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EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA E SEMENTES SINTÉTICAS 
 
Guerra, M.P.; Torres, A.C.; Teixeira, J.B. 1999. Embriogênese Somática e Sementes Sintéticas. In: 
Torres, A.C.; Caldas, L.S.; Buso, J.A. (eds.). Culturas de Tecidos e Transformação Genética de 
Plantas. Brasília, Embrapa-CBAB. v.2. p. 533-568. 
 
Introdução 
 
 Embriogênese somática, adventícia ou assexual são têrmos usualmente empregados para 
designar o processo pelo qual células haplóides ou somáticas desenvolvem através de diferentes 
estádios embriogênicos dando origem a uma planta, sem que ocorra a fusão de gametas (Williams & 
Maheswaran, 1986). Este processo constitui um exemplo da expressão da totipotencialidade das 
células das plantas, postulado por Haberlandt (1902). 
 O padrão de desenvolvimento de um embrião somático em dicotiledôneas apresenta muitas 
características morfológicas semelhantes as do embrião zigótico. Inicialmente, ambos são 
caracterizados pela diferenciação de uma estrutura bipolar, constituída de ápice caulinar e radicular. 
Ambos passam pelos estádios de desenvolvimento pró-embrionários e embrionários propriamente 
ditos: globular, cordiforme, torpedo e cotiledonar, num processo ontogenético que pode ser sub-
dividido em 20 diferentes estágios que representam tres grandes eventos (Jurgens e Mayer, 1992). 
As estruturas internas do embrião somático globular e cordiforme são semelhantes aos equivalentes 
zigóticos; a protoderme é evidente, bem como a polaridade, e no estádio cordiforme, simetria 
bilateral (Smith, 1985). As principais diferenças entre os embriões somáticos e zigóticos relacionam-
se com o fato de os embriões somáticos se desenvolvem livres de correlações físicas, fisiológicas e 
genéticas que ocorrem durante o desenvolvimento de um embrião zigótico (Zimmermann, 1993) e 
poderem apresentar desenvolvimento anormal. Uma particularidade dos embriões somáticos é a 
presença de um sistema vascular fechado, sem conecção vascular com os tecidos do explante 
inicial. Esta característica aliada a sua bipolaridade torna este modelo morfogenético distinto dos 
processos de micropropagação e de organogênese. 
 A embriogênese somática in vitro foi descrita pela primeira vez, independentemente, por Steward 
et al. (1958) e Reinert (1958) em cenoura, sendo também possível induzir embriões somáticos a 
partir de células generativas (micrósporos) de Datura inoxia (Guha & Maheswari,1964) e Nicotiana 
tabacum (Nitsch & Nitsch, 1969a,b). Atualmente, a embriogênese somática foi relatada em mais de 
300 espécies (Bajaj, 1995). 
 A embriogênese somática pode ser natural e in vitro ou induzida. No primeiro caso, células dos 
tecidos embrionários podem ser direcionadas para esta rota de desenvolvimento morfogenético, 
como é o caso do sistema da embriogenia adventícia ou nucelar em Citrus sp, onde os embriões 
apomíticos originam-se por gemação a partir de células do nucelo que representam o genoma 
materno (Spiegel-Roy & Vardi, 1984). Estes embriões apomíticos são geneticamente idênticos à 
planta-mãe e a consequência deste fenômeno é a perpetuação de populações clonais através da 
semente. 
 Na embriogênese somática in vitro ou induzida, células haplóides ou diplóides (somáticas) em 
diferentes estágios de diferenciação podem, se adequadamente induzidas, por estímulos ambientais 
ou químicos, serem reprogramadas e adquirirem novas competências morfogenéticas. 
A embriogênese somática in vitro é um método importante para propagação massal clonal de 
genótipos superiores. Além disto é uma técnica de grande aplicabilidade para os estudos básicos 
relacionados com a fisiologia, genética e bioquímica do desenvolvimento embrionário (Yeung, 1995). 
Atualmente este sistema vem sendo utilizado para a obtenção de plantas transgênicas (Prakash & 
Varadarajan, 1992; Gama, 1993) e sementes sintéticas (Schultheis et al., 1990). 
Revisões recentes, abordando diferentes aspectos sobre este tema são encontradas, entre 
outros, em Zimmerman (1993), Lindsey e Topping (1993), Goldberg et al., (1994), Meinke (1995), 
Schmidt et al., (1994) e Dodeman et al., (1997). 
 
Padrões e origem dos embriões somáticos in vitro 
 Dois padrões básicos de expressão da embriogênese somática são comumente observados in 
vitro (Sharp et. al, 1980). O primeiro corresponde ao modelo direto no qual os embriões somáticos 
originam-se dos tecidos matrizes sem a formação de estágios intermediários de calos. Este padrão 
ocorre por exemplo, em células nucelares de variedades poliembriônicas de citros (Sharp et al., 
1982), em embriões imaturos de Malus pumila (James et al., 1984), de Medicago sativa e Trifolium 
repens (Maheswaran & Williams, 1984), das palmeiras Euterpe edulis (Guerra e Handro, 1988) e em 
inflorescências jovens de Euterpe edulis (Guerra & Handro, 1991). Um sistema referência para este 
modelo é mostrado na figura 1 e foi desenvolvido por Guerra e Handro (1988 e 1991). 
 O segundo padrão corresponde ao modelo indireto no qual os embriões somáticos se formam a 
partir de um tecido intermediário chamado calo, que apresenta células em diferentes estágios de 
diferenciação e, consequentemente com diferentes graus de determinação. Estas células podem 
adquirir novas competências mediadas por mensageiros químicos específicos, como será discutido 
mais adiante. Um exemplo clássico deste sistema é a indução da embriogênese somática em tecidos 
do floema secundário de cenoura Steward et al. (1958) e Reinert (1958). 
 Independentemente do padrão direto ou indireto, as células-mães embriogênicas apresentam 
um conjunto de características comuns ao comportamento de células embrionárias em divisão ativa. 
Estas características incluem o tamanho pequeno (100-200 µm), conteúdo citoplasmático denso, 
núcleos grandes com nucléolos proeminentes, vacuolos pequenos e presença de grãos de amido. As 
propriedades histoquímicas destas células sugerem intensa atividade metabólica e de síntese de 
RNA (Tisserat et al., 1979; Sharp et al., 1980; Vasil, 1982). 
 Os têrmos complexo celular pró-embrionário e massa celular suspensor-pró-embrionária devem 
ser empregados, respectivamente em angiospermas e gimnospermas, para designar grupos 
celulares embriogenéticos polimórficos, em oposição ao têrmo calo. Neste último, as células-filhas 
crescem de maneira desorganizada, a menos que elas tenham sido induzidas para padrões que 
caracterizam calos embriogênicos. Neste caso, deve-se tomar cuidados uma vez que podem ocorrer 
alterações genéticas causadas pelos substratos nas populações clonais originadas destes calos 
(Durzan, 1988). Komamine et al. (1990) empregou o têrmo ‘celula embriogenética’ para definir as 
células derivadas de tecidos somáticos, que atingiram a transição para um estágio em que não são 
mais necessários estímulos externos para produzir um embrião somático. 
 
