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Ciettcias ‘Bit logicas Fisiolegia Vegetal (Exerticios Prathas)r Moacir Maestri Paulo de Tarso Alvim Marco Aurelio Pedron e Silva Paulo Roberto Mosquim Rolf Puschmann Marco Antonio Oliva Cano Raimundo Santos Barros EdiTORA UFV Fisiologia Vegetal [EHercicias Praticos] Universidade Federal de Vi^osa Reitor Vice-Reitora Pro-Reitor de Extensao e Cultura Luiz Claudio Costa Nilda de Fatima Ferreira Soares Gumercindo Souza Lima Jose Gouveia da Silva Paula Dias Bevilacqua (Presidente), Eduardo Antonio Gomes Marques, Eduardo Seiti Gomide Mizubuti, Jose Gouveia da Silva, Ketia Soares Moreira, Luiz Antonio dos Santos Dias, Paulo Henrique Alves da Silva, Ronan Eustaquio Borges e Rosimar de Fatima Oliveira Diretor da Editora UFV Conselho Editorial A Editora UFV e filiada a V Asociacion de Editoriales Universitarias de America Latina y e! Caribe Associagao Brasileira das Editoras Universitarias 1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE VICOSA CENTRO DE CIENCIAS BIOLOGICAS E DA SAUDE DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA VEGETAL Fisiologia Vegetal [Exera'cios Praticos) 12a reimpressao Moacir Maestri Professor Titular Aposentado da UFV Paulo de Tarso Alvim Pesquisador da CEPLAC Marco Aurelio Pedron e Silva Professor Adjunto da UFV Paulo Roberto Mosquim Professor Adjunto da UFV Rolf Puschmann Professor Adjunto da UFV Marco Antonio Oliva Cano Professor Titular da UFV Raimundo Santos Barros Professor Titular Aposentado da UFV EdiTORA UFV Universidade Federal de Vigosa 2019 2 © 1995 by Moacir Maestri, Paulo de Tarso Alvim, Marco Aurelio Pedron e Silva, Paulo Roberto Mosquim, Rolf Puschmann, Marco Antonio Oliva Cano e Raimundo Santos Barros. Pedigo: 1995 1" reimpressao: 1996 2" reimpressao: 1998-Sdrie Cademos Did&ticos 3“ reimpressao: 2001; 4“ reimpressao: 2003; 5a reimpressao: 2005 6“ reimpressao: 2006; 7“ reimpressao: 2007; 8a reimpressao: 2009 9" reimpressao: 2010; 10“ reimpressao: 2011; 1 la reimpressao: 2012 12a reimpressao: 2019 Os Cademos Didaticos visam publicar textos elaborados pelos docentes ou por eles e outros autores para uso em sala de aula. Os textos, de responsabilidade dos autores. poderao ser aperfei9oados para, em futuras edi<?oes, serem publicados na forma de livro. Impresso no Brasil Ficha catalografica preparada pela Segao de Catalogagao e Classificagao da Biblioteca Central da UFV Fisiologia Vegetal; exercicios praticos [por] Moacir Maestri [e outros].-Vi90sa : UFV, 1998. 91p. (Cademos didaticos, 20) ISBN: 85-7269-069-7 F537 1998 1. Fisiologia vegetal - estudo e ensino. 2. Fisiologia vegetal - Problemas, exercicios etc. I. Maestri, Moacir. II. Alvim, Paulo de Tarso. III. Silva, Marco Aurelio Pedron e. IV. Mosquim, Paulo Roberto. V. Puschmann, Rolf. VI. Cano, Marco Antonio Oliva. VTI. Banos, Raimundo Santos. VIII. Universidade Federal de Vi9osa. IX. Serie. CDD 19.ed. 581.107 CDD 20.ed. 581.107 Capa: Fabio Abreu Barbosa Revisao lingiiistica: Ana Maria de Gouveia Almeida Editora9ao eletronica: Jose Afonso de Freitas Impressao e acabamento: Divisao de Grafica Universitaria da UFV Editora UFV Pedidos Tel. (31) 3612-2064 Tel. (31 ) 3612-2062 E-mail: editoravendas@ufv.br editoraorcamento@ufv.br Livraria Virtual: www.editoraufV.com.br Edificio Francisco Sao Jose, s/p Universidade Federal de Vifosa 36570-900 Vifosa, MG, Brasil Caixa Postal 251 Tel. (31 ) 3612-2080/2074 www.editora.ufv.br E-mail : editora@ufv.br 3 SUMARIO RECOMENDA^OES PARA AS AULAS PRATICASREDACAO DO RELATORIO 56 SE^AOI - FOTOSSINTESEPigmentos Hidrossoluveis e Lipossoluveis em Tecidos Vegetais Separate) de Pigmentos Cloroplastidicos por Cromatografia em Papel Determinate do Espectro de Absorto dos Pigmentos dos Cloroplastos Formato de Poder Redutor por Cloroplastos Isolados (Reato de Hill) Determinate da Irradiancia de Compensato.. Sintese de Amido: Efeito da Clorofila e da Luz Fatores que Afetam a Fotossintese em Elodea canadensis 7 8 10 1? 14 17 19 22 SE£AOII - RESPIRA£AO Determinate Colorimetrica da Atividade da Peroxidase Atividade Desidrogenativa em Sementes Atividade de Catalase em Tuberculos de Batatinha ....30 Demonstrate da Respirato pelo Metodo Indicador .31 25 26 28 SE£AO III - PERMEABILIDADE E TRANSPORTE Efeito da Temperatura sobre a Permeabilidade das Membranas Celulares Permeabilidade das Membranas Celulares a Moleculas e Ions 35 36 38 SECAOIV - NUTRICAO MINERAL Nutrito Mineral das Plantas 41 41 4 SEgAOV - AGUA EM CELULAS E TECIDOS Demonstrate) da Osmose na Celula de Traube Intensidade da Osmose Relapoes Energeticas da Embebipao Plasmolise e Efeito de Substancias Toxicas sobre a Permeabilidade das Membranas Celulares Determinate do Potencial Osmotico de Tecidos Vegetais pelo Metodo Plasmolitico Determinate do Potencial Hidrico de Tecidos Vegetais pelo Metodo Densimetrico ou de Schardakow 48 50 51 53 55 57 60 SEgAO VI - ABSORgAO E PERDA DE AGUA PELA PLANTA ..62 Avaliapao da Abertura dos Estomatos com o Porometro de Alvim Avaliapao da Abertura Relativa dos Estomatos pelo Metodo de Infiltrapao SEgAOVII - TRANSLOCAgAO Sudato ou Gutapao Translocato de Solutos Organicos Exsudato da Seiva do Floema Construto do Modelo do Fluxo por Pressao - Modelo de Munch Recuperapao de Turgescencia em Ramos Cortados Desenvolvimento de Tensoes Intemas de Agua em Tecidos Vegetais 63 65 67 67 69 70 72 74 76 SEgAO VIII - CRESCIMENTO E DESENVOLVIMENTO Efeito da Qualidade da Luz na Germinapao de Sementes Fotoblasticas Efeito da Auxina sobre o Crescimento Direcional de Plantas Efeito do 2,4-D no Alongamento de Raizes Indupao de Raizes Adventicias em Estacas Polaridade Atividade Herbicida do 2,4-D Dominancia Apical 78 79 81 82 84 86 88 89 5 RECOMENDA^OES PARA AS AULASPRATICAS Para melhor aproveitamento das aulas praticas, os seguintes procedimentos sao recomendados: 1. Comparecer a aula pontualmente, munido de avental (jaleco) branco, do material relacionado na lista abaixo e deste manual, obrigatoriamente. 2. Ler cuidadosamente o exerdcio antes de iniciar sua execugao. 3. Dividir os trabalhos equitativamente com o(s) companheiro(s) do grupo. 4. Tomar notas das observagdes e dos resultados, levando em conta todos os pormenores relevantes a preparagao do Relatorio. 5. Discutir com o instrutor todos os pontos duvidosos. 6. Usar apenas o material estritamente necessario, evitando desperdicios e danos. 7. Limpar, no final da aula, o balcao de trabalho, lavar a vidraria e colocar todo o material utilizado (drogas, solugoes e aparelhagem) em seu devido lugar. Material de Uso Pessoal, Indispensavel ao Acompanhamento das Praticas 1 estilete de ponta reta Pinga reta de ponta fina 3 laminas para microscopia 6 laminulas para microscopia 1 regua de plastico, de 15 cm ou mais 3 laminas de barbear, novas 1 rolo de fita adesiva 1 lapis de desenho 1 borracha 1 lapis de cera ou caneta hidrocor 6 REDAgAO DO RELATORIO O relatorio de cada exercicio, que sera feito em modelo padronizado, devera conter: a - Ti'tulo b - Objetivos c - Resultados d - Discussao e - QuestSes O item Resultados deve trazer apenas dados obtidos, preferencialmente expressos em quadros ou figuras (graficos, desenhos esquemas). As possiveis explicaqoes devem ser colocadas apenas no item Discussao, que pode abranger ainda algumas conclu§oes no seu final. Quanto as Questoes, nao e necessario reescreve-las, bastando apenas apresentar as suas respostas. O Cademo de Relatorios sera recolhido periodicamente pelos professores, em datas definidas no programa de aulas praticas e tambem no final do curso para uma avaliaqao global. 7 SECAO I FOTOSSINTESE Na fotossmtese, a luz (radiagao eletromagnetica) e utilizada para transferir eletrons para a redugao de NADP+ a NADPH, com a oxidagao de H20, e gerar energia para a formagao de ATP. Esse “poder assimilador” (eletrons e energia) e, entao, usado para reduzir C02 a carboidratos, com ganho liquido de energia (energia quimica). O processo como um todo pode ser representado pela equagao geral: luz > C(H20) + H20 + 02C02 + 2 H20 cloroplastos A fotossmtese compoe-se de tres processosparciais, a saber: 1) Processo fotoquimico, que resulta na conversao da energia luminosa em energia quimica, pela formagao de NADPH e ATP. O processo envolve pigmentos para a absorgao da luz (reagoes biofisicas) e co- fatores e enzimas diversas (reagoes quimicas). Os pigmentos responsaveis pela absorgao da luz sao as clorofilas e os carotenoides. 2) Processo fisico de transporte, por difusao do C02, do ar extemo ate o local de reagao na matriz dos cloroplastos. 3) Processos bioquimicos relacionados com a redugao do C02, envoivendo varias reagoes enzimaticas. P Os fatores extemos que afetam diretamente a fotossmtese, como luz, concentragao de C02 e temperatura, tern efeito seletivo sobre cada um desses processos parciais. O processo fotoquimico e afetado apenas pela luz, enquanto o de difusao do C02 e influenciado pela diferenga de concentragao desse gas no ar extemo (ou turbulento) e na matriz dos cloroplastos, sendo levemente alterado pela temperatura. Ja os processos bioquimicos sao afetados principalmente pela temperatura. O estado hidrico da folha (determinado por seu potencial hidrico) tern, principalmente, efeito indireto sobre o transporte de C02, via abertura dos estomatos, que opoem maior ou menor resistencia ao fluxo de gases e vapor d'agua entre o interior da folha e o meio extemo. Os estomatos sao, portanto, reguladores tanto da fotossmtese quanto da transpiragao. 