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Aula 03
Natália Gindri Fiorenza
Maria Paula de Souza Sampaio
Aplicação da 
Biologia Molecular 
no Diagnóstico 
Laboratorial
Diretor Executivo 
DAVID LIRA STEPHEN BARROS
Diretora Editorial 
ANDRÉA CÉSAR PEDROSA
Projeto Gráfico 
MANUELA CÉSAR ARRUDA
Autor 
EDUARDO NASCIMENTO DE ARRUDA
Desenvolvedor 
CAIO BENTO GOMES DOS SANTOS
NATÁLIA FIORENZA
Olá. Meu nome é Natália Fiorenza. Sou formada em Ciências 
Biológicas, com mestrado e doutorado na área de Ciências da Saúde. 
Passei por diferentes laboratórios de pesquisa, publicando trabalhos 
científicos e participando de muitos Congressos e Cursos em diferentes 
áreas de saúde e educação. Fui professora universitária e tutora durante 
4 anos do curso de medicina, onde me conectei com minha paixão pela 
docência e por metodologias ativas de ensino. Sou ávida por aprender e 
ensinar e por trocar conhecimentos quer na area científico-acadêmica, 
quer na área de desenvolvimento humano e autoconhecimento. Recebi 
com muita alegria o convite da Editora Telesapiens para integrar seu 
elenco de autores independentes, pois tenho como propósito transmitir 
aquilo que sei e auxiliar outras pessoas no início de sua jornada 
profissional. Estarei com você nessa caminhada de muito estudo e 
trabalho. Conte comigo!
MARIA PAULA SAMPAIO
Meu nome é Maria Paula, sou graduada em Biomedicina, 
habilitada em Citopatologia. Além da prática com a minha habilitação, 
pude realizar um curso avançado em Citopatologia Cérvico-Vaginal. 
Atualmente, sou voluntária de um projeto de pesquisa na Fundação 
Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) sobre Patologia Mamária Comparada, onde fiz 
iniciação científica por um ano. Em minha jornada de estudante pude 
participar ativamente de congressos e projetos de estudo, e sempre 
tive uma paixão por ensinar. Junto com Natália, pretendo transmitir todo 
o ensinamento que obtive até aqui, buscando sempre aprender mais. 
Estamos juntos nesse aprendizado!
Autoras
INTRODUÇÃO: 
para o início do 
desenvolvimen-
to de uma nova 
competência;
DEFINIÇÃO: 
houver necessidade 
de se apresentar 
um novo conceito;
NOTA: 
quando forem 
necessários obser-
vações ou comple-
mentações para o 
seu conhecimento;
IMPORTANTE: 
as observações 
escritas tiveram 
que ser prioriza-
das para você;
EXPLICANDO 
MELHOR: 
algo precisa ser 
melhor explicado 
ou detalhado;
VOCÊ SABIA? 
curiosidades e inda-
gações lúdicas sobre 
o tema em estudo, 
se forem necessárias;
SAIBA MAIS: 
textos, referências 
bibliográficas e 
links para aprofun-
damento do seu 
conhecimento;
REFLITA: 
se houver a neces-
sidade de chamar a 
atenção sobre algo 
a ser refletido ou 
discutido sobre;
ACESSE: 
se for preciso aces-
sar um ou mais sites 
para fazer download, 
assistir vídeos, ler 
textos, ouvir podcast;
RESUMINDO: 
quando for preciso 
se fazer um resumo 
acumulativo das 
últimas abordagens;
ATIVIDADES: 
quando alguma ativi-
dade de autoapren-
dizagem for aplicada;
TESTANDO: 
quando o desen-
volvimento de uma 
competência for 
concluído e questões 
forem explicadas;
Iconográficos
Olá. Meu nome é Manuela César de Arruda. Sou a responsável pelo pro-
jeto gráfico de seu material. Esses ícones irão aparecer em sua trilha de 
aprendizagem toda vez que:
SUMÁRIO
Controle de qualidade em laboratório de Biologia Molecular 12
Fase pré-analítica 13
Fase analítica 13
Fase pós-analítica 14
Programas de acreditação em laboratório clínico 15
Detecção de vínculo genético 15
Paternidade 15
Exame de Paternidade 18
Cartão FTA 18
Swab bucal 21
Repetições em Tandem (Microssatélites) 22
Polimorfismo no Comprimento do Fragmento de Restrição 
(RFLP) 24
Perícia criminal 26
Detecção de mutações 28
Mutações 28
Erros de replicação 29
Lesões no DNA 30
Tipos de mutações moleculares 32
Reparo e recombinação 33
Rearranjos e alterações cromossômicas 34
Alterações cromossômicas 34
Rearranjos cromossômicos 35
Técnicas para detecção de mutações 36
PCR 36
Microarranjos (microarrays) 37
FISH 37
Exames de cariótipo 38
Detecção de doenças infecto-parasitárias e imunogenética 40
Doenças infecciosas 40
Retrovírus 41
