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SEÇÃO 6: TÓPICOS ESPECIAIS Carcinogênico Caroinogênico Co- primário secundário carcinogênico Enzimas metabolizadoras Promotor Metabólito reativo ~N/ Alteração do DNA (mutação) _ Expressão do oncogene Transformação maligna Fig. 52.2 Seqüência de eventos na mutagênese e na carcinogênese. DETERMINAÇÃO DA MUTAGENICIDADE E CARCINOGENICIDADE M u i t o s esforços têm levado ao desenvolvimento de tes- tes para detectar a mutagenicidade e a carcinogenicida- de. Estes podem ser amplamente divididos em: • Testes in vitro para a mutagenicidade. Esses testes rápidos estão disponíveis para a triagem de grande número de substâncias, mas eles podem dar resul- tados positivos para substâncias que, a seguir, não se mostram carcinogênicas em testes com animais inteiros, podendo deixar escapar os carcinogêni- cos conhecidos. • Testes em animais inteiros para a carcinogenicida- de. Tais testes são caros e consomem tempo. M a s são geralmente necessários para as autoridades re- guladoras dos fármacos, antes de uma nova subs- tância ser licenciada para uso em seres humanos. A principal limitação desse tipo de estudo é que há importantes espécies diferentes, principalmente em relação ao metabolismo de substâncias estranhas e à formação dos produtos. • Testes em animais inteiros para a teratogenicidade (teste de toxicidade sobre o sistema reprodutor). Testes em animais grávidos são necessários para os fármacos que estão para serem usados pelas mu- lheres de potencial reprodutor (de modo óbvio), se seu uso se destina ao período de gravidez. L i m i - tações semelhantes de tais testes se aplicam para testes de carcinogênese. Testes in vitro para os carcinogênicos genotóxicos As bactérias têm grande vantagem como sistema de tes- tes para determinar a mutagenicidade, dada a sua alta taxa de replicação. Os ensaios mais amplamente usados são as variações do teste de Ames, que determina a velo- cidade de mutação reversa (isto é, reversão do mutante para a forma do tipo selvagem) em uma cultura de Sal- monella typhimurium. T As raças normais do t ipo selvagem crescem em um meio que não contém aminoácidos adicionados, porque elas po- dem sintetizar todos de que necessitam a partir de fontes simples de carbono e ni t rogênio. O teste se baseia no fato de a forma mutante do organismo não poder formar histidina por esse mecanismo e, portanto, somente cresce em meio contendo esse aminoácido. Além disso, envolve o crescimento da forma mutante em meio contendo uma pequena quanti- dade de hist idina, sendo o fármaco a ser testado, adicionado à cultura. Após várias divisões, a hist idina torna-se depleta- da, e somente as células que cont inuam a se div id i r são as que sofreram mutação de volta para o t ipo selvagem. Uma contagem de colônias após a subcultura nas placas deficien- tes em histidina dá uma medida da taxa de mutação. Os carcinogênicos pr imários causam mutação por uma ação direta sobre o D N A bacteriano, mas a maior ia deles têm de ser convertidos em metaból i to ativo (ver antes). Portanto, é necessário incluir na cultura enzimas que catalisam a con- versão necessária. E geralmente empregado um extrato de fígado a partir de um rato tratado com fenobarbital para induzir as enzimas hepáticas. Há muitas variações baseadas no mesmo pr incípio. Outros testes in vitro de curto prazo para as substâncias quí- micas genotóxicas incluem determinações da mutagenicida- de em células de l in foma de camundongo e ensaio para aber- rações cromossomais e troca de cromátides-irmãs nas célu- las de ovário de hamster chinês ( C H O ) . Con tudo , todos es- ses testes in vitro dão alguns resultados falso-positivos e al- guns falso-negativos. Testes in vivo para a carcinogenicidade Os Testes in vivo para a carcinogenicidade acarretam a detecção de tumores em grupos de animais de teste. Os testes de carcinogenicidade são inevitavelmente lentos, pois há geralmente uma latência de meses ou anos antes dos tumores se desenvolverem. Além disso, os tumores podem-se desenvolver espontaneamente em animais de controle, e os resultados, com freqüência, fornecem so- mente evidência equivocada da carcinogênese do fárma- co testado, tornando difícil para a indústria e autorida- des reguladoras decidir sobre o desenvolvimento poste- rior e possível licenciamento de um produto. N e n h u m dos testes até aqui descritos pode detectar de modo con- fiável os carcinogênicos epigenéticos. Para isso, é neces- sário determinar o efeito da substância-teste sobre a pro- Aesculapius EFEITOS N O C I V O S D O S FÁRMACOS dução de tumor com uma dose limiar do agente genotó- xico. Tais testes estão sendo avaliados. Poucos fármacos são conhecidos por aumentarem o risco de câncer, sendo os mais importantes grupos os que agem sobre o D N A , isto é, fármacos citotóxicos e imu- nossupressores e hormônios sexuais (p.ex., estrogênios que aumentam a ocorrência de câncer endometrial e, possivelmente, também câncer de outros órgãos que res- pondem ao hormônio). Primetamina (Cap. 47) é um mutagênico em altas concentrações, e a testagem da car- cinogenicidade em camundongos da raça A (mas não em outras raças ou espécies) foi positiva para um aumento de três vezes em tumores de pulmão. Metoxsalen (um psoralênico usado com a luz ultravioleta (PUVA) em cen- tros especiais de doenças de pele, para o tratamento da psoríase) é tanto mutagênico como carcinogênico em ani- mais-modelo, podendo aumentar a incidência em câncer de pele em seres humanos. Carc inogênese • Carc inogênicos p o d e m ser: - genotóxicos, isto é, c a u s a m mutações d i re tamente (carcinogênicos pr imários) ou após sua conversão em metaból i tos reat ivos (carcinogênicos secundár ios) ; - epigenéiicos, isto é, a u m e n t a m a poss ib i l idade de o mutagên ico causar câncer, e m b o r a por si própr ios não se jam mutagên icos. • Carc inogênicos epigenét icos inc luem "p romoto res " que a u m e n t a m a taxa de câncer se dados após o mutagên ico , e "co-carc inogên icos" que a u m e n t a m a taxa se dados junto c o m eles. Os ésteres de forbol t ê m a m b a s as ações. • N o v o s fármacos são testatos pa ra mutagênese e carc inogênese. • O pr inc ipal teste para a mu tagen ic idade m e d e a mutação reversa, em um me io livre de h is t id ina, de um mutante de Salmonella iyphimurium (que, d i ferente do t ipo se l vagem, não pode crescer sem histidina) na presença: - da substância química a ser tes tada ; - de u m a preparação enzimát ica mic rossomal hepát ica para gerar os metaból i tos reat ivos. O cresc imento da colônia ind ica que a mutagênese ocorreu. O teste é rápido e barato, mas podem ocorrer a lguns resul tados fa lso-posi t ivos e fa lso-negat ivos . • Testagem da ca rc inogen ic idade : - envolve a d o s a g e m crônica de grupos de an ima is ; - é caro e consome t e m p o ; - não há rea lmente teste disponível para os carcinogênicos epigenét icos. TERATOGÊNESE E LESÃO FETAL INDUZIDAS POR FÁRMACOS O termo teratogênese é usado para significar a indução de malformações estruturais grosseiras durante o desen- volvimento fetal, para distingui-la de outros tipos fetais induzidos por fármacos, como retardamento mental, dis- plasia (p.ex., bócio associado ao iodeto) ou redução assi- métrica de membro, que resulta da vasoconstrição causa- da pela cocaína (ver C a p . 42), em um membro que, por outro lado, se desenvolve normalmente. Exemplos de fár- macos que afetam adversamente o desenvolvimento fetal são apresentados na Tabela 52.2. E conhecido, desde 1920, que os agentes externos podem afetar o desenvolvimento do feto, quando se des- cobriu que os raios X, durante a gravidez, poder iam causar malformação ou a morte do feto. Quase 20 anos mais tarde, foi reconhecida a importância da infeção da rubeola, mas foi a partir de 1960 que os fármacos fo- ram implicados como agentes causadores de teratogê- nese: a experiência chocante c o m a ta lidomida levou a uma reavaliação de muitos outros fármacos de uso clí- nico e à instalação de organismos reguladores de fárma- cos em muitos países. A maior ia dos defeitos ao nascer (cerca de 70%) ocorrem sem o reconhecimento de ne- n h u m fator causai. Acredita-se que a exposição ao fár- maco ou à substância química durante a gravidez seja somente responsável por cerca de 1% das malforma- ções fetais. Embora essa percentagem pareça pequena, os números totais são expressivos. M E C A N I S M O DA TERATOGÊNESE O curso temporal do insulto teratogênico em relação ao estágio do desenvolvimento fetal é crítico para determi- nar o tipo e a extensão da lesão produzida. O desenvolvi- mento fetal dos mamíferos cursa três fases (Tabela 52.3). • formação do blastocisto; • organogênese; • histogênese e maturação da função. A divisão celular é o principal processo que ocorre durante a formação do blastocisto. Durante essa fase os fármacos podem causar a morte do embrião por inibirem a divisão celular, mas, caso o embrião sobreviva, o seu desenvolvimento subseqüente geralmente não parece es- tar comprometido, embora o etanol possa afetar o de- senvolvimento nesse estágio muito precoce (Cap. 42). É durante a organogênese, que se estende por 17-60 dias, que os fármacos podem causar malformações gros- seiras. A organização estrutural do embrião ocorre em uma seqüência bem definida: olho e cérebro, esqueleto e mem- bros, coração e principais vasos sangüíneos, palato, siste- ma genitourinário. Assim, o tipo da malformação produ- zida depende do tempo de exposição ao teratógêno. Os mecanismos celulares pelos quais as substâncias te- ratogênicas produzem os seus efeitos não estão ainda com- preendidos. Há uma considerável sobreposição entre mu- tagenicidade e teratogenicidade. Em um grande levanta- mento entre 78 substâncias, 34 eram tanto teratogênicas como mutagênicas, 19 eram negativas em ambos os testes Aesculapius SEÇÃO 6: TÓPICOS ESPECIAIS T a b e l a 52.2 F á r m a c o s r e l a t a d o s c o m o t e n d o efei tos a d v e r s o s s o b r e o d e s e n v o l v i m e n t o feta l h u m a n o Agente Efeito Teratogenicidade Ver Capítulo Tal idomida Focomel ia , defeitos cardíacos, atresia intestinal etc. C 52 Penic i lamina Pele frouxa etc. c 16 Warfar in Nar iz em se la , crescimento retardado, defeitos dos membros, olhos, S N C c 20 Corticosteróides Fenda palat ina e catarata congênita - raras 27 Androgênicos Masculinização em mulheres 29 Estrogênicos Atrofia testicular em homens 29 Estilbestrol Adenose vaginal em feto feminino, também câncer vaginal ou cervical Ma is tardiamente 20 + anos 29 Anticonvulsivantes Fenitoína Fenda lab ia l /pa lato, microcefal ia, retardamento mental C 39 Valproato Defeitos do tubo neura l , p. ex., espinha bifida C 39 Carbamazep ina Retardamento do crescimento da cabeça fetal S 39 Fármacos citotóxicos (especialmente os antagonistas do folato) Hidrocefal ia, fenda palat ina, defeitos do tubo neural etc. C 49 Aminoglicosídios Surdez 44 Tetraciclina Coloração dos ossos e dentes, esmalte f ino, crescimento ósseo prejudicado S 44 Etanol Síndrome alcoólica do feto C 52 Retinóides Hidrocefal ia etc. C 51 Inibidores da enz ima de conversão da angiotensina Ol igo-h idrâmnio, falência renal c 18 C, teratogênico conhecido (em animais de experiência e /ou seres humanos) ; S, teratogênico suspeito (em animais de experiência e /ou seres humanos). Adaptado a partir de: Juchau 1989 Annu Rev Pharmacol Toxicol 29 :165 . T a b e l a 52 .3 N a t u r e z a dos efei tos dos f á r m a c o s s o b r e o d e s e n v o l v i m e n t o feta l Estágio Período de gestação em seres humanos Principais processos celulares Afetado por Formação do blastocisto Organogênese 0-16 dias Aprox imadamente 17-60 dias Histogênese e maturação 60 dias ao termo funcional Divisão celular Divisão Migração Diferenciação Morte Todos os precedentes Fármacos citotóxicos, ?álcool Teratogênicos Teratogênicos Teratogênicos Teratogênicos Fármacos var iados, p. ex., á lcool , nicot ina, drogas anti t i reoidianos, esteróides e 25 (entre elas a talidomida) eram positivas em um, mas não em outro. Portanto, parece que o dano ao D N A é importante, mas a carcinogênese não é, certamente, o úni- co fator. O controle da morfogênese é mal entendido: os derivados da vitamina A (retinóides) estão envolvidos e são potentes teratogênicos (ver adiante). Os Teratogênicos conhecidos incluem vários fármacos (p. ex., metotrexato e fenitoína) que não reagem diretamente com o D N A , mas que inibem a síntese por efeito sobre o metabolismo do folato. A administração de folato durante a gravidez reduz a freqüência de malformações espontâneas e induzidas por fármacos, em especial os defeitos do tubo neural. Aesculapius EFEITOS N O C I V O S D O S FÁRMACOS No estágio final da histogênese e da maturação fun- cional , o feto é dependente de um suprimento adequa- do de nutrientes, e o desenvolvimento é regulado por uma gama de hormônios. As malformações estruturais grosseiras não surgem da exposição aos mutagênios, nesse estágio mas os fármacos que interferem com o suprimento de nutrientes ou com o milieu hormonal podem ter efeitos deletérios sobre o crescimento e de- senvolvimento. A exposição do feto feminino aos an- drogênicos pode causar masculinização. Estilbestrol era comumente dado às mulheres grávidas com história de aborto recorrente durante os anos 50 (por motivos des- conhecidas) e causa displasia vaginal da criança e uma incidência aumentada de carcinoma vaginal em indiví- duos adolescentes e na casa dos 20 anos. Acredita-se que a angiotensina desempenhe um papel importante nos estágios mais tardios do desenvolvimento fetal e na função renal do feto, e que os A C E I e do receptor da angiotensina (estartans) causem oligo-hidrâmnio e fa- lência renal se administrados durante os estágios mais tardios da gravidez. Eles foram associados com defeitos do crânio em animais de experiência. TESTES DE TERATOGENIC1DADE O desastre da talidomida dramaticamente provocou a necessidade de estudos de rot ina da teratogenicidade para os novos fármacos. Avaliação da teratogenicidade em seres humanos é particularmente um problema difí- c i l , por várias razões. U m a é que a taxa de malformação é alta (3-10% dependendo da definição de uma malfor- mação significativa) e altamente variável entre regiões, grupos etários e classes sociais diferentes. São necessá- rios estudos em larga escala, que duram muitos anos e são muito dispendiosos, geralmente dando resultados sugestivos, mas não conclusivos. N o s métodos in vitro, baseados na cultura de células, órgãos ou embriões inteiros, até agora não foram desen- volvidos em um nível que permitisse predizer a teratogê- nese in vivo, e a maioria das autoridades reguladoras so- licita testes de teratogenicidade, um em um roedor (ge- ralmente rato ou camundogo) e um outro em não-roe- dor (geralmente coelho). As fêmeas grávidas são avalia- das em vários níveis durante o período crítico da organo- gênese, e os fetos são examinados para as anormalidades estruturais. Contudo, má correlação entre espécies signi- fica que os testes desse tipo não são confiavelmente pre- visíveis em seres humanos e geralmente se recomenda que os novos fármacos não sejam usados na gravidez, a não ser que sejam essenciais. A L G U N S TERATOGÊNICOS H U M A N O S DEFINIDOS E PROVÁVEIS Embora muitos fármacos tenham se revelado teratogêni- cos em graus variados em animais de experiência, relati- vamente poucos se mostram teratogênicos em seres hu- manos (ver Tabela 52.2). Alguns dos mais importantes são abordados a seguir. Talidomida A talidomida é realmente única em produzir em dose tera- pêutica, virtualmente 100% de crianças malformadas, quan- do dada nas primeiras 3-6 semanas de gestação. Foi intro- duzida em 1957 como hipnótica e sedativa,com a caracte- rística especial de que era extremamente segura em dosa- gem excessiva, e ainda recomendada especificamente para uso na gravidez (com o slogan publicitário "o hipnótico seguro"). C o m o era então normal, fo i submetida somente ao teste de toxicidade aguda, e não ao de toxicidade crôni- ca* ou ao teste de teratogenicidade. A talidomida foi lan- çada no mercado com grande impacto e muito sucesso, e a primeira suspeita de sua teratogenicidade surgiu inicial- mente em 1961, com registros de um aumento abrupto na incidência de focomelia. Essa anormalidade ("membros de foca") consiste em uma ausência no desenvolvimento dos ossos longos dos braços e pernas, e era até então virtual- mente desconhecida. Nessa época, 1.000.000 de compri- midos estavam sendo vendidos por dia na Alemanha O c i - dental. Relatos de focomelia vieram de Hamburgo e Sid- nei, e foi feito o elo com a talidomida. O fármaco foi reti- rado do mercado só mais tarde, em 1961, ao tempo em que eram estimadas 10.000 crianças que nasceram malfor- madas (Fig. 52. 3). Apesar de estudo intenso, o seu meca- nismo de ação permanece mal compreendido, embora in - vestigação epidemiológica mostrasse muito claramente a correlação entre o tempo de exposição e o tipo de malfor- mação produzida (Tabela 52. 