tecnicas de estudos de transcriptoma

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Análise de transcriptomas
Eduardo M. Reis
Departamento de Bioquimica
IQ - USP
Fevereiro 2011
Curso de Verão em Bioinformatica 2011
IME - USP
O que é o transcriptoma ? 
• O transcriptoma corresponde a fração do código genético (DNA) que é 
transcrita pela RNA polimerase em moléculas de RNA.
• Depende do estágio do desenvolvimento, estado fisiológico e tipo de 
tecido.
Transcriptoma
= Coleção de RNAs (transcritos) presentes em uma célula/tecido em
um dado momento.
Principais Tipos de RNA codificados no 
Genoma
• RNAs mensageiros (mRNA): contém a informação 
genética que codifica a sequência de aminoácidos 
das proteínas
• RNAs transportadores (tRNA): identifica e 
transporta os aminoácidos até o ribossomo. 
Responsáveis pela leitura do código genético.
• RNAs ribosomais (rRNA): constituinte dos 
ribossomos. Síntese protéica.
• Pequenos RNAs nucleares envolvidos no 
processamento de outros RNAs (snRNAs, 
snoRNAs)
• Pequenos RNAs regulatórios: micro RNAs, 
piRNAs, pasRNAs
• Longos RNAs regulatórios (RNAs não-
codificadores)
Bolha de transcrição
Fita molde
(antisenso)
RNA 
polimerase
Direção da transcrição
Fita codificadora 
(senso)
Desenovelamento
Re-enovelamento
Transcrição do DNA
Trancrição e tradução são acopladas em procariotos
Etapas 
envolvidas na 
expressão de 
genes em 
eucariotos
Transcrição
Processamento
Transporte
Tradução
Citoplasma
Núcleo
Promotores de genes bacterianos
Região -10Região -35 Posição +1
Genes codificantes
para RNA ribosomal
possuem elementos UP
Região -40 a -60
A transcrição do RNA se inicia em regiões específicas
do genoma: Regiões Promotoras
Estrutura de um gene eucariótico
Citoplasma Núcleo
DNA genômico
Pre-mRNA
mRNA
Transcrição
Processamento
• adição de cap 5’
• adição de cauda poliA 3
• remoção de introns (RNA splicing)
Promotor do gene codificador da strictosidina 
sintase, enzima da via de síntese de alcaloides em 
plantas.
Abundância de RNAs em eucariotos é regulada por
fatores de transcrição, proteínas que se ligam ao DNA e
a RNA polimerase e ativam ou reprimem a transcrição
DNA
mRNA
Proteina
Transcrição
Tradução
Papéis estruturais e 
metabólicos
substrato produto 
Genômica
(Genoma) 
Transcriptômica
(Transcriptoma)
Proteômica
(Proteoma)
Metabolômica 
(Metaboloma) 
morfologia
fisiologia
 comportamento
ecologia
Genótipo
Fenótipo
O mundo “omics”
Análise de Transcriptomas em larga-escala
• identificação de todos os RNAs expressos em um dado 
organismo ou tecido.
• compararação do perfil de expressão gênica em diferentes 
condições ambientais, estados patológicos, fisiológicos ou de 
desenvolvimento.
• caracterização de polimorfismos associados aos genes transcritos: 
formas alternativas de splicing e SNPs.
•Identificação de genes e vias moleculares envolvidas em processos 
biológicos :
“guilt by association”: genes com perfil de expressão semelhante podem 
estar funcionalmente relacionados ou sob o mesmo mecanismo e 
controle.
•Fornecer pistas sobre as funções de genes ainda não caracterizados a 
partir do estudo do padrão espacial (localização sub-celular) e temporal 
de expressão.
•Identificar marcadores para diagnóstico molecular de doenças 
•Os padrões de expressão gênica podem indicar eventos de regulação em 
cis- e em trans- , permitindo assim a inferência acerca de diferenças 
genéticas entre indivíduos.
•Podem ainda indicar alterações no proteoma e/ou metaboloma.
Que informações podem ser obtidas através da
análise de transcriptomas ?
Experimentais: permitem a quantificação do nível de 
expressão gênica
• Differential display (RT-PCR)
• Sequenciamento de ESTs
• SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)
• Massive Paralel Signature Sequencing (MPSS) 
• Microarrays de DNA
• RNA-seq
Métodos para estudo de transcriptomas
In silico: requerem conhecimento da sequencia genômica
• predição de genes ab initio 
• busca por domínios protéicos conhecidos
• busca por homologia com outros organismos
• Síntese fotoquímica in situ.