Herpes vírus 43
Infecção bacteriana e seus genes de resistência 44
Protozoários 45
Imunogenética 46
Complexo principal de histocompatibilidade 47
Prova Cruzada 49
Tipagem HLA 49
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 9
UNIDADE
03
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial10
Nesse capítulo nós abordaremos aspectos da rotina de um 
laboratório de biologia molecular. Veremos como funciona o programa 
de controle de qualidade, tanto interna como externa. Além dos exames 
laboratoriais que podem ser realizados, com base nas técnicas que foram 
abordadas anteriormente. Serão abordadas as fases dos processos de 
controle de qualidade e suas características. Dentre os exames laboratoriais 
de biologia molecular, destacaremos a detecção de vínculo paterno, 
detecção de mutações e detecção de doenças infecto-parasitárias e 
técnicas de histocompatibilidade. Todos esses assuntos abordados serão 
muito importantes para entender a importância da aplicação da biologia 
molecular no diagnóstico laboratorial, relacionando-os com os assuntos já 
vistos. Ao longo desta unidade letiva você vai mergulhar neste universo! 
Vamos nessa?
INTRODUÇÃO
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 11
Olá. Seja muito bem-vindo à Unidade 3. Nosso objetivo é auxiliar 
você no desenvolvimento das seguintes competências profissionais até 
o término desta etapa de estudos:
1. Controle de qualidade em laboratório de Biologia Molecular.
2. Detecção de vínculo genético.
3. Detecção de mutações.
4. Detecção de doenças infecto-parasitárias e Imunogenética.
Então? Preparado para uma viagem sem volta rumo ao 
conhecimento? Ao trabalho!
OBJETIVOS
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial12
Controle de qualidade em laboratório de 
Biologia Molecular
INTRODUÇÃO:
Neste capítulo iremos abordar os processos de controle 
de qualidade interna durante as três fases: pré-analítica, 
analítica e pós-analítica. Por fim, abordaremos a função 
de programas de acreditação laboratorial, como a PALC, 
na manutenção da qualidade das três fases do processo 
interno de qualidade laboratorial. E então, vamos lá?
Como foi visto nas unidades anteriores, existem diversas técnicas 
em biologia molecular que são métodos fundamentais no diagnóstico 
das doenças humanas que resultam de lesões do DNA. Esses testes 
podem ser realizados com amostras advindas dos mais diversos tipos 
de tecidos. A inovação tecnológica oferecida pela técnica de PCR 
possibilitou que quantidades mínimas dessas amostras pudessem ser 
analisadas. O alcance e a precisão dos diagnósticos genéticos são de 
extrema importância e demandam responsabilidades clínicas, éticas 
e legais sem precedentes. Além de erros técnicos, a interpretação 
incorreta de exames laboratoriais é bastante prejudicial. Levando em 
consideração esses fatores, as normas e metas dos laboratórios dessa 
área devem obter rigorosidade ao realizar qualquer procedimento, para 
que a quantidade de erros seja a mínima possível ou nenhuma. 
Para que um laboratório de biologia molecular exerça suas 
atividades com responsabilidade, é necessário que haja um controle de 
qualidade. É muito importante que os laboratórios forneçam serviços que 
superem as expectativas dos pacientes. Importante conter um sistema 
de qualidade eficiente, com infra-estrutura adequada e equipe treinada, 
utilizar reagentes de qualidade comprovada, sistema de limpeza de 
vidrarias e processos de coleta e conservação de amostras seguindo 
os protocolos implantados. Além do mais, deve conter uma gestão de 
qualidade que será responsável por determinar o apoio e disponibilizar 
os recursos necessários. Na realização de um exame pelo laboratório 
deve-se considerar as etapas pré-analíticas, analíticas e pós-analíticas.
Aplicação da Biologia Molecular no DiagnósticoLaboratorial 13
Fase pré-analítica
Tudo que ocorre nessa etapa é mais difícil de se controlar e de 
obter monitoramento e isso é devido ao fato de a maior parte dos fatores 
ocorrem fora do laboratório. Destacamos alguns fatores que podem 
afetar os resultados dos exames, podendo causar erros ou variações. 