Origem e ontogênese 
 As circunstâncias associadas à origem a partir de células simples ou múltiplas foram 
propostas por Williams e Maheshwaran (1986) com base nas idéias formuladas por Sharp et al. 
(1980), os quais procuraram distinguir entre embriogênese somática direta e indireta. Assim, 
embriogênese somática direta passou a ser considerada para aqueles explantes que sofreram 
poucas divisões celulares antes da indução embriogenética. Embriogênese somática indireta seria 
aquela na qual os explantes passaram por um período longo de proliferação desorganizada, na 
forma de calos, antes da indução embriogenética propriamente dita. Sharp e seus colaboradores 
sugeriram que a embriogênese somática direta era característica de explantes nos quais as células 
eram pré-determinadas para a rora embriogenética, como consequência da retenção de algumas 
propriedades das células mersitemáticas parentais, das quais as células do explante derivam. Isto 
poderia explicar a tendência da embriogênese somática ocorrer preferencialmente em explantes 
derivados de tecidos embrionários ou juvenis. Já, a embriogênese somática indireta é considerada 
como característica de explantesderivados de tecidos mais diferenciados, ou maduros, noa quais as 
células devem passar por vários ciclos antes de adquirir a condição embriogenética. 
 Uma vez que não se dispõe ainda de marcadores confiáveis para definir `competência 
embriogenética´ torna-se difícil conceituar pré-determinação. Além disso, as caracteristicas 
associadas à embriogênese direta ou indireta não necessariamente indicam diferenças substanciais 
nas características e atributos nas células envolvidas nesta rota morfogenética. 
 
 
Morfogênese e fitorreguladores 
 Apesar dos avanços verificados no estudo da embriogênese somática, ainda é limitada a 
compreensão dos estímulos e condições necessárias para a indução e controle deste processo. A 
possibilidade de manipulação deste sistema experimental para fins tecnológicos depende do 
domínio preciso de princípios de fisiologia do desenvolvimento. Desta maneira morfogênese pode ser 
conceituada como a integração entre os processos decorrentes da divisão e diferenciação celular. 
Por determinação celular define-se o processo pelo qual o potencial de desenvolvimento de uma 
célula torna-se limitado a uma rota específica (Christianson,1985), e por competência celular a 
capacidade das células reagirem a sinais (que podem ser reguladores de crescimento) específicos 
de desenvolvimento. Epigênese é aqui definida como a ativação seletiva e diferencial de genes 
(reprogramação celular), envolvendo células receptivas ou tecidos responsivos. Exemplos 
representativos de epigênese em plantas são a transição da fase juvenil para adulta e a camada de 
abscisão em pecíolos de folhas. Para a embriogênese somática um exemplo de células receptivas ou 
marcadas para a ativação epigenética é a camada epidérmica de explantes embrionários. Existem 
evidências que a iniciação de poliembriões nucelares em Citrus sp ocorre em resposta a um estímulo 
provocado pela alta biossíntese de fitohormônios, principalmente auxinas, que ocorre nas fases 
iniciais da embriogênse zigótica. Em geral, na maioria dos modelos de embriogênese induzida in 
vitro, as auxinas e entre elas o 2,4-D, são consideradas as substâncias responsáveis pelo 
desencadeamento dos processos de desdiferenciação (modelos indiretos) e rediferenciação 
(modelos diretos), alterando determinação e conferindo novas competências às células responsivas 
presentes nos explantes. 
 Fitohormônios são uma classe de compostos químicos endógenos, facilmente transportados 
para células responsivas, onde estão diretamente envolvidos com o contrôle da atividade gênica em 
nível de transcrição e de tradução, em um grande número de processos. Supõe-se que estas células 
responsivas são caracterizadas pela presença de receptores, que se ligam ao fitohormônio e, 
subsequentemente, iniciam a resposta na célula. Estes receptores estão localizados nas 
membranas, no citoplasma e no núcleo e são, na maioria dos casos, de origem proteica (van der 
Linde, 1990). Células responsivas seriam aquelas que possuem sensibilidade, que foi definida por 
Trewavas (1981) como sendo a competência de um tecido em responder a um sinal específico. Os 
fitohormônios exercem sua ação através do reconhecimento de receptores específicos presentes em 
células responsivas, traduzindo sinais hormonais em eventos bioquímicos e fisiológicos. Existem 
similaridades nos mecanismos gerais de transmissão de sinais entre sistemas animais e vegetais, 
contudo, os aspectos específicos revelam diferenças marcantes. Enquanto os primeiros tem uma 
rota de sinais baseada principalmente no AMP cíclico, os segundos tem esta rota baseada em 
proteinas quiinases dependentes de cálcio, que são enzimas específicas para plantas e que não são 
utilizadas por animais. Além disto já está bem estabelecido o papel do cálcio e do potássio nos 
sistemas de mensageiros secundários em plantas (Barendse & Peeters, 1995). 
 Tem sido proposto que a concentração de uma substância específica, presente em um 
compartimento celular que contém receptores para aquela substância, determina a magnitude de 
alguns processos regulatórios naquela célula. Aceita-se também que os reguladores de 
crescimento não influenciam as respostas da planta exclusivamente através de mudanças na sua 
concentração, mas que esta regulação também pode ser exercida através de mudanças na 
sensitividade das células responsivas. Desta maneira, a resposta a um determinado fitoregulador 
pode ser alterada por mudanças: a) no número e na afinidade dos receptores, e b) no nível de outras 
substâncias endógenas (Firn, 1986). Estes aspectos analisados em conjunto explicam porque 
determinados explantes são competentes para a embriogênese somática e outros não e porque 
explantes de mesma origem, coletados em diferentes períodos apresentam respostas diferentes à 
indução embriogenética. Traduzida desta maneira, a tão conhecida quanto vaga terminologia 
‘estágio fisiológico do explante’ seria aquela condição na qual as células responsivas do explante 
conteriam um grande número de receptores para aqueles reguladores de crescimento presentes no 
meio de cultura. 
 O mecanismo de ação das auxinas sobre processos fisiológicos, proposto por van der Linde 
(1990), relaciona-se com a formação de um complexo receptor proteico-hormônio no citoplasma. 
Este complexo migra até o núcleo da célula onde promove a ativação da RNA-polimerase, a qual 
aumenta a transcrição de genes envolvidos na regulação da divisão celular. O receptor é inativado 
por fosfatases no núcleo, liberando o grupo fosfato e a auxina, sendo subsequentemente, reciclado 
no citoplasma em uma conformação inativa. No citoplasma este receptor pode ser novamente 
ativado se a concentração de cálcio livre for suficientemente alta para ativar a respectiva proteina-
quinase e se houver auxinas em concentração suficientemente alta para saturar o receptor. 
 Com base nisto, uma hipótese a ser postulada é a de que padrões diretos de embriogênese 
somática seriam o resultado de uma ativação de células responsivas contendo receptores para 
determinado regulador de crescimento. Estas células seriam rediferenciadas para novas rotas 
morfogenéticas, gerando células-mães embrionárias competentes, que podem originar populações 
clonais de células embriogenéticas. Padrões indiretos de embriogênese somática seriam produto de 
uma desdiferenciação de células contendo estes receptores, gerando células calosas. Células 
responsivas destes calos podem, por processo de indução, adquirir competência embrionária, 
gerando populações clonais de células embriogenéticas. 
 De uma maneira geral, a embriogênese somática é induzida por auxinas fortes. Neste caso, uma 
célula somática adquire competência para originar uma linhagen de células-filhas que irão formar 
embriões somáticos. O têrmo célula embriogênica tem sido empregado para designar aquelas 
células que já não necessitam mais de auxinas para produzir os embriões somáticos (De Jong et al., 
1993). Células em transição entre célula somática e célula embriogênica são chamadas de células 
competentes (Toonen et al., 1994). A indução embriogenética de uma célula somática não é 
exclusivamente dependente do uso de reguladores de crescimento. Choques térmicos, variações nos 
níveis de pH e utilização de outros produtos químicos podem tambem induzir competência 
embriogenética em células somáticas (Toonen et al., 1996). 
 
