TCC Polyane Bertotto

Odontologia

•

FASB

Pietra Alcantara

29/11/2023

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
CURSO DE ODONTOLOGIA

Polyane Bertotto

Avaliação da interferência do método de esterilização do óxido de etileno nas
características físico-químicas e no comportamento biológico de microesferas de PLGA
com e sem sinvastatina encapsulada

Florianópolis
2020
Polyane Bertotto

Trabalho Conclusão do Curso de Graduação em
Odontologia do Centro de Ciências da Saúde da
Universidade Federal de Santa Catarina como requisito
para a obtenção do título de Cirurgiã-Dentista.
Orientador: Prof. Dr. Ricardo de Souza Magini
Coorientador: MSc.Raíssa Borges Curtarelli

Florianópolis
2020
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor,
através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária da UFSC.
Bertotto, Polyane
Avaliação da interferência do método de esterilização do
óxido de etileno nas características físico-químicas e no
comportamento biológico de microesferas de PLGA com e sem
sinvastatina encapsulada / Polyane Bertotto ; orientador,
Ricardo de Souza Magini, coorientadora, Raissa Borges
Curtarelli, 2020.
50 p.
Trabalho de Conclusão de Curso (graduação) -
Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências
da Saúde, Graduação em Odontologia, Florianópolis, 2020.
Inclui referências.
1. Odontologia. 2. Microesferas. 3. PLGA. 4.
Sinvastatina . 5. Óxido de etileno. I. Magini, Ricardo de
Souza. II. Curtarelli, Raissa Borges. III. Universidade
Federal de Santa Catarina. Graduação em Odontologia. IV.
Título.
Polyane Bertotto

Este Trabalho Conclusão de Curso foi julgado adequado para obtenção do Título de “Cirurgiã
Dentista” e aprovado em sua forma final pelo Curso de Odontologia

Florianópolis, 17 de Julho de 2020.

Prof. Dra. Glaucia Santos Zimmermann
Coordenadora do Curso

Banca Examinadora:

Prof. Dr. Ricardo de Souza Magini
Orientador
Instituição UFSC

Prof. Dr. César Augusto Magalhães Benfatti
Avaliador
Instituição UFSC

Prof. Dr. Águedo Aragones
Avaliador
Instituição UFSC

AGRADECIMENTOS

Agradeço em primeiro lugar a Deus, por me fortalecer e estar sempre comigo, guiando
minhas escolhas na realização deste sonho e de tantos outros que estão por vir.
Aos meus pais, Clarice e Vilmar, que apesar de todas as dificuldades nunca deixaram
de lutar pela minha educação. Agradeço por todo incentivo, confiança e por nunca me deixar
perder a fé. Vocês são o meu melhor exemplo de amor, cumplicidade e superação. Agradeço
por me agregar tantos princípios e por me permitir seguir os próprios passos. A vocês eu devo
a vida e todas as oportunidades que nela tive. A minha irmã, Franciane, agradeço por sempre
acreditar em mim, seu apoio foi fundamental para me dar força e coragem nessa caminhada.
Vocês são a minha base, a razão pela qual busco ser melhor a cada dia.
Ao meu namorado, Victor Lopes, por todo suporte emocional durante a realização
dessa pesquisa, por toda paciência, cuidado, compreensão e por trazer paz nos momentos em
que mais precisei.
A todas as amizades da graduação, em especial as que compartilhei meus sentimentos.
Agradeço por cada momento de apoio, conselho, risada, por cada almoço descontraído, por
cada ensinamento e por todo carinho. Agradeço a Luana Bernardes, minha parceira de
laboratório e que esteve ao meu lado durante toda realização dessa pesquisa, muito obrigada
por todo apoio, sua companhia e auxílio tornou tudo mais fácil. A minha dupla, obrigada por
todos os momentos na clínica e fora dela, por me compreender com um simples olhar e por ter
doado tanto de si para me ajudar. Como é bom cultivar amizades que tornam a vida mais leve!
Ao meu orientador, Prof. Dr. Ricardo de Souza Magini, agradeço por realizar um
sonho ao me inserir na pesquisa, por delegar a mim um trabalho com tamanha
interdisciplinaridade e por acreditar na minha capacidade muito mais do que eu mesma.
À Prof. Dra. Ariadne Cristiane Cabral da Cruz, por todo tempo dedicado a mim, pelo
seu carinho, paciência e todo auxílio fornecido durante essa pesquisa. O seu amor pela docência
e pela pesquisa torna-se evidente pela sua forma encantadora de compartilhar conhecimentos.
À minha coorientadora e doutoranda Raíssa Borges Curtarelli, por nunca medir
esforços para me ajudar, ser sempre tão gentil ao compartilhar seus conhecimentos e por buscar
sempre a melhor forma de sanar minhas dúvidas nem que isso levasse a repetidas explicações.
A sua tranquilidade e capacidade de ajudar sem olhar a quem é admirável. Obrigada por ser a
minha luz durante essa pesquisa, tenho certeza que seguirá iluminando muitas outras vidas.
A todos os professores do curso, que trilham sua caminhada na docência com
estusiasmo e nos transmitem sempre muita força e coragem para enfrentar as dificuldades.
Obrigada por compartilhar suas experiências, seus conhecimentos e seu tempo com tanta
excelência. Por oferecer sempre a melhor condição de ensino apesar das adversidades. Obrigada

por despertar meu senso crítico, minha autoconfiança e me fazer ver o mundo por diferentes
perspectivas. Todo crescimento pessoal e profissional que conquistei ao longo desses 5 anos eu
devo a vocês.
A Universidade Federal de Santa Catarina, por me receber de braços abertos, ser minha
segunda casa durante esses 5 anos, por me conceder os recursos e a estrutura necessária para
realização dessa pesquisa e por me tornar uma profissional com tantos valores. Serei
eternamente grata!
Aos meus pacientes, por permitir e confiar em mim durante os atendimentos
possibilitando não só o meu desenvolvimento técnico profissional, como também a capacidade
de compreender, cuidar e orientar cada um na sua particularidade.
Aos servidores da universidade, por toda dedicação, cuidado e apreço pela instituição,
professores e alunos.

RESUMO

Para a aplicação de microesferas (MPS) de ácido polilático co-glicólico (PLGA) incorporando
sinvastatina (SIN) em estratégias de reparação óssea in vivo e estudos clínicos, é necessário que
se estabeleça um método de esterilização eficaz que permita a manutenção das características
do biomaterial. Assim, o objetivo deste estudo foi produzir MPS de PLGA com e sem a
incorporação de SIN a 2%, e avaliar as interferências da esterilização por óxido de etileno (OE)
nas características físico-químicas e biológicas do biomaterial. As MPS foram sintetizadas pelo
método de emulsão de óleo em água (O/A) e evaporação do solvente, utilizando duas soluções
de PLGA (82L:18G), com e sem a adição de SIN na proporção de 2% (PLGA+2%SIN) entre
fármaco e polímero (m/m). Parte das amostras foi submetida a esterilização por OE (grupo
esterilizado) a 55ºC durante 180min e a outra parte permaneceu sem esterilização (grupo não-
esterilizado). A morfologia das MPS foi analisada por microscopia eletrônica de varredura
(MEV) o seu tamanho médio foi mensurado por ImageJ. A caracterização química foi realizada
por espectroscopia por energia dispersiva (EDS) e espectroscopia no infravermelho com
transformada de Fourier (FTIR). A fase do material foi determinada por difração de raio X
(DRX) e o comportamento biológico foi avaliado por meio do teste colorimétrico MTT em 1 e
7 dias.A análise estatística foi realizada com os dados da mensuração das MPS utilizando o
teste t de student (p<0,05). Para os dados do comportamento biológico foi aplicado o teste
ANOVA one-way seguido do pós-teste de Tukey (p <0,05). As imagens obtidas por MEV
revelaram MPS com formato esférico e livre de porosidades, o tamanho e a forma não foram
alterados pela incorporação da SIN ou pela esterilização. A análise da composição química
demonstrou aumento do elemento químico carbono e variação na transmitância associado a
possível presença de resíduo proveniente da esterilização. O FTIR também certificou a
incorporação da SIN ao PLGA. O material manteve sua natureza amorfa após a esterilização.
As amostra esterilizadas e não esterilizadas não foram citotóxicas em ambos os tempos
experimentais. O método de emulsão e evaporação do solvente foi satisfatório na obtenção das
características físicas das MPS. A esterilização por OE causou pequenas alterações químicas
sem comprometer as características físicas e biológicas das MPS.

Palavras-chave: Microesferas 1. PLGA 2. Sinvastatina 3. Óxido de Etileno 4.