4). Fármacos citotóxicos Muitos agentes alquilantes (p. ex., clorambucil e ciclofos- famida) e antimetabólitos (p. ex., azatioprina e mercapto- purina) causam malformações, quando usados no início da gravidez, mas com freqüência levam ao aborto (ver Cap. 49). Os antagonistas do folato (p. ex., metotrexato) pro- duzem uma incidência muito maior de malformações, evi- dentes em fetos que nasceram e em natimortos. *Uma grave neuropatia periférica, levando a uma paralisia irrever- sível e perda sensorial, foi relatada dentro de um ano após a intro- dução do fármaco e subseqüentemente confirmada em muitos rela- tos. A companhia responsável pelo fármaco era menos escrupulosa em agir nesses relatos (ver Sjostrom H, Ni lsson R 1972 Thal idomi- de and the power of the drug companies. Penguin Books, London), que foram logo ofuscados pela descoberta dos efeitos teratogêni- cos; mas o efeito neurotóxico era por si só bastante grave para de- terminar a retirada do fármaco do uso geral. Hoje, o uso da talido- mida tem tido um pequeno ressurgimento relacionado com aplica- ções especializadas. E atualmente prescrito por especialistas (der- matologistas e na infecção pelo HFV, entre outros) em condições firmemente controladas e restritas. Aesculapius SEÇÃO 6: TÓPICOS ESPECIAIS 1957 1958 1959 1960 1961 1962 Fig. 52.3 Incidência das principais anormal idades fetais na Europa Ocidental após a introdução e retirada da tal idomida. Tabela 52.4 T e r a t o g ê n e s e p e l a t a l i d o m i d a Dias de gestação Tipo de deformidade 21-22 Mal formação dos ouvidos Defeitos nos nervos cranianos 24 -27 Focomelia dos braços 28 -29 Focomel ia dos braços e das pernas 30-36 Malformação das mãos Estenose anorretal Ret inó ides Etretinato, um retinóide (isto é, derivado da vitamina A) com efeitos marcantes sobre a diferenciação da epider- me, é um teratogênico conhecido e causa uma elevada proporção de anormalidades sérias (notadamente, defor- midades do esqueleto) em fetos expostos. Os dermatolo- gistas usam retinóides para tratarem doenças cutâneas, como a acne e a psoríase, que são comuns em mulheres jovens. O etretinato acumula-se na gordura subcutânea e é lentamente eliminado, persistindo quantidades detec- táveis por muito meses, após a exposição crônica ser i n - terrompida. Por causa disso, as mulheres devem evitar a gravidez pelo menos 2 meses após o tratamento. Acite- trina é metabólito ativo do etretinato. E igualmente tera- togênico, mas o acúmulo tecidual é menos pronunciado e a eliminação pode, portanto, ser mais rápida. Meta is p e s a d o s Chumbo, cádmio e mercúrio, todos causam malforma- ções fetais nos seres humanos. A pr inc ipal evidência provém da doença de Minamata, chamada de acordo c o m a localidade no Japão, onde ocorreu uma epide- mia , quando a população local ingeriu peixe contami- nado com metilmercúrio, que era usado como um fun- gicida na agricultura. Este prejudica o desenvolvimen- to cerebral, em fetos expostos, resultando em paralisia cerebral e retardo mental , freqüentemente c o m micro- cefalia. O mercúrio, como outros metais pesados, ina- tiva muitas enzimas por formar ligações covalentes com sulfidrilas e outros grupamentos, e acredita-se que esse fator seja o responsável por essas anormalidades no desenvolvimento. F á r m a c o s a n t i e p i l é p t i c o s Malformações congênitas estão aumentadas duas a três vezes em crianças de mães epilépticas. Curiosamente, todos os fármacos antiepilépticos existentes foram impli- cados, incluindo a fenitoína (particularmente, na fenda leporina/palato), valproato (defeitos do tubo neural) e carbamazepina (espinha bifida e hipospadias - uma mal- formação da uretra masculina), assim como os agentes mais novos (Cap. 39). War fa r in A administração de warfarin (Cap. 20) no primeiro tri- mestre está associada com hipoplasia nasal e várias ano- malias do sistema nervoso central (SNC) , afetando apro- ximadamente 2 5 % das crianças expostas. No último tri- mestre, ele não deve ser usado devido ao risco de hemor- ragia intracraniana em crianças durante o parto. Tera togênese e lesão fetal «j induzida por fá rmacos • Teratogênese s igni f ica p rodução de ma l fo rmações estruturais grossei ras do feto, p. ex. , ausência de m e m b r o s após a t a l i dom ida . A lesão menos ab rangen te pode ser p roduz ida por mui tos outros fá rmacos (ver Tabela 52.2) . A t r ibu i -se menos de 1% dos defei tos fetais congêni tos aos fá rmacos dados à mãe . • Ma l fo rmações grossei ras são p roduz idas somente se os teratogênicos a tua rem duran te a o rganogênese . Isso ocor re duran te os 3 pr imei ros meses da g rav idez , mas após a f o r m a ç ã o do blastocisto. A lesão fetal i nduz ida por fá rmacos é rara duran te a f o rmação do blastocisto (exceção: s índrome alcoól ica do feto) e após os 3 pr imei ros meses (exceção: in ib idores da e n z i m a conversora de ang io tens ina e estartans. • O m e c a n i s m o de ação dos tera togênicos não está c la ramente c o m p r e e n d i d o , e m b o r a a lesão do D N A seja u m fator e m mui tos casos. • Novos fármacos são ge ra lmen te testados em mulheres grávidas d e , pe lo m e n o s , um roedor e de um não - roedo r (p. ex. , coe lho) . Aesculapius EFEITOS N O C I V O S D O S FÁRMACOS Antieméticos Os antieméticos foram amplamente usados para tratar a cinetose matinal no início da gravidez, e alguns são teratogênicos em animais. Resultados de levantamen- tos em seres humanos não são conclusivos, não forne- cendo evidência clara de teratogênese. C o n t u d o , é p r u - dente evitar, se possível, o uso desses fármacos em pa- cientes grávidas. AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GENOTÓXICO O registro dos medicamentos necessita de uma avaliação abrangente de seu potencial genotóxico. C o m o nenhum teste isolado é adequado, a abordagem usual recomenda- da pela International Conference of Harmonisation (ESRA Rapporteur 1997 4: 5-7) é executar uma bateria de testes in vitro e in vivo para a genotoxicidade. A seguinte bate- ria é, com freqüência, util izada: • um teste de mutação gênica em bactérias; • um teste in vitro com avaliação citogenética da le- são cromossomal; • um teste in vivo de lesão cromossomal, usando cé- lulas hematopoéticas de roedores; • testagem da toxicidade reprodutora; • testagem da carcinogenicidade. REAÇÕES ALÉRGICAS AOS FÁRMACOS Reações alérgicas de vários tipos são uma forma co- mum de resposta adversa aos fármacos. M u i t o s fárma- cos sendo substâncias de baixo peso molecular, não são por si sós imunogênicos. C o n t u d o , um fármaco ou os seus metabólitos atuam como um hapteno por intera- giremcom proteína, formando um conjugado estável que é imunogênico (Cap. 15). A base imunológica de algumas reações alérgicas de fármacos foram bem es- tabelecidas, mas com freqüência é infer ida a partir das características clínicas da reação e está faltando evi- dência direta de um mecanismo imunológico. Os p r i n - cipais critérios que são sugestivos de uma resposta i m u - ne são: • a reação tem um curso temporal diferente daquela do efeito farmacodinâmico: é retardada no início, ocorrendo poucos dias após a administração do fármaco ou ocorre somente com a exposição repe- tida do mesmo; • sensibilização e/ou reação alérgica subsequente po- dem ocorrer em doses que são muito pequenas para promoverem efeitos farmacodinâmicos; • a reação ajusta-se a uma das síndromes clínicas as- sociadas com a alergia - tipos I, II, III e IV da clas- sificação de Gel l & Coombs (ver adiante e Cap. 15) - e não está relacionada com o efeito farmacodinâ- mico do fármaco. A incidência global das reações alérgicas é variavel- mente relatada como estando entre 2 e 25%. A grande maioria são erupções cutâneas relativamente inócuas. Várias reações (p. ex., anafilaxia, hemólise e depressão da medula óssea), que podem ser fatais, são raras. Penici- linas, que são a causa mais comum de anafilaxia induzida por fármacos, produzem essa resposta em uma estimati- va de 1 em 50.000 pacientes expostos. As erupções cutâ- neas podem ser graves e ocorrem mortes com a síndro- me de Stevens-Johnson (provocada, por exemplo, pelas sulfonamidas) e com necrólise epidérmica tóxica (que pode ser causada pelo alopurinol) . Mecanismos imunológicos A formação de um conjugado imunológico entre uma pequena molécula e uma proteína endógena necessita de uma ligação covalente. Na maioria dos casos, os metabó- litos reativos e não o próprio fármaco são os responsá- veis. Tais metabólitos reativos podem ser produzidos du- rante a oxidação do fármaco ou pela fotoativação na pele. Eles também podem ser produzidos pela ação dos meta- bólitos tóxicos de oxigênio gerados pelos leucócitos ati- vados. Raramente (p.ex., no lúpus eritematoso sistêmico induzido por fármacos), as porções reativas interagem para formarem um imunogênico com os componentes nucleares ( D N A , histona). A conjugação com uma ma- cromolécula é geralmente essencial, embora a penicilina seja uma exceção, porque pode formar polímeros sufici- entemente grandes em solução para produzir uma rea- ção anafilática em um indivíduo sensibilizado, mesmo sem conjugação à proteína. Os conjugados de penicilina e de seus metabólitos com as proteínas são também formados e podem atuar como imunogênicos. Tipos clínicos de respostas alérgicas aos fármacos Na classificação de Gel l & Coombs da hipersensibilida- de, as reações (Cap. 15) dos tipo I, II e III são mediadas por anticorpos e o tipo IV por células. As reações indese- jáveis aos fármacos envolvem reações com anticorpos e mediadas por células. As manifestações clínicas mais i m - portantes de hipersensibilidade incluem o choque anafi- lático, as reações hematológicas, a lesão hepática alérgica e outras reações de hipersensibilidade. Choque anafilático O choque anafilático - uma resposta de hipersensibilida- de do tipo I - é reação repentina e comprometedora da vida, que resulta da liberação de histamina, leucotrienos e outros mediadores (Cap. 15). As principais característi- cas incluem erupção urticariforme, edema dos tecidos moles, broncoconstrição e hipotensão. Aesculapius SEÇÃO 6: TÓPICOS ESPECIAIS Penicilinas são os fármacos mais prováveis de causar reações anafiláticas, sendo responsáveis por cerca de 7 5 % das mortes por anafilaxia, refletindo