Fatores que afetam a embriogênese somática 
 
Explante 
 Em geral, quase todas as partes da planta podem ser usadas na indução da embriogênese 
somática: ápices caulinares (Cantliffe et al. 1987; Chee & Cantliffe, 1988), hipocótilos (Halperin, 
1966); discos foliares (Sondahl & Sharp, 1977); segmentos foliares (Rabéchault et al., 1970; Ahée et 
al., 1981); inflorescências (Chu et al. 1984), raízes (Okamura et al. 1973), entre outros. 
 Em batata-doce cultivar "White Star", os ápices caulinares são excelentes explantes para 
indução da embriogênese somática por apresentarem alta frequência de produção de calosembriogênicos (Cantliffe et al., 1987). Uma vantagem adicional deste explante é relaciona-se com a 
possível manutenção da identidade genética do material a ser propagado. 
 Um dos tecidos com maior competência embriogênica é o tecido epidérmico de cotilédones. Na 
figura 4 são mostrados os estágios da embriogênese somática em Feijoa sellowiana, uma mirtácea 
nativa do planalto de Santa Catarina. Nesta figura pode-se observar a iniciação dos embriões 
somáticos diretamente sobre o tecido epidérmico cotiledonar. 
 
Composição do meio nutritivo 
Sais minerais 
 Meios com alta concentração salina tais como o de MS (Murashige & Skoog, 1962), o SH 
(Schenk & Hildebrandt, 1972), e o B5 (Gamborg et al., 1968) têm sido usados pelos efeitos positivos 
no crescimento e desenvolvimento de embriões somáticos. Amirato & Steward (1971) mostraram que 
estruturas pró-embriônicas têm melhor desenvolvimento nestes meios quando comparados com o 
desenvolvimento em meio de baixa concentração salina, como o de White (White, 1943). 
 A grande vantagem do meio MS é a presença do nitrogênio sob a forma de nitrato de amônio 
(Ammirato, 1983). A forma pela qual o nitrogênio é adicionado ao meio de cultura é determinante no 
sucesso da embriogênese somática. Sabe-se que a adição simultânea de compostos nitrogenados 
na forma reduzida e de nitrato têm efeito estimulatório na embriogênese somática. (Halperin & 
Wetherell, 1965; Reinert et al., 1967; Amirato, 1983; Gleddie et al., 1983). Nitrogênio na forma 
amoniacal é essencial para o desenvolvimento do pró-embrião (Halperin & Wetherell, 1965; Kato & 
Takeuchi, 1966) e na ausência de amônio nâo houve formação de embriões em cenoura. Para 
Reinert et al. (1967) a quantidade de nitrogênio no meio é mais importante do que a forma do íon, 
observando-se a formação de embriões em cultura de tecidos de cenoura tanto em presença de 
KNO3 quanto de NH4NO3 . 
 Em meio contendo nitrato a adição dos aminoácidos L-glutamina; ácido L-glutâmico e α-alanina 
favorece a produção de maior número de embriões somáticos formados e com melhor qualidade, 
quando comparado com os resultados obtidos em meio suplementado com o ion amônia (Kamada & 
Harada, 1979; Higashi et al., 1997). Para mostrar os diferentes efeitos dos aminoácidos e do íon 
amônio foi medida a atividade da sintetase da glutamina (enzima chave na assimilação do 
nitrogênio). A atividade desta emzima decresce durante os últimos estádios de desenvolvimento do 
embrião (Higashi et al., 1997). 
 O potássio é outro íon fundamental para a embriogênese somática. Maior número de embriões 
formados foi obtido pela inclusão de KH2PO4 ao meio contendo uma fonte de nitrogênio reduzido 
Reinert et al., 1967). A exigência por potássio também foi mostrada por Brown et al. (1976) em 
cultura de células de cenoura, onde o número de embriões produzidos se correlacionava com o 
aumento da concentração de potássio no meio de cultura. Para Ipomoea batatas a proliferação de 
calo embriogênico foi maior em meio suplementado com 30μM de KCl (Cantliffe, 1992). 
 O uso de quelatos de ferro pode favorecer o desenvolvimento de embriões somáticos in vitro. 
Desenvolvimento dos embriões após o estádio globular foi inibido em meio desprovido de ferro 
(Ammirato, 1983). O desenvolvimento normal de embriões androgênicos em Nicotiana tabacum 
(Nitsch, 1969b; Havranek & Vagera, 1979) só ocorreu na presença de ferro no meio de cultura 
 Com relação ao cálcio, a forma em que este elemento é adicionado ao meio influencia o 
processo da embriogênese. Tazawa & Reinert (1969) observaram que a adição de 28,4 mM de 
Ca(NO3)2 no meio de cultura inibia a embriogênese somática em cenoura. 
 Concentrações de sódio entre 46-83 mM não mostraram nenhum efeito na embriogênese 
somática de cenoura (Tazawa & Reinert,1969). Por outro lado, Wetherell & Dougall (1976) 
observaram inibição da embriogênese na presença de sais de sódio. 
 Tem sido demonstrado que com a otimização e balanceamento adequados dos meios de cultura 
feito por torna-se possível a redução na concentração dos reguladores de crescimento nestes meios 
Preece (1995). Em alguns casos a combinação precisa entre a composição do meio de cultura e o 
estágio fisiológico do explante pode até mesmo eliminar a necessidade de suplementação de 
reguladores de crescimento, como é o caso da indução de culturas poliembriogenéticas do Pinheiro 
do Paraná (Araucaria angustifolia) à partir de explante de pró-embriões zigóticos (Guerra, M.P., 
dados não publicados) cultivados em meio LP (von Arnold & Erikson, 1981). 
 Para a embriogênese somática normalmente são empregados pelo menos dois diferentes meios 
de cultura. O primeiro meio é otimizado visando a indução da embriogênese somática, enquanto que 
o segundo meio visa permitir o desenvolvimento dos embriões somáticos. As condições que 
favorecem a primeira fase geralmente, inibem a segunda. 
 
