I007 Slides de Aula - Unidade II UNIP BIOL MOLEC

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Prof. Dr. Alexandre Dias
UNIDADE II
Biologia Molecular
Aplicada à Biomedicina
 Século XXI – grande avanço nos métodos para analisar as células, as proteínas, o DNA e 
o RNA.
 Informações importantes que viabilizaram o estudo celular e as suas macromoléculas.
 Na aula de hoje, estudaremos os métodos tradicionais da Biologia Molecular utilizados para 
estudar o DNA, RNA e proteínas.
Etapas:
 Obtenção do material a ser estudado;
 Escolha da metodologia a ser aplicada;
 Realização dos testes moleculares;
 Elaboração do laudo.
Técnicas de Biologia Molecular aplicadas à terapia e ao tratamento de doenças
Métodos artesanais:
 Extração salina;
 Extração com fenol-clorofórmio;
 Extração coluna – kit.
Métodos automatizados:
 Robôs de extração de DNA e RNA.
Extração de ácidos nucleicos
1. Material 
biológico
2. Digestão
enzimática
3. Extração
do DNA
4. Análise da 
quantidade e 
qualidade
da amostra
Fontes: autoria própria.
Fonte: 
https://www.promega.
com.br/products/lab-
automation/automated
-dna-rna-extraction-
purification-maxwell/
Fonte: https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-
translational-research/dna-rna-purification/instruments-
equipment/qiasymphony-spas-instruments/
Estudo molecular!
Qual metodologia e 
equipamento escolher?
Escolha do método de estudo – Biologia Molecular
Variante
de ponto 
específica 
e conhecida
Grupo de 
possíveis 
variantes
de ponto
CNVs 
com HD
CNVs 
sem HD
A escolha do método depende da finalidade do estudo!
Fonte: autoria própria.
 Técnica de Biologia Molecular – Kary Banks Mullis. 
 Síntese enzimática de cópias de ácidos nucleicos – amplificação do material genético.
 Permite que determinada região do genoma de qualquer organismo possa ser amplificada e 
multiplicada em milhões de cópias.
 Método in vitro de replicação do DNA.
Aplicações:
 Obtenção do material a ser estudado;
 Escolha da metodologia a ser aplicada;
 Realização dos testes moleculares;
 Elaboração do laudo.
A Biologia Molecular e a técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction)
 PCR.
 Reação em cadeia de polimerase.
 Amplificação de material genético a partir de primers específicos. 
 Reação qualitativa.
 Replicação do DNA por pareamento de bases complementares, usando um molde e as 
variações de temperatura.
Aplicações da Biologia Molecular à Biomedicina
 PCR – Para que seja possível o processo de amplificação de um segmento de DNA 
específico, é necessário que as extremidades da sequência de pares de bases
sejam conhecidas.
 Primers – Os iniciadores ou primers que delimitam e são complementares à região alvo de 
amplificação apresentam cerca de 15 a 25 nucleotídeos de extensão. Os primers são projetados de 
modo que um é complementar ao filamento de uma molécula de DNA em um lado da sequência alvo 
e o outro é complementar ao outro filamento da molécula de DNA no lado oposto da sequência alvo.
 Amplificação de material genético a partir de primers específicos.
 Reação qualitativa.
 Replicação do DNA por pareamento de bases complementares, 
usando um molde e as variações de temperatura.
“Ingredientes”:
 Termociclador;
 Material genético inicial;
 Enzima – Taq DNA polimerase;
 Primers;
 Nucleotídeos (dNTPs).
Compreendendo a PCR
A PCR
Termociclador!
Fontes: autoria própria.
Etapas:
 Desnaturação – Elevação da temperatura a 95 ºC – quebra das ligações de hidrogênio;
 Anelamento – Aproximadamente 60 ºC (depende de C-G) – ligação dos primores;
 Extensão – Aproximadamente 72 ºC – Taq DNA Pol – adição dos nucleotídeos.
A PCR
Fonte: Alberts et al. (2017).
Separar as fitas de DNA e
adicionar os iniciadores
Síntese de
DNA
Separar as fitas de DNA e
anelas indicadoras
Síntese
de DNA
Separar as fitas de DNA e
anelas indicadoras
Síntese
de DNA
Oligonucleotídeos
iniciadores de DNA
Região do DNA
cromossomal de fita
dupla a ser amplificado
etc.
