A morte celular apoptótica induzida por A3K2A3 em Leishmania amazonensis ocorre por meio de disfunção mitocondrial dependente de caspase e ATP

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A morte celular apoptótica induzida por A3K2A3 em Leishmania amazonensis 
ocorre por meio de disfunção mitocondrial dependente de caspase e ATP 
 
Resumo 
A leishmaniose é uma doença tropical negligenciada que afeta milhões de pessoas em 
todo o mundo. As terapias atuais dependem principalmente de medicamentos antimonial 
que são inadequados devido à sua alta toxicidade e aumento da resistência a 
medicamentos. Existe uma necessidade urgente de descobrir novos medicamentos mais 
eficazes, acessíveis e direcionados. Vias associadas à morte celular semelhante à apoptose 
foram identificadas em eucariotos unicelulares, incluindo parasitas protozoários. No 
presente estudo, investigamos o mecanismo de morte celular induzida por A3K2A3 
contra L. amazonensis. A3K2A3 é uma dibenzilidenoacetona com uma dienona acíclica 
ligada a grupos arila em ambas as posições β, similar a curcuminoides e estruturas de 
chalcona. Esse composto já foi demonstrado anteriormente ser seguro em relação à 
citotoxicidade e ativo contra o parasita. Abordagens bioquímicas e morfológicas foram 
usadas no presente estudo. Os resultados sugeriram que A3K2A3 causou disfunção 
mitocondrial em promastigotas de L. amazonensis, levando a mecanismos de morte 
celular que compartilham algumas características fenotípicas com a apoptose de 
metazoários, como aumento na produção de espécies reativas de oxigênio, diminuição na 
razão de trifosfato de adenosina, exposição de fosfatidilserina, diminuição no volume 
celular, produção de caspase e fragmentação de DNA. Em conjunto, essas descobertas 
indicam que a apoptose realmente pode ser desencadeada por agentes quimioterapêuticos. 
Introdução 
A leishmaniose continua endêmica em várias partes do mundo e é um grave problema de 
saúde em numerosos países em desenvolvimento. Ela se manifesta como uma doença 
complexa e clinicamente diversa, causada por espécies protozoárias do gênero 
Leishmania, transmitidas através da picada de flebotomíneos. Apesar dos avanços 
recentes, o tratamento da leishmaniose ainda é problemático devido à alta toxicidade e 
aos efeitos colaterais adversos dos medicamentos terapêuticos. A necessidade de 
identificar novos alvos moleculares para melhorar a terapia é claramente justificada. 
Estudos de identificação de alvos e mecanismos de ação desempenham papéis 
importantes na descoberta de medicamentos. O alvo em potencial deve estar ausente no 
hospedeiro ou ser significativamente diferente do homólogo do hospedeiro, de forma a 
poder ser explorado como um alvo terapêutico [1]. 
Curiosamente, a morte celular programada em protistas parece compartilhar algumas 
características morfológicas com a apoptose em organismos multicelulares, incluindo 
redução celular, perda do potencial de membrana mitocondrial e externalização da 
fosfatidilserina [2, 3]. Um melhor entendimento da maquinaria mecanística da morte 
celular programada do tipo apoptose em protistas seria, portanto, imensamente benéfico 
no desenvolvimento de intervenções quimioterapêuticas racionais de maneira dependente 
do alvo [4]. A dibenzilidenoacetona 1,5-diariopentanoide é o composto pai de uma classe 
de compostos que possuem uma dienona acíclica ligada a grupos arila em ambas as 
posições β. 
 
Essas estruturas se assemelham às curcuminoides (1,7-diariheptanos) e aos chalconas 
(1,3-diariopropanos), que são compostos naturais bioativos muito importantes 
encontrados em muitas espécies vegetais [5]. Dibenzilidenoacetonas (DBAs) e seus 
análogos têm efeitos antiproliferativos, anti-inflamatórios e apoptóticos por meio da 
regulação de múltiplas vias de sinalização em linhagens celulares cancerígenas [6-10]. 
Relata-se que a dibenzilidenoacetona aumenta a apoptose induzida por TRAIL (fator de 
necrose tumoral relacionado à citocina indutora de apoptose) ao regular proteínas de 
sobrevivência celular e proteínas pró-apoptóticas por meio da ativação de espécies 
reativas de oxigênio (ROS) e CHOP (proteína homóloga a C/EBP) em células de câncer 
de cólon [11]. 
A boa biodisponibilidade de algumas dibenzilidenoacetonas e seus derivados, necessária 
para a bioatividade, e o seu modo de ligação cruzada despertaram o interesse dos químicos 
em sua síntese [5]. Nosso estudo anterior relatou os efeitos anti-leishmaniais e anti-
trypanossomais de A3K2A3 (2d) [5]. Considerando sua atividade anti-leishmanial e 
seletividade para parasitas, o objetivo do presente estudo foi caracterizar melhor as 
alterações bioquímicas induzidas por esse composto contra as formas de promastigotas 
de L. amazonensis e elucidar o possível mecanismo de ação de A3K2A3 envolvido na 
morte celular desse protozoário. 
 