ABSTRACT

For the application of microspheres (MPS) of polylactic co-glycolic acid (PLGA) incorporating
simvastatin (SIN) in bone regeneration strategies in vivo and clinical studies, it is necessary to
establish an effective sterilization method that allows the maintenance of the characteristics of
biomaterial. Thus, the objective of this study was to produce MPS of PLGA with and without
the incorporation of 2% SIN, and to evaluate the interferences of ethylene oxide (OE)
sterilization in the physical-chemical and biological characteristics of the biomaterial. The MPS
were synthesized by the oil-in-water (O/W) emulsion method and solvent evaporation, using
two PLGA solutions (82L: 18G), with and without the addition of SIN in the proportion of 2%
(PLGA + 2% SIN) between drug and polymer (m/m). Part of the samples was submitted to
sterilization by OE (sterilized group) at 55ºC for 180min and the other part remained without
sterilization (non-sterilized group). The morphology of the MPS was analyzed by scanning
electron microscopy (SEM) and their average size was measured by ImageJ. Chemical
characterization was performed by energy dispersive spectroscopy (EDS) and Fourier
transform infrared spectroscopy (FTIR). The phase of the material was determined by X-ray
diffraction (XRD) and the biological behavior was evaluated using the MTT colorimetric test
in 1 and 7 days. A statistical analysis was performed with the MPS measurement data using
Student’s T-distribution (p <0.05). For the biological behavior data, the one-way ANOVA test
was applied followed by the Tukey’s post-test (p <0.05). The images obtained by SEM revealed
MPS with spherical shape and free of porosities, the size and shape were not altered by the
incorporation of the SIN or by sterilization. The analysis of the chemical composition showed
an increase in the chemical element carbon and variation in transmittance associated with the
possible presence of waste from sterilization. The FTIR also certified the incorporation of SIN
into the PLGA. The material maintained its amorphous nature after sterilization. The sterilized
and non-sterile samples were not cytotoxic in both experimental times. The solvent emulsion
and evaporation method was satisfactory in obtaining the physical characteristics of the MPS.
Sterilization by OE caused minor chemical changes without compromising the physical and
biological characteristics of the MPS.

Keywords: Microspheres 1. PLGA 2. Simvastatin 3. Ethylene Oxide 4.

LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fórmula química do PLGA .................................................................................. 15
Figura 2 - MEV de MPS de PLGA esterilizadas e não esterilizadas ...................................... 27
Figura 3 - MEV de MPS de PLGA+2%SIN esterilizadas e não esterilizadas ........................ 28
Figura 4 - Área de MPS de PLGA e PLGA+2%SIN esterilizadas e não esterilizadas ............ 29
Figura 5 - EDS de MPS de PLGA e PLGA+2%SIN esterilizadas e não esterilizadas ............ 30
Figura 6 - FTIR de MPS de PLGA esterilizadas e não esterilizadas ...................................... 31
Figura 7 - FTIR de MPS de PLGA+2%SIN esterilizadas e não esterilizadas. ......................... 32
Figura 8 - DRX das MPS de PLGA esterilizadas e não esterilizadas ..................................... 33
Figura 9 - DRX de MPS de PLGA+2%SIN esterilizadas e não esterilizadas ......................... 33
Figura 10 - Viabilidade celular de HGF à MPS de PLGA esterilizadas e não esterilizadas 34
Figura 11 - Viabilidade celular de HGF à MPS PLGA+2%SIN esterilizadas e não esterilizadas
.................................................................................................................................. ................ 35
Figura 12 - Viabilidade celular de SHED à MPS de PLGA esterilizadas e não esterilizadas . 35
Figura 13 - Viabilidade celular de SHED à MPS de PLGA+2%SIN esterilizadas e não
esterilizadas ......................................................................................................................... 36

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

DMSO Dimetilsulfóxido
DRX Difração de Raio X
EDS Espectroscopia por Energia Dispersiva, do inglês Energy Dispersive Spectroscopy
OE Óxido de etileno
FDA Administração de alimentos e medicamentos, do inglês Food and Drug Administration
FTIR Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier, do inglês Fourier
Transform Infrared
g Grama
HGF Fibroblastos gengivais humanos, do inglês Human Gingival Fibroblasts
h Hora
L Litro
m/m Relação massa/massa
m/v Relação massa/volume
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura
mg Miligrama
MPS Microesferas
PBS Tampão salino-fosfato, do inglês Phosphate-Buffered Saline
PLA Ácido polilático
PLGA Ácido polilático-co-glicólico
PGA Ácido poliglicólico
PVA Álcool polivinílico
SFB Soro Fetal Bovino
SHED Células-tronco da polpa de dentes decíduos, do inglês Stem cells from Human
Exfoliated Deciduous teeth
SIN Sinvastatina
µ Micro

SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 11
2 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................ 13
2.1 TECIDO ÓSSEO................................................................................................... 13
2.2 BIOMATERIAIS................................................................................................... 14
2.3 PLGA..................................................................................................................... 15
2.4 SINVASTATINA.................................................................................................. 16
2.5 ESTERILIZAÇÃO................................................................................................ 17
2.6 ÓXIDO DE ETILENO.......................................................................................... 18
3 OBJETIVOS .................................................................................................... 21
3.1 OBJETIVO GERAL .......................................................................................... 21
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................. 21
4 METODOLOGIA ............................................................................................ 22
4.1 SÍNTESE DAS MICROESFERAS .................................................................... 22
4.2 ESTERILIZAÇÃO DAS MICROESFERAS ..................................................... 23
4.3 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA ........................................................ 23
4.3.1 Microscopia Eletrônica de Varredura(MEV) ................................................ 23
4.3.2 Mensuração das microesferas ......................................................................... 23
4.3.3 Espectroscopia por energia dispersiva (EDS) ................................................. 23
4.3.4 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) .... 24
4.3.5 Difração de Raios X (DRX) ............................................................................. 24
4.4 COMPORTAMENTO BIOLÓGICO ................................................................. 24
4.4.1 Citotoxicidade .................................................................................................. 24
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................ 25
5 RESULTADOS ................................................................................................ 26
5.1 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA ........................................................ 26
5.1.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ................................................ 26
5.1.2 Mensuração das microesferas ......................................................................... 26
5.1.3 Espectroscopia por energia dispersiva (EDS) ................................................. 29

5.1.4 Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR)....... 30
5.1.5 Difração de raio X (DRX) ................................................................................ 32
5.2 COMPORTAMENTO BIOLÓGICO ................................................................. 34
5.2.1 Citotoxicidade .................................................................................................. 34
6 DISCUSSÃO .................................................................................................... 37
7 CONCLUSÃO.................................................................................................. 41
8 REFERÊNCIAS............................................................................................... 42
11

1 INTRODUÇÃO

A remodelação progressiva do tecido ósseo alveolar e o consequente
comprometimento estético-funcional decorrente de perdas dentárias, doenças degenerativas e
traumatismos, tem incentivado a busca por biomateriais capazes de permitir a reparação óssea
(LEKOVIC et al., 1998; SCHROPP et al., 2003). Atualmente, os biomateriais utilizados para
a recuperação do volume ósseo podem ser classificados conforme sua origem em: autólogos,
homólogos, xenógenos ou sintéticos. Entre esses, a única opção que conta com as três
características ideais para promover o reparo - osteoindução, osteocondução e osteogênese - é
o osso autólogo. Contudo, além de apresentar disponibilidade limitada, a necessidade de um
sítio doador confere maior morbidade ao procedimento (FARDIN et al., 2010; CIAPETTI;
GRANCHI; BALDINI, 2012). Os substitutos de enxertos sintéticos permitem o controle total
da produção gerando maior disponibilidade e alta versatilidade de aplicação. São cada vez
mais a principal e mais segura escolha para reparação óssea (BUSER, 2010, SHEGARFI;
REIKERAS, 2009).
O copolímero ácido polilático-co-glicólico (PLGA, do inglês Poly(Lactic-co-Glycolic)
Acid) é um material sintético, biocompatível e atóxico. Sofre degradação por hidrólise,
resultando em ácido lático e ácido glicólico, subprodutos naturais do organismo eliminados na
forma de dióxido de carbono (CO2) e água (H2O) (ATHANASIOU, NIEDERAUER,
AGRAWAL, 1996; BAO et al., 2010). Devido a essas características e a possibilidade de
controle sobre a sua taxa de degradação, a utilização do PLGA em aplicações clínicas têm
crescido nos últimos anos como dispositivo para liberação controlada de medicamentos
(MOTTA e DUEK, 2006). Suas excelentes propriedades físicas e mecânicas facilitam a adesão
e proliferação celular, demonstrando bom potencial osteocondutor (MOTTA e DUEK, 2006).
Microesferas (MPS, do inglês Microspheres) de PLGA podem encapsular e liberar localmente
medicamentos hidrofóbicos ou hidrofílicos por semanas ou meses. Essa possibilidade de
incorporação de fármacos mostra-se como uma possibilidade de associar o polímero a fatores
indutores da osteogênese, tornando-o, dessa forma, osteoindutor (MAKADIA; SIEGEL, 2011;
QI et al., 2018).
As proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs do inglês, Bone morphogenetic proteins)
participam ativamente no reparo do tecido ósseo regulando os fatores necessários para
diferenciação de osteoblastos. Entretanto, apresentam dificuldade de controle de atuação e custo
12

elevado (SUGIYAMA et al., 2005; CASAGRANDE et al., 2011). Estudos foram realizados a
fim de revelar um composto estável indutor da BMP para utilização no reparo ósseo. A
sinvastatina (SIN), medicamento amplamente utilizado no controle da hipercolesterolemia
sistêmica, demonstrou aumentar a expressão BMP-2 em células indiferenciadas e favorecer a
formação óssea em animais (MUNDY et al., 1999). Além disso, estudos in vitro mostraram que
a SIN inibe a reabsorção óssea e tem efeito pró-angiogênico, estimulando a formação de vasos
sanguíneos (GRASSER et al., 2003; YAMASHITA et al., 2010; MAEDA; KAWANE;
HORIUCHI, 2003). A associação de MPS de PLGA com SIN encapsulada para aplicação local
demonstrou melhorar a formação óssea em defeitos de tamanho crítico com diferentes modelos
de animais (NAITO et al., 2014; TERUKINA et al., 2016; FERREIRA et al., 2014). Apesar
dos resultados promissores, a utilização deste biomaterial em pacientes é inviável até que um
meio de esterilização adequado seja encontrado.
Os polímeros são sensíveis ao calor e a umidade, por essa razão, torna-se um desafio
encontrar um método de esterilização que não altere as propriedades físico-químicas do material
e tampouco cause inativação da SIN (ATHANASIOU, NIEDERAUER, AGRAWAL, 1996).
A esterilização pode ocorrer por meios físicos através do calor seco em estufas, do calor úmido
mediante alta temperatura e pressão como a autoclavação, ou por meio de radiação gama, que
atua em baixa temperatura mas apresenta um alto custo. Os meios físico-químicos são
amplamente utilizados em ambiente hospitalar para esterilização de materiais sensíveis à altas
temperaturas (RUTALA, GERGEN, WEBER 1998; ALFA et al., 1996). O OE é um gás incolor
a temperatura ambiente que inativa as proteínas nucleares dos microrganismos impedindo sua
reprodução. Opera em uma baixa faixa de temperatura (30-60ºC), quando comparado a
esterilização por autoclavação, mas necessita do aumento da umidade relativa para elevar seu
poder esterilizante (LEROUGE, SIMMONS, 2012). Posto isso, propõe-se nesse estudo
identificar as possíveis alterações promovidas pela esterilização por OE em MPS de PLGA
associadas a SIN, a fim de viabilizar sua utilização como biomaterial na aplicação clínica.
13