PRIMEIRO CICLO
produzindo duas moléculas de fita dupla
SEGUNDO CICLO
produzindo quatro moléculas 
de DNA
TERCEIRO CICLO
produzindo oito moléculas
de DNA
A PCR
Fontes: 
https://www.genome.
gov/genetics-
glossary/Polymerase-
Chain-Reaction
Fonte: autoria própria.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
2000bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
100bp
Qual é a finalidade de se utilizar os primers no processo de replicação in vitro pela PCR?
Interatividade
 Os primers são os iniciadores e sinalizadores do processo de reação em cadeia da 
polimerase. Eles delimitam a região alvo a ser amplificada, permitindo que a cada ciclo de 
temperatura fragmentos de DNA sejam fabricados de maneira exponencial.
Resposta
 É uma técnica de separação de partículas de acordo com a sua carga elétrica e o seu
peso molecular.
 Permite a separação de frações de moléculas
orgânicas, como: RNA, DNA, proteínas e enzimas,
pela migração destas em um gel durante
a aplicação de um potencial elétrico.
Enxergando o produto da PCR – Eletroforese
Fonte: livro-texto.
 Migração em um gel pela carga elétrica do material e peso molecular.
 Carga negativa do DNA – o produto da PCR migra pela aplicação de uma carga elétrica. Ao 
final do processo, as cadeias de DNA terão migrado do polo negativo para o polo positivo.
 Conforme o tamanho do fragmento amplificado, as partículas de menor peso molecular terão 
mais facilidade de migrar pelo gel do que as de maior peso molecular, e percorrerão uma 
distância maior ficando mais próximas do polo positivo.
Enxergando o produto da PCR – Eletroforese
 Rotineiramente: separação de ácidos nucleicos.
 Polímero extraído de algas marinhas. Forma uma rede que “segura” as moléculas durante a 
migração. Dependendo da concentração de agarose, tem-se uma diferença no gradiente de 
separação. Quanto maior a concentração, maior a capacidade de distinguir os fragmentos, 
ou seja, maior a definição.
 Os géis de agarose são, geralmente, corados com as soluções 
de brometo de etídio (EtBr), uma substância intercalante que 
revela os ácidos nucleicos ao fluorescer sob a 
luz ultravioleta.
 Baixa resolução – podem separar os fragmentos de DNA
de 200 a 50.000 bp.
Gel de agarose
Gel de agarose
Fontes: autoria própria.
 Mistura de dois polímeros: acrilamida e bisacrilamida.
 A acrilamida é uma molécula linear, enquanto que a bisacrilamida é em forma de “T”. 
 Misturando essas duas moléculas, tem-se a formação de uma “rede”. Para preparar um gel 
de poliacrilamida, deve-se misturar as duas substâncias formadoras nas concentrações 
desejadas, colocá-las em um suporte de vidro, e adicionar Temed e S208, que atuam como 
catalizadores da polimerização.
 A identificação dos produtos pode ser feita pelo brometo de 
etídio, mas o nitrato de prata é o mais utilizado.
Gel de poliacrilamida
 Como o oxigênio inibe a polimerização precisam ser montados entre as placas de vidro. 
 Alta resolução – separa os fragmentos de menos de 500 bp. Pode separar os fragmentos 
com o tamanho de, apenas, uma base de diferença.
Gel de poliacrilamida
 Enzimas que cortam a molécula de DNA em locais específicos, identificados por uma 
sequência de nucleotídeos que é reconhecida pela enzima.
O uso das enzimas de restrição para o estudo de variantes genéticas
Fonte: livro-texto.
 Bacteriófagos – partículas virais que invadem e destroem as bactérias.
 Década de 1940 – experimentos mostraram como funcionavam os genes de vários 
destes vírus. 
 Uma geração depois: experimentos com fagos levaram a uma descoberta fundamental –
as enzimas de restrição – “Tesouras” moleculares, que a bactéria emprega para se defender 
dos bacteriófagos.
 Ferramenta para estudar e manipular o DNA, e, 
consequentemente, para o desenvolvimento da 
Engenharia Genética.
O uso das enzimas de restrição para o estudo de variantes genéticas
Aplicação da RFLP
Fonte: livro-texto.
Com a descoberta das enzimas de restrição, o estudo de variantes de ponto puderam ser 
realizadosde maneira assertiva e de baixo custo. No caso de pacientes terem uma mutação no 
sítio de restrição, a enzima de restrição funcionaria de maneira correta?