Materiais e métodos 
Produtos químicos Actinomicina D, antimicina A, albumina sérica bovina, 
clorofenilhidrazona de carbonila m (CCCP), digitonina, dimetilsulfóxido (DMSO), 
rodamina 123 (Rh123), diclorofluorescina diacetato de 2′,7′ (H2DCFDA) e Nile Red 
foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Soro fetal bovino (FBS) foi 
obtido da Invitrogen (Grand Island, NY, EUA). Anexina-V FITC e iodeto de propídio (PI) 
foram obtidos da Invitrogen (Eugene, OR, EUA). Difenil-1-pirenilfosfina (DPPP), o Kit 
de Ensaio de Terminal deoxinucleotidyl transferase mediado por enzima de marcação 
(TUNEL) APO-BrdU e o Kit de Ensaio de Caspase-3 EnzChek foram adquiridos da 
Molecular Probes (Eugene, Oregon, EUA). CellTiter-Glo foi obtido da Promega 
(Madison, WI, EUA). Todos os outros reagentes eram de grau analítico. 
 
Síntese e preparação de A3K2A3 
A3K2A3 foi sintetizado como previamente descrito por Ud Din et al. [5]. As soluções 
estoque foram preparadas assepticamente em DMSO e diluídas em meio de cultura de 
forma que a concentração de DMSO não excedesse 1% nos experimentos. As 
concentrações de A3K2A3 utilizadas nos ensaios foram de 3,4 e 9,3 μM, representando o 
IC50 e IC90, respectivamente, como descrito anteriormente [5]. 
 
Parasitas 
Promastigotas de Leishmania amazonensis (MHOM/BR/Josefa) foram mantidos a 25°C 
no meio de Warren (infusão de cérebro-coração mais hemina e ácido fólico; pH 7,2) 
suplementado com 10% de FBS inativado pelo calor. 
Ensaio antiproliferativo in vitro 
Promastigotas em fase logarítmica (1 × 106 parasitas/ml) foram cultivadas em placas de 
microcultura de 24 poços a 25 °C em meio de Warren suplementado com 10% de FBS. 
Os parasitas foram então incubados na presença de diferentes concentrações de A3K2A3 
(1–100 μM). A atividade anti-leishmania foi determinada contando diretamente os 
parasitas de vida livre em uma câmara de Neubauer diariamente até 72 h de incubação, e 
a concentração versus porcentagem de inibição do crescimento foi plotada a cada dia, a 
fim de determinar a concentração de inibição de 50% dos parasitas (IC50). 
 
Atividade contra amastigotas intracelulares 
Macrófagos peritoneais foram coletados de camundongos BALB/c por lavagem com 
solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada suplementada com 3% de FBS. O 
protocolo animal foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Estadual de Maringá 
(aprovação nº 029/2014). Lamínulas de vidro estéreis foram colocadas nos poços de uma 
microplaca de 24 poços, e 5 × 105 células/ml foram adicionadas a cada poço em meio 
RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS. A microplaca foi incubada por 2 h a 37 °C 
em uma mistura de ar com 5% de CO2 para aderir os macrófagos. 
O monólito de macrófagos foi infectado com formas de promastigotas na proporção de 
7:1 (parasita: macrófago). Após 4 h de interação a 34 °C em uma mistura de ar com 5% 
de CO2, a microplaca foi lavada com meio RPMI 1640 para remover os parasitas não 
interiorizados. Em seguida, os macrófagos infectados foram tratados com diferentes 
concentrações de A3K2A3 (1, 2,5, 5,0 e 10 μM) e incubados por 48 h. A porcentagem de 
macrófagos infectados foi avaliada após coloração com Giemsa, contando 
microscopicamente o número de amastigotas por macrófago [12].Atividade hemolítica 
Outra maneira de avaliar a segurança de um medicamento é medir sua atividade 
hemolítica. Sangue de ovelha defibrinado foi lavado em solução salina glicosilada para 
remover qualquer hemoglobina livre do processo de defibrinização. As células vermelhas 
do sangue foram inoculadas em placas de 96 poços a 3% em solução salina glicosilada 
com diferentes concentrações de A3K2A3 (10-2000 μM). As placas foram incubadas por 
3 h a 37 °C, e o sobrenadante foi lido em 550 nm. Para calcular a porcentagem de 
hemólise, 1% de Triton X-100 foi usado como controle positivo [13]. 
Microscopia eletrônica de transmissão 
Para a análise ultraestrutural, as formas de promastigotas foram tratadas por 72 h a 25 °C 
com concentrações de A3K2A3 que correspondiam ao IC50 e IC90. Após lavagem com 
PBS, os parasitas foram fixados em glutaraldeído a 2,5% em tampão de cacodilato de 
sódio a 0,1 M a 4 °C e pós-fixados em uma solução contendo tetraóxido de ósmio a 1%, 
ferrocianeto de potássio a 0,8% e cloreto de cálcio a 5 mM. Os parasitas foram 
desidratados em uma série de acetona e emblocados em resina Epon por 72 h a 60 °C. As 
seções ultrafinas foram coradas com acetato de uranilo a 5% e citrato de chumbo e 
examinadas em um microscópio eletrônico de transmissão JEOL JEM 1400. 
 