2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 TECIDO ÓSSEO
O tecido ósseo é um tipo especializado de tecido conjuntivo que constitui a principal
estrutura de sustentação do organismo. Sua formação e manutenção depende essencialmente de
4 tipos celulares. As células osteoprogenitoras (1) diferenciam-se em osteoblastos perante a
influência do grupo de proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs) e do fator de crescimento de
transformação β (TGF-β). Os osteoblastos (2), por sua vez, sintetizam a porção orgânica da
matriz óssea e participam da sua mineralização. De acordo com a velocidade de deposição da
matriz, alguns osteoblastos acabam aprisionados em lacunas em meio a matriz extracelular
mineralizada e passam a denominar-se osteócitos (3). Por fim, os osteoclastos (4), células
gigantes multinucleadas que promovem a reabsorção óssea e a liberação de cálcio no organismo
(JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2003; GENESER, 2003; GARTNER & HIATT, 2007). Devido
a estas características, o tecido ósseo apresenta um importante potencial reparativofrente a
destruição tecidual. Entretanto, sua capacidade torna-se limitada quando determinadas
condições não são respeitadas. Falhas no suprimento vascular, instabilidade mecânica e defeitos
excessivos são exemplos de fatores que podem impedir o reparo (BUSER, 2010).
Na cavidade oral, o tecido ósseo que circunda os dentes é chamado de processo
alveolar (SCHROEDER, 1986). Seu aporte nutritivo provém do periósteo e do ligamento
periodontal, ambos tecidos conjuntivos ricamente inervados e vascularizados, responsáveis
pelo revestimento externo do osso e pela distribuição e amortecimento de forças que incidem
sobre o elemento dental, respectivamente (ALLEN, HOCK & BURR, 2004). Estudos clínicos
e radiográficos demonstraram que ocorrem alterações dimensionais consideráveis no osso
alveolar em decorrência da perda dental, seja ela simples ou de múltiplos elementos
(PIETROKOVSKI; MASSLER, 1967; LEKOVIC et al., 1998). Um dos importantes
fatores para tal remodelação óssea é a ausência do suporte nutritivo do ligamento periodontal
após extração (BUSER, 2010). Um estudo clínico e radiográfico realizado por Schropp et al.
(2003) avaliou a remodelação óssea após a extração de um único elemento dental. Os resultados
mostraram que a maior parte da perda dimensional em altura e cerca de dois terços da redução
em espessura ocorrem logo nos primeiros 3 meses de acompanhamento e que, após 1 ano,
ocorre uma redução de 50% na dimensão vestíbulo-lingual. O mesmo resultado foi encontrado
por uma revisão sistemática realizada por Tan et al. (2011), a maior remodelação da crista
óssea ocorre nos primeiros 3 a 6 meses pós extração simples ou múltipla; sendo a perda óssea
horizontal (29-63%) mais expressiva que a vertical (11-22%). Se nada for feito para
14

compensar a inevitável remodelação óssea, o indivíduo poderá sofrer com prejuízos estéticos e
funcionais (CHIAPASCO et al., 2009).
2.2 BIOMATERIAIS
A busca por biomateriais que viabilizem a recuperação da estrutura e função do tecido
ósseo perdido tem estimulado pesquisas na área da engenharia tecidual. O substituto ósseo ideal
deve dispor de 3 características essenciais para a regeneração óssea: (1) osteoblastos viáveis
capazes de iniciar o processo de deposição da matriz óssea (osteogênese); (2) servir como
arcabouço, permitindo a adesão e migração dessas células tal como das presentes no sítio
receptor (osteocondução); (3) ser carreador de fatores de crescimento capazes de promover a
diferenciação de células osteoprogenitoras em células produtoras de matriz óssea
(osteoindução). O osso autólogo é o único que apresenta todas essas características, entretanto
sua quantidade limitada e a morbidade causada pela intervenção cirúrgica no sítio doador
incentiva o desenvolvimento de pesquisas acerca de biomateriais aloplásticos, ou também
chamados sintéticos (BUSER, 2010; CIAPETTI; GRANCHI; BALDINI, 2012; FARDIN et al.,
2010).
O biomaterial de escolha para reconstrução óssea não pode apresentar características
prejudiciais, ou seja, não deve induzir reações adversas no organismo receptor. Substitutos
ósseos aloplásticos devido à sua natureza sintética, não oferecem, por exemplo, risco de
transmissão de doenças cruzadas (KIM; RODRIGUEZ; NOWZARI, 2016). A versatilidade
dessa classe de biomateriais é uma importante vantagem sobre as demais devido à
possibilidade de definir sua morfologia, controlar sua composição química visando alcançar
um equilíbrio em sua taxa de reabsorção e, ainda, associar efeito osteoindutor por meio da
adição de substâncias em um sistema de liberação controlado. Sendo assim, torna-se possível
beneficiar tanto a neoformação óssea quanto a estabilidade dimensional da região enxertada.
Entre os biomateriais aloplásticos estão o fosfato de cálcio, os vidros bioativos e os polímeros.
Os fosfatos mais utilizados são a hidroxiapatita (HA) e o β-tricálcio fosfato (TCP), ambos
podem ser associados em variadas proporções conforme a necessidade de prevalência de suas
propriedades individuais. Os biovidros são a base de sílica e são conhecidos por sua
biocompatibilidade (BUSER, 2010). Entre os polímeros estudados, o PLGA vem sendo
utilizado na área médica desde a década de 70 como material reabsorvível para suturas
cirúrgicas. Atualmente, têm demonstrado boa aplicabilidade clínica tanto na forma de
membranas para regeneração óssea guiada quanto dispositivos para liberação de fármacos
(MOTTA & DUEK, 2006; MAKADIA; SIEGEL, 2011; SILVA et al., 2015).
15

2.3 PLGA
O PLGA (Figura 1) é um copolímero sintético e reabsorvível, formado a partir da
combinação em proporções variáveis de dois polímeros, o ácido poliglicólico (PGA) e o ácido
polilático (PLA), unidos por ligações éster. A hidrólise dessas ligações gera subprodutos que
são completamente eliminados do organismo através do ciclo de Krebs na forma de dióxido de
carbono (CO2) e água (H2O). Além disso, o PLGA apresenta boa afinidade com fármacos,
propriedades físico-químicas adequadas e baixa imunogenicidade. É facilmente fabricado em
várias formas e tamanhos e pode encapsular moléculas de praticamente qualquer tamanho.
Sendo amplamente utilizado como dispositivo para liberação controlada de fármacos,
principalmente no formato de MPS (BAO et al., 2010; MAKADIA; SIEGEL, 2011).

Figura 1 - Fórmula química do PLGA
Fonte: Sigma Aldrich (2020)

Os polímeros com maior conteúdo de PGA são mais hidrofílicos e, portanto,
apresentam menor tempo de degradação; em contrapartida, polímeros com maior quantidade
de PLA são mais hidrofóbicos, devido aos grupos laterais metila, absorvendo menos água e
degradando mais lentamente. A possibilidade de criar diferentes formas do polímero variando
as proporções de PLA e PGA proporciona grande vantagem e autonomia quanto ao seu tempo
de degradação. (FREIBERG; ZHU, 2004; MAKADIA; SIEGEL, 2011). Outros fatores
controláveis como o peso molecular, composição, porosidade e tamanho da partícula permitem
alcançar o perfil de liberação desejado do medicamento incorporado (FREIBERG; ZHU, 2004;
SILVA, et al., 2015; QI et al., 2018). Na área médica regenerativa, as MPS de PLGA
apresentam papel osteocondutor, servindo como uma ampla matriz de suporte para aderência e
proliferação celular, contudo, não apresenta bioatividade intrínseca para osteoindução. Sendo
assim, torna-se necessário associar ao PLGA substâncias indutoras da reparação óssea que serão
liberadas no local alvo à medida que o copolímero é degradado pelo organismo (LANSMAN
et al., 2006; BAO et al., 2010; MAKADIA; SIEGEL, 2011; NATH et al., 2013).
16