8 PRATICA N° 1 PIGMENTOS HIDROSSOLUVEIS E LI POSSOLUVEIS EM TECIDOS VEGETAIS 1NTRODUCAO Aldm das clorofilas e dos carotenoides, que sao lipossoluveis, as plantas contem outros pigmentos, como os flavonoides, que constituem uma serie de compostos relacionados, soluveis em agua, tendo como estrutura basica um esqueleto Ci5 de flavona. Os flavonoides ocorrem universalmente nas plantas superiores, mas sao incomuns entre as criptogamas. Encontram-se dissolvidos em agua, no suco celular (no interior do vacuolo) tanto de folhas como de frutos e de raizes, mas se acumulam especialmente nas flores, conferindo-lhes as cores caracteristicas. Desses pigmentos, os mais conhecidos sao as antocianinas, cada qual com uma cor distinta, que varia, conforme o pH, do azul ao vermelho, embora algumas sejam incolores. Alem de sua importancia como atrativo para insetos polinizadores, parecem ter a fun^ao deinibidores de bacterias e tern sido utilizadas como marcadores, por taxonomistas, na classificapao de plantas. As antocianinas ocorrem na forma de glicosideos, ligados comumente a uma ou duas unidades de glicose ou de galactose. A parte molecular sem o acpucar ainda mantem a coloraqao e e denominada antocianidina. O acumulo de antocianinas em caules, folhas ou frutos e estimulado por altos niveis de luz, por deficiencias de certos nutrientes (nitrogenio, fosforo, enxofre e outros) e por temperaturas baixas. OBJETIVOS Observar a separa9ao de pigmentos lipossoluveis e hidrossoluveis, por meio de sua partiipao em solventes nao misciveis. Acompanhar as varia9oes das propriedades de alguns destes pigmentos, em fun9ao das varia9oes do pH do meio ou de sua hidrolise parcial. 9 MATERIAL • Folhas variegadas • Homogenizador • Proveta de 50 ml • Tubos de ensaio • Funil separador • Funil de vidro • Acetona 80% • Eter etilico • Papel-filtro • Musselina • Pipetas de 15 ml • NaOH 0,1 N • HC1 0,1 N • KOH 3 N PROCEDIMENTO Homogenize 10 a 20 g de folhas coloridas (Coleus, p. ex.) em 50 a 100 ml de acetona 50%. Filtre o homogenato atraves de oito camadas de musselina e, em seguida, filtre-o novamente atraves de duas camadas de papel-filtro. Coloque 10 ml do filtrado num funil separador e adicione, escorrendo pelas paredes, igual quantidade de eter etilico e igual quantidade de agua destilada. Execute movimentos leves de rota^o no funil separador.Observe a separafao das camadas. Recolha, em um tubo de ensaio, cerca de 5 ml da camada inferior e dilua com igual volume de agua destilada. Proceda da mesma forma com a camada superior, observando as diferen^as.Acrescente a mistura proveniente da camada inferior algumas gotas de NaOH 0,1 N e anote o resultado. Em seguida, adicione a mesma quantidade de HC1 0,1 N e observe o que acontece. A mistura proveniente da camada superior acrescente algumas gotas de KOH 3 N e observe o que ocorre. Explique os resultados obtidos. 10 QUESTOES 1. Represente esquematicamente a partiqao dos pigmentos lipo e hidrossoluveis nas fases da mistura de solventes. 2. Onde se localizam, na cdlula, os pigmentos lipossoluveis das plantas verdes? Quais sao estes pigmentos? 3. Quais s3o os pigmentos hidrossoluveis e em que partes das celulas eles se encontram? 4. Fa<?a o esquema de uma celula vegetal, indicando os seus principais constituintes. 5. Por que podemos afirmar, com certeza, que as antocianinas nao participam da fotossintese? 6. Por que certos frutos ficam mais vermelhos quando expostos a luz solar? 7. Se voce fizesse um extrato de petalas de uma flor vermelha, que tipo de pigmento seria encontrado ao fazer sua separa9ao por parti^ao emsolventes? O que aconteceria se voce alterasse o pH da sohupao? PRATICA N° 2 SEPARACAO DE PIGMENTOS CLOROPLASTIDICOS POR CROMATOGRAFIA EM PAPEL INTRODUCAO Os pigmentos dos cloroplastos localizam-se nos tilacoides, associados as membranas lipoproteicas. Suas principais finises sao a absor9ao da energia radiante e a transferencia dessa energia a uma serie de compostos oxirredutiveis, os quais permitem a forma9ao de O2, ATP e NADPH + H+. O pigmento que participa diretamente da transferencia de eletrons e apenas a clorofila a enquanto a clorofila b e os carotenoides tern uma atua9§o indireta, transferindo a energia luminosa a clorofila a. 1 1 Cada tipo de pigmento tem uma estrutura qui'mica definida, com um padrao caracteristico de duplas ligaQoes conjugadas que determina a abso^aoseletiva de certos comprimentos de onda, fazendo com que cada pigmento apresente Colorado especifica. Assim, a clorofila a 6 verde-azulada, a clorofila b e verde-amarelada, as xantofilas sao amarelas e os carotenos sao alaranjados. Alem das cores, esses pigmentos apresentam diferentes afinidades pelos diversos solventes organicos e pela agua, em fun^ao dapropor9ao dos radicais hidrofilicos ou hidrofobicos que cada um deles possui. Uma tecnica extremamente simples que permite a separa^ao destespigmentos e a cromatografia em papel. Esta tecnica revolucionou, em 1944, a separacpao e detec9ao de produtos de rea95es, permitindo a determina9ao e a identifica9ao de compostos. No caso, ela consiste no uso de tiras de papel-filtro como suporte de uma fase aquosa, no qual uma fase movel organica se dirige para o apice. As substancias a serem separadas sao colocadas proximo a base da tira e se movem verticalmente, dependendo de sua afinidade por uma das fases (a aquosa e a organica). A separa9ao e, portanto, baseada na parti9ao liquido-liquido dos compostos. OBJETIVOS Separar e identificar alguns pigmentos dos cloroplastos, por meio da tecnica de cromatografia em papel. MATERIAL • Folhas de plantas sugeridas pelo instrutor • Tira de papel-filtro (20 x 4 cm) • Cuba de vidro para cromatografia • Tetracloreto de carbono •Tubo de ensaio • Funil de vidro • Placa de Petri • Areia lavada • Almofariz • Tesoura • Algodao • Acetona • Pipeta Pasteur ’ Secador de cabelo 12 PROCEDIMENTO Pegue tres folhas da planta indicada pelo instrutor, picote-as com uma tesoura e junte os peda<?os com um pouco de areia num almofariz. Coloque um pouco de acetona e homogenize. Filtre o homogenato em algodao, num funil de vidro, e recolha o filtrado num tubo de ensaio. Corte uma tira de papel-filtro de aproximadamente 20 x 4 cm, tomando o cuidado de manusea-la o minimo possivel (a gordura da mao atrapalha). Com uma pipeta Pasteur, passe 5 a 10 camadas do extrato dos pigmentos foliares sobre a origem do cromatograma, as quais deverao ser estreitas e concentradas, devendo-se ventilar levemente o papel apos a aplicaqao de cada camada. Em seguida, coloque 5 a 10 ml de tetracloreto de carbono (solvente) em uma cuba. Fixea tira de papel-filtro numa placa de Petri invertida e introduza-a no interior da cuba, de modo que sua extremidade encoste no solvente, mas sem mergulhar a origem (mancha). Apos 1 a 2 horas, identifique os pigmentos, considerando a coloraqao que cada faixa formada apresentou. QUESTOES 1. Transcreva a estrutura molecular dos pigmentos dos cloroplastos. 2. Como se pode explicar a separasao de pigmentos pela cromatografia de papel, com base na estrutura molecular de cada composto? 3. Por que as clorofilas a e b nao se separam bem por cromatografia em papel? 4. Identifique as fases estacionaria e movel do sistema e explique como elas estao atuando na separatpao dos pigmentos. 5. Caracterize: “frente”, “origem” e “valor Rf \ 13 PRATICA N" 3 DETERMINACAO DO ESPECTRO DE ABSOR^AODOS PIGMENTOS DOS CLOROPLASTOS INTRODUCAO As folhas absorvem mais fortemente as radioes das faixas do azul- violeta e do amarelo-vermelho, mas transmitem ou refletem quase toda a radial da faixa do verde. Os pigmentos dos cloroplastos sao os responsaveis por essa absorgao. Cada foton da radiagao absorvida ira excitar uma molecula de clorofila ou carotenoide nos tilacoides dos cloroplastos. Podem-se purificar um tipo de pigmento e determinar, com o auxllio de um colorimetro ou espectrofotometro, sua absorbancia relativa nos diferentes comprimentos de onda e, assim, construir um “espectro de absor9ao”. Quando se estuda o efeito da luz de diferentes comprimentos de onda (usando quantidades nao saturantes) num processo, como a fotossintese, obtem-se um “espectro de a9ao”. O espectro de a9ao, comparado com o espectro de absor9ao do pigmento, ajuda a elucidar a possivel participa9ao de um pigmento no processo. OBJETIVO Determinar o espectro de absor9ao dos pigmentos dos cloroplastidios. MATERIAL • Extrato cetonico de pigmentos de cloroplastos • Extrato de carotenoides • Acetonapura • Colorimetro ou espectrofotometro PROCEDIMENTO Utilizando extrato cetonico de pigmentos foliares, determine absorbancia nos comprimentos de onda disponiveis no colorimetro ou a 14 cspcctrofotomctro. Caso o cxtrato esteja muito concentrado, dilua-o com acetona. Use a acctona pura para ajustar o zero de absorbancia (ou 100% dc transmitancia). Construa um grafico e coloque na abscissa os comprimentos de onda c, na ordenada, as respectivas absorbancias. Da mesma forma, determine o espectro de absorgao de uma preparagSo de carotenoides e compare com o espectro anterior. QUESTOES 1. Quais sao as faixas de comprimentos de onda em que os extratos de pigmentos dos cloroplastos mais absorvem? 2. Por que a absorbancia e menor na regiao da luz verde? 3. Os carotenoides apresentam espectro de absorgao semelhante ao das clorofilas? 4. Quais sao os comprimentos de onda mais absorvidos pelos carotenoides? 5. Para quantificar as clorofilas a e b de um extrato cetonico ou de pigmentos por meio de um fotocolorimetro, podem-se utilizar comprimentos de onda na faixa da luz azul? E da luz vermelha? 6. Qual e o principio basico do funcionamento de um colorimetro (ou espectrofotometro)? PRATICA N° 4 FORMAOAO DE PODER REDUTOR POR CLOROPLASTOS ISOLADOS (REA0AO DE HILL) INTRODUCAO Sabe-se que em presenga de luz os cloroplastos, nas plantas, formam um “poder redutor” (o NADPH) pela redugao do NADP+, e pela oxidagao da agua, com liberagao de O2. Para cada molecula de O2 liberada, e necessaria a transferencia de 4 eletrons (provenientes da oxidagao de 2 moleculas de H20), o que permite a formagao de 2 NADPH + 2 H+. 