A identificação do paciente de forma correta é de extrema importância, 
devendo conter nome do paciente, data e hora da coleta e o tipo de 
material que foi colhido. A preparação do paciente também é muito 
importante pois pode afetar o resultado dos exames diretamente.
Alguns exames necessitam de jejum, o paciente não deve 
consumir álcool ou drogas, a quantidade de exercício físico também 
influencia e até mesmo há a interferência de medicamentos.
A hora da coleta da amostra também demanda bastante atenção, 
seja no ato da coleta, no preparo do material ou no armazenamento 
da amostra. Todos esses fatores citados podem interferir de alguma 
maneira no resultado do exame. Os principais erros que podem ocorrer 
nessa fase envolvem a escrita ilegível ou erro nos dados do paciente, 
interpretação incorreta do exame, falta de orientação para realização 
do exame, troca de amostras, uso de tubo e anticoagulante errados, 
volume excedido ou insuficiente para exame, hemólise de hemácias e 
lipemia, além de contaminação de material e amostra.
Fase analítica
Essa etapa envolve basicamente o método de diagnóstico que 
será utilizado. Deve-se levar em consideração a confiabilidade (precisão, 
exatidão, especificidade, sensibilidade, linearidade) e praticidade (tipo 
de amostra e volume, necessidade de equipamentos, estabilidade 
IMPORTANTE:
Deve haver uma padronização nos procedimentos 
realizados pelo laboratório, todas as atividades devem 
ser documentada através de Procedimento Operacional 
Padrão (POP) ou Instrução de Trabalho (IT), que deverão 
ficar disponíveis a toda a esquipe do laboratório.
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial14
dos reagentes, complexidade da metodologia utilizada) dos métodos 
analíticos. Também devem ser levados em consideração a qualidade 
da água utilizada nas técnicas, a limpeza da vidraria e os equipamentos 
devem estar todos bem calibrados (pipeta, balança).
Os métodos analíticos devem ser documentados e devem estar à 
disposição dos responsáveis pelos exames.
Os controles interno e externo da qualidade são utilizados na 
monitoração e avaliação dos métodos analíticos. O controle interno 
da qualidade envolve o nível de segurança fundamental para que seja 
garantida a qualidade, eficiência e confiabilidade aos resultados dos 
exames. O controle externo é interlaboratorial onde o resultado de cada 
teste do laboratório é comparado com a média de consenso do grupo 
envolvido, ou seja, compara a exatidão dos exames de um laboratório 
com a de outros.
Nessa fase podem ocorrer erros de má pipetagem, de reagentes 
mal conservados, contaminados ou fora da validade; de tempo de 
reação ou nos cálculos de concentração e diluição.
Fase pós-analítica
Essa etapa consiste no que acontece após a realização do exame, 
ou seja, envolve o cálculo dos resultados, a análise, a liberação dos 
laudos, o armazenamento do material e arquivamento de resultados. O 
laboratório deve assegurar que o laudo seja entregue ao paciente e o 
laudo precisa conter todas as informações necessárias, sendo escrito de 
forma legível e sem rasuras. Os dados contidos no laudo são totalmente 
sigilosos e confidenciais ao paciente e tem que ser respeito o prazo 
para entrega do laudo. O laboratório deve obter cópias do laudo para 
recuperação posterior, se for necessário. Os erros mais frequentes nessa 
etapa envolvem a transcrição de dados do paciente incorreta, resultado 
ilegível, falta de identificação de interferentes possíveis, além de falta de 
especificidade e sensibilidade do teste utilizado.
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 15
Programas de acreditação em laboratório 
clínico
O Programa de Acreditação específico para Laboratórios Clínicos 
(PALC) e os programas de acreditação, em geral, avaliam o laboratório 
como um todo, incluindo o sistema de qualidade, competência da 
equipe do laboratório, equipamentos, reagentes, métodos, controles 
interno e externo da qualidade, segurança, preparo do paciente, 
métodos e laudos. No Brasil, existem dois programas de acreditação 
patrocinados por sociedade científica, que são: Sociedade Brasileira 
de Patologia Clínica (SBPC), através do PALC, e Sociedade Brasileira 
de Análises Clínicas (SBAC), através do Departamento de Inspeção e 
Credenciamento da Qualidade (DICQ).
Detecção de vínculo genético
INTRODUÇÃO:
Ao término do capítulo, você entenderá a investigação 
do DNA para detecção de vínculo de paternidade ou 
identidade genética. Durante o capítulo iremos entender 
como e o porquê que esse exame pode ser utilizado 
emáreas como a paternidade e a perícia forense. Então, 
vamos iniciar nossa jornada?