a freqüência com que elas são usadas na prática clínica. Outros fármacos que podem causar anafilaxia incluem várias enzimas, como por exemplo, as estreptoquinases (Cap. 20), aspa- raginase (Cap. 50); hormônios, por exemplo, corticotro- pina (hormônio adenocorticotrópico; Cap. 27); hepari- na (Cap. 20); dextranas; contrastes radiológicos; vacinas e outros produtos sorológicos. A anafilaxia com anestési- cos locais (Cap. 43), com o anti-séptico de superfície clo- rexidina e com muitos outros fármacos foi relatada, mas é incomum. A anafilaxia é tratada com injeção de adre- nalina (epinefrina), que é salvadora da vida nessa circuns- tância, corticosteróides e anti-histamínicos. E algumas vezes factível um teste cutâneo para a pre- sença da hipersensibilidade anafilática, que envolve a inje- ção de uma dose mínima intradérmica. Isso é algumas ve- zes possível se o paciente relata que é alérgico a determi- nado fármaco. Contudo, o teste não é completamente con- fiável. Além disso, a dose do teste, por si própria, pode originar uma reação grave. O uso de peniciloilpolilisina é um reagente do teste cutâneo para a alergia à penicilina, porque ele contorna a necessidade para a conjugação da substância-teste, reduzindo, portanto, a probabilidade de um resultado falso-negativo. Estão disponíveis outros tes- tes especializados para detectar a presença de IgE específi- ca no plasma ou a liberação de histamina dos basófilos do paciente, mas estes não são usados rotineiramente. Outras reações de hipersensibilidade do tipo I induzi- das por fármaco incluem o broncoespasmo (Cap. 22) e a urticaria. Reações h e m a t o l ó g i c a s As reações hematológicas causadas por fármacos podem ser induzidas pela hipersensibilidade dos tipos II, III ou IV. As reações do tipo II podem afetar quaisquer ou to- dos os elementos formadores do sangue, que podem ser destruídos pelos efeitos sobre as próprias células sangüí- neas circulantes ou sobre as suas progenitoras da medula óssea. Elas envolvem a ligação do anticorpo a um com- plexo fármaco-macromolécula sobre a membrana da su- perfície celular. A reação antígeno-anticorpo ativa o com- plemento, o que leva à lise (Fig. 15.1) ou provoca o ata- que pelos linfócitos killer ou pelos leucócitos fagocíticos. A anemia hemolítica foi comumente relatada com as sul- fonamidas e fármacos correlatos (Cap. 45) e com o fár- maco anti-hipertensivo metildopa (Cap. 11) que ainda é amplamente usado para tratar a hipertensão durante a gravidez. C o m a metildopa ocorre hemólise significativa em menos de 1% dos pacientes, mas o aparecimento de anticorpos direcionados contra a superfície das hemácias é detectado em 15% pelo teste de Coombs. Os anticor- pos são direcionados contra os antígenos R h , mas não se sabe como a metildopa produz esse efeito. Agranulocitose induzida por fármacos (ausência completa de neutrófilos circulantes) é geralmente retardada por 2-12 semanas após o início do tratamento com o fármaco, mas pode ser repentina no início. C o m freqüência apresenta-se como úlceras na boca, uma dor de garganta intensa ou ou- tra infecção. O soro do paciente lisa os leucócitos de outros indivíduos, e os anticorpos circulantes antileucócitos em geral podem ser detectados de maneira imunológica. Os fárma- cos associados com agranulocitose incluem N S A I D s (espe- cialmente a fenilbutazona, Cap. 16), carbimazol (Cap. 28) e clozapina (Cap. 37). As sulfonamidas e fármacos correla- tos (p.ex., tiazidas e sulfoniluréias) são causas incomuns, mas bem documentadas de agranulocitose. Isso é raro, mas uma condição comprometedora da vida, porque a redução marcante dos granulócitos circulantes torna o paciente ex- tremamente vulnerável às infecções bacterianas. A recupe- ração, quando o fármaco é interrompido, com freqüência é lenta ou ausente. Esse tipo de destruição leucocitária me- diada por anticorpos deve ser distinguido do efeito direto dos fármacos citotóxicos (ver Cap. 50), a maior parte dos quais causam agranulocitopenia. Contudo, com estes últi- mos fármacos, o início é rápido, previsivelmente relaciona- do com a dose e é reversível. Trombocitopenia (redução do número de plaquetas) pode ser causada pelas reações do tipo II à quinina (Cap. 48), heparina (Cap. 20) e diuréticos tiazídicos (Cap.23). Alguns fármacos (notadamente o cloranfenicol) po- dem suprimir todas as três linhagens celulares hemato- poéticas, dando origem à anemia aplástica (anemia com agranulocitose associada e trombocitopenia). A distinção entre as reações de hipersensibilidade dos tipos III e IV na causa das reações hematológicas não é nítida, e é provável que ambos os mecanismos estejam freqüentemente envolvidos. Lesão h e p á t i c a a l é r g i c a A maioria das lesões hepáticas induzidas por fármacos resulta dos efeitos tóxicos diretos dos fármacos ou de seus metabólitos, como já descrito. Contudo , as reações de hipersensibilidade estão algumas vezes envolvidas, sen- do um exemplo (ver C a p . 35). O trifluoracetilcloreto, um metabólito reativo do halotano, acopla-se a uma ma- cromolécula, formando um imuogênico. A maioria dos pacientes com lesão hepática induzida pelo halotano tem anticorpos que reagem com os conjugados halotano-pro- teína. Há evidência de experiências em coelhos de que os antígenos halotano-proteína podem ser expressos na su- perfície dos hepatócitos. A destruição das células ocorre por reações de hipersensibilidade do tipo II envolvendo as células T killer. Se os complexos antígeno-anticorpo são liberados das células lesadas, as reações do tipo III podem contribuir. Enflurano pode também causar lesão hepática medi- ada por anticorpos e é relatada sensibilização cruzada aparente com o halotano. Aesculapius EFEITOS N O C I V O S D O S FÁRMACOS Reações a lérg icas aos fá rmacos • Os fármacos ou os seus metaból i tos reat ivos p o d e m se l igar cova len temente às proteínas pa ra f o r m a r e m imunogên icos . A penic i l ina (que t a m b é m pode ser imunogên ico por fo rmar po l ímeros ) é um exemp lo impor tante . • As reações alérgicas (hipersensibi l idade) induz idas pelos fá rmacos p o d e m ser med iadas por ant icorpos (tipos I, II, III) ou med iadas por células (tipo IV). Mani festações clínicas impor tantes i nc luem: - choque anaf i lá t ico (tipo I): põe em risco a v i da , por obstruir a respi ração; mui tos fá rmacos p o d e m causar a condição e a ma io r ia das mortes são causadas pe la pen ic i l i na ; - reações hemato lóg icas (tipos II, III ou IV): estas, junto c o m os exemplos dos fármacos causadores , são a n e m i a hemolí t ica (su l fonamidas e met i ldopa) , ag ranu loc i tose , que pode ser irreversível (su l fonamidas, c lo ranfen ico l e carb imazol ) e t romboc i topen ia (qu in ina, hepa r ina e diurét icos t iazídicos); - lesão hepát ica alérgica (tipos II, III): p. ex., o metabó l i to reativo do ha lo tano acop la - se às proteínas plasmát icas, f o r m a n d o o imunogên i co ; - erupções cutâneas (tipos I, IV): estas oco r rem c o m mui tos fá rmacos , são gera lmente do t ipo IV e m o d e r a d a s , e m b o r a a l g u m a s possam pôr em risco a v i d a ; - lúpus er i tematoso sistêmico induz ido por fá rmacos (pr inc ipalmente do t ipo II): esta envo lve ant icorpos contra o mater ia l nuclear. Outras reações de hipersensibilidade As manifestações clínicas das reações de hipersensibilida- de do tipo IV são diversas, variando de pequenas erupções cutâneas à doença auto-imune generalizada. Febre pode acompanhar essas reações. Erupções cutâneas podem ser mediadas por anticorpos, mas são geralmente mediadas por células. Elas variam de erupções brandas a exfoliação fatal. Em alguns casos, as lesões são fotossensíveis, prova- velmente por causa da degradação do fármaco em subs- tâncias reativas na presença de luz ultravioleta. Alguns fármacos (notadamente hidralazina e procai- namida) podem produzir uma síndrome auto-imune que lembra o lúpus eritematoso sistêmico. Há um distúrbio multissistêmico no qual há lesão imunológica a muitos órgãos e tecidos (incluindo articulações, pele, pulmão, sistema nervoso central e rim) causado sobretudo, mas não exclusivamente, pelas reações de hipersensibilidade do tipo III. O arranjo prodigioso dos anticorpos dir ig i - dos contra os componentes "self" fo i chamado de " tem- poral auto-imune" . Os anticorpos reagem com determi- nantes exibidos por muitas moléculas, como, por exem- plo , o esqueleto fosfodiéster do D N A , R N A e fosfolipí- dios. No lúpus eritematoso sistêmico induzido por fár- maco, o imunogênico pode resultar da porção reativa do fármaco que interage com o material nuclear, e, na fase efetora, é comum ocorrer lesão articular e pulmonar. A condição geralmente resolve quando o tratamento com o fármaco causador é interrompido. REFERÊNCIAS E LEITURA ADICIONAL Alison M R, Sarraf C E 1995 Apoptosis: regulation and re- levance to toxicology. H u m Exp Toxicol 14: 234-247 (Revisão) Anonymous 1997 Drug-induced agranulocytosis. Drug Ther Bull 35: 49-52 (Considera que os fármacos são os mais comumente envolvidos, como minimizar os riscos e como gerir) Boobis A R, Fawthrop D J, Davies D S 1989 Mechanisms of cell death. 