Interatividade
 No caso do paciente apresentar uma variante de ponto, em heterozigose, a enzima 
funcionaria, apenas, em um dos alelos. No caso do paciente apresentar uma variante de 
ponto em homozigose, a enzima não funcionaria em nenhum dos alelos do
produto amplificado.
Resposta
qPCR: 
 Reação em cadeia de polimerase em tempo real;
 Real-time polymerase chain reaction, técnica descrita em 1993, por Kary Mullis;
 Técnica altamente sensível e rápida.
Teste quantitativo:
 Detecção de fluorescência que permite uma quantificação real a cada ciclo;
 A emissão de fluorescência ocorre quando a sonda vai sendo degradada e
libera fluorocromo.
PCR em tempo real
 Princípio básico do Real-Time PCR.
 qPCR – Detecção de carga viral.
PCR em tempo real
Fonte: autoria própria.
Fonte: 
https://assets.publishing.service.gov.u
k/government/uploads/system/uploads
/attachment_data/file/926410/Understa
nding_Cycle_Threshold__Ct__in_SAR
S-CoV-2_RT-PCR_.pdf
O aumento no sinal 
de fluorescência é, 
diretamente, 
proporcional ao 
número de 
amplicons gerados.
RT-PCR amplification cycles
Linear
phase
Exponential
phase
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 
Cycle Number
R
e
la
ti
v
e
 F
lu
o
re
s
c
e
n
t Plateau phase
Threshold line
Cycle Threshold (25.6)
Leitura e detecção da fluorescência na PCR em tempo real
Fonte: Bio-Rad.
qPCR
Fonte: Nzytech (2021).
Sistemas: SYBR Green e TaqMan
Fonte: https://www.integra-biosciences.com/
SYBR Green X TaqMan
Denaturation
Primer
Annealing
Primer
Extension
SYBR Green I
Annealing
Primer
Extension
Primer
Cleavage
Signal detection
Probe
 SYBR Green: marcador intercalante de DNA, ele se liga na dupla fita da molécula de DNA e 
emite um sinal fluorescente. A intensidade do sinal aumenta proporcionalmente ao número 
de ciclos da reação, devido ao acúmulo do produto da PCR. Para a reação ocorrer, são 
necessários primers específicos, o reagente SYBR Green que, normalmente, é vendido na 
forma de master mix (mistura de SYBR Green e dNTPs) e um equipamento capaz de realizar 
a leitura da fluorescência.
 Sondas TaqMan: sondas específicas de oligonucleotídeos 
que carregam um fluoróforo, também chamado de repórter, no 
terminal 5’, e um quencher (absorve a fluorescência emitida 
pelo fluoróforo) no 3’. Durante a fase de anelamento/extensão, 
a sonda é clivada pela Taq polimerase, separando o fluoróforo 
do quencher. A fluorescência que passa a ser detectada é 
proporcional à quantidade de produto da PCR.
 O DNA, uma vez desnaturado, é capaz de restaurar os pares de bases entre as
fitas, reanelando-se.
 Dessa forma, quando misturados com os segmentos de DNA desnaturados, homólogos ou 
com origens diferentes e sob as condições apropriadas de temperatura e força iônica, 
formam as moléculas híbridas. Esse processo de pareamento entre os polinucleotídeos 
complementares de fita simples é conhecido como hibridação.
 A hibridação de DNA pode ser utilizada para a identificação de 
moléculas de DNA específicas. Nesse caso, um fragmento 
purificado ou uma molécula de DNA sintetizada quimicamente 
com a sequência definida, chamado de sonda, é utilizado para 
procurar as moléculas que contenham uma sequência 
complementar a ela em misturas de ácidos nucleicos. Para 
facilitar a sua localização, uma vez que ela tenha encontrado a 
sua sequência alvo, a sonda de DNA deve ser marcada com 
fluorescência, material radioativo (p-32).
Os métodos de hibridação
Exemplo:
Tecnologia da hibridação
Fonte: livro-texto.
Figura 90 – Uma molécula de DNA pode sofrer a desnaturação ou renaturação (hibridização). Para que duas
moléculas fita simples hibridizem, elas devem ter sequências nucleotídicas complementares que permitam o
pareamento das bases. Nesse exemplo, as fitas em vermelho e laranja são complementares entre elas, e as fitas
em azul e verde são complementares entre elas. Embora a desnaturação por calor seja mostrada, o DNA também
pode ser renaturado, após a desnaturação por tratamento alcalino.