Paternidade
O registro e assumo da responsabilidade legal do filho por parte 
do pai biológico é assunto de extrema importância. O abandono paterno 
tem alertado algumas entidades públicas por conta de seu aumento no 
número de casos. 
Por exemplo, em São Paulo, em 2015 o Brasil ganhou mais de um 
milhão de famílias compostas por uma mãe solo, isso foi um aumento 
em um período de 10 anos. Claro que, quando falamos de famílias com 
mãe solo, muitas causas podem estar presentes, inclusive o falecimento 
do progenitor. Entretanto, o número de pais que não registraram suas 
crianças acaba sendo maior do que esses casos. Entretanto, esses casos 
não abrangem somente as pessoas nascidas a partir de 2000. 
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial16
Algumas entidades públicas, como o ministério público, promovem 
eventos dedicados à coleta de amostra de mães, filhos, irmãos e 
possíveis candidatos a pai biológico das crianças para análise em um 
laboratório terceirizado, afim de detectar vínculo através da identidade 
genética. Normalmente, esses mutirões acabam não chamando atenção 
somente de mães e crianças com a necessidade de encontrar os pais 
biológicos, mas também chama a atenção de adultos de todas as idades 
que tem a curiosidade ou necessidade de saber a identidade de seus 
pais biológicos. Portanto, programas de paternidade ajudam milhões de 
pessoas a identificar seus pais.
Antigamente, esses exames podiam serem feitos a partir de 
outras vertentes biológicas, que não eram a genética. O sistema 
sanguíneo ABO RH+ consegue identificar, mas não com muita precisão, 
a paternidade de uma criança e seus pais. Isso porque o nosso sistema 
ABO RH+ deriva de nossos pais, puxando dois alelos, um para o A, B ou 
Oe o outro para o RH+, sendo positivo ou negativo, formando assim o 
sistema mais imunogênico da fração vermelha do nosso sangue. 
Basicamente, a herança genética envolvida nesse sistema 
é mediada pelos genes IA e IB, dois genes dominantes, e um gene i, 
recessivo. O pai e a mãe de um indivíduo hipotético vão passar um 
desses alelos. Caso o pai seja A, ele pode ser IAIA ou IAi, já a mãe sendo 
B, ela será IBIB ou IBi. Sendo assim, se o filho for O, significa dizer que 
ele só possui os alelos recessivos ii obrigatoriamente e os pais IAi e IBi. 
Existem casos também de AB, ou seja, nesse caso hipotético, isso só 
seria possível se o filho herdasse os IAe IB dos pais, sendo ele IAIB. É por 
esse raciocínio que a paternidade era explorada utilizando os grupos 
sanguíneos. Entretanto, não era tão específico, já que qualquer pessoa, 
possuindo parentesco ou não, pode ter, por coincidência, um grupo 
sanguíneo idêntico ao verdadeiro pai biológico.
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 17
Tabela 1: Correlações dos grupos sanguíneos
Grupo sanguíneo quem podem ocorrer...
dos pais
... que podem ser 
constatado nos filhos
... que não podem ser 
constatado nos filhosO com O O A, B, AB
O com A O, A B, AB
A com A O, A B, AB
O com B O, B A, AB
B com B O, B A, AB
A com B O, A, B, AB -
O com AB A, B O, AB
A com AB A, B, AB O
B com B A, B, AB O
AB com AB A, B, AB O
Hoje em dia, os exames de DNA visam vertentes mais precisas 
para investigar vínculo genético. O projeto genoma humano descobriu 
que todos os seres humanos possuem, entre si, similaridade de 99%. 
Sendo assim, 1% equivale a regiões altamente polimórficas que variam de 
pessoa a pessoa, tornando somente os gêmeos univitelinos totalmente 
idênticos geneticamente. 
VOCÊ SABIA?:
Esses elementos polimórficos são repetições de pares de 
bases ao longo de um locus cromossômico, denominado 
de microssatélites, ou repetições em tandem (STR).
Essas repetições variam de pessoa a pessoa e os filhos herdam 
dos pais. Portanto, o exame de paternidade é focado nessas repetições 
que estão presentes em determinados locus gênicos dos progenitores 
e o resultado vai mostrar esses locus, o polimorfismo nesse locus de 
todos os participantes e o filho(a) precisa herdar, necessariamente, uma 
repetição do locus do pai e outra repetição do locus da mãe, portanto, 
o que será analisado não é a repetição em si, mas se elas foram 
herdadas para os descendentes. Esse método confere maior precisão 
na discriminação da paternidade.