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Ela ainda não levou a produtos licenciados, mas de- tém grande promessa. Neste capítulo, introduzimos os conceitos centrais, abordamos os problemas téc- nicos e as abordagens para lidar com isso, descre- vemos os problemas de segurança e, finalmente, consideramos o progresso que foi feito em áreas terapêuticas específicas. Estamos confiantes de que: • as terapias baseadas em ácidos nucléicos serão desenvolvidas, seguras e eficazes; • isso mudará radicalmente a medicina; • contudo, o impacto total não se realizará por muitos anos. INTRODUÇÃO A história da terapêutica foi marcada por inovações monu- mentais (p.ex., cirurgia, imunização, antibióticos) que são conceitualmente simples, mas têm transformado o mundo. A terapia gênica certamente não consegue fazê-lo - ainda. O conceito de introduzir ácido nucléico nas células do cor- po de modo a tratar ou prevenir doenças é, contudo, tão atraente que vastos recursos (públicos e privados) foram com- prometidos para o seu desenvolvimento. Há várias ra- zões para essa atração. Primeira, a abordagem oferece o potencial para a cura radical de doenças genéticas simples, como a fibrose cística e as hemoglobinopatias, que são cole- tivamente responsáveis por muita indigência por todo o mundo. Segunda, condições muito mais comuns, incluindo as doenças cancerosas, neurodegenerativas e infecciosas, têm um grande componente genético. O tratamento convencio- nal de tais distúrbios é, como os leitores deste livro aprecia- rão, angustiosamente inadequado, de modo que uma abor- dagem completamente nova tem enorme atração. Finalmen- te, uma capacidade para controlar a expressão gênica pode- ria revolucionar o controle das doenças nas quais não hou- vesse totalmente um componente genético.* O gene para o fator de crescimento do endotélio vascular está sendo usa- do para estimular o crescimento de vasos sangüíneos ao re- dor dos bloqueios das artérias com aterosclerose, sendo os resultados preliminares encorajadores. Mundialmente falan- do, se uma proteína deficiente (como o fator VIII, a insulina ou a eritropoeitina) pudesse ser sintetizada in vivo em res- posta a uma intervenção terapêutica simples, isso poderia ter grandes vantagens práticas sobre as injeções recorrentes da proteína purificada ou sintética nas doenças como a he- mofilia (Cap. 20), o diabete (Cap. 25) ou a falência renal crônica (Cap. 23). Usando técnicas modernas, é possível identificar e clo- nar genes, alterar D N A ou R N A em laboratório e produ- zir grandes quantidades de ácido nucléico modif icado, recombinante. Tal ácido nucléico recombinante, codif i - cado por um gene que se espera terá efeito terapêutico, pode ser introduzido nos cromossomas do hospedeiro por meio de plasmídeos e transposons (ver Cap. 5). Os mestres no assunto são enfáticos ao declararem que "a *Uma ovelha pode crescer a partir do núcleo de uma célula do libe- re de uma ovelha adulta: não precisa ser um H G Wells para imagi- nar as aplicações (p.ex., amputados), embora se deva admitir que isso ainda pareça algo forçado. Aesculapius SEÇÃO 6: TÓPICOS ESPECIAIS Def in ição e usos potenciais • A te rap ia gênica é a modi f icação genét ica das células pa ra prevenir, a l iv iar ou curar doenças ; esforços atua is estão d i rec ionados pa ra as células somát icas, e não pa ra as células germina t i vas . • Apl icações potenc ia is : - cura rad ica l de doenças genét icas s imples (p.ex., f ib rose cística, hemog lob inopa t ias ) - m e l h o r a das doenças c o m ou sem um c o m p o n e n t e genét ico , inc lu indo mui tas doenças cancerosas , neurodegenera t i vas e in fecc iosas. parte conceituai da revolução da terapia gênica de fato já ocorreu. . . " Portanto, onde estão as terapias? O problema, naturalmente, está no detalhe: nesse caso, os detalhes de • farmacocinética: a transferência do gene para as células-alvo apropriadas. • expressão farmacodinâmica controlada do gene em questão. • segurança. • eficácia clínica e praticabilidade em longo prazo. Esses problemas são incomensuráveis: uma analogia é pôr-se no lugar de um cirurgião-barbeiro extraindo os cálculos em Samuel Pepys. Esse profissional deve segura- mente ter imaginado o conceito de cirurgia abdominal (para aliviar a obstrução de uma hérnia estrangulada ou um tumor, por exemplo), mas a realização do sonho ne- cessitava de descobertas nos campos da anestesia e da técnica asséptica nos séculos X I X e X X . No caso da terapia gênica, talvez o principal obstácu- lo seja o problema da transferência; a virologia moderna oferece mais do que um sopro de possibilidades de trans- ferência gênica para uso terapêutico e outras técnicas es- tão também disponíveis para introduzir ácidos nucléicos nas célulasde mamíferos (ver adiante). É esse sentido de possibilidade na colocação, por um lado, de um conceito tão simples que qualquer leitor de cartaz pode aprendê- lo , e, por outro lado, grandes preços (humanitário, cien- tífico e comercial) levaram, inevitavelmente, a grandes expectativas e, talvez, de igual modo inevitável, à frus- tração na falta do progresso prático. Havia um consenso* de que tentativas na terapia gê- nica devessem focar as células somáticas, e uma morató- ria foi acordada sobre as terapias destinadas a alterar o D N A das células germinativas, influenciando, portanto, a geração seguinte. ASPECTOS TÉCNICOS TRANSFERÊNCIA GÊNICA A transferência de ácido nucléico recombinante para den- tro das células-alvo - o problema da "distribuição do fár- maco" - é crítica para o sucesso da terapia gênica. O ácido nucléico deve passar do espaço extracelular pelas mem- branas citoplasmática e nuclear e, a seguir, ser incorpora- do nos cromossomas. Já que o D N A tem muitas cargas negativas e os genes isolados têm peso molecular por volta de I O 4 vezes maior que os fármacos convencionais, o pro- blema é de natureza diversa do estágio equivalente do de- senvolvimento de rotina de fármacos. Várias abordagens foram desenvolvidas, a maioria envolvendo a inserção do gene terapêutico em sistema de transferência de fármacos, chamado de vetor, com freqüência na forma de um vírus adequadamente modificado (ver adiante). Há duas estratégias principais para transferir os ge- nes para os pacientes: in vivo e ex vivo. A estratégia in vivo é injetar uma suspensão de um vetor contendo o gene terapêutico diretamente no paciente, por via intra- venosa - no caso, alguma forma do alvejamento do vetor ao órgão ou tecido ao qual ele deve agir - ou em um tecido no qual se espera que ele atuará (p.ex., diretamen- te em um tumor maligno). A estratégia ex vivo é remover células do paciente (p.ex., células-tronco da medula ós- sea ou do sangue circulante ou mioblastos de uma bióp- sia de músculo estriado), tratá-las com o vetor e injetar no paciente as células geneticamente alteradas. Um vetor ideal deve ser seguro, muito eficiente (isto é, inserir o gene terapêutico numa grande fração de células- alvo) e seletivo, capaz de levar à expressão da proteína tera- pêutica nas células-alvo, mas não à expressão das proteínas virais. Ele deve causar expressão persistente, evitando a ne- cessidade de tratamento repetido desde que a célula na qual é inserido seja ela própria de longa vida. Este é um proble- ma com um alvo terapêutico como o epitélio das vias aé- reas. Isso funciona mal no distúrbio autossômico recessivo, a fibrose cística devida à deficiência de um transportador de membrana do C l " (CFTR) . As células epiteliais nas vias aé- reas descarnam continuamente, sendo então substituídas, de modo que, se o gene da C F T R fosse transferido estavel- mente transfectado para dentro do epitélio, haveria ainda uma necessidade de tratamento periódico, a não ser que o gene pudesse ser introduzido nas células progenitoras (tron- co). Problemas semelhantes são antecipados em outras cé- lulas que se renovam continuamente, como as do epitélio gastrintestinal e da pele. (Administração repetida de fárma- cos terapêuticos é, naturalmente, em geral necessária, mas no caso das macromoléculas e dos vírus, essa repetição cau- sa problemas associados com as respostas imunes). *Para algumas visões discordantes atentas, ver: Stack G, Campbell J (eds) "Engineering the human germline: an exploration of the science and ethics of altering the genes we pass to our chi ldren". Oxford University Press, New York. Vetores v i ra is Os vírus assumem o controle da maquinaria metabólica das células que invadem, e alguns têm a propriedade de Aesculapius TERAPIA GÊNICA fundir-se com o ácido nuciéico celular. A maioria das estratégias empregadas para o fornecimento de genes uti l iza essas propriedade. Embora isso ofereça um justi- gante vislumbre das inúmeras possibilidades*, ainda res- tam problemas em parte, pelo menos, porque, assim como os vírus evoluíram os mecanismos para invadir as células humanas, também os seres humanos evoluíram enzimas e as respostas imunes que a eles se opõem. Isso não é de totalmente mau, contudo, pelo menos do pon- to de vista da segurança. Por exemplo, um