15 Quando submetidos a condi?5es adequadas, cloroplastos isolados tamb6m sao capazes de realizar essa rea^o. Isso foi descoberto por Hill,em 1937, ao observar quc cloroplastos isolados produziam oxigenio, quando iluminados, em presen9a de oxalato fdrrico. Mais tarde foram descobertos outros compostos, como as quinonas e certos corantes, que tamb6m podiam atuar como “oxidantes de Hill”, conforme passaram a ser chamados. A reafao tambem ficou conhecida como “rea9ao de Hill”. Um desses compostos e o 2,6-diclorofenol-indofenol (DCPIP), capaz de detectar baixos niveis da atividade de Hill e mudar da cor azul para incolor ao ser reduzido. OBJETIVO Demonstrar o poder redutor de cloroplastos isolados e iluminados pelo emprego de um corante de oxirredu9ao. MATERIAL • Solu9ao de DCPIP (2,5 x lo-4 M) • Cristais de acido ascorbico • Tampao fosfato, pH 6,8 • Centrifuga refrigerada • Tubos de centrifuga • Bequer de 200 ml • Tubos de ensaio • Pipetas de 2 ml • Folhas de fumo • Sacarose 0,4 M • Fund de vidro • Homogenizador • Banho de gelo • Fonte de luz • Musselina • Pin9a • Papel-aluminio PROCEDIMENTO Homogenize 20 g de folhas de fumo em 100 ml de uma solu9ao de sacarose 0,4 M, em tampao fosfato pH 6,8, durante meio minuto. Filtre o 16 homogenato atrav^s de quatro camadas de musselina, recolhendo ofiltrado em urn copo mantido em banho de gelo. Centrifugue o filtrado a 200 rpm, por 10 minutos. Colete o sobrenadante e centrifugue-o novamente por 10 minutos, a 1.000 rpm. Despreze o sobrenadante e ressuspenda o precipitado na mesma solu9ao anteriormente utilizada. Observa^ao: Todo o material a ser utilizado (vidraria e solu9oes) deve ser previamente resfriado em congelador e mantido em banho de gelo durante sua utilizaipao. Separe 4 tubos de ensaio pequenos e numere-os de Coloque 0,5 ml da suspensao de cloroplastos nos tubos 1, 2 e 3; adicione 1,5 ml da solufao de DCPIP aos tubos 2, 3 e 4 e 1,5 ml de H20 ao tubo 1; e envolva o tubo 3 em papel aluminio. Exponha o conjunto a uma fonte de luz por um periodo aproximado de 10 minutos e, findo esse tempo, anote os resultados. Acrescente um cristal de acido ascorbico aos tubos 3 e 4, anote os resultados e interprete-os. Considere que o potencial redox do DCPIP esta em tomo de 0,2 V e o do acido ascorbico equivale a 0,0 V. a 4. QUESTOES 1. O que e “rea^ao de Hill”? 2. Qual e o oxidante natural de Hill? 3. Qual e o papel da luz e dos cloroplastos na descolora9ao de DCPIP? 4. Por que a solu9ao de DCPIP se descolore com a adi9ao de acido ascorbico? 5. Por que e necessario o uso de temperaturas baixas (banho de gelo) durante o prepare da suspensao dos cloroplastos? 6. A utiliza9ao de oxidantes artificiais de Hill permite detectar a ocorrencia das “rea9oes fotoquimicas”, mas impede que ocorram as rea9oes de “fixa9ao de C02”. Explique por que isso acontece. 17 PRATICA NH 5 DETERMINACAO DA IRRADIANCIA DE COMPENSACAO INTRODUQAO A taxa fotossintetica de folhas isoladas expostas ao ar atmosferico normal (320 ppm de CO2) varia de acordo com a intensidade luminosa. A irradiancia em que a taxa fotossintetica real e igual a taxa respiratoria (a troca de CO2 entre a folha e o meio ambiente e zero) e chamada de “irradiancia de compensa9ao” ou “ponto de compensa9ao luminoso”. Esse ponto varia com as especies, com as cond^oes deluminosidade durante o crescimento, com a idade e a posi9ao da folha, com a temperatura e com a concentra9ao de CO2. Somente acima desse ponto se observa fotossintese liquida, podendo ocorrer aumento no peso da materia seca das plantas. Um metodo simples para determinar a irradiancia de compensa9ao utiliza uma solu9ao de vermelho de cresol, que e indicador de pH. Essa solu9ao tern uma cor purpura em meio alcalino, podendo ser utilizada para indicar o teor de CO2 no ar. Quando o CO2 aumenta, a solu9ao toma-se mais acida e sua cor passa para amarelo. Tal situa9ao indica que a atividade fotossintetica e menor que a respiratoria. Quando a fotossintese e mais intensa que a respira9ao, a concentra9ao de CO2 diminui e a solu9ao se toma mais alcalina e passa a apresentar uma cor purpura mais intensa. A manuten9ao da cor original da solu9ao indica que a concentra9ao-de C02 do ar permaneceu constante e a taxa fotossintetica foi igual a respiratoria, ou seja, a fotossintese liquida foi igual a zero. OBJETIVOS Determinar a irradiancia de compensa9ao em folhas isoladas de plantas. Verificar o efeito do defice hidrico sobre a taxa fotossintetica de folhas isoladas. 18 MATERIAL • S0I119S0indicadora de vermelho de cresol • Folhas de plantas indicadas pelo instrutor • Rolhas de corti9a ou borracha, com suporte para as folhas • Tubos de ensaio grandes (9), preferentemente com tampas rosqueaveis • Suporte para tubos de ensaio • Papel-aluminio • Pipeta de 10 ml • Lampada refletora • Luximetro • Fita metrica PROCEDIMENTO Adicione 2 ml da sokupao indicadora (*) a 8 tubos de ensaio. Deixe um tubo como testemunha e fixe um segmento de folha turgida (ou a propria folha, dependendo de seu tamanho) a 6 dos demais, fechando-os bem com tampa de corthpa ou de borracha ou rosqueando-os. Enrole completamente um destes tubos em papel-aluminio e prenda um segmento de folha murcha da mesma especie a um outro tubo, fechando-o como os anteriores. Coloque cada tubo contendo folha turgida a distancias aproximadas de 0,40; 0,60; 1,0; e 1,70 m de uma lampada forte. Nessas distancias, obtem- se irradiancias aproximadas de 115, 55, 22 e 10 pmol m'V1, respectivamente. A ffente da fonte luminosa, coloque uma Cuba de vidro com agua para atenuar os efeitos do calor. Os tubos que content o segmento de folha murcha e 0 coberto com papel-aluminio devem ser deixados a 0,10m da fonte de luz. Pegue 0 ultimo tubo de ensaio (que content apenas a solu9ao indicadora) e sopre-o com uma pipeta, observando a mudan9a de colora9ao. Apos 2 horas, observe a colora9ao da solu9ao indicadora nos diversos tubos e determine a irradiancia de compensa9ao para a especie em estudo. * A solufSo indicadora contem NaC03 (84 mg. L'1), KC1 (7,45 g. L‘‘ ) e vermelho de cresol (10 mg. L'1 ); pH ajustado para 8, 1 . 19 QUESTOES 1. 0 que e irradiancia de compensagao? 2. Por que “plantas de sol” geralmente morrem se colocadas a sombra? 3. Por que pedals de folha mantidos no escuro tornam a solugao de vermelho de cresol amarelada? 4. Sob um dossel florestal, a intensidade media de luz incidente e de 50 p mol m'2 s’1. Considere duas especies arboreas, cujas irradiancias de compensagao sejam: A- 75 pmol m'V1 B- 25 pmol m'V1 Qual das duas teria condigoes de se estabelecer sob a floresta? Justifique. 5. Determinou-se a irradiancia de compensagao de uma folha a 20 °C; posteriormente, a irradiancia de compensagao da mesma folha foi determinada a 40 °C. Houve alguma diferenga nos valores obtidos? Justifique. 6. No presente exercicio, voce observou que a solugao do tubo contendo a folha a 500 nmol m'V1 adquiriu coloragao purpura bastante intensa; 50 pmol m s 1, a solugao ficou amarelada. Que fazer para determinar a irradiancia de compensagao aproximada? a PRATICA N° 6 SINTESE DE AMIDO: EFEITO DA CLOROFILA E DA LUZ INTRODUQAO Os principals produtos que se acumulam como resultado da atividade fotossintetica sao a sacarose e o amido. Hexoses livres, como glicose e frutose, sao menos abundantes. Poucas especies acumulam frutosanas ou, em menor quantidade, polissacarideos semelhantes. A sacarose e o principal agucar transportado no floema e pode ser 20 acumulado cm grandes quantidades cm certos tecidos de algumas plantas, como a cana-de-a<?ucar. Entretanto, a reserva mais importante, na grande maioria das plantas, 6 o amido. O amido forma-se sempre em plastidios, em que aparece como graos de estrutura caracteristica. Nas folhas, ele e sintetizado nos cloroplastos, mas, em tecidos nao clorofilados, os graos de amido s5o formados nos amiloplastos (leucoplastos). Nas folhas, o teor de amido aumenta durante o dia, em virtude de a translocagao nao acompanhar a taxa de acumulo promovido pela fotossintese, e a noite, ja que transloca^o continua e a espira<?ao consome amido, decresce.O amido apresenta-se constituido por amilose (cadeias nao- ramificadas) e amilopectina (cadeias ramificadas). Ambos os constituintes colorem-se pelo “lugol” (uma solufao de iodo-iodeto de potassio), o que permite a utilizafao dessa solu^ao para testar a presen9a de amido nascelulas. a OBJETIVOS Relacionar a presen9a de amido com a de clorofila em folhas variegadas. Demonstrar a importancia da luz para que o amido se acumule nas folhas. MATERIAL • Folha variegada (Coleus, p. ex.) e folha totalmente verde • Sohupao de lugol (I2 + KI) • Azulejo branco ou vidro de relogio ou placa de Petri • Alcool etilico comercial • Fogareiro eletrico • Bequeres de 250 ml PROCEDIMENTO 1 Efeito da clorofila Observe uma folha de planta variegada (Coleus, p. ex.). Fa9a um desenho desta folha, mostrando os limites das manchas brancas e verdes. Se a folha apresentar cuticula espessa, fa9a varios furos (com um estilete) em toda a sua extensao. Mergulhe a folha, pelo periodo de meio a um 21 minuto, em agua fervente e transfira-a para um copo contendo alcool etilico deixando-a ate a sua despigmenta9ao completa. Coloque a folha despigmentada, com a face abaxial para cima, sobre um azulejo branco (ou vidro de relogio ou placa de Petri) e trate-a com algumas gotas de lugol. Uma Colorado azulada intensa (quase preta) indica a presen9a de amido. 2 Efeito da luz Pegue uma folha de Coleus, de um ramo hidratado, que tenha permanecido por uns tres dias no escuro (tambem podem ser utilizadas folhas de plantas de milho ou de feijao mantidas no escuro pelo mesmo periodo). Pegue outra folha da mesma especie, mas que tenha sido mantida sob luz intensa, e proceda da forma descrita no item anterior, no intuito de determinar a presen9a ou nao de amido. Compare os resultados. Observa^o:A solu9ao de lugol e preparada, dissolvendo-se 15 g de KI em 1 litro de agua, na qual se dissolvem, em seguida, 3 g de 12. QUESTOES 1. Em que parte de uma folha variegada se verifica a presen9a de amido? 2. Qual o papel da luz e dos cloroplastos na sintese de amido? 3. Uma folha verde e branca apresentou rea9ao positiva ao lugol nas partes claras. Como voce explica isso? 4. Tecidos intemos de um caule nao apresentam cloroplastos desenvolvidos, no entanto o teste com lugol acusa a presen9a de amido nesses tecidos. Explique. 5. Quais sao as organelas celulares que acumulam amido? 