2.4 SINVASTATINA
O grupo das estatinas têm sido objeto de diversos estudos como alternativa
osteoindutora. São normalmente utilizadas no tratamento da hipercolesterolemia, seu
mecanismo de ação consiste em inibir a 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A redutase (HMG-
CoA), bloqueando a conversão do HMG-CoA em mevalonato e impedindo, assim, a síntese do
colesterol hepático (ZHANG; DRICU; SJÖVALL, 1997). Todavia, o efeito das estatinas não
se limita apenas ao controle lipídico. Mundy et al. (1999), foi o primeiro a descrever a atuação
da SIN sobre o tecido ósseo; seu estudo in vitro mostrou que células ósseas expostas às estatinas
aumentaram a expressão de proteína morfogenética óssea 2 (BMP-2). Foi observado ainda, um
aumento da neoformação óssea de duas a três vezes quando a calvária de camundongos foi
colocada em cultura por explante e exposta às estatinas, além de um número elevado de células
osteoblásticas em todos os estágios de diferenciação. In vivo, Mundy et al. (1999) observou um
aumento de 50% na neoformação óssea após injeção subcutânea três vezes ao dia durante cinco
dias na calota craniana de roedores. Estudos subsequentes demonstraram o aumento da
expressão de mRNA para a expressão de BMP-2 e relataram o aumento da expressão de
fosfatase alcalina, sialoproteínaóssea, osteocalcina e colágeno tipo I em osteoblastos
indiferenciados (SONG et al., 2003; MAEDA et al., 2004; BAEK et al., 2005). A SIN também
apresenta efeito angiogênico por meio da expressão do fator de crescimento endotelial vascular,
(MAEDA; KAWANE; HORIUCHI, 2003), efeito antiinflamatório pela diminuição da
produção de interleucina-6 e interleucina-8 (SAKODA, 2006), além de suprimir a atividade
osteoclástica (GRASSER et al., 2003; YAMASHITA et al., 2010).
A forma usual de administração da SIN por via oral sofre metabolismo de primeira
passagem e menos de 5% alcança a circulação sistêmica. Desse modo, não é capaz de promover
a neoformação óssea em locais específicos. A necessidade de maior disponibilidade
aumentando a dose oral pode levar a quadros de lesão hepática e insuficiência renal
(BROWN, 2008; PARK J.B, 2009; TAN et al., 2015). Estudos foram realizados preconizando
a injeção subcutânea para evitar a degradação hepática e atingir concentrações terapêuticas
locais. Anbinder et al. (2006) administrou SIN por via subcutânea e não observou melhora no
reparo ósseo de defeitos tibiais experimentais em ratos. Rutledge et al. (2011) relatou baixo
efeito da SIN sobre a formação óssea quando injetada localmente no osso maxilar de cães.
Outros estudos utilizando modelos de animais verificaram aumentos significativos da
formação óssea durante o período de aplicação subcutânea, mas o efeito cessou quando as
injeções foram encerradas. A rápida difusão do fármaco pelos tecidos exige repetidas
17

aplicações para manter a concentração terapêutica local, tornando este meio de administração
inviável. (AYUKAWA et al., 2009; YANG et al., 2013).
Dessa forma, faz-se necessário encontrar um transportador capaz de liberar a SIN de
forma lenta e contínua no local de aplicação sem provocar resposta de corpo estranho. O uso
do PLGA já foi aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) em vários sistemas de
distribuição e está disponível no mercado com pesos moleculares diferentes (BUSER, 2010).
A síntese de MPS de PLGA destinada a administração de drogas é normalmente preparada pelo
método de emulsão de óleo em água e evaporação do solvente. O copolímero permite
encapsular drogas insolúveis em água, como a SIN. Estudos utilizando essa técnica já
demonstraram alta eficácia de encapsulamento e lenta liberação da SIN no local de aplicação
(NAITO et al., 2014; MASAELI et al., 2016; TERUKINA et al., 2016).
Considerando que a altura e largura da crista alveolar diminuem após a extração
dentária, Wu et al. (2008) utilizou o PLGA associado a SIN em alvéolos pós extração de
incisivos inferiores em 30 roedores. Os resultados mostraram que o material manteve a altura
da crista do rebordo residual e ainda promoveu neoformação óssea. Ferreira et al. (2014) criou
defeitos ósseos de tamanho crítico (5mm de diâmetro) na calota craniana de roedores e
preencheu com MPS de PLGA com 2,5% de SIN encapsulada. Após 60 dias do tratamento, os
defeitos que receberam as MPS com SIN encontravam-se praticamente totalmente reparados, a
matriz óssea mostrou-se mais organizada e madura quando comparada ao grupo que
permaneceu apenas com o coágulo. Uma avaliação ultraestrutural revelou íntima interação de
células com o biomaterial. Naito et al. (2014) incorporou MPS de PLGA com SIN encapsulada
a um cimento ósseo sintético e obteve liberação controlada por um mês, induzindo a formação
óssea em defeitos de tamanho crítico na calvária de coelhos. Terukina et al. (2016) criou
defeitos ósseos de tamanho crítico na calvária de roedores e preencheu o lado direito do defeito
com MPS de PLGA/SIN e o lado esquerdo com nanoesferas de PLGA/SIN. Os resultados
mostraram que as nanoesferas liberaram SIN por 5 dias, enquanto que as MPS obtiveram uma
liberação sustentada por 4 semanas e induziram a proliferação de células pré osteoblásticas.
2.5 ESTERILIZAÇÃO
Em virtude aos promissores resultados in vitro e in vivo obtidos com arcabouços de
PLGA associados à SIN para reparação óssea e frente à dificuldade de manter o ambiente
asséptico durante todas as etapas de confecção, faz-se necessário encontrar um método de
esterilização que não interfira nas propriedades físico-químicas e biológicas desse biomaterial.
Os diversos métodos de esterilização disponíveis podem ser divididos de acordo com a sua
natureza em métodos físicos, químicos e físico-químicos. Os meios físicos abrangem o calor
18

seco, o vapor saturado sob pressão e a radiação. Tanto o calor seco das estufas quanto o calor
úmido das autoclaves necessitam de temperaturas acima de 120ºC para exercer seu poder
esterilizante. Entretanto, devido à baixa temperatura de transição vítrea (54 - 60º) do PLGA
(82:18), métodos que utilizam altas temperaturas tornam-se inviáveis por favorecer a
degradabilidade e instabilidade do copolímero (ATHANASIOU, NIEDERAUER,
AGRAWAL, 1996; RUTALA, WEBER, 2008; QI et al., 2018). A radiação do tipo Gama
apresenta boa capacidade de penetração nos produtos e não necessita do aumento da
temperatura para desempenhar seu poder esterilizante. Contudo, este método apresenta alto
custo e pode afetar o desempenho do biomaterial dependendo da composição do polímero e
substância associada (MONTANARI et al., 1998). Os meios químicos atuam a partir da imersão
do material em soluções como o glutaraldeído, todavia, a degradabilidade do PLGA em meio
aquoso inviabiliza a utilização desse método. Os meios físico-químicos utilizam elementos
como o gás de OE e o vapor de formaldeído como agente esterilizante. Atuam em uma baixa
faixa de temperatura tornando-se uma opção viável para esterilização de produtos
termossensíveis (RUTALA, GERGEN, WEBER 1998; RUTALA, WEBER, 2008).
2.6 ÓXIDO DE ETILENO
O OE (C2H4O) é um gás à temperatura ambiente, que promove a alquilação das
proteínas nucleares de células microbianas. As principais vantagens desse método de
esterilização é a sua ação esporicida em temperaturas relativamente baixas e o seu alto poder
de penetração devido ao pequeno tamanho das suas moléculas (RUTALA, GERGEN, WEBER
1998; RIES, WEAVER, BEALS, 1996; ALFA et al., 1996). Dispositivos sensíveis ao calor, à
umidade ou a radiação podem ser submetidos ao OE sem sofrer deformação ou ter sua
degradação acelerada. Materiais médico-hospitalares, materiais poliméricos, plástico
termolábil e biomateriais utilizam o OE como esterilizante de escolha. (ATHANASIOU,
NIEDERAUER, AGRAWAL, 1996; LEROUGE, SIMMONS, 2012). O método apresenta boa
flexibilidade do processo, permitindo ajuste dos seus parâmetros de acordo com a sensibilidade
do material. Atua em uma baixa faixa de temperatura (30-60ºC) quando comparado à
esterilização por calor ou vapor seco e ainda, conta com alto poder de difusão e eficácia
comprovada (RUTALA e WEBER, 1999; SORDELLINI, SATTER, CAPUTO, 1998).
Entretanto, o OE é extremamente tóxico, inflamável, irritante para a superfície
corpórea e explosivo na presença de oxigênio. Para amenizar os riscos, gases inertes como o
dióxido de carbono (CO2) podem ser associados ao OE sem comprometer sua eficácia.
(LAMBERT; MENDELSON; CRAVEN, 2011). O OE apresenta ponto de ebulição de 10,7°C
e temperatura crítica em torno de 196°C. Durante o processo de esterilização, pode sofrer reação
19