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial18
Exame de Paternidade
Após a coleta do material de todos os participantes, a amostra 
é encaminhada diretamente ao laboratório que irá realizar o exame e o 
protocolo é diferente a depender do material colhido. Os participantes 
incluem o autor da investigação, o filho ou filha, sua mãe e o(s) possível(eis) 
pai(s). Em um caso, pode haver mais de um possível pai e quando não 
há, então recorrerá para os parentes de 2° grau (em relação ao filho ou 
filha) para que haja a investigação. Lembrando que tudo que acontecer 
no caso, será em relação ao investigante, que é o filho ou filha. Os seus 
parentes de segundo grau envolvem tios, tias, avô e avó. Um outro caso 
pode ser investigação de parentesco do filho com o seu possível irmão, 
uma pessoa já registrada pelo pai. A não ser que o possível pai não tenha 
falecido, todas as investigações têm que serem feitas com o possível pai. 
Após o cadastro devido da amostra, identificando e correlacio-
nando os dados contidos no rótulo da amostra com os dados cadastrais 
do caso, a amostra será processada de acordo com os seus respectivos 
materiais. Um dos métodos são via swab bucal ou por cartão de FTA. 
Cada um possui suas especificidades, que serão discutidas com mais 
detalhes a partir de agora.
Cartão FTA
O método de extração envolvendo o cartão FTA é uma forma 
invasiva de obter amostra biológica para a extração do DNA de todos 
os participantes, pois ela envolve a retirada de uma gota de sangue 
através de um pequeno furo com uma lanceta na ponta do dedo de 
cada envolvido para que se obtenha uma espécie de impressão digital 
feita de sangue no cartão. Por ser um método que envolve sangue, não 
é recomendado para qualquer pessoa que esteja fazendo o teste de 
paternidade porque, além de invasivo, a depender do participante, essa 
técnica pode dar resultados não condizentes com a realidade. 
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 19
Outro fator que limita a utilização do cartão FTA é a idade dos 
participantes. Normalmente, quando o autor da investigação é um 
bebê ou recém-nascido o procedimento é feito através de um swab, 
material esse que será explicado mais tarde, devido à dificuldade de 
acesso, tendo que ser feito na região calcânea, por causa da circulação 
sanguínea em crianças dessa idade. Lembrando que, antes de qualquer 
coleta, deve-se realizar a massagem no local para levar a circulação na 
ponta do dedo ou na região do calcâneo e a assepsia com álcool a 70%. 
EXPLICANDO MELHOR:
Uma pessoa que recebeu ou recebe frequentemente 
uma bolsa de sangue não pode realizar o exame a partir 
do cartão FTA, já que o sangue coletado pode conter 
duas identidades genéticas: a do próprio participante e da 
pessoa que a doou a bolsa de sangue.
VOCÊ SABIA?
As pessoas que frequentemente recebem ou já receberam 
bolsas de sangue para transfusão podem ter passado por 
alguma cirurgia de risco ou sofrerem de enfermidades como 
anemia falciforme ou leucemias, principalmente aquelas 
que envolvem bastante depleção do conteúdo vermelho 
(hemácias) do sangue, sendo assim, diminuindo também 
a concentração de hemoglobina. Entretanto, a transfusão 
crônica de sangue pode levar ao desenvolvimento de 
reações transfusionais, mesmo prestando bastante 
atenção no sistema ABO, já que outros grupos sanguíneos 
em contato crônico, caso não sejam levados em conta, 
podem ativar uma reação pós-transfusional no paciente. 
É por esse motivo, que estão desenvolvendo bolsas de 
sangue artificial, sem os grupos sanguíneos, com o intuito 
de aumentar o fluxo de transfusões sanguíneas para essas 
pessoas em programa de transfusões crônicas, podendo 
também, não interferir na coleta do sangue para o teste de 
paternidade, já que será sangue sintético artificialmente.
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial20
Após a coleta, realizar o transporte do material até o laboratório, 
onde será deixado em overnight para secar o material sanguíneo e 
posteriormente retirar uma pequena rodela do material coletado a partir 
de uma caneta coletora.
Figura 1: Kit com cartão FTA e caneta coletora
Fonte: http://bit.ly/35Jykpv
A utilização desse método de coleta, que também serve como 
um ótimo método de transporte de amostra, é que evita a coleta 
desnecessária de um tubo de sangue, além também de superar as 
dificuldades de transporte de um material fresco entre locais distintos, 
que muitas vezes podem envolver o transporte de uma cidade do 
interior de um estado até a outra cidade. É uma técnica simples, não tão 
invasiva quanto a coleta venosa, há redução de volume e peso e não 
tem a necessidade de refrigeração da amostra. Além disso, o cartão é 
feito de um material que contém uma área com a presença de reagentes 
que inativam e inibem o crescimento microbiológico, além de lisarem as 
células sanguíneas e liberam o DNA, o qual é preservado contra ação de 
nucleases (DNases), oxidação e raios UV. Elas podem ser armazenadas 
sem refrigeração por 17 anos. 