Detecção de corpos lipídicos citoplasmáticos por coloração com Nile Red 
As formas de promastigotas de L. amazonensis foram tratadas com concentrações de 
A3K2A3 que correspondiam ao IC50 e IC90, conforme descrito anteriormente no ensaio 
antiproliferativo. Os parasitas tratados foram então colhidos, lavados duas vezes em PBS 
e corados diretamente com 10 μg/ml de Nile Red (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) 
por 30 min à temperatura ambiente. Os corpos lipídicos citoplasmáticos nos parasitas 
foram detectados com um microscópio de epifluorescência (Olympus BX51) equipado 
com um filtro WG. Os parasitas foram fotografados usando uma câmera Olympus UC30. 
As amostras também foram analisadas em um leitor de microplacas de fluorescência 
(Victor X3, PerkinElmer, Finlândia) em um comprimento de onda de excitação de 515-
560 nm e um comprimento de onda de emissão >590 nm. 
 
Determinação do potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) 
Promastigotas (1 × 107 células/ml) foram tratadas com 3,4 e 9,3 μM de A3K2A3 por 24 
h a 37 °C, colhidas, lavadas com PBS. Os parasitas foram incubados com 1 ml (5 mg/ml 
em etanol) de Rh123, uma sonda fluorescente que se acumula nas mitocôndrias, por 15 
min, ressuspendidos em 0,5 ml de PBS e incubados por mais 30 min. O ensaio foi 
conduzido de acordo com as instruções do fabricante. 
Os parasitas foram analisados usando um citômetro de fluxo BD FACSCalibur e o 
software CellQuest Pro (Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ, EUA). Um total de 
10.000 eventos foi adquirido na região correspondente aos parasitas. CCCP (100 μM) foi 
usado como controle positivo. 
 
Medição de espécies reativas de oxigênio 
Promastigotas (1 × 107 células/ml) foram tratadas ou não tratadas com 3,4 e 9,3 μM de 
A3K2A3 por 24 h, centrifugadas, lavadas e ressuspendidas em PBS, pH 7,4. Em seguida, 
esses parasitas foram carregados com 10 μM da sonda permeável H2DCFDA no escuro 
por 45 min [15]. As espécies reativas de oxigênio foram medidas como um aumento na 
fluorescência causado pela conversão do corante não fluorescente em 20,70-
diclorofluoresceína altamente fluorescente. Os parasitas foram analisados usando um 
citômetro de fluxo BD ACCURI™ C6 com um total de 10.000 eventos adquiridos na 
região pré-determinada correspondente aos parasitas. Além disso, a fluorescência também 
foi medida em um leitor de microplacas de fluorescência (Victor X3, PerkinElmer, 
Finlândia) em um comprimento de onda de excitação de 488 nm e um comprimento de 
onda de emissão de 530 nm. Peróxido de hidrogênio (20 mM) foi usado como controle 
positivo. 
 
Estimativa de peroxidação lipídica pelo ensaio de difenil-1-pirenilfosfina 
As formas de promastigotas de L. amazonensis (1 × 106 células/ml) foram tratadas com 
3,4 e 9,3 μM de A3K2A3 por 24 h a 25 °C. As células foram lavadas duas vezes, 
ressuspendidas em PBS e carregadas com DPPP [16] por 15 min. Durante o procedimento 
de marcação, a suspensão celular foi mantida no escuro. Após a incubação, as 
intensidades de fluorescência das amostras foram medidas com um leitor de microplacas 
de fluorescência (Victor X3, PerkinElmer, Finlândia) em um comprimento de onda de 
excitação de 355 nm e um comprimento de onda de emissão de 460 nm. Peróxido de 
hidrogênio (200 μM) foi usado como controle positivo. 
 
Determinação de adenosina trifosfato intracelular 
Promastigotas de L. amazonensis (1 × 106 células/ml) foram tratadas com 3,4 e 9,3 μM 
de A3K2A3 por 24 h. Após a incubação a 25 °C, os promastigotas foram centrifugados, 
lavados e ressuspendidos em PBS. Em placas brancas de 96 poços, volumes iguais de 
reagente CellTiter-Glo e uma alíquota de cada amostra foram adicionados, misturados e 
incubados por 10 min. A intensidade de luminescência foi quantificada usando um leitor 
de microplacas de luminescência (VICTOR X3, PerkinElmer). CCCP (100 μM) foi usado 
como controle positivo. 
Determinação da integridade da membrana celular 
Promastigotas (1 × 107 células/ml) foram tratadas com 3,4 e 9,3 μM de A3K2A3 por 24 
h a 32 °C, colhidas e lavadas com PBS. Os parasitas foram incubados com 50 μl de PI a 
2 mg/ml por 5 min, de acordo com as instruções do fabricante. Imediatamente depois, os 
parasitas foram analisados usando um citômetro de fluxo BD FACSCalibur equipado com 
o software CellQuest. Um total de 10.000 eventos foi adquirido na região correspondente 
aos parasitas. Digitonina (40,0 μM) foi usada como controle positivo [17]. 
Microscopia eletrônica de varredura de promastigotas e amastigotas intracelulares 
Promastigotas (1 × 106 células/ml) e macrófagos peritoneais aderidos à superfície de 
pequenas lamínulas de vidro previamente infectadas com promastigotas por 4 h a 34 °C 
(conforme descrito na seção 2.4) foram preparados. Após o período de infecção, as placas 
foram incubadas a 34 °C por 24 h e somente então as células foram tratadas com 3,4 e 9,3 
μM de A3K2A3 por 48 h e 24 h na mesma temperatura, a fim de avaliar as alterações 
morfológicas em promastigotas e amastigotas intracelulares, respectivamente. Após o 
tratamento, as células foram fixadas em glutaraldeído a 2,5% em tampão de cacodilato de 
sódio a 0,1 M por 1–3 h. 
Posteriormente, elas foram desidratadas em concentrações crescentes de etanol e secas 
em ponto crítico em CO2. Para a observação de amastigotas intracelulares, as lâminas 
foram colocadas em um aparelho apropriado e os macrófagos infectados foram fraturados 
com fita adesiva. Todas as amostras foram revestidas com ouro e observadas em um 
microscópio eletrônico de varredura Shimadzu SS-550 (Japão) [18, 19]. 
Determinação do volume celular dos parasitas 
Promastigotas (1 × 107 células/ml) foram tratadas com 3,4 e 9,3 μM de A3K2A3 por 24 
h a 25 °C, colhidas e lavadas com PBS. Posteriormente, os parasitas foram analisados 
usando um citômetro de fluxo BD FACSCalibur e o software CellQuest Pro. 
Histogramas foram gerados, e FSC-H representou o volume celular. Um total de 10.000 
eventos foi adquirido na região correspondente aos parasitas. Actinomicina D (20,0 mM) 
foi usada como controle positivo [18]. 
 
