I008 Slides de Aula - Unidade III UNIP BIOL MOLEC

Prévia do material em texto

Prof. Dr. Alexandre Dias
UNIDADE III
Biologia Molecular
Aplicada à Biomedicina
Conceitos importantes:
Alelos:
 Selvagem;
 Variante.
Técnicas de Biologia Molecular aplicadas à terapia e ao tratamento de doenças
Variantes:
 Polimorfismos;
 Heteromorfismos;
 Raras.
Variantes de nucleotídeos únicos:
 Single Nucleotide Variants (SNVs);
 Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs).
Técnicas de Biologia Molecular aplicadas à terapia e ao tratamento de doenças
Fonte: livro-texto.
TGCCTTTATTTGGTAATTTTTTTGT[T/C]TCTGAGACAGTCTCACTCTGTTGCC
rs133045 é uma variante T/C no cromossomo 22
Polimorfismos – Indels:
 “Os simples apresentam dois alelos, ou seja, a presença ou a ausência do seguimento 
inserido ou deletado. Já os multialélicos se apresentam como as repetições de fragmentos 
de DNA em tandem (repetições de 1-6 bases de comprimento que se encontram uma ao 
lado da outra no cromossomo intercaladas por outras sequências de DNA). Os indels
multialélicos são subdivididos em microssatélites e minissatélites”.
Técnicas de Biologia Molecular aplicadas à terapia e ao tratamento de doenças
Fonte: livro-texto.
Microssatélites:
 Os microssatélites são segmentos de DNA de 1 a 10 nucleotídeos repetidos no genoma.
A maior parte dos microssatélites são formados por unidades repetidas de
2, 3 ou 4 nucleotídeos.
Técnicas de Biologia Molecular aplicadas à terapia e ao tratamento de doenças
Fonte: Adaptado de: livro-texto.
Short Tandem Repeat
A. ACAGAGATAGACACACACACACACACACACACACACACAAACAAGCATGCTC
B. ATCAATGGATGCATACGT(AGAT)15GAGAGGGGATTTATTAGAGGAATTAGC
Figura 101 – Microssatélites. O D6S282 é uma repetição (CA)n no cromossomo 6 (A).
D12S391 e uma repetição de quatro nucleotídeos no cromossomo 12 (B).
Técnicas de Biologia Molecular aplicadas à terapia e ao tratamento de doenças
Aplicação na 
paternidade!
Fonte: Adaptado de: livro-texto.
Pai Mãe Criança
T
a
m
a
n
h
o
 d
o
 f
ra
g
m
e
n
to
Figura 102 – Esquema de marcador hipotético de microssatélite. O esquema representa as bandas
de um gel de agarose após a amplificação por PCR. As bandas superiores representam os fragmentos
maiores e as inferiores, menores. Cada indivíduo possui dois alelos com diferentes repetições
(diferentes tamanhos) para esse microssatélite. Dessa forma, é possível observar o parentesco
da criança com os pais, pois ela possui um alelo herdado de cada um dos pais.
Minissatélites:
 Os minissatélites são segmentos de DNA de 10 a 100 nucleotídeos repetidos centenas ou 
milhares de vezes no genoma. Os minissatélites também podem ser chamados de número 
variável de repetições em tandem (VNTRs, do inglês variable number of tandem repeats). Os 
loci de VNTRs apresentam grande número de diferentes alelos; isso se deve à alta taxa de 
mutações que leva às variações no tamanho;
 Atualmente, 13 loci de minissatélites são utilizados pelo 
Federal Bureau of Investigation (FBI), nos Estados Unidos, 
para a identificação de indivíduos pela impressão digital 
de DNA (DNA fingerprinting).
Técnicas de Biologia Molecular aplicadas à terapia e ao tratamento de doenças
Fonte: livro-texto.
Variable Number Tandem Repeat
Técnicas de Biologia Molecular aplicadas à terapia e ao tratamento de doenças
Tipos de variantes
Fonte: Adaptado de: livro-texto.
Mutação Definição Exemplo (Gene) Doença/condição
Mutação pontual Alteração de um par de base A > G, A > T
Missense
(não sinônima)
Alteração de um nucleotídeo
que resulta em um códon
que codifica um 
aminoácido diferente
A82P
(HSD3B2)
Deficiência 3βHSD
Nonsense
Substituição de um nucleotídeo
que resulta em um códon
de terminação prematuro
G23X (HBB) Talassemia beta
Sinônima
Alteração de um nucleotídeo
que resulta em um aminoácido
com propriedades similares
ao substituído
V1531 (GJB2) Perda auditiva
Alteração de
matriz de leitura
Deleção, inserção ou duplicação
de um nucleotídeo não divisível
por 3 alterando a matriz de leitura
920dupTCAG (LDLR)
Hipercolesterolemia
familiar
CNVs
Variações no número de cópias de
maiores fragmentos do genoma
(CGG) n > 200 
(FMR1)
Síndrome do
X Frágil
 Transposons: elementos transponíveis presentes no genoma que têm a capacidade de 
mudar de posição ao longo do cromossomo. Os transposons podem inserir as cópias de si 
mesmos em outra região do genoma ou se deslocarem no genoma inserindo-se em outra 
posição. Muitos transposons são compostos por genes e a grande maioria está presente 
em bactérias.