O procedimento envolvido na obtenção do DNA serve para extrai-
lo do pequeno pedaço do cartão extraído, estando ele contido em um 
reagente de eluição, preparado para ser amplificado pela técnica de 
PCR e posteriormente analisado em um sequenciador automático capaz 
de identificar os locus cromossômicos dos microssatélites.
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 21
Swab bucal
A técnica de swab é uma forma alternativa de se coletar a amostra 
biológica, é menos invasiva e pode ser utilizada para qualquer situação, 
embora haja seus fatores de interferência. O swab é um bastão tipo de 
cotonete, que será imerso na boca de cada participante afim de retirar 
células na mucosa da boca que irão fixar na parte de algodão do swab. 
São células escamosas da mucosa da boca, sendo assim, não precisa 
ser feita muita força para a sua retirada.
Figura 2: Kit comercial do swab bucal 
Fonte: http://bit.ly/37MxzxQ 
Como dito anteriormente, essa técnica pode ser utilizada para 
muitas situações (praticamente todas). No caso em que algum participante 
do caso tenha recebido sangue através de transfusões, a forma alternativa 
de coletar um material biológico é através da coleta por swab, que levará 
na aquisição da amostra real dos pacientes, já que estamos falando 
de células escamosas próprias. Outro fator que a utilização dele acaba 
superando a do cartão FTA é na coleta em bebês e recém-nascidos, afinal 
se trata de um método não tão invasivo, sendo não desconfortável para o 
bebê e podendo gerar resultados precisos da mesmaforma. 
No kit da coleta por swab, são disponibilizados dois cotonetes 
para a extração. É essencial a utilização desses dois cotonetes em casos 
de re-extração, como será explicado logo a frente. 
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial22
Recomenda-se não ingerir qualquer alimento e nem beber nada 
além de água por um período de 1 hora antes do teste, afinal o alimento 
ingerido pode criar uma camada de sujeira que será coletada junto com 
as células escamosas. Nesses casos, da para superar a ação dessa 
sujeira através de processos de lavagens mais rigorosas. 
Após a coleta, deixar o material secar antes de embalá-lo para 
análise. O armazenamento ineficiente pode levar à germinação de 
esporos de fungos no local da amostra devido ao ambiente úmido 
promovido pela não secagem correta do material. Outros casos que 
podem acontecer é o transporte de um material amassado, ralado, ou 
quebrado, comprometendo a viabilidade da amostra para a análise. Esses 
casos podem ser muito comuns quando uma amostra acaba sendo 
transportada de uma cidade à outra e quando não tomado os devidos 
cuidados, os cotonetes podem vim completamente comprometidos 
quanto a sua total viabilidade para extração do DNA. 
Após a coleta e o transporte do material até o laboratório responsável 
pela extração desse material, o swab será submetido à fricção da sua 
parte coletora em um tubo contendo um reagente de diluição. Essa fricção 
vai permitir que as células coletadas na boca de cada participante migre 
para o reagente de diluição, tornando o tubo com um reagente límpido 
para um tubo com um reagente turvo ou, dependendo das orientações 
seguidas pelos participantes, o tubo ficará com uma coloração diferente e 
aparência turva caso o aquele participante não tenha se resguardado de 
qualquer alimentação dentro de uma hora.
Após todo o processamento da amostra, ela então será amplificada 
pela técnica da PCR e sequenciada em um sequenciador automático de 
DNA, tipo o ABI 3500.
Repetições em Tandem (Microssatélites)
Como foi abordado anteriormente, os microssatélites são regiões 
polimórficas do DNA e possuem uma grande taxa de variabilidade entre 
os seres vivos. Além de serem bastante explorados para identificar 
paternidade, são também utilizados para identificar regiões polimórficas 
que predispõe câncer. Essas repetições contribuem significantemente 
com variações fenotípicas, adaptação evolucionária e doenças humanas. 
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 23
Eles consistem de pequenos fragmentos que podem ter até 10 pares 
de base que são repetidas em uma sequência genômica. O fato de 
estarem presentes repetidos de tal forma, pode interferir em eventos 
de recombinação e até mesmo da replicação, causando erros nesses 
processos, levando ao ganho ou perda de função. 