teste tera- pêutico foi paralisado pela F o o d and D r u g Adminis tra- t ion dos E U A por causa do aparecimento do vírus carre- ante do gene no líquido seminal de um receptor, surgin- do receios de que poderia ser transmitido a uma criança em gestação. C o n t u d o , investigações posteriores reve- laram que o vírus não está presente nos espermatozói- des, possivelmente graças aos mecanismos envolvidos para proteger a informação genética nos gametas a par- tir do ataque v i ra l . *Mui to semelhante a um cirurgião imaginário no século XVI I con- templando o uso da anestesia geral, quando sua única experiência se limitava à intoxicação com as bebidas alcoólicas Retrovirus Os vetores retrovirais são importantes porque , se i n - troduzidos nas células-tronco, seus efeitos são persis- tentes por se tornarem incorporados e se repl icarem c o m o D N A do hospedeiro, sendo transferidos para cada f i lha durante a divisão celular. Em oposição a isso, como eles são inseridos ao acaso no cromossoma, p o - dem causar dano (ver adiante). Ademais , como eles são relativamente promíscuos em relação às células que infectam, poder iam p r o d u z i r efeitos indesejáveis, até mesmo sobre as células germinativas, se administrados in vivo. Portanto, eles são atualmente usados para ten- tativas de terapias ex vivo. O c ic lo de v id a dos re t rovi - rus que ocorrem naturalmente é explorado para cr iar vetores para uso em terapia gênica (ver F ig . 5 3 . 1 ) . Es- pera-se que, futuramente, seja possível alterar o enve- lope retroviral para aumentar a especificidade, de m o d o que o vetor possa v ir a ser administrado sistemicamen- te, mas residindo somente sobre a população celular- alvo desejada. Um exemplo dessa abordagem é a subs- tituição da proteína do envoltório de um vetor não- patogênico (p.ex., vírus da leucemia do camundongo , que não é patogênico para os seres humanos e f o i ava- LTR Potencializador-promotor LTR Transgene Factor IX (a)' ^ / T r a n s f e c ç ã o Transcriptase reversa CÉLULA ACONDICIONANTE m m Gag Pol ® DNA de dupla fita Fator IX protéico Secreção O * © © O C I T O P L A S M A Tradução C E L U L A - A L V O grrwnÊÊf ® I nton ror>ía r\ Integração • - v NÚCLEO D N A do hospedeiro Fig. 53.1 Estratégia para produzir vetores retrovirais. O transgene (o exemplo mostra o gene para o fator IX) em um arcabouço de vetor é introduzido (a) em uma célula acondicionante, onde é integrado em um cromossoma no núcleo e (b) transcrito para produzir o m R N A do vetor, que é acondic ionado em um vetor retroviral e emitido da célula acondic ionante. Ele então infecta a célula-alvo (c). A transcriptase reversa codif icada viralmente (d) converte o RNA do vetor em um híbrido R N A - D N A e, a seguir, no D N A de dupla fita, que é integrado (e) no genoma da célula-alvo. Ele pode, a seguir, ser transcrito e traduzido para produzir o fator IX, uma proteína. (Redesenhado de: Verma I M, Somia N 1997 Nature 3 8 9 : 239-242. ) Aesculapius 53 SEÇÃO 6: TÓPICOS ESPECIAIS 8 4 4 l iado com um vetor retroviral potencial para uso em seres humanos) com a proteína do envoltório do vírus da estomatite vesicular humana, de m o d o a atingir es- pecificamente as células epiteliais. A maior ia dos veto- res retrovirais são incapazes de penetrar o envoltório nuclear e, portanto, somente infectar as células que se d i v i d e m , pois a membrana nuclear se dissolve durante a divisão da célula. Conseqüentemente, eles não infec- tam as células que não se d iv idem, como os neurônios adultos. Adenovirus Os vetores de adenovirus são populares graças à altaexpressão transgênica que pode ser obtida. Eles trans- ferem genes para o núcleo da célula hospedeira, mas (diferente dos retrovirus) não são inseridos no geno- ma do hospedeiro e, assim, não produzem efeitos ca- pazes de ultrapassar as divisões celulares subseqüen- tes. Os vetores adenovirals foram usados para tentar a terapia gênica in vivo. A ausência de inserção nos cro- mossomas do hospedeiro remove o risco de c o m p r o - meter a função dos genes celulares vitais, bem como o risco teórico de carcinogenicidade (ver adiante), mas à custa de produzir somente um efeito temporário. Os vetores adenovirals são geneticamente modificados por fazerem deleções no genoma v i r a l , tornando, portan- to, o vírus incapaz de se replicar e causar infeção dis- seminada no hospedeiro, ao mesmo tempo criando es- paço, no genoma v i r a l , para ser inserido o transgene terapêutico. Um dos primeiros vetores adenovirals não t inha a parte controladora de uma região do cresci- mento, chamada de E r Esse vírus defeituoso cresceu em uma l inha celular que substituía a função E j perdi - da. O vírus recombinante é produzido por infectar as células complementares com um plasmídeo gerado de D N A clonado de interesse terapêutico mais um "cas- sete" de expressão e porções do D N A adenoviral . A recombinação entre isso e a "espinha d o r s a l " do geno- ma adenoviral deficiente de E j resulta em vírus que codif ica o transgene desejado. Essa abordagem leva a resultados aparentemente espetaculares, demonstran- do a transferência gênica para as linhagens celulares e para os animais-modelo de doença, mas foi desaponta- dora (em particular para a fibrose cística) em seres hu- manos. O pr inc ipal problema fo i que baixas doses (ad- ministradas por aerossol em pacientes com essa doen- ça) p r o d u z i u somente muito pouca eficiência de trans- ferência, enquanto altas doses resultaram em inf lama- ção e em uma resposta imune e expressão de curta duração do gene. Além disso, o tratamento não pode ser repetido por causa dos anticorpos neutralizantes. H o u v e então manipulações de vetores adenovirals na tentativa de reduzir sua imunogenicidade, por muta- ção ou remoção dos genes mais fortemente imunogêni- cos, uma abordagem atualmente muito adotada. Outros vetores virais Outros vetores virais potenciais sob investigação incluem o vírus adenoassociado, o herpes vírus, versões incapaci- tantes do vírus da imunodeficiência humana (HIV) . O ví- rus adenoassociado se associa com o D N A do hospedeiro; pode ser menos imunogênico que outros vetores, mas é difícil de ser produzido em massa e tem uma pequena ca- pacidade; conseqüentemente, não pode ser usado para transporte de grandes trangenes. O herpevírus não se as- socia com o D N A do hospedeiro, mas vive muito no siste- ma nervoso e poderia, portanto, ter aplicações específicas em tratar doenças neurológicas. HIV, diferente da maioria dos outros retrovirus (ver adiante), pode infectar células que não se dividem, como os neurônios. E possível remo- ver os genes do H I V que permitem a sua replicação e subs- tituir marcadores genéticos que são expressos logo após a injeção no cérebro de rato, e espera-se que os genes tera- pêuticos possam ser inseridos de modo semelhante. Alter- nativamente, pode-se provar ser possível transferir aque- les genes que permitam ao H I V penetrar no envoltório nuclear a outros retrovirus não-patogênicos. Vetores n õ o - v i r a i s Lipossomas Vetores não-virais inc luem uma variante de lipossomas (Cap. 7). Plasmídeos (diâmetro de até cerca de 2 /mi) são mui to grandes para serem acondicionados em l i - possomas regulares (diâmetro 0,025-0,1 jum), mas par- tículas maiores podem ser feitas usando lipídios carre- gados positivamente (" l ipoplexos") , que interagem com as cargas negativas sobre as membranas celulares e so- bre o D N A carregado, melhorando a transferência para o núcleo e a incorporação nos cromossomas. Tais par- tículas foram usadas para transferir genes de H L A - B 7 , interleucina-2 e C F T R . Elas são mui to menos eficien- tes do que os vírus, e tentativas estão atualmente sen- do feitas para melhorar esse desempenho pela incor- poração de várias proteínas virais sinalizadoras (pro- teínas de fusão de membrana, por exemplo) em sua camada externa. Entretanto, a injeção direta em tumo- res sólidos (p. ex., melanoma, câncer de mama, r i m e cólon) pode alcançar altas concentrações locais dentro do tumor. Microesferas Microesferas que sofrem erosão biologicamente, feitas de copolímeros polianidrídicos de ácido fumárico e áci- dos sebácicos (ver Cap. 7), podem ser carregadas com D N A plasmídico. Um plasmídeo com atividade de P-ga- lactosidase bacteriana, formulado desse modo e dado por via oral a ratos, pode resultar em absorção sistêmica e expressão da enzima no fígado de rato, surgindo a possi- bilidade de terapia gênica oral! Aesculapius TERAPIA GÊNICA ceis. His tor icamente , f o i a realização dessa d i f i cu lda- de que desviou a atenção das hemoglobinopatias (os primeiros alvos projetados da terapia gênica). A corre- ção desses distúrbios demanda um equilíbrio a p r o p r i - ado da síntese das cadeias a e {3 da g lobina , além da síntese do t ipo selvagem em vez do polipeptídio m u - tante. Para esta e para muitas outras aplicações poten- ciais, será essencial, mais ou menos de m o d o preciso, a expressão gênica controlada. A i n d a não está provado ser possível controlar os transgenes em receptores h u - manos, mas isso pode ser alcançado, dependendo do uso de um sistema de expressão induzível pela tetraci- c l ina . Isso f o i inicialmente apl icado em células em cu l - tura e, a seguir, nos camundongos in vivo. Miob las tos são planejados para a expressão da er i tropoiet ina i n - duzível pela dox ic i c l ina e específica de músculo esque- lético, usando dois vetores retrovirais . Após a injeção intramuscular dessas células, o transgene torna-se de- tectável no músculo esquelético do receptor, sendo pro- vado possível desvio para a produção de er i t ropoiet i - na (e, conseqüentemente, o hematócrito) em camun- dongos, e pelo tratamento c o m a d o x i c i c l i n a por um período de vários meses (Fig. 53 . 