22 PRATICA N° 7 FATORES QUE AFETAM A FOTOSSINTESE EM Elodea canadensis INTRODUCAO Muitas informa9oes acerca da influencia de fatores como luz, CO2 e temperatura sobre a fotossintese podem ser obtidas com facilidade, contando-se o numero de bolhas produzidas pela planta aquatica Elodea canadensis, submetida a varias cond^oes do meio.Algumas experiences serao feitas, usando-se um pequeno ramo de Elodea submerso em agua (freqiientemente uma solu9ao de KHCO3 a 0,1%), com o apice para baixo, dentro de um tubo de ensaio; deve-se escolher, de preferencia, a ponta de um ramo novo. As bolhas a serem contadas sairao do caule pela parte seccionada. Deve-se compreender que, em experimentos dessa natureza, os resultados nem sempre sao perfeitos, pois o numero de bolhas pode variar durante a experiencia, em fun9ao de fatores tao diversos como tamanho do ramo, altera9oes mecanicas na regiao cortada e varia9oes na solubilidade do oxigenio provocadas por mudan9as de temperatura etc. De qualquer modo, o “metodo das bolhas” e utilissimo nas aulas praticas, em virtude de sua extrema simplicidade. OBJETIVOS Verificar 0 efeito dos fatores extemos luz e temperatura sobre a fotossintese. Comprovar a utiliza9ao do gas carbonico na fotossintese. MATERIAL • Tubos de ensaio de 2 x 17 cm (4) • Copos de 600 ml, forma alta (4), com tampas de isopor • Suporte para tubos de ensaio • Refletor, com lampada de 200 W • Cronometro • Termometro • Lamina de barbear 23 • Pinga de ponta fina • Ramos de Elodea recentemente colhidos PROCEDIMENTO 1 Efeito da intcnsidade de luz Coloque um ramo de Elodea em um tubo de ensaio, que deve ser preso a um suporte e colocado dentro de um copo com agua a 30 °C, para atenuar as variagoes de temperatura. Com o frasco situado a 1,0 m de uma lampada de 200 W (30 jimol m'V1), determine o numero de bolhas produzidas por minuto ate obter um numero constante de bolhas uniformes. Em seguida, aproxime a lampada (deve-se evitar mexer no tubo) para 0,30 m da planta (de modo a obter uma densidade de fluxo fotonico de 170 pmolm'V1). Espere 5 minutos ate a estabilizagao da nova condigao e faga a mesma contagem de bolhas por 3 minutos. Finalmente, apos aproximar a lampada para 0,10 m da planta e um intervalo de 5 minutos, faga a contagem das bolhas, a semelhanga das anteriores. Normalize os dados, considerando 100 o numero maximo de bolhas e os outros em relagao a ele. Faga um grafico dos resultados do experimento, colocando na ordenada a intensidade da fotossintese (expressa pelo numero medio de bolhas por minuto) e, na abscissa, o fluxo fotonico. 2 Efeito da temperatura Coloque o mesmo tubo utilizado no experimento anterior a 0,30 m da lampada de 200 W. Primeiramente mergulhe o tubo em um copo contendo agua a 20 °C. Apos 5 minutos de estabilizagao, determine o numero de bolhas produzidas por minuto, durante 5 minutos consecutivos. Em seguida, substitua a agua do copo (sem mexer no tubo) por agua a 30°, 40° e 50 °C, fazendo as mesmas contagens de bolhas, por 5 minutos, em cada temperatura. Espere 5 minutos, antes de iniciar nova contagem, cada vez que a agua for mudada. Normalizando o numero maximo de bolhas para 100, faga um grafico com os resultados de seu experimento, colocando na ordenada o numero medio de bolhas e, na abscissa, a temperatura. 24 3 LJtiliza^ao do C02Enumere 3 tubos de ensaio e encha-os com uma solugao de KHCO3 0,1% Coloque um ramo de Elodea nos tubos 1 e 2 e envolva o ultimo com papel aluminio ou plastico preto. Mantenha todos os tubos a 0,30 m de uma fonte de luz. Apos um periodo de 2 horas, adicione uma ou duas gotas de fenolftaleina em cada tubo e observe se ha alguma diferen9a na intensidade de Colorado dos dois. QUESTOES 1. Por que o aumento da intensidade luminosa faz tambem aumentar a fotossintese em Elodea? 2. Por que ao medir a taxa de fotossintese em resposta a variagoes na intensidade de luz se deve sempre colocar o tubo contendo Elodea em um copo com agua? 3. Por que, ao aumentar a temperatura, a fotossintese da Elodea tambem aumenta ate certa temperatura? 4. Por que ocorre queda na fotossintese em temperaturas mais elevadas? 5. Por que as aguas contendo plantas aquaticas sao, em geral, mais acidas a noite do que durante o dia? 6. Nesses experimentos com Elodea voce esta determinando a taxa de fotossintese real (total) ou aparente liquida)? Explique. 7. Que gas forma as bolhas que se desprendem do ramo de Elodea iluminado? Que evidencias indiretas voce obteve como suporte para sua afirmativa? 25 SECAO II RESPIRACAO A respirafao promove a libera9ao controlada da energia annazenada em moleculas organicas para a manuten9ao e o crescimento do sistema vivente. Importantes moleculas de reserva nos organismos vegetais que sao utilizadas na respira9§o pertencem ao grupo dos carboidratos, especialmente o amido, a sacarose e a hemicelulose, e ao grupo dos lipideos, particularmente os triglicerideos. Eventualmente, outras substancias, como acidos organicos e aminoacidos, sao tambem utilizadas. Primariamente, todas as moleculas organicas tern origem na fotossintese, e a respira9ao apenas libera a energia quimica previamente armazenada pela transforma9ao da energia eletromagnetica da luz. Normalmente, as rea9oes da respira9ao iniciam-se com glicose. Numa primeira etapa, a glicose, por meio de uma seqtiencia de rea9oes, e transformada em acido piruvico. Essa fase denomina-se glicolise e ocorre sem redu9ao liquida de oxigenio, em cond^oes anaerobicas. Numasegunda etapa, por meio do chamado ciclo dos acidos tricarboxilicos (ciclo de Krebs), o acido piruvico e oxidado, em cond^oes aerobicas,com utiliza9ao de oxigenio, dando como produtos finais C02 e H20 (respira9ao aerobica). A degrada9ao incompleta de glicose nos organismos anaerobicos gera pequena quantidade de energia, enquanto o seu catabolismo completo, nos organismos aerobicos, fomece muito mais energia. Em ambos os casos, essa energia e armazenda na forma de ATP. A degrada9ao enzimatica da molecula de glicose na respira9ao e fundamentalmente um processo de oxirredu9ao, em que carbono e oxidado do nivel de (CH20) a C02, e oxigenio e reduzido de 02 a H20. Portanto, enzimas do grupo das oxirredutases, incluindo principalmente desidrogenases e oxigenases, atuam em diversos passos da sequencia degradativa. Alem de oxirredutases, outras enzimas participant do processo. As rea9oes bioquimicas da respira9ao sao influenciadas pela temperatura. Como sao reguladas por enzimas, os seus limites de temperatura sao relativamente pequenos. A respira9ao entre 0 °C e 35 °C segue bem de perto a lei de Vant’Hoff. O Qi0 para tecidos vegetais submetidos a temperaturas entre 5 e 25 °C e de 2,0 a 2,5. Quando se estuda o efeito da temperatura sobre a respira9ao, deve-se levar em conta o tempo 26 do durapSo do experimento, pois a intensidade do processo pode modificar-sc com o coirer do tempo, indcpendentcmente de outros fatores. A rcspirapSo implica pcrda de materia seca e trocas gasosas (absorpSo de oxigcnio e produp&o de C02). Os metodos utilizados para rnedir a respirapSo baseiam-se na determinapao de algum desses parSmetros. A medida da variapao do peso da materia seca requer grande quantidade dc material, aldm da sua destruipao. Os metodos baseados em trocas gasosas sao mais sensfveis, requerem menos material e nao sao destrutivos. Podem consistir na medipao manometrica do 02 consumido ( respirdmetro de Warburg, por exemplo); no eletrodo de Clark, (potenciometria); ou na medipao de C02 liberado (metodos fisicos), como a utilizapao do analisador de gas infravermelho (AGIV), ou fisico- quimicos, que se baseiam na retenpao de C02 em uma base e em sua determinapao por titulometria, colorimetria ou condutivimetria. PRATICA N° 8 DETERMINAPAO COLORIMETRICA DA ATIVIDADE DA PEROXIDASE INTRODUCAO As peroxidases sao oxirredutases largamente distribuidas em plantas e animais. Oxidam diidrofenois em presenpa de H202, formando quinona e H20: peroxidase H20 (benzoquinona)(hidroquinona) 27 Outros substratos sSo a tirosina, o triptofano, o dcido ascorbico ou as formas incolores de certos corantes de oxirredu9ao. As peroxidases estao aparentemente envolvidas na sintese de ligninas, degrada9ao de A1A e biossintese de etileno. OBJETIVO Determinar espectrofotometricamente a atividade da peroxidase. MATERIAL • Extrato enzimatico cru • Sohupao de peroxido de hidrogenio 20 v a 40% • Solu9ao de guaiacol a 0,5% • Pipetas de 10 ml (1) • Espectrofotometro PROCEDIMENTO Homogenize 100 g de peda9os cortados de nabo forrageiro (nabo, rabanete ou couve-flor) por 3 minutos, com 200 ml de agua resfriada em banho de gelo. Filtre o homogenado atraves de 4-8 camadas de musselina, coletando o filtrado em copo mantido em banho de gelo. Esse extrato pode ser empregado como extrato cru para o experimento. Coloque 5 ml de agua destilada numa Cuba de espectrofotometro e adicione 1 ml da solu9ao de guaiacol e 1 ml da solu9ao de peroxido de hidrogenio. Leve a cuba ao espectrofotometro e ajuste a absorbancia para zero, a 420 nm. Imediatamente, adicione 1 ml enzimatica (de concentra9ao conveniente, previamente determinada pelo instrutor) e proceda a leituras da absorbancia, em intervalos de 10 segundos, ate que a rea9ao pare (ponto em que nao mais se observa a deflexao do ponteiro do aparelho). Construa um grafico das leituras de absorbancia (ordenada) contra o tempo (abscissa). QUESTOES l .De a equa?ao de oxidafao do guaiacol pela peroxidase (com formulas estruturais). 28 2. Por que 6 necess&rio um espectrofotometro para determinar a atividade de peroxidase neste exercicio? 3. Se a temperature fosse mantida constante e voce quisesse aumentar a velocidade inicial da reatpao, o que voce faria? 4. Sabe-se que a velocidade das reafoes enzimaticas e diretamente proporcional a concentrafao das enzimas. Num experimento em que todas as outras condifdes foram mantidas constantes, a velocidade da rea9ao aumentou ate determinada concentra^ao de enzima. A partirdesse ponto, a adi9ao de mais extrato enzimatico nao fazia aumentar a velocidade da rea9ao. Por que?5. Nos testes com enzimas, o extrato enzimatico deve ser sempre conservado em baixa temperature. Por que? 6. Que propriedades devem possuir os componentes de uma rea9ao enzimatica para que sua velocidade seja estudada espectrofotome- tricamente? 