Carboidratos 
 Vários trabalhos têm observado os efeitos da concentração e tipo de carboidratos na 
embriogênese somática. Infelizmente, nestes estudos não se determinou se o efeito dos carboidratos 
ocorre na iniciação ou no desenvolvimento dos embriões. 
 A sacarose tem é a fonte de carboidrato mais usada para a embriogênese somática, embora 
outros mono e dissacarídios possam ser utilizados. A concentração de sacarose influencia nos 
processos de iniciação e diferenciação dos embriões somáticos, uma vez que o seu metabolismo em 
plantas é regulado por um grupo de genes (sacarose sintase e sacarose invertase) cujas respostas 
são moduladas de acordo com a variação da sua concentração (Koch et al., 1995). 
 Em geral a concentração de 3% de sacarose é satisfatória para os processos de iniciação e 
diferenciação. Em algumas situações, por exemplo, em Ipomoea batatas a transferência dos calos 
embriogênicos para meio desprovido de substância reguladora de crescimento, deve ser 
acompanhada da redução da concentração de sacarose para 1,6% para favorecer a produção de 
embriões e sua conversão em plantas (Cantliffe, 1992). 
 Homes (1967) observou em cenoura o aumento no número de embriões formados com o 
aumento da concentração de glucose do meio nos níveis de 0 a 10%. Essa correlação também foi 
mostrada em cultura de células de Ranunculus onde o número máximo de embriões formados foi 
em meio com até 2% de sacarose; concentração de 5% deste açucar inibia ligeiramente este 
processo (Konar & Nataraja, 1969). Masuda et al. (1981) observaram que sacarose ou maltose foram 
os carboidratos mais efetivos na indução de embriogênese somática em cenoura, quando 
comparados com glucose, manose, rafinose e glucose + frutose. 
 
Substâncias reguladoras de crescimento 
 Atenção tem sido dada ao tipo, concentração e período de tempo em que os reguladores de 
crescimento são mantidos na cultura, objetivando minimização da sua concentração e tempo de 
exposição (Ammirato, 1989). As auxinas e citocininas, estas nem sempre necessárias, têm papel 
fundamental na embriogênese somática de várias espécies de plantas. Algumas espécies 
necessitam que o meio seja suplementado com ácido giberélico ou ácido abscísico para o 
desenvolvimento de embriões somáticos, enquanto outras não necessitam desta suplementação 
uma vez que o processo de indução foi estabelecido. 
 
Auxinas 
 As auxinas estão envolvidas com a indução e a iniciação de embriões somáticos. Tem sido 
sugerido que as auxinas são necessárias para a formação de agregados embriogênicos a partir de 
células individuais expresando a totipotencia das células competentes (Komamine et al., 1992). Em 
muitas espécies, o processo de iniciação se verifica ao se cultivar o explante em meio com 
concentração relativamente elevada de 2,4-D. O desenvolvimento subsequente dos embriões 
somáticos ocorre após transferência do calo ou suspensão celular para meio com baixa 
concentração de auxinas, ou desprovido desta delas (Halperin & Wetherell, 1964; Reinolds & 
Murashige, 1979; Chée & Cantliffe, 1988). Isto ocorre porque após a iniciação,as auxinas, 
particularmente o 2,4-D, inibem o desenvolvimento subsequente dos embriões. Tem sido sugerido 
que a manutenção prolongada das culturas embriogênicas em meio com 2,4-D causa variações 
genéticas e epigenéticas que afetam o potencial embriogênico (Caligari & Shohet, 1993). Observou-
se em alguns sistemas que os embriões somáticos tornam-se habituados durante períodos 
prolongados de sub-cultivos em 2,4-D, resultando na perda do potencial de maturação (Tautorus et 
al., 1991). Em Ipomoea batatas culturas submetidas a longos peródos em 2,4-D perdem a 
capacidade dos embriões converterem em plantas. 
 O efeito das auxinas no desenvolvimento de embriões somáticos é primariamente inibitório, e se 
manifesta nos estádios subsequentes ao globular. Isto foi demonstrado pelo trabalho de Halperin e 
Wetherell (1964), em cenoura, em culturas mantidas em meio com 1 mg/l de 2,4-D. Newcomb & 
Wetherell (1970) também verificaram que, na presença de 2,4-D, os embriões somáticos se 
desenvolviam até o estádio de pró-embrião. Desenvolvimento posterior para os estádios globular, 
cordiforme, maturo e plantas adultas só ocorria em meio desprovido de 2,4-D. 
 
Citocininas 
 As citocininas podem favorecer a produção de calo embriogênico (Chée & Cantliffe, 1988), mas, 
em algumas famílias, como a Umbelliferae, elas parecem não serem necessárias (Ammirato, 1983). 
Schenck & Hildebrandt (1972), entretanto, afirmaram que baixas concentrações de citocininas são 
necessárias para a embriogênese somática na maioria das culturas de células de dicotiledôneas. Em 
suspensão celular de soja foi mostrado que a zeatina não foi efetiva, que a benziladenina foi 
adequada e que a cinetina teve ótimo efeito na formação de embriões somáticos (Phillips & Collin, 
1981). Recentemente, Gosukonda et al.(1993) observaram que o thiadizuron apresentou a melhor 
resposta para produção de embriões somáticos em batata-doce entre as várias citocininas testadas 
 
Ácido Abscísico 
 O ácido abscísico afeta o desenvolvimento de embriões somáticos. Fujimura e Komamine (1975) 
observaram que embora o número total de embriões somáticos em desenvolvimento decrescia com 
o aumento da concentração de ácido abscísico no meio, o número de embriões que permaneciam 
nos estádios globular e cordiforme não se alterava. Isto indica que todo o processo de embriogênese 
somática foi inibido e não apenas o desenvolvimento dos embriões dos estádios precoce aos 
tardios. Concentrações de ABA entre 10-4 - 10-7 podem favorecer o crescimento, desenvolvimento e 
produção de embriões somáticos normais, evitando a germinação precoce dos mesmos (Ammirato, 
1977). Quanto mais cedo se adicionar o ABA no meio de cultura, mais efetivo é o seu efeito no 
desenvolvimento normal dos embriões. A inclusão de ABA também, aumenta a frequencia de 
embriões somáticos produzidos e sua conversão em plantas (Zheng et al. 1993). 
 
Ácido Giberélico 
 Em alguns casos, o ácido giberélico tem sido usado para a conversão de embriões somáticos 
em plantas. A concentração de 1 mg/l de GA3 estimulou a formação de raízes em embriões 
somáticos de nucela de Citrus (Button e Borgnman, 1971). Também foi demonstrado o efeito 
estimulador do ácido giberélico no enraizamento de embriões somáticos (Kochba et al. 1974). O GA3 
nas concentrações entre 1 e 5 mg/l aumentava o enraizamento dos embriões; em combinação com 
sulfato de adenina (27 mg/l) e este regulador de crescimento apresentou um efeito direto na 
iniciação do desenvolvimento da raiz ou no desencadeamento do desenvolvimento inicial de raizes 
pré-formadas. 
 Efeitos negativos de ácido giberélico no desenvolvimento de embriões somáticos de cenoura foi 
observado por Fujimura e Komamine (1975), onde o aumento da concentração de GA3 de 10
-8 a 10-5 
M correspondia a um decréscimo no número total de embriões somáticos produzidos. 
 