Determinação da exposição de fosfatidilserina 
Promastigotas (1 × 106 células/ml) foram tratadas com 3,4 e 9,3 μM de A3K2A3 por 24 
h a 25 °C. Em seguida, os parasitas foram lavados e ressuspendidos em 100 μl de tampão 
de ligação (140 mM de NaCl, 5 mM de CaCl2 e 10 mM de HEPES-Na, pH 7,4), seguido 
pela adição de 5 μl da proteína de ligação de fosfolipídios dependente de cálcio, anexina-
V FITC, por 15 min à temperatura ambiente. Em seguida, foram adicionados 400 μl de 
tampão de ligação. Antimicina A (125,0 μM) foi usada como controle positivo. Aquisiçãode dados foi realizada usando um leitor de microplacas de fluorescência (Victor X3, 
PerkinElmer, Finlândia) em um comprimento de onda de excitação de 488 nm e um 
comprimento de onda de emissão de 520 nm. Além disso, as células foram contracoradas 
com PI (0,2 μg/mL) e as imagens foram adquiridas por um microscópio de 
epifluorescência (Olympus BX51) usando uma câmera Olympus UC30. As células 
coradas com anexina-V foram consideradas apoptóticas. 
Detecção de caspase 
A atividade da protease caspase-3/7 foi medida usando o kit EnzChek Caspase-3 
(Molecular Probes). O ensaio foi realizado de acordo com as instruções do fabricante com 
as seguintes modificações menores. Resumidamente, 106 parasitas foram incubados com 
3,4, 9,3 e 18,6 μM de A3K2A3 por 24 h, lavados e lisados com Triton X-100 em PBS a 
1% por 30 min, seguido pela adição de reagentes do kit (ou seja, tampão de reação, 
ditiotreitol e substrato Z-DEVDAMC a 5 mM) e incubação por 30 min. Quando as 
reações foram concluídas, o aumento na fluorescência, que é indicativo da clivagem do 
substrato Z-DEVD-AMC, foi lido fluorometricamente nos comprimentos de onda de 
excitação e emissão de 342 e 441 nm, respectivamente. As reações foram realizadas com 
e sem o inibidor Ac-DEVD-CHO (1 mM). A camptotecina (20 μM) foi usada como 
controle positivo. 
 
Determinação de fragmentação de DNA 
Além de determinar a fragmentação de DNA e a atividade de nuclease, as células de 
promastigotas de L. amazonensis tratadas foram fixadas com paraformaldeído a 4% e 
incubadas com Triton X-100 a 0,2% por 10 min para permeabilização e então incubadas 
com uma mistura de reação de TdT que continha BrdUTP por 2 h a 37 °C, de acordo com 
as instruções do fabricante com modificações menores (Kit de ensaio APO-BrdU 
TUNEL, com Anti-BrdU Alexa Fluor 488). Células ligadas a BrdU foram detectadas 
usando um anticorpo anti 
 
-BrdU Alexa Fluor 488 fluorescente verde por 30 min. A fluorescência foi quantificada 
fluorometricamente em um leitor de microplacas com um comprimento de onda de 
excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 520 nm. A camptotecina 
(10 μM) foi usada como controle positivo. 
 
Análise estatística 
Os dados apresentados nos gráficos são expressos como média ± desvio padrão (SD) de 
pelo menos três experimentos independentes. Os dados foram analisados usando análise 
de variância (ANOVA) de um e dois fatores. Diferenças significativas entre as médias 
foram identificadas usando o teste pós-hoc de Tukey ou Bonferroni. Valores de p ≤ 0,05 
foram considerados estatisticamente significativos. As análises estatísticas foram 
realizadas usando o software Prism 5 (GraphPad, San Diego, CA, EUA). 
 