7. A velocidade de uma rea9ao enzimatica, medida espectro- fotometricamente, foi alta no inicio do ensaio, permanecendo constante algum tempo depois. Como fazer para aumenta-la novamente? PRATICA N° 9 ATIVIDADE DESIDROGENATIV A EM SEMENTES I M R O D l f A O Alguns corantes podem agir como aceptores de hidrogenio, mudando de cor com a sua redu9ao. Por exemplo: sais de tetrazolio sao incolores e soluveis quando oxidados e produzem sais de formazana insoluveis e coloridos quando reduzidos. Com o uso de sais de tetrazolio, e possivel verificar a presen9a “in situ” da atividade de desidrogenases, uma vez que as formazanas precipitam-se onde esta ocorre. A presen9a de desidrogenases ativas e considerada sinal de vitalidade do tecido vegetal. 29 As desidrogenases catalisam rea9oes do tipo: BH2 + A - (substrato (acceptor reduzido) oxidado) > B + AH2 (produto (aceptor oxidado) reduzido) Sais de tetrazolio tem sido recomendados para testes rapidos de vitalidade e germinabilidade de sementes. OBJETIVO Determinar a ocorrencia e a localiza9ao da atividade de desidrogenases em sementes. MATERIAL • Graos de milho embebidos, por 12 a 24 horas • Solu9ao de TTC a 1% (cloreto de trifeniltetrazolio) • Banho-maria fervente • Tubos de ensaio • Lamina de barbear PROCEDIMENTO Separe 10 graos de milho, embebidos de vespera, e deixe-os em agua fervente por 5 minutos. Com uma lamina de barbear, corte cada grao longitudinalmente, num piano perpendicular as faces chatas, expondo o eixo maior do embriao. Fa9a o mesmo tipo de corte em outro lote de graos embebidos, mas que nao foram fervidos; conserve os dois grupos separados. Imeija os graos cortados em solu9ao de cloreto de triteniltetrazolio (TTC) a 1%, utilizando solu9ao suficiente para cobrir os graos. Observe as mudan9as de cor que ocorrem com o tempo. Fa9a um esquema da distribu^ao da colora9ao vermelha nos graos vivos (considerecasos tipicos se houver diferen9as entre os graos de um mesmo grupo). QUESTOES 1. O teste de TTC e especifico para determinar a atividade de que tipo de enzima? 30 2. Por que o teste de TTC pode ser usado para indicar a vitalidade de sementes? 3. Em que regioes da semente aparece a Colorado vermelha? 4. Descreva a rea9§o que conduz ao aparecimento da cor vermelha. 5. Zonas meristematicas de raizes vivas apresentam rea^ao positiva aoteste do TTC e partes suberosas de raizes velhas dao resultado negativo ao mesmo tipo de teste. Explique. 6. Cite o nome de pelo menos tres desidrogenases que voce conhece. 7. Escreva a equa<?ao geral para a a9ao de uma desidrogenase. PRATICA N° 10 ATIVIDADE DE CATALASE EM TUBERCULOS DE BATATINHA INTRODUCAO Durante a respira9ao, pode haver forma9ao de peroxido de hidrogenio (H2O2), que e toxico para as celulas. Sabe-se que essa substantia e um potente inibidor de muitas enzimas, devendo existir, portanto, um mecanismo enzimatico nos tecidos que promova sua destrui9ao. Ha evidencias de que as celulas geralmente contem enzimas denominadas catalases, que utilizam H202: Catalase 2 H202 > 2 H20 + 02 Outras fim9oes de catalases nas plantas ainda nao estao determinadas. OBJETIVO Observar a atividade de catalases em tuberculo de batatinha. 31 MATERIAL • Agua oxigenada 20 volumes • Placa de Petri (1) • Tuberculo de batatinha PROCEDIMENTO Coloque uma fatia fina de tuberculo de batatinha em uma placa de Petri e cubra-a com uma solu9ao diluida (30:1) de peroxido de hidrogenio. A evolu9ao de bolhas de oxigenio indica a presen9a de catalase. Repita a opera9ao com uma fatia de batatinha que tenha sido anteriormente fervida por 5 minutos. Interprete os resultados. QUESTOES 1. De a rea9ao das catalases, indicando o substrato e os produtos. 2. Cobrindo fatias de batatinha com agua oxigenada, observa-se maior evolu9ao de bolhas de oxigenio nos tecidos da periferia do que nos tecidos intemos. Por que? 3. Que diferen9as existem entre catalases, peroxidases e desidrogenases quanto as rea9oes que catalisam? 4. Explique a principal diferen9a entre enzimas “preexistentes” e as sintetizadas “de novo”. PRATICA N° 11 DEMONSTRA^AO DA RESPIRACAO PELOMETODO INDICADOR INTRODUCAO Nos processos fotossintetico e respiratorio ocorrem trocas gasosas com o meio ambiente. Na respira9ao aerobica, ha consumo de oxigenio 32 e liberate* de gas carbonico, enquanto na fermentaqao nao ha consumo de oxigenio, mas pode haver libera^ao de gas carbonico (apenas no caso dafermentaijao alcoblica). O CO2 em presen9a de agua forma acido carbonico. Portanto, num sistema fechado, a respiraqao acidifica a fase aquosa, ja que se estabelece um equilibrio entre as fases aquosa e liquida (com deslocamento para a direita): C02 <=> C02 <=> H2CO3 <^> H+ + HCO3-(ar) (agua) (agua) Se a fase aquosa contiver um indicador de pH, as varia9oes na quantidade de C02 no ar podem ser detectadas pelas mudanqas de colora9ao. O azul de bromotimol e um indicador, que se apresenta verde em meio neutro, azul em meio basico e amarelo em meio acido e pode, portanto, ser usado para se observar a acidifica9ao de uma fase aquosa por C02 proveniente da respira9ao. (agua) OBJETIVO Demonstrar a ocorrencia de atividade respiratoria em diversos materiais biologicos. MATERIAL • Suspensao de levedo, em solu9ao de sacarose a 10% • Suspensao de levedo, em agua destilada • Suspensao de levedo fervido • Folha • Malhas de plastico ou suportes metalicos (5) • Agua contendo C02 (agua mineral gasosa) • Sementes de milho em germinaqao • Canudos de refresco ou pipetas • Solu9ao de azul de bromotimol • Tubos de ensaio grandes (9) • Tubos de ensaio pequenos (4) • Estante para tubos de ensaio • Plastico preto (ou papel-aluminio) • Rolhas de borracha • Conta-gotas • HC1 0,1 N • NaOH 0,1 N 33 PROCEDIMENTO Enumere 6 tubos de ensaio de tamanho medio e adicione neles 5 gotas de azul de bromotimol. Coloque no fundo dos tubos de n° 2 a 6 uma malha de plastico (ou um pequeno suporte metalico), para manter uma plataforma cerca de 1 cm acima do nivel do indicador. Este arranjo servira de apoio para um tubo menor, que contera o material a investigar e que nao deve tocar a sohupao indicadora. Com esses tubos, proceda aos seguintes ensaios: Tubo 1 - Testemunha, para referencia da Colorado inicial do indicador. Tubo 2 - Coloque suspensao de levedo preparada em soluipao de sacarose a 10% ate a metade de um tubo de ensaio pequeno, que sera introduzido no tubo com o indicador ate tocar o suporte. Tubo 3 - Proceda da mesma forma anterior, mas usando suspensao de levedo preparada em agua. Tubo 4 - Proceda da mesma maneira que a anterior, porem usando suspensao de levedo previamente fervida. Tubo 5 - Proceda de forma semelhante a anterior, colocando sementes recem-germinadas de milho no tubo pequeno ou sobre uma mecha de algodao umedecido, mas que nao esteja em contato com a solu9ao indicadora. Tubo 6 - Coloque uma tira de folha no suporte, acima do indicador. Enrole o tubo de ensaio em papel-aluminio para evitar a entrada de luz. Arrolhe bem todos os tubos imediatamente apos a montagem e aguarde cerca de 1 hora. Observe as mudan9as na cor do indicador e anote suas observa9oes, adotando um sistema de conven9ao para as varia95es de cor da solu9ao indicadora. Enquanto espera, execute os seguintes ensaios: Teste 1 Coloque 3 ou 4 gotas do indicador em um tubo de ensaio e acrescente uma gota de HC1 0,1 N. Observe o que ocorre. Em seguida, adicione NaOH 0,1 N, gota a gota, ate que haja nova mudan9a de cor. Anote esta mudan9a e explique os resultados. Teste 2 Coloque 3 ou 4 gotas do indicador em outro tubo de ensaio. 34 Acrescente algumas gotas de dgua contendo g&s carbonico atd que mude a colora9So. Anote o resultado. Teste 3 Coloque 10 a 12 gotas do indicador em um tubo de ensaio. Sopre devagar, atrav^s de um canudo de refresco(ou uma pipeta), de modo queo ar borbulhe na solu9ao. Anote a mudan9a de cor. QUESTOES 1. Comparando os resultados dos testes 1 e 2, o que acontece ao C02 quando dissolvido em agua? 2. Explique o resultado do teste 3. 3. O que havia em comum nos tubos onde houve mudan9a de cor? 4. Compare e justifique os resultados obtidos nos tubos 2, 3 e 4. 5. Para demonstrar a respira9ao em folhas, foi necessario cobrir o tubo com papel-aluminio. Por que? 35 SECAO III PERMEABILIDADE E TRANSPORTE As celulas das plantas superiores sao circundadas por membranas que limitam o protoplasto (plasmalema), o vacuolo (tonoplasto) e as organelas, tais como cloroplastos, mitocondrias, peroxissomos e glioxissomos. Os cloroplastos e as mitocondrias apresentam dupla membrana. Investigates a respeito da compos^ao quimica, da ultra-estrutura e das fim9oes das membranas indicam que todas possuem caracteristicas comuns. A composito quimica mostra que praticamente todas elas apresentam cerca de 60% de proteinas e 40% de lipidios. Quanto a ultra-estrutura, nao se conhecem ainda, ao certo, sua arquitetura e os tipos de for5a que causam a coesao dos constituintes proteicos e lipidicos. Com rela^o as suas fw^oes, sabe-se que estas apresentampermeabilidade diferencial em rela9ao as particulas (moleculas ou ions). Essa seletividade esta provavelmente associada a natureza da particula, a ultra-estrutura da propria membrana e a disponibilidade de energia metabolica. Segundo a hipotese da “peneira molecular”, existiriam poros na membrana, atraves dos quais a taxa de penetra9ao de moleculas hidrofilicas seria inversamente proporcional ao tamanho da molecula. A penetra9ao de particulas hidrofobicas, de acordo com o “modelo lipidico” da membrana, estaria associada a sua solubilidade em lipideos. Esses modelos funcionam ate certo ponto, mas algumas substancias ionizadas e muitas moleculas atravessam as membranas celulares contra um gradiente de potencial eletroquimico, ou seja, via um transporte ativo, o que se ajusta ao modelo do “mosaico fluido” da ultra-estrutura da membrana. Existem varios processos pelos quais as moleculas podem atravessar as membranas. Dentre eles: (1) DIFUSAO LIVRE - As particulas seguem um gradiente de potencial eletroquimico. Neste caso, elas se movem livremente do interior para o exterior celular ou vice-versa, alcan9ando o equilibrio. O processo de difusao livre e afetado pela solubilidade das particulas em lipideos (quanto mais lipofilicas, maior a sua penetra9ao na membrana) ou pelo grau de ioniza9ao da particula (quanto menos ionizada, maior a sua penetra9ao). 