Fundamentos da Biologia Celular - Alberts et al - 2017 - 4 Edicao-354

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Capítulo 10 • Tecnologia de DNA recombinante moderna 327
sempre degradavam esse DNA “estranho” que era introduzido nelas experimen-
talmente. Uma procura pelo mecanismo responsável revelou uma nova classe de 
nucleases bacterianas que clivam o DNA em sequências nucleotídicas específi-
cas. O próprio DNA bacteriano é protegido da clivagem pela modificação química 
dessas sequências específicas. Visto que essas enzimas funcionam para restrin-
gir a transferência de DNA entre cepas de bactérias, elas foram chamadas de 
nucleases de restrição. O estudo desse aparente mistério biológico promoveu o 
desenvolvimento de tecnologias que mudaram para sempre a maneira como os 
biólogos celulares e moleculares estudam os seres vivos.
Espécies bacterianas diferentes produzem nucleases de restrição distintas, 
cada uma cortando em uma sequência nucleotídica específica diferente (Figura 
10-2). Como essas suas sequências-alvo são curtas – em geral 4 a 8 pares de 
nucleotídeos –, muitos sítios de clivagem ocorrerão, meramente por acaso, em 
qualquer molécula longa de DNA. A razão pela qual as nucleases de restrição 
são tão úteis no laboratório é que cada enzima cortará determinada molécula 
de DNA nos mesmos sítios. Assim, para determinada amostra de DNA, uma nu-
clease de restrição em particular gerará confiavelmente o mesmo conjunto de 
fragmentos de DNA.
O tamanho dos fragmentos resultantes depende das sequências-alvo das 
nucleases de restrição. Como mostrado na Figura 10-2, a enzima HaeIII corta em 
uma sequência de quatro pares de nucleotídeos; espera-se que uma sequência 
desse comprimento ocorra por acaso aproximadamente uma vez a cada 256 pa-
res de nucleotídeos (1 em 44). Em comparação, seria esperado que uma nuclea-
se de restrição com uma sequência-alvo que tem oito pares de nucleotídeos de 
comprimento clivasse o DNA uma vez a cada 65.536 pares de nucleotídeos (1 em 
48), em média. Essa diferença na seletividade pela sequência torna possível clivar 
uma molécula longa de DNA em tamanhos de fragmentos que são mais apropria-
dos para determinada aplicação.
A eletroforese em gel separa fragmentos de 
DNA de diferentes tamanhos
Depois que uma molécula grande de DNA é clivada em segmentos menores com 
uma nuclease de restrição, os fragmentos de DNA podem ser separados uns dos 
outros com base no seu comprimento por eletroforese em gel – o mesmo mé-
todo utilizado para separar misturas de proteínas (ver Painel 4-5, p. 167). Uma 
mistura de fragmentos de DNA é aplicada a uma das extremidades de um bloco 
de gel de agarose ou de poliacrilamida, que contém uma rede microscópica de 
poros. Quando uma voltagem é aplicada em todo o gel, os fragmentos de DNA 
carregados negativamente migram em direção ao eletrodo positivo; os fragmen-
tos maiores migram mais lentamente, pois seu progresso é impedido em grande 
parte pela matriz do gel. Após algumas horas, os fragmentos de DNA ficam dis-
tribuídos ao longo do gel de acordo com o tamanho, formando uma escada de 
bandas individuais, cada uma composta por uma coleção de moléculas de DNA 
5′
3′ 5′
3′
5′
3′
5′
3′
G
C
5′
3′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
G
C
C
G
C
G
G
C 5′
3′
+
+
G
C
C
G
C
G
Sítio de clivagem
HaeIII
G
C
A
T
A
T
T
A
T
A
EcoRIC
G
G
C
A
T
A
T
T
A
T
A
C
G
+
A
T
A
T
G
C
C
G
T
A
HindIIIT
A
A
T
A
T
G
C
C
G
T
A
T
A
Figura 10-2 Nucleases de restrição 
clivam o DNA em sequências nucleotí-
dicas específicas. Frequentemente, as 
sequências-alvo são palindrômicas (i.e., 
a sequência nucleotídica é simétrica em 
torno de um ponto central). Aqui, ambas as 
fitas da dupla-hélice de DNA são cortadas 
em pontos específicos na sequência-alvo 
(laranja). Algumas enzimas, como HaeIII, 
cortam transversalmente dupla-hélice e 
dão origem a duas moléculas de DNA com 
extremidades cegas; com outras enzimas, 
como EcoRI e HindIII, os cortes em cada 
extremidade são assimétricos. Esses cortes 
assimétricos geram “extremidades coesi-
vas”, curtas, projeções de fita simples que 
ajudam as moléculas cortadas a se unirem 
pelo pareamento das bases complemen-
tares. Essa nova união das moléculas de 
DNA se torna importante para a clonagem 
de DNA, como discutimos adiante. As nu-
cleases de restrição costumam ser obtidas 
de bactérias, e seus nomes refletem as suas 
origens: por exemplo, a enzima EcoRI vem 
de Escherichia coli.
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