Outras Substâncias 
 Recentemente, Desamero et al. (1993) desenvolveram um protocolo de induzir embriogênese 
somática direta em batata-doce, a partir de explantes de ápices caulinares com 1 a 3 primórdios 
foliares (0.3 a 0.5 mm de tamanho), suplementado o meio de cultura com combinações de ácido 
picolínico (2 e 3 mg/l) e cinetina (0.25 e 1 mg/l). 
 A embriogênese somática também pode ser induzida quando agua de côco, extratos de 
levedura, caseína hidrolisada são adicionadas a esta formulação básica (Kohlenbach, 1976). 
 
Concentração Osmótica 
 O aumento da concentração osmótica do meio pela adição de sacarose, sorbitol ou manitol 
previne a germinação precoce e o desenvolvimento anormal de embriões somáticos em cultura de 
células de cenoura (Ammirato & Steward, 1971). 
 
Luz 
 Em geral, o processo de indução e iniciação de embriões somáticos é realizado no escuro. A luz 
afeta o desenvolvimento dos embriões somáticos somente após a iniciação. Entretanto, em 
Ranunculus sceleratus o desenvolvimento de embriões somáticos foi similar tanto no escuro, quanto 
na luz (Komar e Nataraja, 1969). 
 
 
Estágios e modulação da embriogênese somática 
 Uma estratégia geral a ser empregada para a indução e modulação da embriogênese e 
poliembriogênese somática encontra-se esquematizada na figura 2. O primeiro passo consiste em 
determinar na planta matriz a melhor fonte de explantes. O processo básico consiste de dois ciclos. 
No ciclo A, um explante juvenil ou embrionário, por exemplo um embrião zigótico, em estágio inicial 
de desenvolvimento, é inoculado em meio contendo 2,4-D. Estas culturas são normalmente mantidas 
no escuro e geram complexos ou massas celulares pró-embrionárias, que por processos de 
embriogênese repetitiva, representados por fenômenos de clivagem e gemação, resultam em um 
ciclo repetitivo de divisões celulares, formando complexos celulares suspensor-embrionários, no 
caso de gimnospermas e de embriões somáticos globulares, no caso de angiospermas. Biorreatores 
podem ser empregados para a produção em larga escala das culturas nesta fase. No ciclo B, esses 
pró-embriões são estimulados a prosseguir o seu desenvolvimento pela retirada das auxinas no 
meio, ou pela inclusão de ABA, citocininas e de agentes que promovam um estresse osmótico. Nesta 
fase as culturas são mantidas em condições de luminosidade. Esse ciclo de maturação forma 
embriões somáticos que podem ser convertidos a plantas ou que podem então então serem 
encapsulados para a obtenção de sementes sintéticas. Cada uma destas fases será detalhada a 
seguir. 
 
Iniciação das culturas embriogenéticas 
 Como já foi descrito anteriormente, culturas embriogenéticas são geralmente iniciadas à partir de 
explantes embrionários, juvenis ou maduros cultivados em meios semi-sólidos, contendo altos níveis 
das auxinas ANA, 2,4-D, e Picloran (20-100 µM) com ou sem uma das citocininas BAP, KIN, 
Thidiazuron (10-20 µM). Em modelos diretos, a primeira expressão morfogenética é o surgimento de 
estruturas globulares brancas e translúcidas que correspondem a embriões somáticos globulares. 
Em modelos indiretos, inicialmente há a diferenciação de calo e o surgimento neste de setores 
friáveis, normalmente brancos e translúcidos, convencionalmente designados de massas ou 
complexos celulares pró-embriogenéticos, os quais dividem-se para formar pró-embriões somáticos. 
Além das características morfológicas as massas calosas e pró-embrionárias podem ser distinguidas 
por características citoquímicas. Células que reagem fortemente ao corante Carmin Acético e 
fracamente ao Azul de Evans são embriogenéticas e células com reação fraca ao primeiro e 
intermediária ao segundo são células calosas (Durzan, 1988). 
 São necessários quatro ou cinco sub-cultivos em placas de petri contendo meios semi-sólidos 
para que ocorra a purificação e estabilizacão destas culturas, de tal maneira que elas possam ser 
consideradas linhagens celulares embriogenéticas. 
 
Manutenção, multiplicação e cultura massal 
 A estratégia, neste caso, consiste em determinar as condições adequadas para o 
estabelecimento de ciclos repetitivos de divisãocelular e o controle restrito dos processos de 
diferenciação, de tal maneira que as culturas sejam constituídas por células pró-embrionárias ou 
embriões somáticos em estágios globulares iniciais de desenvolvimento. Suspensões celulares são 
mais adequadas, podendo ser cultivadas em biorreatores ou frascos Erlenmeyers sob agitação. Um 
sistema simples, eficiente e de baixo custo e facilmente adaptável às condições dos laboratórios 
brasileiros, consiste no emprego do agitador rotatório, com as células sendo multiplicadas em balões 
voluméticos modificados de 1.000 ml. Esta modificação consiste na alteração das paredes laterais do 
balão para a soldadura de pontas de tubos de ensaio e a formação de protuberâncias (nipple-flasks). 
Estes frascos são fixados por molas em uma placa de acrílico perfurada no tamanho do diâmetro do 
balão volumético. Cada placa contendo seis balões gira (1 rpm), em torno de um eixo horizontal 
levemente inclinado, que pode conter quatro destas placas. Cada aparato completo pode conter 
quatro eixos, perfazendo um total de 96 balões volumétricos. Este equipamento nada mais é do que 
uma adaptação do sistema empregado por Steward em seus experimentos com células 
embriogênicas de cenoura. 
 Para o estabelecimento de ciclos repetitivos de divisão celular e a cultura massal (scale-up) 
destes complexos pró-embriogenéticos, inocula-se uma determinada quantidade dos mesmos em 
frascos Erlenmeyers ou balões volumétricos de 1.000 ml, contendo 250 ml de meio de cultura. para 
iniciar as culturas a quantidade de 2 a 5 g ou de 5 a 10ml de volume sedimentado destas linhagens 
são suficientes. A partir disto pode-se estabelecer a curva de crescimento, determinando-se as 
fases lag, exponencial, linear e estacionária e, adicionalmente, pode-se determinar o índice mitótico 
para cada fase desta curva e o volume ou peso final na fase estacionária, avaliando-se também 
através de monitoramento histoquimico a qualidade destas culturas. Com isto é possível determinar o 
intervalo médio de sub-cultivos, que serão feitos quando as culturas estiverem no ponto mediano da 
fase linear da curva de crescimento e a quantidade de biomassa celular que gerará o número 
desejado de embriões somáticos ao final do ciclo. 
 O principal ponto de contrôle da manutenção das linhagens em ciclos repetitivos diz respeito à 
uma redução considerável nos níveis dos reguladores de crescimento. Nos vários sistemas em 
funcionamento, observa-se que as concentraçoes médias destes reguladores nesta fase estão na 
faixa de 2 a 5 µM para as auxinas e de e 2 a 5 µM para as citocininas (Gupta et al., 1993). 
 Estas culturas deverão ser mantidas no escuro, em salas de cultura com temperatura média de 
25oC. 
 Devido a maior possibilidade de contaminação da cultura em meio líquido, recomenda-se a 
manutenção de um estoque de culturas em meio semi-sólido, em placas de petri, e em estufa 
incubadora ajustada para temperaturas mais baixas, para que as repicagens mensais sejam 
suficientes para manter as culturas em condições adequadas. No Laboratório de Cultura de Tecidos 
do CCA/UFSC, linhagens celulares embriogenéticas de Picea abies tem sido mantidas em sistema 
de suspensões no aparato de Steward e em plaqueamento, em ciclos repetitivos de divisão celular 
desde 1991, sem perda no potencial morfogenético. Havendo protocolos e recursos disponíveis, a 
criopreservação em N líquido pode ser uma alternativa para preservação das linhagens celulares. 
 