36 (2) DIFUSAO FACILITADA - Admite-se que a subst&ncia combina com urna motecula transportadora, dentro da membrana celular, atravessa- a e d liberada no meio interno, voltando o transportador a recarregar- se no meio extemo. Nesse caso, a taxa de transporte da substancia, ao longo de seu gradiente de potencial eletroquimico, 6 mais rapida que a prevista pelo seu tamanho molecular e pela lipossolubilidade. Acredita-se que os compostos sejam transportados por proteinas. (3) TRANSPORTE ATIVO - Opera principalmente com ions minerais e metabdlitos insoluveis em lipideos, tais como afucares, aminoacidos e acidos organicos, que entram e saem da celula ou de seus compartimentos, por meio de processos envolvendo uma combina^aoreversivel com proteinas ou enzimas (ATPases) das membranas. 0 movimento passa-se contra um gradiente de potencial eletroquimico, com gasto de energia metabolica (ATP), levando ao acumulo da substancia no meio intemo. Todavia, o acumulo nao significa necessariamente que houve transporte ativo. (4) PINOCITOSE - Neste caso, as membranas formam vesiculas, que englobam as particulas, liberando-as no interior ou exterior celular. PRATICA N° 1 2 EFEITO DA TEMPERATURA SOBRE A PERMEABILIDADE DAS MEMBRANAS CELULARES INTRODU^AO A beterraba contem um pigmento vermelho hidrossoluvel, a betanina, do grupo das betacianinas, que, juntamente com as betaxantinas forma uma classe de pigmentos vermelhos e amarelos denominados betalainas. Esses pigmentos sao encontrados apenas em 10 familias pertencentes todas a uma so ordem. 37 A estrutura molecular das betalainas, que contem nitrogenio, nao guarda nenhuma rela^ao com a das antocianinas, mas elas, como osflavonoides em geral, possuem um a^ucar em sua molecula. A parte damolecula de betanina sem o acpucar e a betanidina, que conserva a cor. Ao contrario das antocianinas, as betalainas nao mudam de cor com a varia<?ao do pH. O tonoplasto e a plasmalema sao essencialmente impermeaveis as antocianinas e betalainas. Entretanto, com tratamentos adequados, a penneabilidade pode aumentar, fazendo com que estes pigmentos saiam das celulas. Varios fatores ambientais podem afetar, ou mesmo desorganizar, a penneabilidade diferencial das membranas, como a temperatura. OBJETIVO Observar o efeito de temperaturas diversas sobre a penneabilidade de membranas de celulas de raizes de beterraba. MATERIAL • Raizes de beterraba • Tubos de ensaio (6) • Pipeta de 20 ml (1) • Perfurador de rolha • Banho-maria • Suporte para tubo de ensaio PROCEDIMENTO Retire, com um furador de rolhas de cerca de 10 mm de diametro, cilindros de uma raiz de beterraba vermelha. Corte 7 pedafos de Colorado homogenea, com 20 mm de comprimento, e lave-os por cerca de 5 minutos, em agua corrente, ate que nao saiam mais pigmentos pelas superficies de corte. Deixe um cilindro no congelador (-15 °C), por mais ou menos uma hora e coloque os cilindros restantes em tubos de ensaio contendo 13 ml de agua destilada. Leve os tubos de ensaio para banhos as temperaturas de 0, 10, 20, 40 e 60 °C, mantendo-os nessas cond^oes por cerca de uma hora.Retire o cilindro do congelador e coloque-o em um tubo de ensaio contendo 13 ml de agua destilada, agitando-o. 38 Transfira o conteudo de cada tubo para uma cubeta de espectrofotometro e leia as respectivas absorbancias, a 425 nm. Construa um grafico em que apare9am as temperaturas nas abscissas e as absorbancias nas ordenadas. QUESTOES 1. Por que a absorbancia e bastante baixa entre 10 e 30 °C e aumenta em temperaturas mais elevadas? 2. Por que a absorbancia e alta quando se congela o cilindro de beterraba? 3. Que outro tratamento provocaria o mesmo efeito? 4. Cilindros de batatinha poderiam ser utilizados para estudar a permeabilidade pelo metodo colorimetrico? Justifique. 5. Por que os fruticultores geralmente armazenam seus frutos em temperaturas baixas, mas nunca inferiores a zero? 6. Desenhe um modelo de membrana, indicando sua constituiipao quimica. 7. Qual e a importancia da lavagem dos cilindros de beterraba durante 5 minutos em agua corrente? PRATICA N° 13 PERMEABILIDADE DAS MEMBRANAS CELULARES A MOLECULAS E IONS INTRODUQAO O vermelho-neutro e um corante vital, que penetra rapidamente no interior da celula, acumulando-se no vacuolo. Em meio acido, o corante apresenta-se rosado ou avermelhado e, em meio alcalino, amarelado, com o ponto de viragem a um pH proximo de 7,2. Como o conteudo vacuolar do levedo e de carater acido, ao penetrar m celula o vermelho-neutro apresenta Colorado rosada. Se uma base penetra no interior da celula, alterando conseqiientemente o pH do meio celular, o vermelho-neutro muda de Colorado, passando a amarelo. Assim, esse corante pode dar uma 39 indicasao da velocidade de penetra^o de urna substancia pelo temponecessario para modificar sua Colorado. OBJETIVO Avaliar a permeabilidade diferencial de celulas de levedo a moleculas e ions. MATERIAL • Levedo (fermento de padaria) • Solu<?ao de carbonato de sodio a 0,5% • Solu9ao de vermelho-neutro a 0,02% • Solu9ao de acido cloridrico 0,02 N • Solu9ao de acido acetico 0,02 N • Solu9ao de hidroxido de sodio 0,02 N • Solu9ao de hidroxido de amonio 0,02 N • Tubos de ensaio (6) • Estante para tubo de ensaio • Funil de vidro • Papel-filtro de porosidade fma PROCEDIMENTO Prepare uma suspensao de levedo a 20% em carbonato de sodio a 0,5% e coloque 2 ml desta suspensao em 5 tubos de ensaio. A cada umdos tubos adicione igual quantidade de sokuiao de vermelho-neutro em agua a 0,02%. Prepare um sexto tubo contendo apenas vermelho-neutro e carbonato de sodio em quantidades iguais. Anote a colora9ao da solu9ao de carbonato de sodio mais vermelho-neutro (tubo 6) e das suspensoes do levedo com o carbonato de sodio e vermelho-neutro (tubos 1 a 5) e interprete as diferen9as. Fa9a agora os seguintes testes: 1) Filtre o conteudo do primeiro tubo e observe a cor do material retido no papel-filtro. Adicione ao filtrado 1 ml de solu9ao de vermelho- neutro e registre o ocorrido. 2) Ferva em banho-maria o tubo 2, com o respectivo conteudo, e observe o que acontece. Explique o resultado. 40 3) Adicione 3 ml da solufao de hidroxido de sodio 0,02 N ao tubo 3. 4) Acrescente 4 ml da solusao de hidroxido de amonio 0,02 N aos tubos 4 e 5. 5) Aos tubos 4 e 5, ja com hidroxido de amonio, acrescente, respectivamente, 2 ml de acido cloridrico 0,02 N e 2 ml de acido acetico 0,02 N. Fa9a uma observa9ao bem rapida das possiveis mudan9as de cor da solu9§o indicadora. Na interpreta9§o dos resultados, tenha em mente que, em solu9ao aquosa, o carbonato de sodio, o acido cloridrico e o hidroxido de sodio estao em estado predominantemente ionizado; o acido acetico hidroxido de amonio encontram-se, principalmente, na forma molecular. Leve tambem em considera9ao a estrutura das membranas celulares. e o QUESTOES 1. Por que o vermelho-neutro adquire a colora9ao de rea9ao acida ao ser adicionado a supensao de levedo em carbonato de sodio, que tem rea9ao basica? Qual o tempo para a mudan9a de colora9ao? i . Sabendo que todos os ions utilizados durante o experimento sao monovalentes, como voce explica a penetra9ao mais rapida de ion potassio em rela9ao ao sodio? 3. Por que moleculas de peso relativamente baixo atravessam mais rapidamente as membranas celulares do que ions de peso semelhante? 4. A uma suspensao de levedo em Na2CC>3 a 0,5% foi adicionada uma solu9ao de vermelho-neutro; a mistura foi fervida. Por que ela apresentou cor amarela apos a fervura? 5. Uma suspensao de levedura foi misturada com uma solu9ao de vermelho-neutro, adquirindo uma colora9ao avermelhada. Com a adi9ao de NH4OH (0,02 N), tomou-se amarelada imediatamente. O que voce conclui quanto ao pH do suco celular e a permeabilidade das membranas ao NH4OH? Explique. 6. Por que, para a execu9ao deste experimento, e imprescindivel a utiliza9ao do vermelho-neutro? 7. Supondo que haja quatro tipos de particulas, AB, C+, D++, E+++, e que a penetra9ao dessas particulas numa membrana celular se de por difusao simples, qual a ordem decrescente de penetra9§o e por que? 41 SE£AO IV NUTRICAO MINERAL Alem de C, H e 0, a planta necessita de 13 outros elementos minerals essenciais, que se dividem em duas categorias: Macronutrientes: N, P, K, Ca, S e Mg Micronutrientes: B, Cl, Fe, Mo, Zn e Cu A classificaipao em macronutrientes e micronutrientes obedece a razoes apenas quantitativas, isto e, os primeiros sao exigidos em quantidades maiores que os ultimos. Os sintomas de deficiencia mineral das plantas dependem de dois fatores principals: da fun9ao ou fin^oes dos elementos minerals e de oelemento ser ou nao facilmente translocado das folhas mais velhas para as mais novas. Os sintomas de deficiencia do magnesio podem perfazer os dois fatores, pois, na ausencia deste elemento, a planta apresenta clorose nas folhas mais velhas (amarelecimento causado pela sintese restrita de clorofila) por causa de sua facil transloca?ao via floema. Dentre os elementos minerais, quanto a sua mobilidade nas plantas, pode-se classifica-los em tres grupos, a saber: a) Moveis: N, P, K, Mg e Cl b) Intermediaries: Mn, Zn, Cu, Mo e S c) Imoveis: Fe, Ca e B PRATICA N° 14 NUTRICAO MINERAL DAS PLANTAS INTRODUCAO No estudo da nutriijao mineral das plantas, nao se faz indica9ao do solo, pois, alem de sua heterogeneidade e complexidade, e dificil de 42 conhecer a sua exata composite) Para contomar tal obstdculo, v&rias tdcnicas