Resultados 
Em um estudo anterior, o A3K2A3 (2k) apresentou atividade interessante contra 
promastigotas de L. amazonensis, com um IC50 de 3,4 ± 0,07 μM, demonstrando seus 
efeitos contra este parasita protozoário. No presente estudo, investigamos ainda mais essa 
atividade e mecanismo de ação. 
Para confirmar os efeitos previamente relatados do A3K2A3 (Fig. 1) na proliferação 
celular de L. amazonensis, foram realizadas contagens diárias de parasitas e construídas 
curvas de inibição do crescimento para cada dia do experimento. O A3K2A3 inibiu o 
crescimento de promastigotas com um IC50 semelhante (2,6 ± 0,3 μM) após 72 h de 
tratamento. Curiosamente, com 24 h de incubação, o A3K2A3 teve um IC50 de 2,7 ± 0,7 
μM, indicando atividade potente mesmo após apenas algumas horas de incubação (Fig. 
2). Para amastigotas intracelulares, o A3K2A3 também apresentou atividade potente, com 
um IC50 de 2,9 ± 0,5 μM. 
Os efeitos de citotoxicidade do A3K2A3 em macrófagos J774A1 foram testados 
conforme descrito anteriormente (CC50 = 43,0 ± 4,24 μM). Para corroborar seu perfil não 
citotóxico, a atividade hemolítica desta substância foi avaliada. O A3K2A3 até uma 
concentração de 2000 μM não apresentou atividade hemolítica. A porcentagem de 
hemólise foi inferior a 6% (dados não mostrados). Para investigar ainda mais e identificar 
os organelas que podem ser alvos potenciais do A3K2A3 em promastigotas, a 
microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foi realizada conforme descrito 
anteriormente. O A3K2A3 causou alterações ultraestruturais significativas (Fig. 3), 
incluindo a desorganização do complexo de Golgi (desintegração das pilhas de cisternas 
e formação de aglomerados de túbulos e vesículas dispersos no citoplasma) e núcleos e 
acúmulo de corpos lipídicos citoplasmáticos. O A3K2A3 também causou danos graves 
nas mitocôndrias do parasita, refletidos pelo inchaço extenso e desorganização da 
membrana mitocondrial interna, intensa vacuolização citoplasmática e presença de 
estruturas de membrana concêntricas dentro da organela. Essas mudanças foram 
observadas em proporções maiores quando as células foram tratadas com o IC90 do 
A3K2A3. Parasitas de controle apresentavam uma ultraestrutura aparentemente normal 
(Fig. 3a). 
Para confirmar o acúmulo de corpos lipídicos em promastigotas tratadas observado por 
TEM, avaliamos a existência dessa estrutura por coloração com Nile Red, que cora 
lipídios neutros. A microscopia de fluorescência revelou um aumento na presença de 
corpos lipídicos em promastigotas após o tratamento com o IC50 e o IC90 do A3K2A3 
por 24 h (Fig. 4) em comparação com células não tratadas. Esse achado foi confirmado 
por fluorimetria, com um aumento de 2,7 vezes na fluorescência em células tratadas com 
o IC90 do A3K2A3 em comparação com células de controle (ou seja, sem tratamento). 
Microscopia Eletrônica de Transmissão também revelou um efeito pronunciado de 
A3K2A3 nas mitocôndrias de L. amazonensis. 
Portanto, o ΔΨm foi avaliado por citometria de fluxo em parasitas tratados. Histogramas 
mostraram uma diminuição acentuada na intensidade total de fluorescência de Rh123 em 
promastigotas após 24 horas de tratamento em todas as concentrações testadas em 
comparação ao grupo controle, indicando despolarização mitocondrial (Fig. 5). Essa 
perda de ΔΨm foi maior no IC90 (40,11%) do que no IC50 (27,00%). O controle positivo 
CCCP induziu uma diminuição de 72,96% no ΔΨm. 
Dado os resultados do ΔΨm, para investigar possíveis danos oxidativos causados por 
A3K2A3 em promastigotas, a produção de ROS totais foi investigada usando a sonda 
fluorescente H2DCFDA, que detecta principalmente H2O2 e radicais hidroxila [21]. 
A3K2A3 aumentou a produção de ROS totais em todas as concentrações testadas em 
