Fundamentos da Biologia Celular - Alberts et al - 2017 - 4 Edicao-371

Prévia do material em texto

344 COMO SABEMOS
SEQUENCIANDO O GENOMA HUMANO
Quando as técnicas de sequenciamento de DNA se torna-
ram totalmente automatizadas, a determinação da ordem 
dos nucleotídeos em um fragmento de DNA deixou de ser um 
projeto de tese de doutorado elaborado para ser uma tarefa 
de rotina de laboratório. Alimentar com DNA a máquina de 
sequenciamento, adicionar os reagentes necessários e obter 
o resultado procurado: a ordem dos As, Ts, Gs e Cs. Nada po-
deria ser mais simples.
Então por que o sequenciamento do genoma humano foi 
uma tarefa tão formidável? Muito por causa do seu tamanho. 
Os métodos de sequenciamento de DNA empregados na épo-
ca eram limitados pelo tamanho físico do gel utilizado para 
separar os fragmentos marcados (ver Figura 10-20). Quando 
muito, apenas algumas centenas de nucleotídeos podiam ser 
lidas a partir de um único gel. Como, então, você lidaria com 
um genoma que contém bilhões de pares de nucleotídeos?
A solução é romper o genoma em fragmentos e sequen-
ciar esses segmentos menores. O principal desafio, então, 
está na organização dos fragmentos curtos na ordem correta 
para gerar uma sequência ampla de um cromossomo inteiro 
e, por fim, todo um genoma. Existem duas estratégias prin-
cipais para realizar a quebra e reorganização do genoma: o 
método aleatório e a abordagem clone por clone.
Sequenciamento aleatório (shotgun)
A abordagem mais direta para sequenciar o genoma é que-
brá-lo em fragmentos aleatórios, separar e sequenciar cada 
um dos fragmentos de fita simples e então utilizar um com-
putador potente para ordenar esses pedaços, usando sobre-
posições de sequências (Figura 10-24). Essa abordagem é 
chamada de “estratégia do sequenciamento aleatório”. Como 
analogia, imagine despedaçar algumas cópias do Fundamen-
tos da Biologia Celular, misturar seus pedaços e então tentar 
montar uma cópia inteira do livro novamente, combinando 
as palavras ou frases ou sentenças que aparecem em cada 
pedaço. (Algumas cópias seriam necessárias para gerar uma 
sobreposição suficiente para a remontagem.) Isso poderia ser 
feito, mas seria muito mais fácil se o livro fosse do tamanho 
de, apenas, vamos dizer, duas páginas.
Por essa razão, uma abordagem aleatória direta é a es-
tratégia de escolha para sequenciar genomas pequenos. Esse 
método provou o seu valor em 1995, quando foi utilizado 
para sequenciar o genoma da bactéria infecciosa Haemophi-
lus influenzae, o primeiro organismo a ter determinada a sua 
sequência genômica completa. O problema com o sequen-
ciamento aleatório é que o processo de remontagem pode 
ficar confuso com sequências repetitivas de nucleotídeos. 
Embora raras em bactérias, essas sequências fazem parte de 
uma grande fração dos genomas de vertebrados (ver Figura 
9-33). Segmentos de DNA altamente repetitivos tornam difícil 
reorganizar as sequências de DNA com acuidade (Figura 10-
25). Retornando à analogia com o Fundamentos, apenas este 
capítulo contém mais do que alguns exemplos do sintagma 
“o genoma humano”. Imagine que uma tira de papel do Fun-
damentos rasgado contenha a informação: “Então por que o 
sequenciamento do genoma humano” (que aparece no início 
desta seção); e outra contenha a informação: “o consórcio de 
sequenciamento do genoma humano combinou o sequencia-
mento aleatório com uma abordagem clone por clone” (que 
aparece a seguir). Você poderia estar tentado a unir esses 
dois fragmentos com base no sintagma sobreposto “o ge-
noma humano”. Entretanto, você concluiria com a sentença 
sem sentido: “Então por que o consórcio de sequenciamento 
do genoma humano combinou o sequenciamento aleatório 
com uma abordagem clone por clone”. Você também perde-
ria vários parágrafos de texto importantes que originalmente 
apareciam entre esses dois exemplos de “o genoma humano”.
E isso apenas nesta seção. O sintagma “o genoma huma-
no” aparece em vários capítulos deste livro. Essas repetições 
compõem o problema de colocar cada fragmento no seu con-
texto correto. Para evitar esses problemas de organização, 
os pesquisadores no consórcio de sequenciamento do geno-
ma humano combinaram o sequenciamento aleatório com a 
abordagem clone por clone.
Sequenciamento e clone por clone
Nessa abordagem, os pesquisadores iniciaram preparando uma 
biblioteca de DNA genômico. Eles quebraram o genoma huma-
no em fragmentos que se sobrepunham, de 100 a 200 pares de 
quilobases de tamanho. A seguir, ligaram esses segmentos a 
cromossomos artificiais bacterianos (BACs, de bacterial artifi-
cial chromosomes) e os inseriram em E. coli. (BACs são simi-
lares aos plasmídeos bacterianos discutidos anteriormente, 
com exceção de que podem carregar fragmentos de DNA muito 
maiores.) À medida que as bactérias se dividem, elas copiam 
os BACs, produzindo, dessa forma, uma coleção de fragmentos 
clonados que se sobrepõem (ver Figura 10-10).
Fragmentação
aleatória
Sequência de uma fita
dos fragmentos
GTTCAGCATTG---
---GCCATTAGTTCA
---GCCATTAGTTCAGCATTG---
Sequência original
reconstruída com base
na sobreposição das sequência
dos fragmentos
Múltiplas cópias
do genoma
Sequências 
de dois
fragmentos
Figura 10-24 O sequenciamento aleatório é o método de 
escolha para sequenciar genomas pequenos. Primeiro, o ge-
noma é quebrado em fragmentos menores que se sobrepõem. 
Cada fragmento é então sequenciado, e o genoma é organizado 
com base nas sequências que se sobrepõem.
Alberts_10.indd 344Alberts_10.indd 344 16/01/2017 10:23:5016/01/2017 10:23:50