foram desenvolvidas. A cultura em solu9ao - cultura hidroponica - 6 uma tecnica que consiste em cultivai* plantas com suas raizes submersas em uma solufao de agua e sais minerals de compos^ao quimica conhecida. Com esse tipo detecnica, podem-se controlar todos os elementos minerals disponiveis para as plantas, estudar os micronutrientes e macronutrientes e verificar os sintomas de toxidez ou deficiencia dos elementos minerals no crescimento e desenvolvimento das plantas. Embora essa tecnica seja uma das mais utilizadas, apresenta algumas desvantagens. Em geral, ha necessidade de aera^ao artificial das solu?oes nutritivas e de trocas constantes destas, poissuas composi9oes quimicas mudam constantemente a medida que as raizes absorvem ions. Algumas raizes apresentam absorfao diferencial de ions, o que pode levar a varia9oes do pH nas sohupoes nutritivas. Essas varia9oes, por sua vez, podem influenciar o equilibrio de oxirredu9ao e a forma ionica de varios elementos minerais nessas soloes. Para evitar as desvantagens da cultura hidroponica, tem-se usado meios solidos, podendo ser areia lavada ou vermiculita. Tais meios sao irrigados periodicamente com soloes nutritivas, fomecendo-lhes, portanto, os elementos minerais necessarios. Contudo, esse metodo nao pode ser empregado no estudo de micronutrientes, pois aqueles meios podem apresentar quantidades variaveis destes elementos. Alem desse fato, toma-se dificil a obten9ao de raizes intactas para analise, pois parte do sistema radicular e, em geral, perdida quando removido do suporte. Existem outros metodos, como o uso de resinas trocadoras de ions, mas essa tecnica pode introduzir, de novo, um pouco da complexidade encontrada no solo. OBJETIVO Observar os sintomas de deficiencia dos macronutrientes e de alguns micronutrientes (Fe e B), bem como o efeito da aera9ao em plantas cultivadas em solu9§o nutritiva. MATERIAL • Frasco(s) de 1.000 ml, de boca larga (10) • Papel-aluminio • Copo ou bandeja de plastico (1) • Chapas de isopor 43 • Espuma ou algodao cm • Tubos de plastico de 2 mm de diametro • Solu9oes-estoques, preparadas segundo HOAGLAND e ARNON (1950) • Plantulas de milho, feijao ou pepino, com cerca de 5 dias de idade PROCEDIMENTO As solu9oes-estoques para prepara9§o das diferentes solu9oes nutritivas sao as seguintes (ja preparadas): Solu9ao- estoque Composto (puro para analise) Concentra9ao Ca(N03)2.4H20 KN03 MgS04.7H20 KH2P04 Ca(H2P04)2.H20 K2S04 CaS04.2H20 Mg(N03)2.6H20 Microelementos (*) Fe - EDTA Microelementos sem boro 1,0 molar (236 g/1) 1,0 molar (101 g/1) 1,0 molar (246,5 g/1) 1,0 molar (136 g/1) 0,01 molar (2,52 g/1) 0,05 molar (8,61 g/1) 0,01 molar (1,72 g/1) 1,0 molar (256,43 g/1) A B C D E F G H I J 0,5% K * (*) A solu9ao de "microelementos" (Mn, B, Zn, Cu e Mo) tern a compos^ao mostra-da a seguir (para demonstrar a deficiencia de boro, o elemento devera ser omitido): B303 2,86 g 1,81 g 0,22 g MnCl2 ZnS04.7H20 H2MO04.H20 (85% M0O3) 0,09 g CuS04.5H20 Agua destilada 0,08 g 1 litro Cuidadosamente, lave 10 frascos de 1.000 ml, enxague-os com agua destilada e os seque em estufa ele ventila9ao for9ada, a 75 °C. Apos a secagem dos frascos, revista-os extemamente com papel-aluminio. Identifique os frascos da seguinte maneira: Completa, - Ca, - S, - M g, - K, - N, - P, - F e, - B. 44 Coloque &gua destilada (500 ml) dentro de cada frasco e adicione as quantidades das solugoes-estoques indicadas para cada tratamento, seguindo a tabela seguinte: Solugdes nutritivas Quantidades (em ml) de solugoes-estoques a serem tomadas para preparar um litro da solugao nutritiva com H2O destilada G H I JA B C D E F K Completa Sem K Sem P 5 1 15 2 1 5 1 12 10 4 6 1 12 Sem Ca 1 15 2 1 Sem N Sem Mg Sem S 200 1 110 5 4 6 1 11 3 4 6 2 1 11 Sem Fe 1 15 5 2 1 Sem boro 5 5 2 1 1 1 Misture bem a solugao apos cada adigao de sais para evitar a sua precipitagao. Quando todos os sais estiverem dissolvidos, complete 0 volume para 1.000 ml. Obtenha tampas de isopor perfuradas, quese adaptem bem a boca de cada frasco. Remova 30 plantulas uniformes de feijao, milho ou pepino que estao sendo cultivadas em areia. Durante a remogao dessas plantulas, todo o cuidado deve ser tornado para evitar danificagao do sistema radicular. A medida que elas sao separadas, devem ser colocadas dentro de um copo ou bandeja contendo agua. Substitua a agua do copo por agua destilada 2 vezes, para melhor lavagem do sistema radicular. Fixe as plantulas (2 por tampa), com o auxilio de espuma ou algodao, entre a tampa e 0 caule; e importante que a espuma nao entre em contato com a solugao. Deixe um orificio aberto em cada tampa para facilitar a troca gasosa. Com 0 objetivo de observar o efeito do arejamento sobre 0 crescimento das plantas, prepare um frasco com solugao “complete”, conforme se descreveu anteriormente. O arejamento desta solugao sera feito com o auxilio de um compressor. 45 Ap6s duas semanas, anote os sintomas de deficiencia e mesa o comprimento maximo das raizes e dos caules. Para medisao do sistema radicular, as plantas podem ser removidas rapidamente dos frascos. Essas medi^oes devem ser feitas com aproximasao de mm. Importante: Durante o experimento, mantenha o nivel da solusao dos frascos com a adigao de agua destilada, sempre que necessario. QUESTOES 1. Por que os sintomas de deficiencia de nitrogenio, fosforo e potassio aparecem primeiro nas folhas mais velhas das plantas? 2. Por que os sintomas de deficiencia de calcio, boro e ferro aparecem primeiro nas zonas meristematicas? 3. Quais sao as principais vantagens e desvantagens do estudo de plantas em soluqao nutritiva? 4. Por meio dos sintomas de deficiencia poderia estabelecer as possiveis fiinsoes dos elementos minerais? 5. Descreva, sucintamente, os sintomas de deficiencia de cada elemento mineral vistos na demonstrate de classe. Ha alguma diferentpa dos sintomas entre as mono e as dicotiledoneas? 6. Por que as plantas cultivadas em sokupoes nutritivas arejadas crescem mais? ANEXO PRINCIPAIS SINTOMAS DAS DEFICIENCIAS DE MINERAIS I Sintomas Generalizados por Toda a Planta ou Localizados nas Folhas Inferiores 1 Sintomas generalizados por toda a planta (as vezes amarelecimento e morte das folhas inferiores) A. Folhagem verde-clara: Plantas anas com o caule lenhoso e pouco ramificado; folhas pequenas, as inferiores mais claras do que as superiores; amarelecimento, seguido de dessecato e aparecimento de uma cor marrom-clara; normalmente, queda reduzida de folhas NITROGENIO 46 B. Folhagem verde-escura: Crescimento retardado; folhas inferiores amarelas, as vezes entre as nervuras, mas comumente com tendencia a desenvolver colora<?ao purpura, em particular, no peciolo; queda prematura das folhas FOSFORO 2 Sintomas localizados (clorose com ou sem manchas necroticas nas folhas inferiores, podendo apresentar dessecamento) A. Folhas cloroticas, que geralmente apresentam necrose mais tarde: Clorose entre as nervuras, permanencendo estas geralmente verdes; margens das folhas reviradas para cima ou para baixo, podendo apresentar manchas necroticas MAGNESIO B. Folhas cloroticas com manchas grandes ou pequenas de tecido morto: Manchas necroticas pequenas, normalmente no apice e nas intemervuras, mais intensas nas margens das folhas, podendo ocorrer queda de folhas Manchas generalizadas de rapido crescimento, geralmente nas areas entre as nervuras, podendo envolver nervuras primarias e secundarias; folhas espessas; caules com entrenos curtos POTASSIO ZINCO II Sintomas Localizados nas Folhas Novas 1) Gema terminal permanentemente viva (folhas cloroticas entre as nervuras, que permanecem verdes) A. Folhas jovens, que permanecem murchas, sem manchas ou clorose profunda; apice incapaz de permanecer ereto. COBRE B. Folhas jovens nao-murchas e aparecimento de clorose, acompanhada ou nao de tecido morto: Pontua^oes necroticas, geralmente presentes e espalhadassobre a superficie da folha; todas as nervuras, mesmo as mais finas, permanecem verdes, dando um aspecto de rede MANGANES 47 Manchas necroticas geralmente ausentes, clorose podendo ou nao envolver as nervuras das folhas, que podem apresentar cores claras Pontua9oes necroticas geralmente ausentes. Em casos extremos, aparece necrose das margens para dentro, tomando conta de grandes areas; somente as nervuras maiores permanecem verdes ou esverdeadas ENXOFRE FERRO 2) Gema terminal geralmente morta A. Deteriora^o nas pontas e nas margens das folhas. Muitasvezes, as folhas novas apresentam a ponta distintamente recurvada; morte das raizes precedendo os referidos sintomas CALCIO B. Deteriorate nas bases das folhas novas; caule e peciolos quebradi90s; morte das raizes, particularmente nas pontas meristematicas. BORO 48 SECAO V AGUA EM CELULAS E TECIDOS Na maioria dos processos fisiologicos das plantas e importante o grau de saturacao hidrica das celulas, mas estas nem sempre se encontram inteiramente saturadas, o que acarreta a formaqao de forqas motoras para o tluxo de agua atrav^s de tecidos ou 6rgaos da planta. Diversas relaqoes tern sido feitas entre o estado hidrico de uma celula ou tecido e a energia livre da agua. Esta energia e afetada por diversos fatores, fisico-quimicos ou meramente mecanicos, como a rigidez da parede celular. A concentraqao de solutos no vacuolo detemiina o potencial de soluto (%), enquanto a pressao hidrostatica, condicionada pela parede celular, determina o potencial de pressao (%). O potencial matrico ou matricial ('Em) e afetado pela quantidade de coloides ou de estruturas micelares da parede celular. Todos esses elementos compoem o potencial hidrico total (VFW) da celula ou tecido, que, em ultima instancia, significa a sua capacidade de ganhar ou perder agua. Assim: + ¥s + 'Em Os metodos conhecidos para determinaqao de cada um desses parametros sao imprecisos ou inadequados, pois, em sua maioria, utilizam-se mediqdes indiretas. O 'Ew pode ser obtido por meio de tres tipos de metodos: = (1) 1) Metodos de compensaqao na fase liquida - compreendem, dentre outros, os metodos densimetrico (Schardakow), refratometrico, volumetrico e de varia9ao de peso ou comprimento de celulas ou segmentos vegetais. Todos eles implicam uma transferencia de agua entre a amostra e uma solu9ao-teste. 