comparação com o grupo controle (Fig. 6a), com aumentos de 12,00% e 45,87% nos IC50 
e IC90 de A3K2A3, respectivamente. O controle positivo (H2O2) aumentou a intensidade 
de fluorescência em 89,74%. Esses resultados também foram confirmados por análise de 
citometria de fluxo (Fig. 6b), na qual foi possível identificar que, em nível populacional, 
93,8% e 98,9% das células analisadas apresentaram algum indício de estresse oxidativo 
após tratamento com IC50 e IC90, respectivamente, em comparação com apenas 3,98% 
de positividade em populações não tratadas. 
Nosso experimento anterior mostrou que o A3K2A3 causou danos mitocondriais e 
desequilíbrio oxidativo em L. amazonensis, levando a uma produção aumentada de ROS. 
Assim, esperávamos que o A3K2A3 pudesse desencadear alterações moleculares e 
estruturais no parasita por meio de reações oxidativas. A peroxidação lipídica foi avaliada 
medindo os produtos totais de peroxidação lipídica fluorescente em células leishmania 
após o tratamento com A3K2A3 usando DPPP, que reage estereometricamente com 
hidroperóxidos lipídicos para produzir o produto fluorescente óxido de DPPP. O 
tratamento com A3K2A3 aumentou significativamente os peróxidos lipídicos após 24 
horas de tratamento em ambas as concentrações testadas (Fig. 7). 
Como a interrupção da função da mitocôndria resulta em uma redução na geração de ATP, 
os níveis de ATP foram medidos após a exposição ao A3K2A3, usando o reagente 
CellTiter-Glo,que é detectado por luminescência. Foi observada uma diminuição gradual 
nos níveis de ATP conforme a concentração de A3K2A3 aumentou após 24 horas de 
tratamento (Fig. 8). 
Para determinar o possível mecanismo de morte celular desencadeado pelo A3K2A3, 
foram avaliadas alterações na integridade da membrana celular usando a coloração de PI. 
Promastigotas tratadas com A3K2A3 e coradas com PI não apresentaram permeabilização 
significativa da membrana plasmática em comparação com parasitas não tratados. 
A3K2A3 nas concentrações de 3,4 e 9,3 μM mostraram, respectivamente, 4,75% e 6,16% 
das células positivas para PI. O controle negativo apresentou uma intensidade de 
fluorescência de PI de 4,15%, e a digitonina (ou seja, o controle positivo) apresentou uma 
intensidade de fluorescência de PI de 57,12% (dados não mostrados). 
A microscopia eletrônica de varredura de promastigotas foi usada para investigar o 
mecanismo de morte celular, identificando as alterações morfológicas induzidas pelo 
A3K2A3 no parasita. As fotomicrografias mostraram que protozoários não tratados 
exibiram características típicas, com uma forma alongada e um flagelo terminal. Em 
contraste, o A3K2A3 alterou dose-dependente o tamanho e a forma dos parasitas, 
incluindo o arredondamento e a redução geral do corpo celular (Fig. 9). Alterações 
também foram observadas em formas de amastigotas intracelulares tratadas com ambas 
as concentrações de A3K2A3 na microscopia eletrônica de varredura, com danos e 
ruptura na membrana celular das amastigotas e redução no número de amastigotas por 
célula (Fig. 10). 
Foram realizados experimentos adicionais para avaliar a redução do tamanho celular, um 
indicador da morte apoptótica. Como mostrado na Fig. 11, foi observada uma diminuição 
no volume celular em células tratadas com 3,4 e 9,3 μM de A3K2A3 após 24 horas e 
analisadas por citometria de fluxo, com reduções de 22,26% e 27,66%, respectivamente. 
O controle positivo, actinomicina D, reduziu o volume celular em 47,20%. 
Para determinar se o mecanismo de morte celular desencadeado pelo A3K2A3 envolve a 
apoptose, avaliamos a externalização da fosfatidilserina, um marcador apoptótico 
presente na camada externa da plasmalema [22], em promastigotas tratadas com A3K2A3 
por 24 horas e cor 
 