química com outras substâncias e originar subprodutos tóxicos que, por sua vez, podem ser
absorvidos pelo produto que está sendo esterilizado e vir a comprometer a saúde de quem for
manuseá-lo ou recebê-lo. Quando em contato com a água, por exemplo, origina o etilenoglicol
e na presença de íons cloreto produz etilenocloridrina como subproduto. Por esse motivo, é
extremamente importante que após o processo de esterilização os produtos sejam submetidos a
aeração mecânica e ambiental para eliminação dos resíduos tóxicos do OE e seus subprodutos
(MENDES, BRANDÃO, SILVA, 2007).
Os produtos a serem esterilizadosdevem ser acondicionados em embalagens
apropriadas que permitam a entrada e saída de OE e umidade. O equipamento esterilizador
utilizado no processo é composto por uma câmara de esterilização, aquecedor, bomba de vácuo,
lavador de gases e comando eletrônico. O processo é automático e inicia com uma parada pré-
programada para uniformizar a umidade interna e a temperatura do produto. A umidade relativa
de 20% a 80% é de extrema importância pois facilita a penetração do gás nas embalagens,
aumentando o seu poder esterilizante. O processo segue com a injeção de nitrogênio para
inertização da carga. Em seguida, realiza-se o vácuo para retirada de bolsas de ar dos produtos
e elevação da pressão para injeção do OE. A concentração de gás recomendada para
esterilização é de 500 a 1200mg/L, o tempo de exposição ao gás pode levar de 4 a 6 horas
dependendo do tipo, densidade e volume do material. Após a esterilização, a bomba de vácuo
é acionada para retirada do OE. Uma nova etapa de vácuo é realizada para certificar a retirada
de bolsas de gás dos produtos. A partir disso, é injetado nitrogênio no interior da câmara e
realizado outro ciclo de vácuo. Esse processo visa retirar o excesso do OE com segurança,
evitando seu contato com o oxigênio presente no ar. Inicia-se então a aeração mecânica no
interior da câmara, pulsos de ar filtrado são injetados para realizar a hiperventilação dos
produtos. Os produtos, então, seguem para uma sala de aeração ambiental onde permanecem
expostos a circulação de ar até que os que os resíduos tóxicos do gás alcancem níveis seguros
de manuseio da equipe e utilização em pacientes. (ANGERER, BADER, KRAMER, 1998;
RUTALA e WEBER, 1999; LEROUGE, SIMMONS, 2012).
Holy et al. (2000) verificou que após a esterilização por OE, arcabouços de PLGA
(75:25) sofreram uma redução de 50% do seu volume inicial, sem apresentar alteração no peso
molecular. Choi et al. (2001) observou uma alteração na cristalinidade de MPS de poli(L-ácido
láctico) (PLLA) após a esterilização por OE, levando a uma agregação excessiva que
impossibilitaria a aplicação clínica. Apesar disso, não houve alteração de peso molecular. O
mesmo foi relatado por Kohane et al. (2006) em um estudo piloto, onde a esterilização por OE
20

resultou na agregação das MPS de PLGA em grandes massas, o que, posteriormente, pode ser
evitado centrifugando-as em 0,25% (m:m) de sacarose e, em seguida, liofilizando-as. Para
Moioli et al., (2006) a esterilização por OE provocou mínimas alterações morfológicas nas MPS
de PLGA (50:50) e não alterou a cinética de liberação do fator básico de crescimento de
fibroblastos, sugerindo que o OE tem se mostrado a melhor escolha para esterilizar MPS de
PLGA associada a fatores de crescimento.
Jeong et al. (2003) sintetizou MPS de PLGA com ácido retinóico encapsulado e
concluiu que a esterilização por OE a 37º C não afetou significativamente sua morfologia e taxa
de liberação do fármaco. Dormer et al. (2013) verificou que a exposição de MPS de PLGA
(50:50) ao OE não alterou a temperatura de transição vítrea (Tg) do polímero nem a quantidade
de proteína liberada a partir das MPS. Entretanto, ao estudar a influência do método na liberação
de vancomicina em compósitos de PLGA, Hsiao et al. (2012) verificou que a quantidade total
de antibiótico liberado foi menor quando comparada aos compósitos não esterilizados,
sugerindo que o antibiótico pode ter sofrido desativação durante o processo com OE.
Tendo em vista que ainda não há um consenso sobre o uso do OE para esterilização de
produtos farmacêuticos associados ao PLGA e frente aos resultados promissores da utilização
de MPS de PLGA com SIN para reparação óssea, propõe-se, nesse estudo in vitro, avaliar a
interferência do método de esterilização por OE em MPS de PLGA com e sem SIN encapsulada
para obtenção de um biomaterial seguro que possa ser utilizado em estudos clínicos futuros.
21

3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar in vitro a interferência do método de esterilização por óxido de etileno nas
características físico-químicas bem como no comportamento biológico de microesferas de
PLGA com e sem sinvastatina encapsulada.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Avaliar a morfologia e tamanho das MPS por microscopia eletrônica de varredura
(MEV) no grupo esterilizado e não-esterilizado.
2. Quantificar os elementos químicos das MPS por espectroscopia por energia
dispersiva (EDS, do inglês Energy Dispersive Spectroscopy) no grupo esterilizado e não-
esterilizado.
3. Determinar a composição química das MPS por espectroscopia no infravermelho
por transformada de Fourier (FTIR, do inglês Fourier Transform Infrared Spectroscopy) no
grupo esterilizado e não-esterilizado.
4. Determinar a orientação espacial das MPS por difração de raio X (DRX) no grupo
esterilizado e não-esterilizado.
5. Avaliar o comportamento biológico das MPS do grupo esterilizado e não-
esterilizado, através do teste de citotoxicidade em linhagens de fibroblastos gengivais humanos
e células tronco procedentes da polpa de dente decíduo em 1 e 7 dias.
22

4 METODOLOGIA
4.1 SÍNTESE DAS MICROESFERAS

As MPS foram produzidas no Laboratório de Virologia Aplicada da Universidade
Federal de Santa Catarina (LVA, UFSC) em cabine de fluxo laminar a fim de reduzir os riscos
de contaminação. O método utilizado foi o de emulsão de óleo em água (O/A) e evaporação do
solvente, adaptado de (JORDÃO et al., 2017). Inicialmente, foi preparada uma solução de
álcool polivinílico (PVA) à 1% (Neon, Brasil), diluindo 20g em 2L de água ultrapurificada
(Milli-Q) à 70º sob agitação constante (fase externa).
Em seguida, dois béqueres contendo, cada um, 40ml de diclorometano (Emsure,
Merck KgaA, Germany) sob agitação constante e temperatura ambiente (21ºC) receberam 1g e
0,98g de PLGA 82L:18G (Resomer LG 824S, Evonik Ind., Alemanha), respectivamente,
resultando na concentração de 2,5% m/v. Ao segundo béquer foi adicionado 0,02g de SIN
(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) obtendo a relação de 2% m/m entre fármaco e polímero (fase
interna).
Após a dissolução total (30min) de ambas as soluções, a fase interna foi emulsificada
por gotejamento em 800ml de PVA a 1% (fase externa), sob agitação vigorosa em agitador
magnético e temperatura ambiente. As misturas foram mantidas sob agitação constante por uma
noite (overnight) para completa evaporação do solvente (diclorometano). A agitação, então, foi
suspensa para decantação das MPS (30min) e a remoção da fase líquida (PVA) dos béqueres.
Em seguida, para lavar as MPS e eliminar qualquer resquício de PVA, 800 mL de água Mili-
Q foram adicionados em cada béquer e novamente submetidos à agitação por 10min, seguidos
de decantação (30min). Esse processo de lavagem foi repetido por 3 vezes, sendo que, na
última repetição, não foi mais adicionada água Mili-Q e foi aguardado que as amostras
secassem por evaporação. As MPS foram separadas em eppendorfs contendo 10 mg cada,
devidamente identificados de acordo com os seguintes grupos:
- PLGA não esterilizado
- PLGA+2%SIN não esterilizado
- PLGA esterilizado
- PLGA+2%SIN esterilizado
23

4.2 ESTERILIZAÇÃO DAS MICROESFERAS

Parte das amostras com (PLGA+2%SIN) e sem SIN (PLGA) foi submetida à
esterilização por OE correspondendo ao grupo teste. Os eppendorfs foram perfurados para
possibilitar a entrada do gás de OE, acondicionados em papel grau cirúrgico e enviados para
esterilização através do serviço de esterilização do Hospital Universitário (HU) da UFSC. A
concentração de OE utilizada foi de 550 a 900 mg/L, durante 180 minutos, em temperatura
média de 55ºC e umidade entre 40 a 90%, em equipamento da marca SERCON. Após a
esterilização, os materiais passaram por aeração mecânica dentro do próprio equipamento com
doze pulsos de ar comprimido seguidos de aeração ambiental por 1 hora para eliminar os
resíduosgerados pelo processo. A validação do processo de esterilização foi confirmada após
48 horas de incubação utilizando Bacillus atrophaeus. O restante das amostras permaneceu
sem esterilização. Ambos os grupos passaram por todos os testes de caracterização a seguir.