IMPORTANTE:
Apesar de sua alta variabilidade, os microssatélites 
frequentemente residem em regiões funcionais do DNA, 
como regiões codificantes e regulatórias. Sendo assim, 
eles conseguem exercer uma alta variabilidade fenotípica, 
sendo os marcadores mais visados para identificação de 
paternidade, já que possivelmente muitas características 
fenotípicas herdadas por um indivíduo dos pais pode ter uma 
alta relação com essas repetições em tandem herdadas.
É estimado que os microssatélites estejam presentes em cerca 
de 6% de toda a região codificável do genoma, destacando também seu 
potencial em afetar o risco para o desenvolvimento de doenças e outras 
enfermidades complexas. 
Os microssatélites são encontrados em outros seres vivos além do 
humano, como baleias, Drosophila, camundongos, bovinos e caprinos, 
espécies vegetais, entre outros. Em plantas, a sua existência já havia 
sido sugerida, com a observação de que oligonucleotídeos contendo 
elementos repetidos de TG e GATA/GACA detectam polimorfismo, 
quando utilizados como sondas RFLP. Os elementos repetidos mais 
frequentes em mamíferos são extensos de dinucleotídeos CA e TG.
Em genomas de eucariotos, estas sequências simples são mais 
frequentes, melhor distribuídas ao acaso e formam lócus hipervariáveis 
constituídos por minissatélites. Este locus altamente polimórfico, 
amplificado via PCR foi também denominado de “STMS- Sequence 
Tagged Microsatellite”, ou seja, sítios de microssatélites marcados 
por sequência, e constitui a classe mais polimórfica de marcadores 
moleculares disponíveis hoje. 
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial24
Polimorfismo no Comprimento do 
Fragmento de Restrição (RFLP)
Seguindo a linha dos microssatélites, no genoma humano 
existem trechos altamente polimórficos que variam de pessoa a pessoa. 
Sendo assim, seguindo essa lógica, uma outra técnica foi criada e, até 
mesmo antes da ampla difusão dos sequenciadores automáticos, ela 
era bem utilizada para identificar paternidade devido esses fragmentos 
polimórficos. 
Há 25 anos atrás, essa técnica foi desenvolvida com o intuito de 
identificar polimorfismo viral sem seu DNA, comparando as cadeias 
polinucleotídicas entre os mesmos vírus. Em pouco tempo, estes 
marcadores tornaram-se uma ferramenta importante em várias áreas 
da biologia e têm sido utilizados para aprofundar o conhecimento em 
diferentes temas.
Imaginemos dois DNAs, cada um de indivíduos diferentes, porém 
das mesmas espécies. Ao clivar ambos os DNAs com a mesma enzima 
de restrição, iremos obter fragmentos de DNA como o produto da 
reação. Normalmente, como se trata de indivíduo da mesma espécie, 
os fragmentos de DNA tendem a ter os mesmos comprimentos e pesos. 
Entretanto, isso seria verdadeiro caso o DNA não fosse cortado em 
regiões específicas do genoma humano. 
Ao submetermos os fragmentos de ambos os indivíduos a uma 
corrida de eletroforese, perceberemos a formação de bandas, mas para 
o diferencial da técnica, algumas bandas não estarão na mesma faixa de 
peso molecular. Sendo assim, há o questionamento: Ao cortar a mesma 
região gênica de dois indivíduos da mesma espécie, como irá gerar 
fragmentos de comprimentos diferentes? 
A resposta para essa pergunta está na compreensão de que nem 
todos os indivíduos terão o mesmo comprimento de fragmento em 
determinado locus, isso porquê cada indivíduo tem uma região polimórfica, 
e isso é uma das contribuições que nos diferem um dos outros. Portanto, 
ao cortar os dois DNAs com uma enzima de restrição, fragmentos de 
tamanhos distintos, em locus específicos, serão gerados e, quando corridos 
em eletroforese, haverá a discriminação das bandas, resultando em duas 
bandas de um mesmo gene em posições diferentes de peso molecular. 
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 25
Devido a esses resultados, o nome da técnica foi dado como 
polimorfismo no comprimento do fragmento de restrição (RFLP), 
podendo ser muito utilizada para exames envolvendo investigação de 
vínculo genético. Afinal, essas regiões polimórficas não são criadas, são 
herdadas. Sendo assim, elas têm que ser herdadas de um pai e de uma 
mãe, 2 alelos. 