 Fragmentos de DNA, RNA e proteínas ==> separados por eletroforese ==> identificação com 
as sondas de hibridização. 
 Muito utilizados para definir e identificar a alteração no padrão de arraste do gel.
SB:
1. DNA clivado e separado por eletroforese em gel;
2. Fragmentos de DNA de dupla fita são desnaturados sob a ação de uma solução alcalina; 
3. Transferência dos fragmentos para uma membrana positivamente carregada; 
4. DNA adere a essa membrana em posições equivalentes às que eles assumiram no gel 
após a eletroforese – impressão ou “carimbo” (blot) do gel; 
5. Esta membrana – sob as condições de concentração salina e 
temperatura próximas às condições de desnaturação e 
renaturação – é incubada com a sonda de DNA contendo 
uma sequência complementar a uma sequência interna ao 
gene de interesse; 
6. Revelação da membrana.
Métodos de Southern, Northern e Western Blot
SB para a Síndrome do X Frágil
Fonte: YIM, S. Y. et al. Fragile X 
Syndrome in Korea: A Case 
Series and a Review of the 
Literature. J Korean Med. Sci.,
2008; 23: 470-476.
mRNA específico em uma população de RNAs:
 Moléculas de mRNA devem ser purificadas a partir de amostras de células ou tecidos;
 Não há a necessidade de digestão com enzimas uma vez que os mRNAs são relativamente 
curtos (geralmente, menores do que 5 kb).
NB:
1. Após a extração – eletroforese em gel;
2. RNA presentes no gel de acrilamida são transferidas 
para uma membrana de nitrocelulose ou de náilon;
3. Sondas de DNA;
4. Os híbridos são formados pelo pareamento de bases 
entre as fitas complementares de RNA e DNA.
NB
 As proteínas são, obviamente, bastante diferentes do DNA e do RNA; dessa forma, para 
identificá-las quando separadas por eletroforese é necessário o uso de anticorpos. 
WB:
1. Proteínas – separadas por eletroforese – transferidas e 
ligadas a uma membrana; 
2. A membrana é, então, incubada com uma solução que 
contém um anticorpo produzido contra determinada 
proteína de interesse; 
3. Por fim, uma enzima cromogênica artificialmente ligada ao 
anticorpo (ou a um anticorpo secundário que se liga ao 
primeiro anticorpo) é utilizada para visualizar o anticorpo 
ligado à membrana.
WB
 Os experimentos de Southern, Northern e Immunoblotting têm em comum a utilização de 
reagentes seletivos para a visualização de moléculas particulares em misturas complexas.
Concluindo…
Fonte: livro-texto.
Membrana de transferência
A técnica de qPCR foi muito divulgada na mídia durante a pandemia da Covid-19, sendo o 
teste padrão-ouro para o diagnóstico de pacientes infectados pelo SARS-CoV-2. Neste teste 
pode-se utilizar a combinação do estudo de mais de um gene, multiplexando os genes humano 
e viral. Qual é a finalidade de se utilizar a marcação para o gene humano no teste para 
a Covid-19?
Interatividade
 No formato do teste de qPCR para a Covid-19, a investigação da expressão de gene humano 
funciona como um marcador de controle da coleta e da reação, diferenciando os pacientes 
verdadeiramente negativos e os pacientes com o erro de coleta com o resultado negativo.
Resposta
Doenças infectoparasitárias:
Aplicações das técnicas de Biologia Molecular ao diagnóstico
Fonte: Adaptado de: livro-texto.
Quadro 7 – Principais microrganismos identificados por métodos
moleculares em uso no diagnóstico de doenças infecciosas
Áreas Microrganismos
Virologia
Vírus da herpes simples, citomegalovírus (CMV), vírus Epstein-Barr (EBV),
vírus da varicela-zóster, herpes-vírus humano tipos 6, 7, 8
Vírus respiratórios (vírus influenza, vírus parainfluenza, adenovírus, rinovírus)
SARS-CoV, vírus da influenza aviária
Vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite B (HBV),vírus da hepatite C (HCV), vírus do papiloma humano (HPV),
rotavírus, norovírus, adenovírus entérico
Bacteriologia
C. trachomatis, N. gonorrhoeae, B. pertussis, M. tuberculosis, Nontuberculous
mycobacteria, T. whipplei, B. henselae, Genital mycoplasma, C. burnetii, M. 
pneumoniae, C. pneumoniae, Legionella spp., N. meningitidis, S. pneumoniae
Micologia Pneumocystis jirovecii, Candida spp., Aspergillus spp.