Desenvolvimento e maturação 
 A próxima fase da embriogênese somática consiste em estimular a progressão das fases iniciais 
para as fases tardias. A estratégia a ser empregada consiste em interromper os ciclos repetitivos de 
divisão celular e fornecer os estimulos fisiológicos, bioquímicos e ambientais para a diferenciacão 
celular para que os ciclos de desenvolvimento e de maturação originem um grande número de 
embriões somáticos maduros, de alta qualidade e aptos a converterem em plantas. 
 O conhecimento dos processos e fatores que controlam a embriogênese zigótica é de 
fundamental importância para que se procure reconstituir ao máximo os mesmos durante a 
embriogênese somática in vitro. Desta maneira as estratégias discutidas a seguir guardam relação 
direta com estes eventos. 
 O aumento da osmolaridade parece estar relacionado com a transição do ciclo 
divisão/diferenciação e este aumento pode ser obtido pela adição de PEG, mio-inositol, sorbitol e 
manitol, de tal maneira que o meio de cultura esteja ajustado em valores de 200 a 350 mM . O ABA a 
exemplo de seus efeitos na embriogênese zigótica exerce efeito notável nesta fase e nas 
concentrações de 25 a 100 mg/l pode impedir processos de clivagem e gemação que são a 
expressão morfogenética dos ciclos repetitivos de divisão e dos estágios iniciais da diferenciação e 
que muitos autores convencionaram conceituar como embriogênese repetitiva ou secundária. Desta 
forma o efeito conjunto do ABA e dos agentes osmóticos, principalmente o PEG de peso molecular 
entre 1.000 - 8.000, resulta na síntese e acumulação de produtos de reserva, de forma similar aos 
eventos desta fase na embriogênese zigótica. Com este método podem ser produzidos 50 a 100 
embriões somáticos cotiledonares de alta qualidade, por cada ml de volume sedimentado de 
suspensões celulares de Picea abies, o que significa um potencial produtivo de 50.000 a 100.000 
embriões somáticos por litro de suspensões celulares, os quais podem apresentar até 90% de taxa 
de conversão para plantas . 
 
 
 
Poliembriogênese somática 
Poliembriogênese somática pode ser definida como a reconstituição por processos de clivagem e 
gemação de mais de um embrião à partir de um complexo celular suspensor-embrionário pré-
existente na embriogênese zigótica de coníferas, diferenciando este processo daquele observado na 
embriogênese somática de angiospermas. Esta terminologia foi empregado primeiramente por Gupta 
& Durzan (1986) para descrever o processo adventício originado a partir de células do suspensor de 
embriões zigóticos de Pinus lambertiana. Para estes autores o modelo de poliembriogênese 
somática observado em Pinus é o que mais se aproxima do processo de poliembriogênese zigótica 
em coníferas. Desde o início da manipulação experimental in vitro deste fenômeno, consideráveis 
progressos foram obtidos com esta técnica, comparativamente aos avanços observados nos 
laboratórios que trabalham com a embriogênese somática em angiospermas. Atualmente várias 
espécies de coniferas podem ser regeneradas in vitro através destas técnicas. Na maioria dos casos 
embriões zigóticos imaturos e maduros tem sido empregados para iniciar as culturas embriogênicas, 
embora gametófitos femininos também apresentam potencial para produzir culturas embriogenéticas 
passíveis de regenerar plantas, como é o caso de Larix decidua (Nagmani & Bonga, 1985). 
 O domínio completo deste sistema regenerativo em coníferas foi relatado pela primeira vez. por 
Chalupa (1985) e Hakman et al. (1985) ao cultivarem embriões zigóticos maduros e imaturos de 
Picea abies. Estes embriões quando inoculados em meio MS (Murashige & Skoog, 1962) ou LP (von 
Arnold & Eriksson, 1981), contendo 10 a 20 µM de 2,4-D e 5µM de BA, originaram um tecido branco 
e translúcido denominado de tecido embriogenético, constituído por células alongadas e vacuoladas 
do tipo suspensor e por células pequenas com citoplasma denso na região do ápice embrionário. 
 Conhece-se muito pouco acerca da iniciação e desenvolvimento da poliembriogênese somática 
em coníferas e tres diferentes hipóteses foram sugeridas por Hakman et al. (1987) para explicar a 
origem deste processo: 1) embriões somáticos podem se originar de células simples ou pequenos 
agregados celulares por uma divisão inicial assimétrica que delimita a região apical embrionária da 
região do suspensor. No caso de Picea abies e P. glauca, as divisões celulares desiguais nas 
camadas epidérmicas e sub-epidérmicas da região dohipocótilo resultam na formação de pró-
embriões (Nagmani et al., 1987); 2) embriões somáticos podem se desenvolver a partir de células 
meristemáticas da região do suspensor, sendo que as iniciais podem se originar por divisão 
assimétrica (Hakman et al.,1987; Schuller et al., 1989); 3) embriões somáticos podem se originar por 
um mecanismo similar à poliembriogênese por clivagem, com a separação inicial, ocorrendo na 
região do ápice embrionário. Este processo foi descrito em culturas de embriões somáticos de Abies 
alba (Schuller et al., 1989), espécies de Pinus e Picea (von Arnold & Woodward, 1988). 
 