 Retrotransposons: esses elementos são identificados no genoma, pois são ladeados por 
sequências terminais repetidas (LTRs, do inglês long-terminal repeat), semelhante às 
encontradas nos retrovírus. Eles se mobilizam por retrotransposição, ou seja, são capazes 
de codificar uma transcriptase reversa que permite a replicação desses elementos.
Elementos móveis – Variantes
Fonte: livro-texto.
 Lines (do inglês long intersperced elements): os lines também se movem por 
retrotransposição, mas não possuem LTRs e não codificam a transcriptase reversa, mas sim 
as enzimas de alta homologia que têm a mesma função. No homem e no camundongo, o 
elemento line mais comum é o L1. No genoma humano temos 850 mil cópias de L1 e 
acredita-se que ele seja responsável por mutações que causaram as doenças genéticas. 
 Sines (do inglês short intersperced elements): os sines são 
semelhantes aos lines, mas são sequências menores. Um 
exemplo são as sequências Alu, que estão presentes de 500 
mil a 1 milhão de cópias no genoma humano. Há casos de 
doenças hereditárias que ocorreram devido à inserção dessas 
sequências em genes funcionais. Parece que a multiplicação 
dos sines foi recente. Juntos, lines e sines, representam 40% 
do genoma humano.
Elementos móveis – Variantes
Fonte: livro-texto.
Qual é a importância de se reconhecer as possíveis variantes no genoma humano, 
principalmente, quando trabalhamos com o diagnóstico de doenças genéticas?
Interatividade
 Reconhecer as variantes e saber qual tipo de mutação nos interessa estudar é a chave para 
a escolha da melhor metodologia diagnóstica.
Resposta
Modelos:
1. Anemia falciforme;
2. Acondroplasia;
3. Síndrome de Down;
4. Síndrome de Prader-Willi;
5. Outras…
As variantes e as doenças genéticas: técnicas diagnósticas
Técnicas 
diagnósticas
MLPA
MMS
NGS
Array
KT
FISH
Sanger
Fonte: autoria própria.
Estudo molecular!
Qual metodologia e 
equipamento escolher?
Escolha do método diagnóstico – Biologia Molecular
Variante
de ponto 
específica 
e conhecida
Grupo de 
possíveis 
variantes
de ponto
CNVs 
com HD
CNVs 
sem HD
Fonte: autoria própria.
A escolha do método depende da finalidade do estudo!
 Sangue periférico.
 Mucosa oral.
 Corte histológico.
 Fragmento tecidual fresco e conservado em formol.
 Material de aborto.
 Líquido amniótico.
 Cultura celular.
 Papel-filtro.
Tipos de materiais
Técnicas diagnósticas – Biologia Molecular
Cariotipagem
FISH
Análise citogenética 
(Célula – Cromossômica)
Fonte: autoria própria.
1 2 3 4
6
5 mar
7 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18
19 20 21 22 X Y
47,XY,+mar
Estudo cromossômico de uma espécie:
 Homens: 46,XY;
 Mulheres: 46,XX.
 Sangue periférico.
 Medula óssea (diagnóstico de câncer hematológico).
 Biópsia cutânea.
 Amniócitos, biópsia de vilosidade coriônica, sangue de cordão, 
material de aborto (pré-natal).
 Biópsia de tumores sólidos.
Cariotipagem
 Coleta: material biológico.
 Cultivo celular: meio apropriado, fatores de promoção da 
proliferação celular.
 Preparação cromossômica: colchicinização, hipotonização
e fixação.
 Confecção das lâminas.
 Microscopia.
Cariotipagem
1 2 3 4
6
5 mar
7 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18
19 20 21 22 X Y
47,XY,+mar
Fonte: autoria própria.
Cariotipagem: técnica
Fontes: autoria própria.
Coleta da amostra Semeadura Cultivo Preparação cromossômica
Lâminas
Análise
Laudo
Exemplo: líquido amniótico
1 2 3 4
6
5 mar
7 8 9 10 1112
13 14 15 16 17 18
19 20 21 22 X Y
47,XY,+mar
Fonte: autoria própria.
Cariotipagem:
1. Cultivo de células;
2. Baixo custo;
3. Análise: profissionais qualificados;
4. Tempo para a liberação.
Pontos relevantes
Pontos de atenção para o teste
de cariotipagem:
Processo de cultura de células – depende de 
diversos fatores para o sucesso:
 Crescimento celular;
 Contaminações;
 Células em metáfase para a análise
do cariótipo;
 Bandamento cromossômico;
 Limitação técnica – resolução 5 Mb.