adas com anexina-V conjugada a FITC. Como mostrado na Fig. 12, o A3K2A3 aumentou 
significativamente a intensidade de fluorescência da anexina-V em mais de 8 vezes tanto 
no IC50 quanto no IC90 em comparação com o grupo controle negativo, indicando 
exposição de fosfatidilserina. Além disso, a microscopia de fluorescência revelou 
parasitas marcados por anexina-V-FITC após o tratamento com ambas as concentrações 
de A3K2A3 (3,4 e 9,3 μM). Na concentração mais alta (9,3 μM) do medicamento testado, 
também é possível identificar alguma coloração de PI no núcleo, indicando algum 
comprometimento da integridade da membrana celular, provavelmente devido a um 
processo apoptótico posterior. 
Uma característica importante da morte apoptótica é o envolvimento de proteases de 
cisteína aspartato (caspases) que medeiam eventos a jusante das mitocôndrias, 
principalmente as caspases executoras 3 e 7 [23, 24]. Para corroborar ainda mais a 
existência dessas proteases em L. amazonensis, foi realizado um ensaio fluorométrico 
usando o kit de ensaio EnzChek Caspase-3. O substrato DEVD-AFC foi adicionado a 
esse extrato, e a liberação de AFC foi usada como medida da atividade da protease 
caspase-3-like madura em células tratadas com A3K2A3. Um aumento significativo 
dessas proteases foi observado após o tratamento com A3K2A3 por 24 horas em 
comparação com células não tratadas. Esse efeito foi mais pronunciado em promastigotas 
tratadas com o IC50 (Fig. 13). O ensaio TUNEL detecta a apoptose em nível de célula 
única e, portanto, permite uma melhor avaliação da fração de células apoptóticas [22]. 
Como mostrado na Fig. 14, promastigotas tratadas com diferentes concentrações de 
A3K2A3 e submetidas ao ensaio TUNEL apresentaram um aumento significativo na 
intensidade de fluorescência em ambas as concentrações testadas. O IC50 (3,4 μM) 
promoveu um aumento de menos de duas vezes na intensidade de fluorescência em 
comparação com os parasitas não tratados (ou seja, o controle negativo), indicando 
fragmentação do DNA. A camptotecina, o controle positivo, causou um aumento de mais 
de nove vezes na intensidade de fluorescência. 
Discussão 
A terapia medicamentosa para a leishmaniose não avançou significativamente desde o 
início do século XX, e o tratamento adequado continua sendo um problema. Há uma 
necessidade urgente de desenvolver medicamentos terapêuticos mais racionais e eficazes 
[25]. 
Os derivados de dibenzilidenoacetona são uma classe de substâncias que possuem uma 
dienona acíclica ligada a grupos arila nas posições β, com um amplo espectro de atividade 
biológica, especialmente atividade antitumoral [11, 26]. A3K2A3 já foi relatado 
anteriormente como tendo uma interessante atividade antitripanossômica e 
antileishmania, e mostrou ser mais seletivo para os parasitas do que para as células 
mamíferas e macrófagos [5]. Um melhor entendimento do mecanismo de morte celular 
seria útil para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas contra parasitas. No 
presente estudo, avaliamos a atividade antileishmania de A3K2A3 para delinear seu 
possível mecanismo de ação. 
Este composto em concentrações micromolares baixas apresentou atividade significativa 
contra as formas de promastigotas e amastigotas intracelulares de L. amazonensis e não 
afetou a viabilidade de hemácias. Esses resultados são muito interessantes porque as 
formas de amastigotas de Leishmania são responsáveis pelas manifestações clínicas no 
hospedeiro vertebrado. Essas amastigotas são o principal alvo da quimioterapia para a 
leishmaniose [27]. 
Os parasitas cinetoplastídeos unicelulares têm organelas especiais envolvidas em vias 
metabólicas essenciais, com etapas diferentes de suas contrapartes mamíferas, tornando-
os alvos atraentes para novos agentes quimioterapêuticos. Estudos ultraestruturais podem 
ser muito úteis para alcançar esse objetivo [4, 28]. Para obter informações sobre o 
mecanismo de ação de A3K2A3 contra L. amazonensis, as promastigotas foram 
analisadas por MET. Fotomicrografias das células tratadas com A3K2A3 exibiram 
alterações ultraestruturais importantes, como acúmulo de corpos lipídicos e 
desorganização do complexo de Golgi. A degradação extensiva do complexo de Golgi e 
retículo endoplasmático causada pelo acúmulo de corpos lipídicos intracelulares no 
citoplasma, indicada por microscopia de fluorescência e fluorimetria (coloração com Nile 
Red), pode indicar alterações nos lipídios e no conteúdo de esteróis e também pode estar 
relacionada à atividade exocítica e autofagia. Alguns estudos relataram que essa atividade 
exocítica pode ocorrer como resultado da secreção de lipídios anormais nessa região, que 
se acumulam como consequência da ação do medicamento ou podem indicar um processo 
de produção exacerbada de proteínas pelas células [29–31]. 
Além disso, análises ultraestruturais dos parasitas tratados revelaram que a mitocôndria 
foi uma das organelas mais afetadas, o que também pode estar relacionado a possíveis 
alterações na composição lipídica. Portanto, focamos em investigar alterações 
mitocondriais e suas consequências, especialmente em relação à morte do parasita. O 
A3K2A3 pode exercer sua atividade antileishmania afetando a função mitocondrial no 
parasita, conforme demonstrado por MET, uma diminuição no ΔΨm e um aumento na 
produção mitocondrial de ROS. 
Os elétrons se movem através da cadeia respiratória mitocondrial durante a fosforilação 
oxidativa, e um gradiente de prótons é estabelecido através da membrana mitocondrial 
interna como fonte de energia para o ATP. Uma diminuição na intensidade da 
fluorescência de Rh123 sugere um aumentona permeabilidade de prótons através da 
membrana mitocondrial interna, o que pode diminuir a síntese de ATP e resultar na morte 
do parasita [13, 32, 33], especialmente porque o parasita depende principalmente da 
fosforilação oxidativa para a produção de ATP [34]. A depleção dos níveis de ATP foi 
observada após o tratamento das promastigotas com A3K2A3. Para organismos com uma 
única mitocôndria, como a Leishmania, não há possibilidade de compensar as 
mitocôndrias lesadas. Portanto, a sobrevivência depende do funcionamento adequado de 
uma única organela [35]. 
Nossos resultados estão em concordância com um estudo anterior que relatou que os 
níveis de ATP diminuíam gradualmente após a perda do ΔΨm durante o tratamento com 
H2O2 [36]. O trifosfato de adenosina é uma molécula-chave para a condensação da 
cromatina, fragmentação e regulação nuclear e a manutenção da homeostase iônica 
durante a apoptose. Portanto, podemos presumir que os níveis de ATP foram gerados antes 
da perda do ΔΨm, e o ATP fornecido pela glicólise foi suficiente para realizar essas 
atividades celulares e propagar a morte celular programada nas células leishmaniais [37]. 
 