Fatores que afetam a poliembriogênese somática 
 A seleção criteriosa do explante é fator crítico para a indução da embriogênese somática em 
coniferas. Diferentes tecidos da mesma planta ou tecidos em diferentes estádios de desenvolvimento 
podem originar diferentes respostas in vitro. Em Picea glauca, por exemplo, apenas uma entre várias 
épocas de coleta de cones revelou respostas morfogenéticas (Lu & Thorpe, 1987). Efeitos similares 
do estágio de desenvolvimento foram observados em Pinus lambertiana (Gupta & Durzan, 1986) e 
Pinus taeda (Becwar et al., 1990). De maneira geral, em espécies de Pinus, embriões zigóticos em 
estágio pré-cotiledonar são os melhores explantes para a indução de tecidos embriogenéticos, 
enquanto que nas espécies de Picea, este resultado é obtido com embriões em estágio cotiledonar. 
Estes aspectos mostram a importância da época de coleta dos explantes e sugerem a existência de 
um estádio de desenvolvimento em que o explante é altamente responsivo à indução embriogênica. 
 Em Larix decidua verificou-se o desenvolvimento de tecidos embriogênicos a partir das regiões 
da chalaza e da micrópila do megagametófito em cultura (von Aderkas et al., 1987). A indução de 
tecido embriogênico haplóide somente é possível durante um curto período de desenvolvimento do 
cone feminino. Este tecido demonstrou autotrofia para reguladores de crescimento, já que a indução 
embriogenética ocorreu em meio de cultura desprovido de auxinas e citocininas, sugerindo que o 
megagametófito poderia suprir os hormônios necessários para a iniciação da embriogênese (von 
Aderkas et al., 1990). 
 Em explantes de sementes imaturas de Pinus lambertiana, a presença do gametófito feminino 
pode auxiliar no estabelecimento de culturas embriogênicas e esta indução é mais intensa quando o 
embrião dominante é removido (Gupta & Durzan, 1986). Não se conhece, contudo, se esta 
dominância está relacionada com a presença de inibidores ou de outros fatores. 
 Em Araucaria angustifolia e em Pinus elliottii a indução de linhagens celulares poliembriogênicas 
é dependente do estádio de desenvolvimento do pró-embrião zigótico, sendo que os complexos 
celulares suspensor-embrionários surgem a partir das células do ápice embrionário. Esta indução 
ocorre em meios contendo 2,4-D, BAP e KIN e ciclos repetitivos de divisão celular foram 
estabelecidos, permitindo a cultura massal destas células (Guerra et al., 1993). Na figura 3 são 
apresentados os principais estádios de desenvolvimento de um modelo poliembriogenético em A. 
angustifolia e Picea abies. 
 O emprego de embriões zigóticos maduros de sementes armazenadas pode proporcionar 
explantes durante todo o ano. Culturas embriogenéticas de Picea glauca (Tremblay, 1990) e de 
Picea mariana (Tautorus et al., 1991) foram iniciadas a partir de embriões zigóticos maduros 
armazenados por 11 e 13 anos respectivamente. Depois de quatro semanas em cultura, os explantes 
produziram um exsudato marron na região do hipocótilo e da radícula, bem como apresentavam um 
intumescimento dos cotilédones. Tecidos embriogênicos foram observados surgindo na região citada 
seis a oito semanas após a inoculação. 
 
Meios de cultura e reguladores de crescimento 
 Existem poucos estudos sobre quais constituintes do meio de cultura podem ser considerados 
essenciais para a indução e manutenção da poliembriogênese somática. Os reguladores de 
crescimento 2,4-D e BA tem sido amplamente empregados nas concentrações de 10 e 5 µM 
respectivamente, para a indução e manutenção em ciclos repetitivos de divisão celular de culturas 
poliembriogenéticas de várias espécies de coníferas. Agentes que provocam estresse osmótico, 
notadamente o polietileno glicol (PEG) e o ABA parecem promover a progressão dos embriões 
somáticos para o estágio policotiledonar. A manipulação desta técnica para fins de propagação 
clonal massal depende de uma série de fatores tais como a fonte e estágio de desenvolvimento do 
explante, o meio de cultura e seus complementos, os reguladores de crescimento, o estabelecimento 
de ciclos repetitivos de divisão celular e de ciclos de maturação e a frequência de subculturas. 
 Modificações dos componentes do meio e das condições de cultura podem afetar 
significativamente a indução de tecido embriogenético, principalmente de explantes maduros (Atree 
et al., 1990; Tautorus et al., 1991). Os fatores mais importantes são: fotoperíodo, concentrações e 
constituintes do meio básico (principalmente, sacarose e nitrogênio), agente geleificante, reguladores 
de crescimento e pH. Portanto, uma otimização do meio deverá ser conduzida para cada espécie 
utilizando-se várias linhagens celulares (Tautorus et al., 1991). 
 
Embriogênese somática e sementes sintéticas 
 Uma vez que os embriões somáticos são estruturalmente similares aos embriões zigóticos torna-
se vantajoso combinar a eficiência e o baixo custo das sementes como fonte de propágulos com a 
produção clonal massal in vitro de embriões a partir de células somáticas. A inserção de sequências 
gênicas em células somáticas pode também permitir que embriões somáticos transgênicos sejam 
produzidos e multiplicados em grande escala em sistemas automatizados (Gray & Purohit, 1991). 
 O conjunto de técnicas que visa o emprego de embriões somáticos como sementes funcionais é 
chamado de tecnologia de sementes sintéticas ou artificiais. As principais vantanges potenciais deste 
método relacionam-se com: a) a produção de grande quantidade de propágulos em curto espaço de 
tempo; b) a manutenção da identidade clonal; c) a semeadura direta a campo, eliminando estruturas 
caras de aclimatização, sementeiras e viveiros; c) o baixo custo por planta. Para espécies florestais, 
pode-se acrescentar que a produção de sementes sintéticas em laboratório pode ocorrer ao longo do 
ano e não depender de perdas por condições climáticas desfavoráveis, ataques de pragas e doenças 
e anos de baixa produção, aspectos estes comumente associados com a produção de sementes 
principalmente em espécies florestais. 
 Das diferentes técnicas disponíveis, o sistema de encapsulamento em gel é o mais empregado. 
Redenbaugh et al. (1986) foram os primeiros a propor o uso de um hidrogel como o alginato de sódio 
para a produção de sementes artificiais, observando frequências de 86% de conversão em 
sementes sintéticas de alfafa.. 
 O alginato de sódio é o principal gel para o encapsulamento devido as suas propriedades 
geleificantes, baixo custo, facilidade de uso e ausência de toxicidade. O procedimento básico para o 
encapsulamento consiste na mistura dos embriões somáticos com o alginato de sódio a 2% (p/v). 
Com o auxílio de uma ponteira de ependorf e de uma chupeta aspira-se o embrião somático e a 
matriz de gel, podendo-se obter sementes sintéticas de diferentes formas e tamanhos que são 
colocadas em uma solução de nitrato de cálcio (30 a 100 mM) por períodos de 10 a 30 minutos. O 
alginato de sódio, na presença de cátions di e trivalentes, complexa-se e forma o alginato de cálcio. 
Os cátions metálicos formam ligações iônicas entre o ácido carboxílico das moléculas de ácido 
gulurônico do alginato. A resistência e dureza da cápsula são funções da proporção entre os ácidos 
gulurônico e manurônico, os cátions e o tempo de complexação (Redenbaugh et al., 1988). Este 
aspecto é importante pois em alguns casos, a dureza excessivada cápsula impede ou dificulta a 
conversão dos embriões para plantas. Além disto as cápsulas de hidrogel podem desidratar e 
dificultar trocas gasosas, limitando o período de armazenamento no escuro e em baixas 
temperaturas por um período máximo de 1 mes (Redenbaugh et al., 1991). Na figura 3I, e 4E 
observam-se embriões somáticos de P. abies e de Feijoa sellowiana encapsulados por este 
método. 
 Esta técnica tem sido continuamente aprimorada de tal maneira que a partir de uma análise 
qualitativa e quantitativa dos componentes do endosperma de uma semente, pode-se reconstituir e 
adicionar nutrientes inorgânicos e orgânicos, agentes protetores bem como microorganismos 
benéficos (micorrizas) ao hidrogel. Uma análise cromatográfica e a posterior adição dos aminoácidos 
presentes no endosperma de sementes do palmiteiro (Euterpe edulis), pode auxiliar na 
reconstituição de um endosperma sintético de alta qualidade nutricional no encapsulamento de 
embriões somáticos desta espécie (Guerra, M.P., dados não publicados). Em sementes sintéticas de 
Picea mariana a adição de sais, sacarose e carvão ativado ao alginato de sódio a 3%, resultou em 
taxas de germinação de 40-50% após o armazenamento a 40C por um mês (Atree & Fowke, 1993). 
 A desidratação dos embriões somáticos é a maneira mais adequada de simular as condições 
reais de um embrião contido dentro de uma semente verdadeira e vários estudos vem se 
concentrando nesta área. Neste caso outros compostos que não hidrogel podem ser empregados 
como matriz para o encapsulamento, tais como resinas plásticas de polietileno-óxido solúveis em 
água (Janick et al., 1989). Embriões somáticos desidratados de Picea glauca foram encapsulados 
em compostos solúveis de baixo ponto de fusão. Isto permitiu a desidratação controlada dos 
embriões somáticos em condições que favoreçam sua alta viabilidade após o armazenamento das 
sementes sintéticas em baixas temperaturas (Attree & Fowke, 1993). 
 Apesar dos avanços verificados com a tecnologia de sementes sintéticas nos últimos dez anos, 
as técnicas de encapsulamento em alginato e em polietileno-óxido, consideradas como as mais 
promissoras, não tem demonstrado aplicabilidade em condições de campo. As limitações principais 
tem sido associadas à: a) baixa resistência à dessecação; b) baixa disponibilidade de nutrientes e de 
oxigenio; e, c) não tolerância ao dano mecânico e às flutuações de temperatura no leito de 
conversão (Gupta et al., 1993). Contudo, inovações e melhorias nos protocolos e o desenvolvimento 
de equipamentos visando a automação do processo de seleção e encapsulamento, vem permitindo 
aumentar as taxas de conversão de embriões somáticos em plantas. 
 