Hibridação in situ por fluorescência – FISH
1. Preparação da lâmina.
2. Desnaturação do DNA e da sonda.
3. Hibridação da sonda.
4. Lavagem da lâmina.
5. Contracoloração da lâmina.
6. Visualização no microscópio de Epi-fluorescência.
Passos importantes!
 Detecta as alterações gênicas a nível cromossômico.
 Grande número de sondas para diversas regiões no mercado comercial, sendo específicas.
 Rapidez e confiabilidade do resultado.
 Conforto na análise.
Vantagens da FISH
 Custo.
 Sondas.
 Microscopia de fluorescência.
 Estrutura física própria para a análise e a realização da técnica – sala escura.
 Necessidade de sistema de fotodocumentação.
 Durabilidade.
 Sondas com tempo de vida útil curto.
Desvantagens da FISH
Um paciente procurou o serviço de diagnóstico genético e teve como resultado um exame de 
cariotipagem normal. Vamos refletir! Um resultado normal para o teste de cariotipagem exclui, 
definitivamente, que o paciente tenha uma doença genética?
Interatividade
 Não! O teste de cariótipo tem as suas limitações, conforme explicado em aula. As variantes 
que podem causar uma doença nos nossos pacientes têm tamanhos e conformações 
diferentes, sendo necessária – de acordo com o fenótipo do paciente – a realização de novos 
testes para complementar o estudo.
Resposta
 Arrays.
 PCRs.
 Sequenciamentos.
 Extração do material genético.
Técnicas moleculares
Técnicas moleculares – Sequenciamentos
Sanger NGS
Tipo Clones, PCR DNA bibliotecas
Passos
Procedimentos
mais simples
Procedimentos
complexos
Dados Uma read por amostra
Milhões de reads e 
muitas amostras
Fonte: Illumina, Co.
Fonte: Thermo Fischer, Co.
 Utiliza os didesoxirribonucleosídeos (ddNTPs) – sem o grupo 3 hidroxila e com a adição de 
um marcador fluorescente. 
 Para a reação ocorrer, utiliza-se: DNA polimerase; primers; ddNTPs ; dNTPs.
Sequenciamento capilar – Sanger
Quando a DNA polimerase adiciona o ddNTP, a 
polimerização do DNA é interrompida, gerando 
diversos fragmentos de diferentes tamanhos. 
Os fragmentos são aplicados em um capilar fino 
e longo, e são separados por eletroforese. 
Leitura da fluorescência e 
transmite a informação para 
um programa no computador 
que monta a sequência.
Capilar
CâmaraLaser
DNA
Primer
Polimerização
ddNTPs
ddTTP
ddCTP
ddATP
ddGTP
3’5’
5’3’
3’5’
3’5’
3’5’
3’5’
3’5’
3’5’
5’
5’
3’
3’
Cromatógrafo
Fonte: Adaptado de: livro-texto.
EXOMA
1-3% do genoma
30-50 milhões bp
85% de todas as 
mutações
GENOMA
3 bilhões bp
GENES
~21.000 genes
NGS – Exemplo: EXOMA
Bioinformática:
Desafios da técnica de NGS
Fonte: 
http://docenti.ing.unipi.it/a.bechini/bioinfo/
BioInfo_en.html
Quando devemos lançar mão de protocolos de NGS em detrimento aos protocolos de 
sequenciamento capilar Sanger?
Interatividade
 O NGS permite o estudo de múltiplos genes e regiões genômicas ao mesmo tempo, tanto 
que esta tecnologia é reconhecida como o sequenciamento massivo em paralelo. Desta 
forma, quando precisamos estudar vários(as) genes/regiões genômicas, o NGS é mais 
recomendado que o sequenciamento capilar Sanger.
Resposta
Arrays
✓ ≠s aplicações
✓ ≠s resoluções Plataforma AGILENT
Plataforma THERMO-AFFYMETRIX
Plataforma ILLUMINA
 Comparação do DNA genômico total, por 
exemplo, de uma célula tumoral, com o 
DNA genômico de uma célula normal. 
 Cada DNA é marcado com fluoróforos 
diferentes que marcam todo o genoma. 
 Utilizamos um suporte sólido (lâmina com 
microarranjo), contendo as sequências de 
DNA de interesse no estudo.
Esquema de CGH-array
 As duas amostras são, simultaneamente, 
hibridizadas no microarranjo.
Fonte: livro-texto.
 Excesso de fluorescência do paciente – ganho de segmento genômico do paciente.
 Excesso de fluorescência do controle – perda de segmento genômico do paciente.