2). Para levar essa estratégia posterior, será necessário descobrir modos pelos quais os estímulos fisiológicos possam controlar a expressão do gene terapêutico. Isso, obviamente, será muito mais difícil para situações que exi jam respostas muito rápidas (p. ex., alterar a glicose sangüínea em um diabético). 85 i ' 1 1 1 • 1 1 1 ' 1 1 1 1 1 ' 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Semanas após o transplante Fig. 53.2 Controle da secreção de eritropoetina pela doxiciclina em camundongos transplantados com mioblastos contendo um transgene de eritropoetina com (quadrados) ou sem (círculos) um segundo transgene que confere induzibilidade à doxiciclina. Administração intermitente de doxiciclina por meio da água potável (indicado em vermelho) resultou na secreção de eritropoietina nos animais que receberam o gene da induzibi l idade à doxiciclina e, portanto, hematócrito aumentado por um período de 5 meses. (De: Bohl D, Naffakh N, Heard JM 1997 Nat Med 3: 299-305) . D N A plasmídico De m o d o surpreendente, verificou-se que o próprio D N A plasmídico ( " D N A nu") pode acessar o núcleo e ser expresso, embora mui to menos eficientemente do que quando é acondicionado em um vetor.* Tal D N A não carreia risco de replicação v i ra l e não é ele própio imunogênico,** mas não pode ser d i r ig ido a uma célu- la de interesse. Há considerável interesse na possibi l i - dade de usar o D N A nu para vacinas, pois mesmo pe- quenas quantidades de proteína estranha podem esti- mular uma resposta imune. Tal vacina para a gripe está em desenvolvimento clínico e mais alvos ambiciosos de longa ação inc luem a malária, tuberculose, clamí- dia , helicobacter e hepatite. CONTROLANDO A EXPRESSÃO GÊNICA Para realizar o potencialamplo da terapia gênica, não bastará, naturalmente, transferir o gene de m o d o sele- t ivo para as células-alvo desejadas e mantê-la expres- sando seu produto , embora esses objetivos sejam difí- *A descoberta proveio do seu uso - injetada no músculo estriado - como um controle "negativo" que se torna positivo. " I s so é uma preocupação teórica, pois anticorpos dirigidos contra o D N A são característicos de várias doenças auto-imunes, incluin- do o lúpus eritematoso sistêmico. Aesculapius SEÇÃO 6: TÓPICOS ESPECIAIS Transferência e expressão gênica • A t ransferência gênica é um dos pr inc ipais obstáculos pa ra to rnar a te rap ia gênica exeqüível . • G e n e s recombinan tes são t ransfer idos por me io de um p lasmíd io a um vetor, c o m f reqüênc ia um vírus a d e q u a d a m e n t e mod i f i cado • Há duas estratégias pr inc ipais pa ra transfer ir genes pa ra o pac iente : - in jeção in vivo, d i re tamente no pac iente , do vetor con tendo o gene terapêut ico (p. ex. , em um tumor ma l igno) ; - t ra tamento ex vivo de células do pac iente (p.ex., cé lu las- t ronco da m e d u l a ou do s a n g u e c i rcu lante ou miob las tos de u m a biópsia de músculo estr iado) segu ido por u m a re in jeção no pac iente . • Um vetor ideal deve ser seguro , ef ic iente (isto é, inserir o g e n e em u m a g rande f ração das células- a lvo) , selet ivo (isto é, levar à expressão da proteína terapêut ica , mas não da proteína viral) e deve causar expressão persistente do gene terapêut ico. • Os vetores virais inc luem retrovirus, adenov i rus , vírus a d e n o a s s o c i a d o s , herpesv i rus, vírus da imunodef ic iênc ia h u m a n a (HIV) incapac i tado . • Os retrovirus in fectam mui tos t ipos di ferentes de células em div isão e to rnam-se incorporados ao acaso n o D N A d o hospede i ro . • Os adenov i rus são gene t i camente mod i f i cados por deleções no g e n o m a que os incapac i tam de se rep l i carem e que cr ia espaço pa ra o t ransgene terapêut ico . Eles t ransferem genes pa ra o núcleo, mas não pa ra o g e n o m a da célula do hospede i ro . P rob lemas c o m os vetores adenov i ra ls a tua is inc luem u m a forte resposta i m u n e , in f lamação e expressão de curta du ração . O t ra tamento não pode ser repet ido por causa dos ant icorpos neutra i izantes. • Os vírus a d e n o a s s o c i a d o s a s s o c i a m - s e c o m o D N A do hospede i ro e não são imunogên icos . C o n t u d o , é difíci l p roduz i - los em g r a n d e q u a n t i d a d e e eles têm u m a c a p a c i d a d e p e q u e n a . • Herpesv i rus não se assoc iam c o m o D N A do hospede i ro , mas v ivem por l ongo per íodo no tecido nervoso e, por tanto, p o d e r i a m ter apl icações específicas no t ra tamento de doenças neurológicas. • Versões incapac i tantes do HIV d i fe rem da ma io r ia dos outros retrovirus, em que e les in fectam células que não se d i v i dem, inc lu indo os neurôn ios . • Vetores não-v i ra is i n c l uem: - u m a var ian te de l i possomas (Cap . 7), fe i ta usando l ipídios ca r regados pos i t ivamente e c h a m a d o s de " l i pop lexos " ; - microesferas desgastáveis b io log i camen te (ver C a p . 7), que es tende u m a poss ib i l i dade de te rap ia o ra lmen te a t i va ; - o p rópr io D N A plasmídico ( " D N A nu") , que pode acessar o núc leo e ser expresso, e m b o r a mui to menos e f ic ien temente do que q u a n d o é a c o n d i c i o n a d o em um vetor ; está sendo usado pa ra desenvo lver novas vac inas . • U m a vez t ransfer ido, o g e n e será essenc ia l para mui tos usos, pa ra que a a t iv idade do g e n e terapêut ico seja controlada. U m a a b o r d a g e m promissora pa ra isso é usar um s is tema de expressão induzível pe la te t rac ic l ina. SEGURANÇA Além das preocupações específicas de segurança para qualquer terapia em particular (p.ex., policitemia, t rom- bose e hipertensão, devido ao excesso de produção de eritropoetina; ver antes e F ig . 53 . 2), uma gama de inte- resses relacionam-se ao uso de vetores virais. Estes são selecionados para não serem patogênicos aos seres hu- manos ou modificados para se tornarem não-patogêni- cos, mas há uma preocupação de que tais agentes pos- sam adquirir virulência durante o uso. As proteínas v i - rais podem ser expressas e ser imunogênicas, originan- do uma resposta inflamatória nociva em algumas situa- ções (p. ex., nas vias aéreas em pacientes com fibrose cística). Vírus como os retrovirus, que se inserem ao acaso no D N A do hospedeiro, poderiam lesar o geno- ma e interferir com os mecanismos protetores que nor- malmente regulam o ciclo celular (ver C a p . 5). Conse- quentemente, se elas v irem a romper uma função celu- lar, isso poderia aumentar o risco de malignidade. Esse risco, mais do que uma possibilidade teórica, tornou-se recentemente evidente em uma criança tratada para uma imunodeficiência combinada grave (SCID; ver adiante), que desenvolveu uma doença semelhante à leucemia. C o m o demonstrado, o próprio vetor retrovial inseriu- se em um gene chamado de L M O - 2 . Mutações do L M O - 2 estão associadas com cânceres em crianças. Ressurgiram experiências clínicas iniciais, mas a mor- te trágica de Jesse Gelsinger (um voluntário de 18 anos em um teste de terapia gênica para a deficiência de or- nitina descarboxilase, doença não-fatal controlada por dieta e fármacos) levou à conclusão de que são muito reais as preocupações de segurança quanto às respostas imunomediadas aos vetores. As violações dos protoco- los tornaram-se aparentes, e, a seguir, mais seis mortes anteriormente não reportadas emergiram de outros dois programas. A possível influência de interesses comerci- ais de tais eventos foi muito discutida.