•Milhões de cópias identicas mesmo oligonucleotídeo 
estão arranjadas em “features”. 
• Human Genome U133 Set: 45,000 “probe sets” 
representando 39,000 transcritos de 33,000 genes 
humanos.
• cada “probe set “ é composto por 11–16 pares de 
25-mer oligonucleotideos selecionados a partir da 
sequência de cada transcrito.
• “Perfect-match” e “”Mismatch” probes
GeneChip 
(oligoarray)
“Wafer”
1,27cm
feature
15
Affymetrix - Síntese de oligoarrays in situ 
através de fotolitografia
16
Sequenciamento por hibridização (Affymetrix)
Oligoarrays de alta-densidade
Chee M. Assessing genetic information with high-density oligonucleotide arrays. Science 1996
17
Agilent 60-mer Ink-jet oligoarrays
244 k elementos
18
Agilent 44k element 
oligoarray
SurePrint Technology“Zoom in”
Detecção de splicing alternativo utilizando 
microarrays
19
Pan et al., Mol. Cell 16:929-941, 2004
20
Como s o utilizados os microarranjos de DNA?ã
Dupla-h liceé
de DNA
Experimentos com microarranjos de DNA
Johnson et al, Trends in Genetics, 21:93-102, 2005
Análise de transcrição em larga-escala
utilizando “tiling” arrays genômicos
Mattick and Makunin Hum.Mol.Genet. 15:R17-R29, 2006
genoma
Transcrição documentada
nas 2 fitas do genoma
Regiões transcritas do
genoma (60-70%) incluindo
introns
2% do genoma ocupado por
regiões codificadores 
deproteínas
Maior parte do genoma humano é transcrito
em RNAS não-codificadores
25
Projeto ENCODE 
Encyclopedia of DNA Elements
Different and redundant approaches to delineate the transcriptional and epigenetic landscapes of ~1% the human genome:
44 genomic regions encompassing 30 Mb of the human genome studied in great detail:
→ 15Mb in 14 regions for which there is already substantial biological knowledge.
→ 15Mb in 30 regions randomly picked
NATURE, 447:799-816 14 June 
2007
Transcrição não-codificadora ubíqua ao longo do genoma (93% do genoma) 
Rede interconectada de loci gênicos 
Trancrição de RNAs não-codificadores se 
correlaciona com a complexidade biológica
from Hüttenhofer et al., 2005 TIGS 21:289-297 Birney et al., 2007 Nature 447: 799–816.
27
microRNAs como reguladores
da expressão gênica
• Micro RNA primário (pri-
miRNA)
transcrito no núcleo
• Clivagem pela enzima Drosha 
(RNAse tipo III)
• Micro RNA precursor (pre-
miRNA, ~70 nt) exportado para 
o citoplasma
• Clivagem específica pela 
enzima Dicer
(RNAse tipo III) produz 
microRNAs maduros (21-22 nt)
• microRNAs promovem o 
silenciamento específico de 
mRNAs-alvo através do 
complexo RISC (“RNA Induced 
Silencing Complex”)
Funções de RNAs não=codificadores longos
Wilusz J E et al. Genes Dev. 2009;23:1494-1504
RNA não-codificador HOTAIR regula 
cromatina através do recrutamento de 
enzimas modificadoras de histonas 
Rinn et al., Cell 2007, 129:1311-1323
RNAs não-codificadores longos intrônicos e antisenso
~ 1 . 1 K b
R A S S F 1 ( C h r 3 p 2 1 . 3 1 )
5 0 , 3 3 1 , 6 0 85 0 , 3 3 0 , 5 5 3 5 '
3 ' 5 '
3 '
~ 0 . 8 K b
A P 1 G B P 1 ( C h r 1 7 q 1 2 )
3 6 , 1 0 7 , 8 0 63 6 , 1 0 7 , 0 0 6 5 '
3 ' 5 '
3 '
C
G
E
~ 0 . 6 K b
P P H L N 1 ( C h r 1 2 q 1 2 )
4 1 , 1 0 6 , 8 5 44 1 , 1 0 6 , 2 6 8 
5 '
3 ' 5 '
3 '
A
T L E 3 ( C h r 1 5 q 2 3 )
3 6 , 0 7 5 , 0 9 63 6 , 0 7 4 , 7 9 6 5 '
3 '
3 '
5 '
4 1 , 0 0 6 , 2 3 4 