Doenças infectoparasitárias:
Aplicações das técnicas de Biologia Molecular ao diagnóstico
Fonte: Adaptado de: livro-texto.
Plasma
Extração
de RNA
Remoção das células
por centrifugação
RNA
Partícula de HIV rara no
plasma da pessoa infectada
Amostra de
sangue da
pessoa infectada
Transcrição
reversa e
amplificação
por PCR do
cDNA de HIV
Eletroforese
em gel
Controle, utilizando o
sangue de uma pessoa
não infectada
Doenças infectoparasitárias:
Aplicações das técnicas de Biologia Molecular ao diagnóstico
Fonte: Adaptado de: livro-texto.
Quadro 8 – Características dos principais vírus
causadores de infecção respiratória aguda
Vírus Família Material genético
Tempo de
incubação
Período de
infecção
Principais genes-alvo
Influenza Orthomyxoviridae RNA simples fita 1 a 4 dias 7 dias M, HA e NS-1
Parainfluenza (PIV) Paramyxoviridae RNA simples fita 1 a 7 dias 1 a 3 semanas HA-NA, P, L, pol e M
RSV3 Paramyxoviridae RNA simples fita 2 a 8 dias
3 a 8 dias até
3 a 4 semanas
(em crianças)
N, F, L e pol1b
Adenovírus Adenoviridae DNA dupla fita 2 a 14 dias Dias-meses H e VA
Rinovírus Picornaviridae RNA simples fita 2 a 3 dias 7 a 10 dias 5’-NCR e VP
hMPV Paramyxoviridae RNA 2 a 3 dias
Em média,
5 dias
F, L, N, M e P
SARS-CoV Coronaviridae RNA simples fita 2 a 10 dias - pol1b, pol1a, pol, S e N
Bocavírus Parvoviridae DNA simples fita - - NP1, NS-1, VP-1 e VP-2
M: proteína de matriz; HA: hemaglutinina; NS-1: proteína não estrutural; HA-NA: gene da
hemaglutinina-neuraminidase; P: gene da fosfoproteína; L: subunidade maior da polimerase;
pol: gene da polimerase; N: proteína do nucleocapsídio; F: proteína de fusão; H: proteína hexon;
VA: gene VA RNA; VP: proteína do capsídio viral; S: proteína Spike; NP-1: nucleoproteína.
 Oncologia.
 Doenças genéticas raras.
 Alimentos e ambientes.
Aplicações das técnicas de Biologia Molecular ao diagnóstico
Fonte: Adaptado de: livro-texto. Alimentos Meio 
de enriquecimento
Extração de DNA Amplificação/corrida
em gel de agarose
Figura 96 – Exemplo de fluxograma para a análise de microrganismos por PCR.
DNA
DNA polimerase
Primers
dNTPs
 Espectrometria de massa – “assinatura proteica” de cada bactéria.
 A técnica de MALDI-TOF MS (do inglês matrix-assisted laser desorption ionization-time
of flight).
 Eficiente na identificação de bactérias gram-positivas, enterobactérias, não fermentadores, 
anaeróbias, micobactérias e fungos.
 Método: análise de proteínas e comparação do perfil obtido com o perfil disponível nos 
bancos de dados.
 Dois sistemas são usados na microbiologia: MS Vitek (bioMerieux) e Microflex Biotyper (Bruker).
 Processo: ionização da amostra e mistura com uma matriz que, 
posteriormente, é exposta a pulsos de laser. As moléculas 
ionizadas são aceleradas por um campo eletrostático e seguem 
para um campo sem pulso atingindo o detector do espectrômetro 
de massa.
 As moléculas com diferentes massas e cargas “voam”; por isso, 
o termo flight, em diferentes velocidades. Os resultados obtidos 
são comparados a uma base de dados e, de acordo com o perfil, 
é possível classificar os microrganismos (MIMICA et al., 2013).
Outras técnicas importantes!
Arrays:
Outras técnicas importantes!
✓ ≠s aplicações
✓ ≠s resoluções
CGH-array
Fonte: Software – Human Genome CGH Microarray 2X 105A, Agilent.
Dup 16pDup 15p
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 x y
Vamos para o chat?
Chat
 MIMICA, M. J. et al. MALDI-TOF MS in the clinical microbiology laboratory. J Bras. Patol. 
Med. Lab., v. 49, n. 4, p. 256-259, 2013.
Referências
ATÉ A PRÓXIMA!