* A questão do nível apropriado do exame minucioso público de tais estudos está em debate. *Ver, por exemplo, "Gene therapy under a c loud" e "The balance of risk and benefit in gene-therapy trials" em Lancet 2000, 355:329 e 384, e "The increasing opacity of gene therapy" em Nature 1999, 402:107. Aesculapius TERAPIA GÊNICA • Há precauções específicas de segurança pa ra qua lque r te rap ia em part icu lar (p. ex., po l ic i temia da expressão em excesso da er i t ropoet ina) e precauções gera is ad ic iona is em re lação, por exemp lo , aos vetores • Vetores virais: - p o d e m adqui r i r v i ru lência duran te o uso ; - con têm proteínas v i ra is, que p o d e m ser imunogên icas ; - p o d e m or ig inar u m a resposta in f lamatór ia - p o d e m lesar o g e n o m a do hospede i ro e interferir c o m o cic lo ce lu lar ; p o d e n d o causar câncer. • A exper iência clínica l imi tada para a época não tem até aqu i fo rnec ido evidência para p rob lemas insuperáveis. ASPECTOS TERAPÊUTICOS DEFEITOS GENÉTICOS SIMPLES Os distúrbios genéticos simples são, individualmente, de certo modo incomuns. C o m o já mencionado, as hemo- globinopatias foram os primeiros alvos projetados da te- rapia gênica (nos anos 80), mas tentativas iniciais foram "contidas" devido ao problema suscitado pela necessida- de de controlar precisamente a expressão dos genes que codificam as diferentes cadeias polipeptídicas da molé- cula da hemoglobina. Pacientes com talassemia* de ge- nótipos idênticos têm diferente expressão da doença, pois mesmo em distúrbios monogênicos, outros genes tam- bém estão envolvidos e o ambiente influencia as manifes- tações clínicas (ver Weãtherall, 2000). O foco foi desvia- do para um distúrbio genético raro, chamado de defici- ência de adenina desaminase, que resulta em S C I D . Isso levou ao primeiro protocolo de transferência gênica a ser aprovado pelo Nat ional Institutes of Health dos E U A . Subseqüentemente, uma equipe francesa tratou 11 crian- ças com uma forma de SCID e forneceu a primeira prova de que a terapia gênica pode curar uma doença compro- metedora da vida, mas tambéma evidência de que os vetores retrovirais podem causar câncer. A regulação r i - gorosa da biossíntese da proteína terapêutica pode não •ser essencial em alguns outros distúrbios (p.ex., fibrose cística e hemofilias). Tentativas na terapia gênica para este e outros distúrbios genéticos simples continuam: proto- colos que foram aprovados para testes clínicos pelo comitê consult ivo de D N A recombinante incluem um relacionado à deficiência de ocl-antitripsina (que cau- sa doença pulmonar crônica), granulomatose crônica (uma doença ligada ao cromossoma X na qual os neutró- *As talassemias são o grupo mais comum de doenças monogênicas. Caracterizam-se por síntese desequilibrada das cadeias cc e p da hemo- globina e mostram enorme variabilidade. Ocorrem pelo mundo todo e são comuns no Mediterrâneo (thalassa, em grego, significa "mar"). filos funcionam mal), hipercolesterolemia familiar (ver C a p . 19), distrofia muscular de Duchenne (uma outra doença ligada ao cromossoma X, na qual os meninos afetados tornam-se progressivamente incapacitados) e várias doenças de armazenamento lisossomal, inc luin- do a doença de Gaucher e a síndrome de H u n t e r (nas quais se acumulam, em vários órgãos, lipídios ou muco- polissacarídios anormais). TERAPIA GÊNICA PARA O CÂNCER Cerca da metade de toda a pesquisa sobre terapia gênica atual é devotada ao câncer. A primeira experiência de trans- ferência gênica a ser aprovada pelo Nat ional Institutes of Health foi um protocolo não-terapêutico, no final dos anos 80, projetado para introduzir um marcador gênico (confe- rindo resistência a um análogo da neomicina) dentro de uma classe de linfócitos que infiltravam vários tumores ("linfócitos infiltrantes de tumor") . A transferência gênica foi executada ex vivo e as células injetadas no paciente de modo a seguir os rastros de sua subsequente redistribui- ção. Essa estratégia foi útil em rastrear outras células, pos- sibilitando assim identificar a causa da recidiva subseqüen- te ao transplante de medula óssea para várias leucemias. Várias abordagens terapêuticas estão sob investigação: há excelente evidência, a partir de modelos animais, para a utilidade potencial de várias delas, mas a experiência com fármacos antineoplásicos convencionais (Cap. 50) exige cautela contra a extrapolação para a situação clínica. Abor- dagens promissoras incluem: • restaurando mecanismos protetores, como o p53 (ver C a p . 5); • inativando a expressão de oncogenes (p.ex., por um vetor retroviral com uma estrutura que produz um R N A transcrito antisense para o oncogene k-ras; ver adiante); • transferindo um gene para as células cancerosas, tornando-as assim sensíveis aos fármacos (p. ex., o que codifica a t imidilato cinase, que ativa o ganci- clovir) ; • transferência de proteínas para as células saudáveis do hospedeiro de modo a protegê-las (adição do canal de resistência a muitos fármacos - ver Cap. 50 - à medula óssea ex vivo, tornando-as, portanto, resistentes aos fármacos usados na quimioterapia e protegendo o paciente da neutropenia e tromboci- topenia, que é, por outro lado, previsivelmente causada por tais tratamentos); • marcando as células cancerosas com genes que, quando expressos, tornam essas células mais visí- veis ao sistema imune do hospedeiro e dispara uma resposta defensora visível (p.ex., para antígenos como H L A - B 7 ou citocinas, como o fator estimu- lante das colônias de macrófagos e granulócitos e a interleucina-2). Aesculapius SEÇÃO 6: TÓPICOS ESPECIAIS Terapia gênica para o câncer A b o r d a g e n s promissoras i nc luem: - restaurar mecan i smos protetores, c o m o o p 5 3 ; - inat ivar a expressão dos oncogenes ; - t ransfer i r um gene para as células cancerosas , t o rnando -as ass im sensíveis aos fá rmacos ; - t ransfer i r um gene pa ra as células do hospede i ro sad ias pa ra protegê- las da q u i m i o t e r a p i a ; - marca r as células c o m genes que as to rnem imunogên icos . As gap junctions entre as células cancerosas podem ajudar a propagar o efeito desejado a partir das células que captam o gene terapêutico às células vizinhas. Entre os estudos que usam essa abordagem, estão em andamento os testes clínicos no câncer de cabeça e pescoço, envol- vendo a injeção no tumor dos vetores adenovirals recom- binantes contendo o gene pS3 humane e testes em glio- blastoma (um tumor cerebral que afeta 4.000-5.000 pes- soas no Reino Unido a cada ano) envolvendo vetores her- pesvirus, que levam um gene para ativar um pró-fárma- co. O programa clinicamente mais avançado para o glio- blastoma é, atualmente, o teste da fase III, que emprega um vetor retroviral para codificar o gene do vírus do her- pes simples para a t imidilato cinase; é administrado no tumor durante a cirurgia, podendo torná-lo suscetível aos fármacos, como o ganciclovir - ver anteriormente. TERAPIA GÊNICA E DOENÇA INFECCIOSA Além das abordagens para o desenvolvimento de vacinas usando D N A nu, já mencionado aqui, há considerável inte- resse relativo ao potencial da terapia gênica para a infecção pelo H I V Atualmente, cerca de 10% de toda a pesquisa clínica de terapia gênica está concentrada nessa área. Os objetivos são a interrupção da replicação do H I V nas célu- las infectadas e impedir que ele se espalhe para as células não-infectadas, de modo ideal por torná-las células-tronco (que se diferenciam em células imunes) resistentes ao HIV, antes de amadurecerem. Várias estratégias estão sob investi- gação, incluindo o uso de genes codificadores de proteínas variantes direcionadas ao H I V que funcionam como agen- tes bloqueadores (assim chamadas de mutações "negativas dominantes", p. ex., rev. que começou a testagem clínica em 1995), as "iscas" de R N A e as formas solúveis da C D 4 (a resposta celular pela qual o H I V ganha acesso aos linfóci- tos; Cap. 46), que irão ligar-se e, com muita esperança, ina- tivar extracelularmente o H I V TERAPIA GÊNICA E DOENÇA CARDIOVASCULAR A transferência gênica vascular é atraente, não minima- mente porque os cardiologistas e os cirurgiões vascula- res executam estudos invasivos rotineiros que oferecem a oportunidade de administrar terapia gênica ex vivo (p. ex., um vaso sangüíneo que foi temporariamente re- movido com a intenção de reimplantá-lo como enxer- to) ou localmente in vivo (p. ex., por injetar de um ex- tremo ao outro um cateter diretamente na artéria coro- nariana ou femoral doente). A transferência gênica ofe- rece novos tratamentos potenciais (ver Ylã-Herttuala e M a r t i n , 2000). A natureza de muitos distúrbios vascu- lares, como a reestenose após angioplastia (dilatação de uma artéria estreitada usando um balão que pode ser inflado por meio de um cateter), é tal que a expressão genética transitória deve constituir tudo que é necessá- rio terapeuticamente. Não há falta de candidatos atrati- vos para a expressão terapêutica excessiva nos vasos san- güíneos, incluindo o ox ido nítrico ou a prostaglandina I 2 (prostaciclina) sintase, t imidi lato cinase, ciclina, bo- meobox de parada de crescimento e muitos outros. A l - guns deles foram estudados em modelos animais de re- estenose. A expressão excessiva do fator de crescimento do endotélio vascular e do fator de crescimento de f i - broblastos foi estudada desse modo , tendo aumentado o f luxo sangüíneo e o crescimento de vasos colaterais no músculo isquêmico da perna e do miocárdio. Essa é uma área promissora. OUTRAS ABORDAGENS BASEADAS EM GENES Até aqui, consideramos muito a adição de genes inteiros, mas existem outros, relacionados com as estratégias ba- seadas em ácido nucléico. U m a destas é tentar corrigir um gene que foi alterado por mutação; isso tem enorme vantagem teórica de que o gene corrigido permaneceria Outras abordagens baseadas nos genes • Cor reção de um gene que foi a l te rado por u m a mutação deve ser o i dea l . Isso está no seu início. • "O l igonuc leot ídeos anti-sense" são
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