4.3 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA
4.3.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

A análise da topografia de superfície dos grupos foi avaliada no seu estado seco,
utilizando o microscópio eletrônico de varredura de alta resolução (JEOL JSM-6390 LV
Scanning Electron Microscope, Massachusetts, USA). Uma amostra de cada grupo foi disposta
sobre a superfície do stub, colada com fita de carbono dupla face e levada ao aparelho
metalizador para recobrimento com ouro. Os espécimes foram examinados operando a 10 kV.
Para cada amostra foram obtidos registros em diferentes ampliações (X50, X200, X500,
X1000).
4.3.2 Mensuração das microesferas

Utilizando 3 imagens com aumento de 500x de cada grupo obtidas por MEV, foi
realizada mensuração da área média (µm2) das MPS utilizando o software ImageJ.
4.3.3 Espectroscopia por energia dispersiva (EDS)

Para análise qualitativa da composição química da superfície das amostras, foi
realizada espectroscopia de raios X por dispersão em energia (EDS) em aumento de 500x
selecionando a porção central de uma MPS de cada grupo utilizando o MEV de alta resolução
(JEOL JSM-6390LV Scanning Electron Microscope, Massachusetts, USA).
24

4.3.4 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR)

O espectro de absorção na região no infravermelho das amostras foi feito com um
espectrofotômetro de FTIR (Agilent, modelo Cary 660, Melbourne, Austrália). As amostras
foram associadas ao KBr (brometo de potássio) e confeccionadas na forma de pastilhas. Para
cada amostra foi feito uma média de 32 varreduras, dentro de um intervalo de 4000 a 400 cm-1
e resolução de 4 cm-1.
4.3.5 Difração de Raios X (DRX)

Os padrões de difração foram obtidos à temperatura ambiente (~21°C) utilizando o
difratômetro de raios X (MiniFlex600, Rigaku, Texas, USA) equipado com detector D/teX
Ultra e uma fonte de cobre, operando a uma tensão de 40 kV e corrente de 15 mA. As amostras
foram analisadas num intervalo de 5 a 90° (2θ) com step-size de 0,05° e velocidade de 10º/min.

4.4 COMPORTAMENTO BIOLÓGICO
4.4.1 Citotoxicidade

A citotoxicidade das MPS de PLGA com e sem SIN, estéreis ou não, foi avaliada em
triplicata através do teste colorimétrico de MTT [3(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio
brometo. Esse teste avalia a metabolização de sais de tetrazolium por mitocôndrias de células
viáveis. A metabolização gera o corante formazan de coloração roxa que pode ser dissolvido
em dimetilsulfóxido e medido quantitativamente por espectrofotômetro de absorbância. As
células utilizadas para o teste foram fibroblastos gengivais humanos (HGF, do inglês human
gingival fibroblasts) e células tronco procedentes da polpa de dente decíduo (SHED, do inglês
stem cells from human exfoliated deciduous teeth). Os períodos experimentais para análise da
viabilidade celular foram de 1 e 7 dias.
As células foram semeadas em placa de 96 cavidades, a uma densidade celular de
2x104 por cavidade. O meio de cultura utilizado para ambas as linhagens foi o meio de Eagle
modificado por Dulbecco (DMEM, 11885-084 Gibco, Massachusetts, EUA), suplementado
com 10% de soro fetal bovino (SFB, 12657-029 Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) numa
quantidade de 180μl por cavidade. As células foram incubadas por 24h a 37 °C com 5% de
CO2.
Após as 24h, as MPS de PLGA e PLGA+2%SIN, estéreis ou não, foram adicionadas
as cavidades da placa, com exceção do grupo controle positivo, que não recebeu MPS. Após os
períodos experimentais, as MPS e o meio de cultura foram removidos com cautela. As
25

cavidades foram lavadas duas vezes com solução tampão fosfato-salino (PBS, Gibco,
Massachusetts, EUA), adicionado 180μl de meio acrescidos de 45μl de solução de MTT (Dye
Solution). As células foram incubadas nas mesmas condições de temperatura e atmosfera
supracitadas durante 4h.
Para realização do teste, o sobrenadante de cada cavidade foi aspirado e adicionado
100μl de Dimetilsulfóxido (DMSO, Vetec Química Fina, Rio de Janeiro, Brasil), responsável
pela liberação da coloração obtida com o MTT. A placa foi colocada em agitador orbital
(shaker) por aproximadamente 5 minutos, para atuação do DMSO. Foram coletados 100μl e
depositados em outra placa para leitura das absorbâncias por espectrofotômetro (Infinite M200,
TECAN, Áustria GmbH, Grödig, Áustria) a um comprimento de onda de 570nm. As
porcentagens das células viáveis foram calculadas em relação ao controle positivo.

4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

A análise estatística foi realizada utilizando o programa Graph Pad Software Inc. (La
Jolla, Califórnia, EUA). Para análise dos resultados da mensuração da área média das MPS, foi
aplicado o teste t de student (p <0,05), comparando os métodos de esterilização (esterilizado e
não esterilizado) no mesmo grupo (PLGA ou PLGA+2%SIN), bem como foram comparados
ambos os grupos (PLGA e PLGA+2%SIN) para o mesmo método de esterilização (esterilizado
ou não esterilizado). Para a análise dos resultados da citotoxicidade, os grupos controle, PLGA
e PLGA+2%SIN foram comparados entre si, avaliando cada tempo experimental
separadamente, aplicando o teste ANOVA one-way seguida do pós-teste de Tukey (p <0,05).
26

5 RESULTADOS

Foi realizada a caracterização físico-química das MPS por meio dos testes:
microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia por energia dispersiva (EDS),
espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) e difração de raios X
(DRX). O comportamento biológico das MPS foi avaliado por teste colorimétrico de
viabilidade celular (MTT).

5.1 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA

5.1.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) :

As imagens obtidas a partir da análise por MEV das amostras de PLGA e PLGA+2%SIN
estão dispostas nas Figuras 2 e 3, respectivamente. É possível observar que a morfologia das MPS
apresenta formato esférico com uma superfície livre de fissuras mesmo após a esterilização por
OE. Ambos os grupos PLGA e PLGA+2%SIN não esterilizados, mostraram uma superfície lisa
com poucas alterações decorrentes do processo de confecção em uma pequena parcela da amostra
(Figura 2 e 3, seta). É possível notar, nas ampliações de X500 e X1000, que após os processo de
esterilização as amostras PLGA e PLGA+2%SIN demonstram leves alterações em padrão
circular côncavo na superfície de algumas MPS.

5.1.2 Mensuração das microesferas

Na mensuração da área média das amostras (Figura 4) é possível observar que as MPS
de PLGA esterilizadas foram menores que as não esterilizadas (p = 0,0477) e estatisticamente
semelhantes ao grupo esterilizado de PLGA+2%SIN (p = 0,4615). Não foi observada diferença
de tamanho entre as MPS esterilizadas e não esterilizadas de PLGA+2%SIN (p = 0,6082).
Entretanto, as MPS não esterilizadas de PLGA+2%SIN são menores que as MPS de PLGA não
esterilizadas (p = 0,0491).
27

Figura 2 - MEV de MPS de PLGA esterilizadas e não esterilizadas

PLGA Não Esterilizado PLGA Esterilizado
Imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) com X50, X200, X500 e X1000 de ampliação a
partir de amostras dos grupos de PLGA sem sinvastatina.
28

Figura 3 - MEV de MPS de PLGA+2%SIN esterilizadas e não esterilizadas

PLGA+ 2%SIN Não Esterilizado PLGA+ 2%SIN Esterilizado
Imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) com X50, X200, X500 e X1000 de ampliação de
amostras de PLGA com sinvastatina 2%.
29

Figura 4 – Área de MPS de PLGA e PLGA+2%SIN esterilizadas e não esterilizadas

Mensuração por Image J

Área (µm2) média das MPS de PLGA e PLGA+2%SIN esterilizadase não esterilizadas mensuradas através do
software ImageJ. Letras minúsculas diferentes sobre as barras representam diferença estatisticamente significante
(Teste t, p<0,05) entre os diferentes métodos de esterilização do mesmo grupo (PLGA ou PLGA+2%SIN). Letras
maiúsculas diferentes representam diferença estatisticamente significante (Teste t, p<0,05) entre o mesmo método
de esterilização (esterilizado ou não esterilizado) nos diferentes grupos.

5.1.3 Espectroscopia por energia dispersiva (EDS)

As análises de EDS nas superfícies das amostras dos grupos esterilizados e não
esterilizados demonstraram que as MPS são formadas essencialmente pelos elementos carbono
e oxigênio (Figura 5). As MPS de PLGA esterilizadas (Figura 5A, B) apresentaram um leve
aumento da presença do elemento químico carbono (5.537) em comparação as MPS de PLGA
não esterilizadas (5.242). O mesmo ocorreu com as MPS de PLGA+2%SIN (Figura 5C, D), o
grupo esterilizado apresentou aumento do elemento carbono (5.961) em comparação as MPS
de PLGA+2%SIN não esterilizadas (4.384). Não houve alteração do elemento químico
oxigênio.
30

A
PLGA não esterilizado
B
PLGA esterilizado
C
PLGA+2%SIN não esterilizado
D
PLGA+2%SIN esterilizado

Figura 5 – EDS de MPS de PLGA e PLGA+2%SIN esterilizadas e não esterilizadas

Gráficos obtidos a partir da espectroscopia por energia dispersiva (EDS). A) microesferas (MPS) de PLGA não
esterilizadas. B) MPS de PLGA esterilizadas por óxido de etileno (OE). C) MPS de PLGA com 2% de
sinvastatina (SIN) encapsulada (PLGA+2%SIN) não esterilizada. D) MPS de PLGA+2%SIN esterilizadas por
OE.