3 6 , 0 7 4 , 5 5 8 3 6 , 1 6 4 , 9 9 6
4 1 , 1 2 7 , 3 9 4 
5 0 , 3 2 6 , 2 2 8 5 0 , 3 3 7 , 3 7 9
3 6 , 0 5 8 , 2 3 63 6 , 1 0 4 , 9 7 6
e x o n 1 3e x o n 1 4
e x o n 1 0e x o n 9
9 . 5
7 . 5
4 . 4
2 . 4
1 . 3
0 . 2 4
k b
D
F
B
5 . 0
1 . 9
k b
5 . 0
1 . 9
k b
5 . 5 3
Sp
le
en
Th
ym
us
P
ro
st
at
e
Te
st
is
PC
3
D
U
14
5
Ln
C
ap
PC
3
D
U
14
5
Ln
C
ap
0 . 6 6
RASSF1
PPHLN1
RASSF1
PPHLN1
Reis et al. Oncogene 23: 6684-6692, 2004
GAS6
Reis et al., Oncogene 2005, 23: 6684-6692; Louro et al. BMC Biology 5:4, 2007
Ao menos 74% dos loci gênicos codificadores de proteína 
(11,679 RefSeqs) possuem regiões intrônicas 
transcricionalmente ativas que originam ncRNAs totalmente 
(TIN) ou parcialmente (PIN) intrônicos
Nakaya et al., Genome Biology 2007, 8:R43
Tipo de sonda Nº de sondas
TIN (senso/antisenso) 7,715 x 2 = 15,430
PIN (senso/antisense) 5,289 x 2 = 10,578
Exon codificador 14,403 
34
Grau de Gleason (GS) 
Diagrama esquemático do sistema
de classificação de Gleason
Gleason Risco de for recorrência do tumor
2 - 6 Baixo
7 Intermediário
8 - 10 Alto
Identificação de ncRNAs intrônicos associados 
a agressividade do câncer de próstata
Gleason 
Grade
# of 
samples
G 5 1
G 6 5
G7 16
G9 1
G10 4
Total 27
G 5 1
G 6 5
G7 16
G9 1
G10 4
Total 27
Grau de
Gleason 
# de
amostras 
G 5G 5 11
G 6G 6 55
G7G7 1616
G9G9 11
G10G10 44
TotalTotal 2727
35
Classifica o n o-supervisionada:çã ã
Clusteriza o hier rquica de 27 amostrasçã á
de c ncer de pr stata a partir dos dados de 3.355 genesâ ó
36
Moreira et al., manuscrito em preparação
Preditores de evolução clínica identificados a partir de 
perfis globais de expressão gênica
Classifica o supervisionada:çã
37
65 transcritos (21 exonicos, 44 intronicos) correlacionados 
com a recorrência do câncer de próstata
SNR p-value<0.01
28 sample28 amostras do conjunto de treinamento
Moreira et al., manuscrito em preparação
38
Transcritos intr nicos ô mais abundantes s o originados emã
regi es intr nicas de genes relacionados com õ ô regula o da transcri oçã çã
123 genes
Em pelo menos 1 tecido
categoria GO 'Regulation of transcription, DNA-dependent' (GO:006355)
está significativamente enriquecida (p < 0.002) entre os 40% antisenso TINs
mais abundantes nos 3 tecidos estudados
Nakaya et al., Genome Biology 2007, 8:R43
Identificação de vias metabólicas/regulatórias 
enriquecidas em assinaturas de expressão gênica
39
Assinatura de expressão gênica preditora de 
metástase no câncer de mama
• 113 transcritos
77 ex nicosô
8 interg nicosê
28 intr nicosô
• 18 amostras de adenocarcinoma ductal invasivo
• Seguimento m nimo de 4 anosí
Sem metástase
Com metástase
Durães et al., manuscrito em preparação
Marcadores moleculares do
adenocarcinoma de pâncreas
 M�dia_ trimada_Teste-t(p<0.01)_z-score-TvsPC+N_L�minas_2007
T N / PC 
* 
Ana Carolina Tahira
Bianca Dazzani
Michele Farias
Colaboradores:
Dr. Marcel Machado
Dra. Márcia Kubrusly
FMUSP – Dep. Cirurgia
41
Qual a função de RNAs não codificadores intrônicos ?
Como são regulados ?
AAAAAA
Re
gu
la
çã
o 
??
?
ncRNA
antisenso
42
Cell 116: 499-509, 2004
PNAS 100: 12247-12252, 
2003
[...] Strikingly, a significant proportion of binding was seen in intronic regions, 
demonstrating that transcription factor binding is not restricted to promoter 
regions. [...]