Também encontramos um aumento significativo na produção de ROS após o tratamento 
com A3K2A3 em promastigotas. A formação de ROS mitocondrial é essencial para vários 
processos de sinalização e está fortemente envolvida no processo degenerativo através de 
danos a macromoléculas, principalmente proteínas, lipídios e DNA [38–40]. 
Promastigotas tratadas com A3K2A3 apresentaram um aumento na relação de 
peroxidação lipídica. Estudos anteriores descobriram que a camptotecina induziu a 
formação de ROS dentro das células leishmaniais e também aumentou o nível de 
peroxidação lipídica [22]. 
Tanto em organismos multicelulares quanto unicelulares, as mitocôndrias servem como 
uma fonte celular importante de ROS, que são cruciais para a indução da apoptose. A 
produção de ROS durante a fase inicial da apoptose geralmente segue um desequilíbrio 
na homeostase redox celular [41]. De fato, estudos anteriores mostraram que o antimôn 
io exerce seu efeito antileishmania gerando ROS e esgotando tióis tanto em parasitas 
quanto em macrófagos [42–44]. O tratamento com A3K2A3 também induziu a 
externalização de fosfatidilserina, que foi visualizada pela coloração com anexina-V. A 
translocação da fosfatidilserina da membrana plasmática para a camada externa é uma 
alteração comum que ocorre durante a morte celular programada [45–47]. Além das 
alterações bioquímicas, a apoptose também causa alterações morfológicas [48]. Com base 
nisso, avaliamos a redução do tamanho celular (um sinal de morte apoptótica). Nossas 
observações de SEM revelaram inchaço e arredondamento geral das células tratadas com 
A3K2A3, o que também foi confirmado por citometria de fluxo. A integridade da 
membrana também foi avaliada, mas não foi significativamente alterada pelo tratamento 
com A3K2A3, refletida por uma baixa proporção de coloração com PI. Portanto, pudemos 
descartar a possibilidade de que a necrose fosse a principal via de morte celular. O 
processo apoptótico está associado a cascatas de sinalização que envolvem mitocôndrias 
(via intrínseca) ou receptores de morte (via extrínseca) [49]. A estimulação da via 
mitocondrial apoptótica intrínseca por ROS e danos ao DNA mitocondrial promove a 
permeabilização da membrana externa e a translocação de citocromo c, AIF (fator indutor 
de apoptose) e Smac/Diablo da mitocôndria para o citosol, desencadeando eventos de 
sinalização citosólica dependentes ou independentes de caspase [50]. 
Logo após a perda do ΔΨm, prótons são liberados no citosol a partir das mitocôndrias, o 
que contribui para a acidificação intracelular nas células leishmaniais, semelhante às 
células mamíferas [51]. Mudanças no pH modulam a responsividade apoptótica da célula 
e amplificam o programa apoptótico regulando a atividade de proteases semelhantes a 
caspase [35]. É bem conhecido que caspases (ou seja, uma família de cisteína proteases) 
estão envolvidas na orquestração da apoptose em metazoários. Homólogos de caspases 
conhecidos como metacaspases (MCAs em Trypanosoma e Leishmania) têm sido 
relatados desempenhando papéis distintos na Morte Celular Programada [52, 53]. O papel 
das MCAs é motivo de debate: funções no controle do ciclo celular, na morte celular ou 
até mesmo na sobrevivência celular foram sugeridas. Foi demonstrado, usando uma cepa 
deficiente em MCA de Leishmania major, que o MCA de L. major (LmjMCA) não apenas 
desempenhava um papel semelhante ao das caspases na morte celular, mas também na 
autofagia e isso por meio de diferentes domínios [54]. 
Na morte celular programada independente de caspase, o aumento do cálcio intracelular 
aumenta o cálcio mitocondrial e causa ainda mais despolarização da membrana 
mitocondrial, a geração de ROS e a ativação de endonucleases [55]. No presente estudo, 
observamos um aumento na atividade de proteases semelhantes a caspase-3/-7 em células 
após a exposição ao A3K2A3. O pré-tratamento com o inibidor de caspase-3 Ac-DEVD-
CHO diminuiu a atividade das proteases semelhantes a caspase-3/-7 nas células. A 
fragmentação de DNA oligonucleossômico representa um evento tardio dessa via de 
morte celular programada, levando à liberação passiva de DNA no citoplasma de células 
apoptóticas [56]. Isso também ocorreu em promastigotas tratadas com A3K2A3. Portanto, 
a fragmentação do DNA em promastigotas sugere fortemente que o efeito antileishmania 
é mediado por uma morte celular semelhante à apoptose. 
 
Conclusão 
 
Em conclusão, o presente estudo descobriu que o efeito antileishmania de A3K2A3 
parece ser consequência da indução de uma morte celular semelhante à apoptose, causada 
pelo aumento dos níveis de ROS dentro das células. Esse aumento provavelmente é 
responsável pelo colapso do potencial da membrana mitocondrial e pelo esgotamento dos 
níveis de ATP. O tratamento com A3K2A3 também desencadeou mudanças semelhantes 
à apoptose nas promastigotas de L. amazonensis, caracterizadas pela externalização de 
fosfatidilserina, redução do tamanho celular, ativação de caspases, indução de 
fragmentação do DNA e aumento do número de gotículas lipídicas no citoplasma. Este 
trabalho fornece algumas pistas sobre a via pela qual a Leishmania passa pela apoptose e 
pode abrir caminho para o desenvolvimento de compostos quimioterapêuticos contra a 
leishmaniose.