5.1.4 Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR)

Os estudos por FTIR nas MPS de PLGA, antes e após esterilização por OE, são
ilustrados pelo gráfico na figura 6. O espectro FTIR apresentou bandas de absorção
características de seus grupos funcionais, mostrando picos correspondentes aos seguintes
grupos de estiramento: O-H (3.420 e 3.500cm-1), -CH, -CH2 e -CH3 (2.930cm
-1), C=O (1730 –
1600cm-1) e C-O (1.002cm-1). Nos grupos PLGA+2%SIN (Figura 7), os picos correspondem
aos grupos de estiramento: O-H (3.450cm-1), C-H (2.920cm-1), C=O (1740 – 1600cm-1) e C-O
(1.010cm-1). Em ambos os gráficos (Figuras 6 e 7), é possível notar uma maior variação na
transmitância dos grupos esterilizados (linha azul) em comparação aos grupos não esterilizados
(linha preta). Apesar disso, as bandas de absorção do PLGA e PLGA+SIN são correspondentes
antes e após a esterilização por OE nos dois gráficos.
31

Figura 6 – FTIR de MPS de PLGA esterilizadas e não esterilizadas

Gráfico gerado a partir da análise por espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) em
microesferas (MPS) de PLGA esterilizadas (linha azul) ou não (linha preta) por óxido de etileno (OE).
32

Figura 7 - FTIR de MPS de PLGA+2%SIN esterilizadas e não esterilizadas

Gráfico obtido através de espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) em
microesferas (MPS) de PLGA com 2% de sinvastatina (SIN) encapsulada esterilizadas (linha azul) ou não (linha
preta) por óxido de etileno (OE).

5.1.5 Difração de raio X (DRX)

Os padrões de DRX das MPS de PLGA e PLGA+2%SIN, esterilizadas ou não, são
mostrados nas Figuras 8 e 9. Ambos os grupos (PLGA e PLGA+2%SIN) encontram-se na
forma amorfa antes e após a esterilização, indicando que os parâmetros de temperatura e pressão
utilizados câmara de OE não alterou a característica amorfa do PLGA. Além disso, é possível
observar que mesmo o grupo com SIN, substância conhecidamente de caráter cristalino (NATH
et al., 2013; MASAELI et al., 2016), apresentou caráter amorfo (Figura 9). Esse
comportamento é sugestivo de que a SIN tenha sido incorporada ao polímero.
33

Figura 8 – EDS de MPS de PLGA esterilizadas e não esterilizadas

Gráfico obtido através da análise de difração de raios X (DRX) das microesferas (MPS) de
PLGA esterilizadas (linha azul) ou não (linha preta) por óxido de etileno (OE).

Figura 9 - DRX de MPS de PLGA+2%SIN esterilizada e não esterilizada

Gráfico obtido através da análise de difração de raios X (DRX) das microesferas (MPS) de
PLGA com 2% de sinvastatina (SIN) encapsulada esterilizadas (linha azul) ou não (linha preta) por
óxido de etileno (OE).
34

5.2 COMPORTAMENTO BIOLÓGICO
5.2.1 Citotoxicidade

A viabilidade celular de fibroblastos gengivais humanos (HGF) e células-tronco
procedentes da polpa de dente decíduo (SHED) expostas às MPS de PLGA e PLGA+2%SIN
esterilizadas por OE e não esterilizadas avaliadas pelo teste colorimétrico MTT, estão expostas
nas Figuras 10-13.
HGF apresentaram viabilidade celular maior que 70% quando expostas às MPS de
PLGA e PLGA+2%SIN em ambos os tempos experimentais, o que significa que as amostras
não foram citotóxicas antes e após esterilização (Figuras 10 e 11). Em relação às MPS de PLGA
(Figura 10), é possível verificar que o grupo esterilizado apresentou a maior viabilidade celular
no dia 1 (p < 0,0001). No dia 7, a viabilidade celular reduziu tanto no grupo esterilizado quanto
no grupo não esterilizado, os tornando estatisticamente iguais ao controle positivo (p = 0,6107).

Figura 10 – Viabilidade celular de HGF às MPS de PLGA esterilizadas e não esterilizadas
Viabilidade celular de fibroblastos gengivais humanos (HGF) frente à exposição a microesferas (MPS)
de PLGA esterilizadas ou não por óxido de etileno (OE). Os valores da viabilidade celular foram calculados a
partir das absorbâncias (570 nm) obtidas pelo teste colorimétrico MTT nos tempos experimentais de 1 e 7 dias.
Letras minúsculas diferentes sobre as barras representam diferença estatisticamente significante (ANOVA one-
way / pós-teste Tukey, p < 0,05) entre os grupos do mesmo tempo experimental.

Na análise da viabilidade celular das MPS de PLGA+2%SIN (Figura 11), o grupo
esterilizado apresentou a maior viabilidade celular no dia 1 (p < 0,0001), resultado semelhante
ao obtido com as MPS de PLGA. No dia 7, a viabilidade celular do grupo esterilizado foi
estatisticamente igual às dos grupos não esterilizado e controle celular (p = 0,3176 e p = 0,3519,
respectivamente).
35

Figura 11 - Viabilidade celular de HGF às MPS de PLGA esterilizadas e não esterilizadas

Viabilidade celular de fibroblastos gengivais humanos (HGF) frente à exposição a microesferas (MPS)
de PLGA com sinvastatina (SIN) encapsulada à 2% (PLGA+2%SIN) esterilizadas ou não por óxido de etileno
(OE). Os valores da viabilidade celular foram calculados a partir das absorbâncias (570 nm) obtidas pelo teste
colorimétrico MTT nos tempos experimentais de 1 e 7 dias. Letras minúsculas diferentes sobre as barras
representam diferença estatisticamente significante (ANOVA one-way / pós-teste Tukey, p < 0,05) entre os
grupos do mesmo tempo experimental.

Os resultados referentes às viabilidades celulares das SHED são expostas nas Figuras
12 e 13. Em relação as MPS de PLGA (Figura 12), o grupo não esterilizado a apresentou a
maior viabilidade celular no dia 1 (p = 0,0017), enquanto os grupos esterilizado e controle
positivo foram iguais (p = 0,1447). No dia 7, os grupos esterilizado e não esterilizado foram
estatisticamente semelhantes ao controle positivo (p = 0,4005).

Figura 12 – Viabilidade celular de SHED às MPS de PLGA esterilizadas e não esterilizadas

Viabilidade celular de células-tronco de polpa de dente decíduo (SHED) frente à exposição a
microesferas (MPS) de PLGA esterilizadas ou não por óxido de etileno (OE). Os valores da viabilidade celular
foram calculados a partir das absorbâncias (570 nm) obtidas pelo teste colorimétrico MTT nos tempos
experimentais de 1 e 7 dias. Letras minúsculas diferentes sobre as barras representam diferença estatisticamente
significante (ANOVA one-way / pós-teste Tukey, p < 0,05) entre os grupos do mesmotempo experimental.
36

Referente ao grupo PLGA+2%SIN (Figura 13), a esterilização por OE não interferiu
na viabilidade celular do dia 1, uma vez que os grupos esterilizado e não esterilizado foram
semelhantes estatisticamente ao controle positivo (p = 0,2715). Em relação ao dia 7, o grupo
não esterilizado foi igual ao controle (p = 0,8689). O grupo esterilizado teve sua viabilidade
celular reduzida (61,96 ± 16,84), porém, considerando o desvio padrão obtido, o resultado se
mostrou estatisticamente igual ao grupo não esterilizado (p = 0,08).

Figura 13 – Viabilidade celular de SHED às MPS de PLGA+2%SIN esterilizadas e não
esterilizadas

Viabilidade celular de células-tronco de polpa de dente decíduo (SHED) frente à exposição a
microesferas (MPS) de PLGA com sinvastatina (SIN) encapsulada à 2% (PLGA+2%SIN) esterilizadas ou não
por óxido de etileno (OE). Os valores da viabilidade celular foram calculados a partir das absorbâncias (570 nm)
obtidas pelo teste colorimétrico MTT nos tempos experimentais de 1 e 7 dias. Letras minúsculas diferentes sobre
as barras representam diferença estatisticamente significante (ANOVA one-way / pós-teste Tukey, p < 0,05)
entre os grupos do mesmo tempo experimental.
37

6 DISCUSSÃO

A associação da SIN a materiais poliméricos biorreabsorvíveis têm demonstrado
eficácia no reparo de defeitos ósseos in vivo. Todavia, os estudos raramente citam um método
de esterilização de escolha provavelmente devido a sensibilidade do biomaterial. Há pouca
literatura disponível sobre a influência da esterilização no comportamento de MPS de PLGA
associado a substâncias farmacológicas. Encontrar um método que garanta a esterilidade do
biomaterial sem alterar a eficácia, sem deixar resíduos tóxicos e sem provocar resposta
inflamatória é fundamental para prosseguir com pesquisas clínicas. Dessa forma, os resultados
obtidos com o presente estudo são importantes para esclarecer os efeitos da esterilização por
OE em biomateriais de PLGA+SIN e viabilizar sua aplicação como regenerador de tecido
ósseo.
A análise por MEV da estrutura física das amostras revelou que as MPS de PLGA
(82L:18G) com ou sem SIN mantiveram o formato esférico e livre porosidades após a
esterilização com OE a 55ºC por 180min. Estudos anteriores também obtiveram resultados
semelhantes quanto a manutenção das propriedades físicas de MPS de PLGA (50:50) após a
esterilização por OE a 37ºC (JEONG et al., 2003; DHAL; MISHRA, 2020). Pequenas
alterações de superfície em formato circular côncavo puderam ser observadas após exposição
ao OE. Moioli et al., (2006) observou que alterações morfológicas mínimas em MPS de PLGA
(50:50) após a esterilização por OE não comprometeram a taxa de liberação do fármaco. Um
estudo recente realizado por Dhal e Mishra (2020), membranas formadas por nanopartículas de
PLGA com gentamicina encapsulada foram esterilizadas por OE a 37ºC durante 100min. As
análises por microscopia eletrônica de varredura revelaram uniformidade da superfície e
ausência de imperfeições. Os resultados in vivo mostraram que a membrana facilitou o
crescimento de fibroblastos antecipando o reparo da incisão cirúrgica sem causar resposta
inflamatória. Todavia, alguns estudos observaram aglomeração e aumento na taxa de
degradação das MPS devido a temperatura empregada pelo método (FRIESS e SCHLAPP,
2006; KOHANE et al., 2006). O presente estudo demonstrou apenas alterações pontuais em
uma parcela da amostra, sendo possivelmente em decorrência do contato entre as MPS e não
devido a degradação de superfície. A temperatura utilizada na esterilização (55ºC) não
demonstrou ter efeito sobre a morfologia final das MPS.
A mensuração da área das MPS mostrou que o grupo PLGA não esterilizado possui
MPS maiores, sendo estatisticamente diferente do grupo PLGA esterilizado e do grupo com
38