Evidências de fatores ativadores da transcrição em
regiões não-codificadoras do genoma humano
A expressão de RNAs intrônicos não-codificadores é 
regulada por fatores semelhantes aos que regulam genes 
codificadores? 
Identificação de transcritos intrônicos não-codificadores com 
expressão regulada por andrógeno 
RNAs diferencialmente expressos na 
linhagem tumoral de próstata LNCaP 
tratada com andrógeno em relação a 
controles não-tratados
•Significance Analysis of Microarrays 
(SAM)
•Fold-change ≥1.5X
•False Discovery Rate ≤ 5% 
6h 9h 12h 18h 24h 48h
6h 9h 12h 18h 24h 48h
134 mRNAs codificadores 28 ncRNAs intrônicos
Louro et al. BMC Biology 5:4, 2007
Louro et al. BMC Biology 5:4, 2007
Identificação de ncRNAs intrônicos antisenso 
com expressão regulada por andrógeno 
45
Louro et al. BMC Biology 5:4, 2007
46
RNAS intrônicos : mecanismo envolvido no ajuste fino da regulação da expressão gênica:
Hipótese 1: estabilização/desestabilização da cromatina transcripcionalmente ativa e/ou do pre-mRNA
Transcrição
CH3
CH3CH3
CH3
Ilhas CpG
pre-mRNA
RNA intrônico antisenso
TF
A
TFBS
+
TFB
S
Pol IITF
Pol II
Reis et al. (2005) OMICS 9: 2-12 
47
Louro et al.,manuscrito em preparação
RNAs intrônicas antisenso cuja abundância está 
inversamente relacionada com a abundância do gene 
codificante para proteína
Louro et al. BMC Biology 5:4, 2007
48
RNAS intrônicos : mecanismo envolvido no ajuste 
fino da regulação da expressão gênica
Hipótese 2: Modulação da abundância de formas alternativas de splicing
Reis et al. (2005) OMICS 9: 2-12 
spliced-out introns
variante de splicing 1
Proteína
isoforma 1
Pré-mRNA
RNA antisenso intrônico
S
C
Proteína
isoforma 2
Splicing Splicing
Alternativo
Tradução Tradução
B
variante de splicing 2
spliced-out introns
S
C
S
C
S
C
+
mRNA 
processado
mRNA 
processado
Complexo do 
Spliceosoma
spliced-out introns
variante de splicing 1
Proteína
isoforma 1
Pré-mRNA
RNA antisenso intrônico
S
C
Proteína
isoforma 2
Splicing Splicing
Alternativo
Tradução Tradução
B
variante de splicing 2
spliced-out introns
S
C
S
C
S
C
+
mRNA 
processado
mRNA 
processado
Complexo do 
Spliceosoma
SAF: a natural intronic antisense message 
modulates the sub-cellular localization of the 
Fas protein
Yan et al., Hum. Mol. Genet. 14:1465–1474, 2005
50
Louro et al. BMC Biology 5:4, 2007
Abundância de RNAs intrônicos antisenso 
regulados por andrógeno está correlacionada ao 
padrão de splicing do gene codificador para 
proteína correspondente
Etapas envolvidas na 
expressão de genes em 
eucariotos
Transcrição
Processamento
Transporte
Tradução
Citoplasma
Núcleo
Spector DL 2001, Journal of Cell Science 114: 2891-2893
Estruturas nucleares em células de mamíferos
Paraspeckle e a retenção nuclear de RNAs 
hipereditados A-I
from Chen & Carmichael, 2009 Molecular Cell 35, 467–478
Diferenciação celular
CTN-RNA, um RNA não codificador expresso no locus do gene codificador para o
transportador de aminoácidos catiônicos mCAT2, é retido no núcleo e se
Localiza em paraspeckles.
Kannanganattu et al., 2005 Cell 123: 249-263 
55Kannanganattu et al., 2005 Cell 123: 249-263 
Conjuntos de mRNAs e ncRNAs intrônicos encontram-se 
enriquecidos na fração nuclear
57
emreis@iq.usp.br
Departamento de
Bioquímica
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	Agilent 44k element oligoarray
SurePrint Technology
	Detecção de splicing alternativo utilizando microarrays
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	Projeto ENCODE 
Encyclopedia of DNA Elements
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	Marcadores moleculares do
adenocarcinoma de pâncreas
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	Paraspeckle e a retenção nuclear de RNAs hipereditados A-ISlide 54
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