping genes (genes essenciais). O registro dessas alterações pode indicar o índice
de ancestralidade e o padrão de migração de populações. A técnica de biologia molecular de
maior valor científico para o reconhecimento das variações genéticas nesses microrganismos, por
possibilitar a comparação entre espécies isoladas de diferentes fontes e oferecer resultados finais
inequívocos, é:
a) A análise de diferentes fragmentos gerados por enzimas de restrição e separados por eletroforese
(RFLP).
b) A amplificação de fragmentos de DNA de forma randômica (RAPD), para comparação dos
segmentos produzidos ao término da reação.
c) A reação em cadeia pela polimerase (PCR), que amplifica sequências passíveis de serem
confrontadas entre espécies.
d) O sequenciamento de DNA, que possibilita a identificação da sequência das bases nitrogenadas
das moléculas, favorecendo as análises comparativas.
e) A citometria de fluxo, que possibilita a separação de frações espécie- específicas, facilitando a
comparação entre espécies.
◼ Nos dias de hoje, observa-se crescente preocupação com a identificação e a
rotulagem de determinados materiais, tais como alimentos e subprodutos
que contenham organismos geneticamente modificados (OGMs), mais
pela ótica do direito do consumidor final à informação do que por uma
preocupação mais específica quanto à segurança. Há que se considerar os
requisitos técnicos que devem ser cumpridos pelos centros responsáveis
pelo armazenamento, manutenção e distribuição de material biológico,
bem como a necessidadede que os métodos e processos de medição
associados às atividades de manipulação e produção sejam estabelecidos
com rigor técnico.
BRASIL. Ministério da Ciência e Tecnologia. Sistema de Avaliação da
Conformidade de Material Biológico. Brasília, SENAI/DN, 2002, p.11 (com adaptações).
Tendo como referência o texto acima, faça o que se pede nos itens a seguir:
a) Em relação a possíveis impactos ambientais e efeitos sobre seres vivos,
quais motivos justificam a preocupação da população com a segurança na
produção e distribuição de OGMs?
b) Quais os possíveis benefícios que a utilização de OGMs pode trazer à
população humana?
Questões ENADE 
Biotecnologia