SIN não esterilizado. A diferença observada pode estar relacionada ao método de preparo das
MPS, visto que outros estudos não observaram alterações significativas no tamanho das MPS
após a incorporação da SIN ao PLGA (ZHANG et al., 2015; QIAO et al., 2017). O grupo
PLGA+2%SIN não apresentou diferença de tamanho entre o grupo esterilizado e não
esterilizado, demonstrando que a exposição ao OE não provocou alterações na área dessas MPS.
Este resultado também foi observado em outro estudo utilizando MPS de PLGA (50:50)
associada ao ácido retinóico, o tamanho das micropartículas não foi alterado pela esterilização
por OE (JEONG et al. 2003).
O EDS revelou que as MPS são formadas por carbono e oxigênio. O PLGA é composto
por carbono, oxigênio e hidrogênio, assim como a SIN (C25H38O5). A presença destes dois
elementos em MPS de PLGA está de acordo com a literatura (KHALIL et al., 2013). O
elemento hidrogênio não pode ser visualizado por meio do EDS pois o equipamento não detecta
elementos químicos com número atômico inferior a 5. O aumento de carbono após a
esterilização por OE (C2H4O) pode estar associado ao poder alquilante do gás. O OE é capaz
de promover reações que adicionam hidroxietil (-CH2-CH2-OH) a grupos funcionais como a
hidroxila (-OH), presente na molécula do PLGA e da SIN (FRANÇA et al., 2013). Todavia, a
repetição do experimento se faz necessária para confirmar os resultados.
Na análise por FTIR, as bandas de absorção características dos grupos funcionais
presentes no copolímero de PLGA puderam ser observadas em (2.930cm-1) referente ao
estiramento assimétrico de grupos -CH, -CH2 e -CH3, picos na faixa de (1730 – 1600cm
-1)
devido ao estiramento vibracional dos grupos funcionais carbonila (C=O) e picos em (1.002cm-
1) correspondente ao estiramento de grupos funcionais éster (C-O). Esses espectros concordam
com os dados descritos na literatura para o PLGA (MOTTA e DUEK, 2006; ERBETTA, et al.,
2012; SILVA, et al., 2015). A presença de picos na faixa (3.420 e 3.500cm-1) correspondentes
ao estiramento hidroxila (O-H) também foi observado nas amostras de PLGA (NATH et al.,
2013; BAO et al., 2010; MASAELI et al., 2016). Na análise das MPS de PLGA+2%SIN foram
observadas bandas de absorção em (3.450cm-1) correspondendo ao estiramento do grupo
hidroxila (O-H), em (2.920cm-1) associado a estiramento vibracional simétrico e assimétrico de
(C-H) metila e metileno e picos na faixa de (1740 – 1600cm-1) característico de estiramento
vibracional dos grupos carbonila lactona e éster (C=O). Segundo espectros de FTIR da SIN
encontrados na literatura, os dois últimos picos são característicos do fármaco, sugerindo que
houve a incorporação da SIN ao copolímero (NATH et al., 2013; BAO et al., 2010; MASAELI
et al., 2016).
39

Saalman (1985) esterilizou polietileno e poli(cloreto de vinil) com OE puro em
laboratório e utilizou o FTIR para avaliar a presença de resíduos do gás. Os materiais não
passaram por período de aeração e a presença do OE foi detectável no número de ondas de
870cm-1 e 866cm-1. Em contrapartida, Friess e Schlapp (2006) ao esterilizar MPS de PLGA
(50:50) a 32 °C durante 6 h, utilizando o OE associado ao dióxido de carbono (15:85) não
encontraram diferenças significativas entre os espectros antes e após a esterilização. Ainda,
segundo os autores, a diferença na transmitância de alguns picos está relacionada à viscosidade
das soluções poliméricas. No presente estudo, foram observados picos em 863cm-1 e 867cm-1
referente ao PLGA e PLGA+2%SIN, respectivamente. Esses picos são compatíveis com
ligações C-H e sugerem a presença de resíduos de OE nas amostras, o que corrobora com o
aumento carbono encontrado na análise por EDS. Todavia, se faz necessário a repetição do
experimento para garantir a reprodutibilidade dos dados.
Segundo Ratner, Schoen e Lemons (1996), o PLA apresenta irregularidades na sua
cadeia polimérica características de um polímero amorfo. Em contraparte, o PGA é altamente
cristalino mas a sua cristalinidade desaparecesignificativamente quando associado ao PLA. De
acordo com a literatura, o copolímero PLGA com menos de 85% de PGA encontra-se na forma
amorfa (KUMAR e BANKER 1993). Os resultados das análises de DRX das MPS de PLGA
(82L:18G) com e sem SIN, estéreis ou não, revelaram que o biomaterial é de natureza amorfa,
concordando com os dados descritos acima. A utilização do PLGA no estado amorfo é
preferível pois permite a dispersão homogênea da SIN na matriz polimérica (ATHANASIOU
et al., 1996).
A estrutura cristalina da SIN observada por meio do DRX origina diversos picos (11°,
13°, 15,5°, 16,5°, 17,5°, 19°, 22,5°, 26°, 28,5° e 32°) devido aos diferentes ângulos de difração
da molécula (MASAELI et al., 2016). A ausência desses picos após a associação ao PLGA
também foi observado em outros estudos que sugerem a provável incorporação do fármaco ao
polímero. (NATH et al., 2013; MASAELI et al., 2016; QIAO et al., 2017).
Um polímero de natureza amorfa pode passar do estado vítreo (rígido) para o estado
borrachoso quando ultrapassa sua temperatura de transição vítrea (Tg, do inglês, glass-
transition temperature). Acima da Tg o movimento térmico que as cadeias poliméricas
adquirem propicia a formação de regiões ordenadas estáveis, tornando o polímero
potencialmente cristalizável (COWIE, 1991). De acordo com Motta e Duek (2006), a Tg do
PLGA 80:20, proporção muito próxima a utilizada no presente estudo (82:18), é de 57ºC. Além
disso, os autores observaram a formação de cristais no PLGA 80:20 após 15 dias de degradação
40

em imersão tampão fosfato. A esterilização por OE a 55ºC, temperatura abaixo da Tg do PLGA,
não demonstrou aumentar a degradação ou promover alterações estruturais na cadeia
polimérica. O copolímero manteve sua natureza amorfa após exposição ao OE.
Na análise da viabilidade celular em linhagens de fibroblastos gengivais humanos
(HGF), as MPS de PLGA e PLGA+2%SIN antes e após a esterilização não foram citotóxicas
nos dois tempos experimentais. O mesmo resultado foi encontrado por Jeong et al. (2003) ao
realizar teste MTT em linhagens celulares de glioma maligno, as MPS de PLGA com ácido
retinóico encapsulado esterilizadas por OE a 37ºC durante 220 min não foram citotóxicas.
Entretanto, apesar dos resultados positivos obtidos no presente estudo, é possível observar uma
queda da viabilidade celular do dia 1 para o dia 7 tanto no grupo esterilizado quanto no grupo
não esterilizado em ambos os gráficos de HGF. Resultado semelhante foi encontrado para as
SHED que apresentaram-se viáveis às MPS de PLGA e PLGA+2%SIN, esterilizadas ou não
por OE. Essa redução na viabilidade está possivelmente relacionada a resíduos decorrentes do
processo de síntese das MPS. De acordo com Sahoo et al. (2002), a porção hidrofóbica do PVA
– emulsificante utilizado na síntese das MPS – permanece associado a superfície das esferas
mesmo após repetidas lavagens. Outro fator que pode ter reduzido a viabilidade celular ao longo
dos dias é a presença de diclorometano residual e sua liberação no meio à medida que o PLGA
foi hidrolisado. Uma etapa de evaporação adicional pode ser introduzida em preparações futuras
para garantir a remoção do solvente orgânico (DE; ROBINSON, 2004).
Frente às informações expostas, foi possível observar que o método de esterilização
por OE mostrou-se eficaz para a esterilização das MPS de PLGA e PLGA+2%SIN, não
resultando em um produto citotóxico e provocando mínimas alterações químicas que devem ser
investigadas em estudos futuros para garantir a segurança do biomaterial para aplicação clínica.
41

7 CONCLUSÃO

A esterilização por OE não interferiu nas características físicas das MPS de PLGA e
PLGA+2%SIN, bem como não exerceu influência sobre a viabilidade celular de SHED e HGF.
Pequenas alterações químicas puderam ser detectadas por FTIR e EDS nos grupos esterilizados
por OE, o que sugere a presença de resíduo do gás de OE no biomaterial após a esterilização. É
preciso que o estudo seja repetido para garantir a reprodutibilidade dos dados. Todavia os
resultados sugerem que o método de esterilização do óxido de etileno apresenta potencial para
utillização em biomateriais de PLGA com SIN encapsulada para uso clínico.
42

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