 Cor equilibrada – paciente não perdeu nem ganhou o segmento genômico.
Microarranjos com os
fragmentos de DNA
Super-representação
Sem alteração
Sub-representação
DNA
investigado
DNA
controle Fonte: Adaptado de: livro-texto.
 Bead-array.
Exemplo de análise
Fonte: autoria própria.
Fonte: autoria própria.
Resultados:
 Database of Genomic Variants (DGV);
 Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans Using Ensembl
Resources (DECIPHER);
 UCSC Genome Bioinformatics;
 Outros bancos…
Classificação de CNVs:
Análise
Fonte: ACMG – American College of Medical Genetics and Genomics.
DNA fingerprint
Fonte: Adaptado de: livro-texto.
Marcador Cromossomo Codis (EUA) SGM + (Europa) PowerPlexTM
D2S1338 2 + +
TPOX 2 + +
D3S1358 3 + + +
FGA 4 + + +
CSF1PO 5 + +
D5S818 5 + +
D7S820 7 + +
D8S1179 8 + + +
THO1 11 + + +
VWA 12 + + +
D13S317 13 + +
Penta E 15 +
D16S539 16 + + +
D18S51 18 + + +
D19S433 19 + +
D21S11 21 + + +*
Amelogenina X, Y + + +
+ Microssatélites utilizados em cada painel. *Também utiliza o Penta D.
Tabela 5 – Painel de microssatélites marcadores utilizados na impressão digital de DNA
Paternidade
Fonte: Adaptado de: livro-texto.
Pais
M C 1 2 3
 A resposta aloimune entre os indivíduos geneticamente diferentes ocorre via complexo 
principal de histocompatibilidade (MHC, do inglês major histocompatibility complex), também 
conhecido como antígenos leucocitário humano (HLA, do inglês human leukocyte antigen); 
essa resposta é a principal barreira nos transplantes de órgãos sólidos, tecidos
e medula óssea. 
 O MHC é subdividido em MHC de classe I (MHC-I) e classe II (MHC-II),
ambos são capazes de apresentar diversos peptídeos. Isso é devido
aos variados genes HLA que codificam os MHCs. A expressão
codominante dos genes HLA regulam a resposta imunológica adquirida
conhecida como HLA-classe I e HLA-classe II. Os genes HLA
localizam-se no cromossomo 6p21.3 e são
codificados por 12 loci MHC-I (HLA-A, -B
e -C) e 9 de MHC-II (HLA-DPA1, -DPB1,
-DQA1, -DQB1, -DRB1, -DRB3,
-DRB4, -DRB5).
Avaliação da combinação de tecidos para os transplantes 
HLA-A
HLA-C
HLA-B
HLA-DR
HLA-DQ
HLA-DP
21.32p
21.31p
p
21.2p
Centrômero
q
Fonte: Adaptado de: livro-texto.
Nomenclatura HLA
Fonte: livro-texto.
Investigação HLA – Sequenciamentos
Fonte: Adaptado de: livro-texto.
 A palavra “transfecção” é utilizada 
para representar a inserção de um 
plasmídeo dentro da célula; já a 
palavra “transdução” é referente à 
entrada de um vetor viral 
na célula. 
 Diversas doenças como linfomas, 
leucemias e algumas doenças 
genéticas já estão sendo tratadas 
por terapia gênica. Normalmente, 
o material genético é carreado por 
vetores que podem ser derivados 
de plasmídeos e, portanto, 
denominados não virais ou por 
vírus como Rv, Adv, AAV, Lv, 
entre outros, sendo denominados 
de vetores virais.
Terapia gênica
Tratamento com as células CAR T
Célula T
Inserção gênica
do CAR Célula T
Coleta do sangue
do paciente para
obter as células T
Produção das células
CAR T em laboratório
Receptor de antígeno
quimérico
Célula T CAR
Crescimento das células
CAR T em laboratório
Células CAR T ligam-se às
células do câncer e as destroem
Antígenos
Célula T CAR
Célula cancerosa
Célula cancerosa Infusão das células
CAR T no paciente
Células CAR T: mecanismo da ação
Célula T Célula do tumor
CAR possibilita as células T de
reconhecerem o antígeno tumoral
Expressão do
CAR
Inserção
DNA viral
Morte das células do tumor
As células CAR T se multiplicam
e liberam as citocinasA
B
C
Fonte: Adaptado de: livro-texto.
Fonte: Adaptado de: livro-texto.
 Laboratório de Biologia Molecular.
 RDC 50/2002.
 Recepção/Administrativo.
 Separação de amostras.
 Pré-PCR.
 Pós-PCR.
 POPs.
 Biossegurança.
 Equipamentos.
 Validações.
 Manutenções.
 Pós-analítico – Laudo.
Laboratórios de Biologia Molecular
Vamos para o chat?
Chat
ATÉ A PRÓXIMA!