 
Considerações finais e perspectivas futuras 
 Um dos problemas no estudo da morfogênese vegetal é conhecer os processos e fatores que 
fazem com que um organismo multicelular complexo evolua a partir do zigôto. Um dos obstáculos 
para isto é a localização dos embriões no interior do saco embrionário, acarretando dificuldade na 
sua manipulação experimental (Goldberg et al., 1994). A embriogênese somática pode contornar 
este obstáculo por apresentar a mesma ontogênese da embriogênese zigótica, fazendo com que 
este sistema seja ideal para tais estudos. 
 Uma das principais aplicações da embriogênese somática em programas de melhoramento de 
plantas perenes, relaciona-se com a possibilidade da fixação do ganho genético pela captura dos 
componentes aditivos e não aditivos da variância genética. O primeiro é baseado no efeito 
independente dos alelos, enquanto que o segundo, normalmente perdido nos processos de 
reprodução sexuada, é baseado na interação dos alelos, dentro ou entre locus (Durzan, 1988). Este 
processo pode iniciar com o cruzamento controlado entre plantas, que já de antemão sabe-se que 
produzirão uma progênie superior. Massas celulares pró-embrionárias podem permitir o 
estabelecimento e a multiplicação massal de linhagens celulares embriogenéticas, de acordo com as 
sequências propostas anteriormente. Enquanto amostras destas linhagens são criopreservadas, uma 
outra parte gerará plantas para o estabelecimento de testes clonais de campo. A performance destes 
genótipos será avaliada até que se tenham elementos suficientes para a seleção final dos melhores 
clones, após o que algumas linhagens criopreservadas serão eliminadas e outras iniciarão um 
programa de propragação clonal massal (Gupta et al., 1993). Para evitar riscos de vulnerabilidade 
genética inerentes ao processo de propagação clonal, propõe-se um grande número de cruzamentos 
dirigidos entre diferentes progenitores de alta performance, de tal maneira que as populações clonais 
resultantes do processo de embriogenêse somática sejam constituidas de mosaicos genéticos. 
 Em plantas com incompatibilidade de geração gametofítica, o resgate de embriões e o 
estabelecimento de linhagens embriogenéticas pode se transformar em uma técnica muito útil e 
poderosa para ampliar as possibilidades de sucesso em programas de melhoramento que objetivem 
incorporar características de resistência de híbridos de cruzamentos interespecíficos. 
 A variabilidade clonal genética ou epigenética leva à uma perigosa situação na biotecnologia 
vegetal, principalmente quando se trata de plantas perenes, uma vez que as expectativas quanto ao 
impacto destas técnicas não são correspondentes à base científica até hoje existente. A instabilidade 
genética em populações de células embriogenéticas é considerada indesejável, mas pode levar à 
obtenção de variantes úteis se sua frequência for devidamente controlada. Isto significa dizer que 
quando a regeneração ocorre a partir de calos ou de células protodérmicas cujas iniciais apresentam 
genótipo variável, pode-se esperar algumas aberrações entre as populações de clones. Para fins de 
seleção, quando se comparam o têrmos aberração e variação, o primeiro parece mais adequado 
para designar os desvios de um genótipo a ser clonado. Em plantas perenes, as características ciclo 
celular relativamente curto e ciclo de vida longo reforçam a hipótese que, para muitas aberrações 
operam poderosos mecanismos de reparo e de inativação celular, os quais minimizam os efeitos 
deletérios (Durzan, 1988). 
 Para que a embriogênese somática venha a ser o sistema de micropropagação do futuro é 
necessário que ocorram melhorias nos protocolos regenerativos. O principal aspecto a ser 
melhorado diz respeito ao estabelecimento preciso de um sistema de dois ciclos. No primeiro, 
determinam-se as condições necessárias para o estabelecimento de ciclos repetitivos de divisão 
celular, no qual seja possível obter-se grandes quantidades de pró-embriões em biorreatores ou 
equipamentos similares. Neste ciclo pode-se estabelecer e manter uma base celular para a 
progressão para o ciclo seguinte e para a introdução de genes de interesse. No segundo ciclo 
determinam-se para cada modelo embriogenético as condições para o desenvolvimento e maturação 
dos embriões somáticos, que podem ser convertidos à plantas ou então encapsulados para a 
obtenção de sementes sintéticas. Com estes dois ciclos torna-se possível reduzir consideravelmente 
o impacto das principais limitações da embriogênese somática, que são: a) a baixa intensidade de 
indução a partir de um explante primário; b) a resposta genótipo-dependente; c) a falta de sincronia 
das culturas em seus diferentes estágios, e; d) as dificuldades de automatização do processo. 
 A tecnologia de sementes sintéticas ainda deve ser aprimorada para que seja amplamente 
empregada. Pesquisas devem ser conduzidas principalmente no sentido de: a) aumentar a 
viabilidade e o período de conservação; b) reconstituição de endospermas sintéticos baseados nos 
constituintes do endosperma que envolve o embrião zigótico, e; c) inclusão de microorganismos 
benéficos no endosperma sintético. 
 
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Figura 2. Processo de dois ciclos para a indução e modulação da embriogênese somática. 
Adaptado de Durzan (1988).