2) Metodos de compensa9ao na fase gasosa - baseiam-se na transferencia de vapor de agua entre as amostras de tecidos e solu9oes com Ts conhecido, encerradas num recipiente hermeticamente fechado. O Ts pode ser determinado gravimetricamente ou por mudan9as de volume nas solu9oes (metodo capilar). 49 3) Mdtodo psicromdtrico - consiste em medir a depressao da temperatura de um bulbo umido num sistema gasoso fechado que se encontra em condisoes isometricas e em equilfbrio com a amostra. A partir deste principio, diversos tipos de psicrometros tern sido desenvolvidos. O potencial de soluto pode ser determinado na propria celula, mediante o emprego do microscopio (m&odo da plasmolise-limite ou incipiente) ou pela medigao direta da concentra9ao osmotica do suco celular (metodos psicometrico, refratometrico e criometrico). O potencial de pressao ou de parede (%) pode ser calculado quando conhecidos 'Fw e 'Fg. O potencial matrico 0Fm) implica a determinado pelo menos da “agua presa”, “agua livre” e “agua movel”. Os metodos para essas determina9des sao muito refinados, nao sendo comumente utilizados no estudo das redoes hidricas. Os potenciais que representam a varia9ao de energia livre da agua num sistema, em rela9ao a energia livre da agua num sistema de referenda (agua pura, 25 °C, pressao normal), tern a dimensao de energia por volume equivalente a pressao. Assim, eles sao medidos em unidades de pressao, ou seja, em MPa (megapascal). A agua nos sistemas biologicos tern comumente sua energia livre diminuida, portanto o potencial hidrico tern valor negativo. Isso resulta do fato de o potencial de pressao ter valor geralmente positivo (so tern valor negativo em celulas sob tensao). Uma terminologia equivalente a de potenciais e tambem usadafreqiientemente no estudo de redoes hidricas nas plantas, em que 'Fs = - n (pressao osmotica); 'Pm = - 3 (pressao matrica); e P (pressao de parede). Assim: 4^ = P - n - 3 que e equivalente a equa9ao (1). 50 PRATICA N° 15 DEMONSTRA^AO DA OSMOSE NA CELULA DETRAUBE INTRODUCAO As membranas de permeabilidade diferencial sao de diversas naturezas. Nos primeiros estudos dos fenomenos osmoticos empregavam- se membranas inorganicas aderidas a parte interior de capsulas de argila ou porcelana, que sao permeaveis a agua e impermeaveis a solutos de peso molecular elevado, conseguindo-se, dessa maneira, um osmometro perfeito. A membrana de Traube, formada pela combina9ao quimica do CuS04 com o ICtFe (CN)6, e facilmente construida em laboratorio, quando esses dois compostos reagem em meio aquoso. Quando um cristal de ferrocianeto e adicionado a uma solugao de sulfato de cobre, nota-se facilmente a formagao continua de membranas por meio do rompimento (absor9ao de agua alem do limite da resistencia da membrana) e do aumento de tamanho, ocorrendo a combina9ao quimica dos dois solutos, quando entram em contato. OBJETIVO Observar o processo de osmose e o crescimento osmotico da celula de Traube. MATERIAL • Solu9ao de CuS04 2% • Cristal de K^Fe (CN)6 •Tubo de ensaio (1) PROCEDIMENTO Coloque no tubo de ensaio cerca de 10 ml de solu9ao de sulfato de cobre e adicione um cristal de ferrocianeto de potassio. Ponha o tubo em lugar firme e, sem tocar nele ou move-lo, observe o que acontece no periodo de 1 hora. 51 QUESTOES 1. Escreva a rea9ao qui'mica envolvida na da celula de Traube. Qual e a constitu^ao quimica da membrana?2. Que substancias existem dentro e fora da cdlula de Traube? 3. Qual e a substancia que atravessa a membrana? Qual 6 a evidencia de sua resposta? 4. Que aconteceria se a membrana de Traube fosse permeavel aos ions cobre? 5. Durante a forma9ao da celula de Traube, as membranas rompem-se e refazem-se continuamente ate que o processo se interrompa. Qual e a causa da paralisa9ao do processo? 6. Por que a celula artificial de Traube e usada para demonstrar o fenomeno da osmose? 7. Por que as celulas vegetais nao se rompem quando colocadas em agua destilada, mesmo sabendo que sua concentra9ao de solutos no meio intemo e maior do que no meio extemo? PRATICA N° 16 INTENSIDADE DA OSMOSE INTRODUQAO Quanto mais concentrada uma solu9ao, menor o seu potencial de soluto. Quando separada da agua pura por membrana semipermeavel, o resultado final e a movimenta9ao da agua para a solu9ao, demonstrando a maior capacidade da agua pura na realiza9ao de trabalho. OBJETIVO Comparar os efeitos de solu9oes com diferentes pressoes osmoticas na intensidade da osmose. 52 MATERIAL • Solu<?5es de sacarose de 0,5 e 1 ,0 M • Sacos de diAlise (3) • Varas de vidro (3), de diametro conhecido • R^gua milimetrada PROCEDIMENTO Encha cada um dos tres sacos de dialise com soli^des desacarose na concentra9ao de 0,5 e 1,0 M e agua pura. Na outra extremidade de cada saco, enfie uma vara de vidro de diametro conhecido, amarrando o saco firmemente a vara, de forma que o nivel da soliupao apare9a acima da parte amarrada. Suspenda entao os saquinhos em tres copos com agua, prendendo as varas de vidro a um suporte. Marque o tempo e, depois de duas horas, me9a a altura da coluna d'agua absorvida. QUESTOES 1. Defina osmose como um processo fisico-quimico. 2. Explique as diferen9as encontradas nos tres sistemas. Por que, quanto maior a concentra9ao de sacarose, maior e a subida da coluna liquida na vara de vidro? 3. Que outro fator, alem da concentra9ao de sacarose, pode ter afetado a intensidade da osmose? 4. A medida que ocorre a entrada de agua no osmometro, o que acontece com a sua pressao osmotica? 5. O que voce faria para medir a pressao osmotica do sistema? 6. O que aconteceria com o sistema se voce usasse acido acetico em vez de sacarose? 7. Ate que altura maxima, na vara de vidro, subiria a coluna liquida, supondo que a vara fosse infinitamente comprida? 53 PRATICA N° 17 RELACOES ENERGETICAS DA EMBEBICAO 1NTRODUCAO A adsoi^ao de agua por coloides, estejam estes participando desistemas fisicos (por exemplo, papel, amido ou solo), ou de sistemas biologicos (celulas vivas), chama-se comumente embeb^ao. A embebi9aoe resultante da intera9ao entre as moleculas d'agua e as superficies solidas. Parte da energia livre (ou atividade) da agua e reduzida pela presen9a de superficies de intera9ao, aparecendo no sistema na forma de calor. A redu9ao da energia livre d'agua, em razao de fenomenos de superficie (embebi9ao, adsor9ao, capilaridade), e medida pelo que se chama potencial matrico (Tm). OBJETIVOS Observar a varia9ao da temperatura quando o amido se hidrata e estimar o potencial matrico aproximado correspondente. MATERIAL • Amido hidratado (deixado ao ar) • Amido desidratado (seco em estufa, por 2 h, a 105°C) • Agua quente e ffia • Tubo de ensaio grande (2) • Proveta de 5 ml ou pipeta graduada de 5 ml • Termometro • Dessecador PROCEDIMENTO Num tubo de ensaio comum, coloque uma camada de amido de milho de 20 a 30 mm de altura. Mergulhe o bulbo de um termometro na massa de amido e anote a temperatura. Em um copo a parte, misture agua quente e ffia ate obter a mesma temperatura do amido. Adicione, entao, ao tubo cerca de 3 ml dessa agua e 54 observe imediatamente a variapSo de temperatura. Continue observando ate que a temperatura atinja o maximo Repita o procedimento, utilizando amido previamente desidratado em estufa e guardado em dessecador. QUESTOES 1. Por que, ao se adicionar agua ao amido desidratado, ocorre aumento da temperatura? Qual e a fonte da energia calorifica desprendida? 2. O resultado desse exercicio permite estimar a pressao matrica do amido. E sabido que, durante a embebifao, um aumento da temperatura de 0,03 °C corresponde a uma pressao de 3,4 MPa. Qual seria a pressao que se deveria aplicar a amostra de amido para evitar sua expansao durante o fenomeno da embebi9ao? 3. Por que, quando se coloca agua em amido desidratado, a temperatura do sistema aumenta muito mais do que quando se adiciona agua em amido hidratado? 4. Qual o processo envoivido na abso^ao de agua pelas sementes nasprimeiras horas de germina9ao? 5. Qual e a origem das for9as que fazem com que as sementes consigam germinar em estradas, rompendo inclusive a camada de asfalto? 6. Como voce explica que sementes muito desidratadas consigam remover agua da atmosfera (em forma de vapor)? 7. Por que as sementes nao se dessecam completamente se expostas as condi9oes atmosfericas normais? 8. Como fazer para determinar o potencial matrico da celulose pulverizada? 55 PRATICA N° 18 PLASMOLISE E EFEITO DE SUBSTANCIAS TOXICAS SOBRE A PERMEABILIDADE DAS MEMBRANAS CELULARES INTRODU^AO Quando se coloca uma celula vegetal numa solufao, ela ganha ou perde agua, conforme seu potencial hidrico seja menor ou maior do que o potencial hidrico da solufao externa. Se o potencial hidrico da celula for maior (positivamente) do que o da solu^ao externa, a celula perdera agua e oprotoplasma, com o vacuolo, vai-se retraindo ate separar-se da parede celular. Esse fenomeno e denominado plasmolise e o inverso, desplasmolise. Ambos so ocorrem porque o protoplasma e envolvido por uma membrana celular, ou plasmalema, dotada de permeabilidade diferencial (permeabilidade seletiva ou semipermeabilidade). Essa permeabilidade mantem as duas fases - solugao externa e sokupao interna - separadas. A membrana celular deixa a agua passar livremente, mas impede, em maior ou menor grau, a passagem de solutos, e isso faz com que as fases externa e interna se conservem individualizadas. E certo que o vacuolo possui sua propria membrana tambem com caracteristicas semipermeaveis, mas em serie com a membrana celular, e, assim, o protoplasma e o vacuolo funcionam como um todo, em suas redoes hidricas. Se as membranas plasmicas, cuja integridade fisica e essencial para a manuten9ao da permeabilidade, forem danificadas por agentes quimicos
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