Figura 3: Resultado de eletroforese de RFLP
Fonte: http://bit.ly/34sYtsj
Para a visualização dos fragmentos polimórficos, serão utilizadas 
sondas de DNA, que podem ser de cDNA, vindo a partir da transcrição 
reversa de um mRNA, fragmentos de DNA genômico e da amplificação 
via PCR de sequências conhecidas utilizando primers específicos. O 
melhor DNA a ser utilizado como sonda seria os fragmentos de DNA 
genômico ou um amplificado a partir de um primer, já que os fragmentos 
de DNA gerados a partir da clivagem por enzimas de restrição terão 
sequências íntrons em sua região codificante.Sendo assim, a utilização 
de cDNA seria mais para avaliar a expressão de um gene, não sua 
presença. Isso porque, como já foi explicado, o cDNA possui somente 
sequências de exons, por vir de um mRNA que passou por suas etapas 
de processamento pós transcricional. 
Se os fragmentos gerados viremde procariotos, a utilização 
de um cDNA não terá o mesmo raciocínio do que quando vindas de 
eucariotos, já que o mRNA de bactérias não sofre processamentos pós 
transcricionais.
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial26
Perícia criminal
Além dos benefícios da análise de regiões polimórficas para 
identificar paternidade entre indivíduos de um caso, essa análise pode 
ajudar a polícia a desvendar um caso, achando o culpado por um 
crime através da perícia criminal. A perícia é um ramo investigativo que 
possui várias vertentes, dentre elas a genética. A descoberta do DNA e 
suas propriedades e elementos teve um grande impacto em diversas 
áreas desse conhecimento. Todos sabem que o DNA é a identidade 
do ser humano, ou seja, todas as informações sobre as características 
genotípicas e fenotípicas estão presentes nessa longa cadeia de dupla 
fita em formato helicoidal. 
O departamento investigativo da polícia trabalha buscando por 
provas que possam traçar e definir a identidade do principal suspeito 
de algum crime e o DNA acaba sendo uma das maiores pistas que um 
perito pode usar. O perito pode utilizar amostra de todos os tipos: sangue, 
saliva, pele, esperma, músculo, cabelo, dente, osso, dentre outros. 
Todas essas amostras biológicas servem como uma ótima ferramenta 
de rastreio. Isso porque a identidade genética de cada ser humano é 
única, a não ser que sejam gêmeos. E essa identidade genética pode 
ser comparada: a amostra de sangue encontrada em uma cena de crime 
pode ser comparada com a da vítima e a do suspeito afim de achar 
alguma correspondência molecular entre eles. Caso não haja amostra 
de um suspeito, pode comparar com os progenitores desse suspeito 
(mãe e pai) ou outros parentes como irmãos, avós e tios.
SAIBA MAIS:
O Departamento Federal de Investigação (Federal Bureau 
ofInvestigation– FBI) realizou um estudo identificando os 
marcadores variáveis, microssatélites, ou STR, através de 
estudos populacionais, no genoma humano e chegou à 
conclusão que 13 marcadores são suficientespara gerar 
um perfil que é único e exclusivo para cada ser humano. 
Esse resultado foi divulgado em 1997 e em 2017 esses 
marcadores já tinham subido para 20. Entretanto, cada país 
possui sua estratégia para marcação.
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 27
A análise é feita da mesma forma que é feita para identificar à 
paternidade, entretanto, as nomenclaturas mudam, de suposto pai vai 
para suspeito. O DNA é extraído, de diferentes amostras, assim como na 
paternidade, mas se extraem mais de swabe cartão FTA, por serem mais 
simples, já a perícia vai utilizar as amostras disponíveis na cena. Após a 
extração e o processamento, o DNA será amplificado nos locus alvos 
para sequenciamento ou para ser corrido em gel de eletroforese.
SAIBA MAIS:
Para mais informações sobre os casos periciais, estude o 
artigo realizado sobre um caso que houve no Rio de Janeiro: 
Identification of a criminal by DNA typing in a rape case in 
Rio de Janeiro, Brazil, disponível em: https://bit.ly/2jXWDOd
RESUMINDO:
E então? Gostou do que lhe mostramos? Para facilitar a 
compreensão deste tema que é tão importante dentro da 
biologia molecular, vamos resumir tudo o que vimos. Você 
aprendeu aqui existem alguns métodos de investigação do 
DNA. Conseguiu entender as técnicas que envolvem o teste 
de paternidade, podendo ser feitas através de coleta por 
swab ou por cartão FTA; aprendeu sobre os microssatélites 
e sua funcionalidade no DNA.Entendeu que utilizar o 
sistema ABO para teste de paternidade não traz muita 
especificidade e compreendeu os motivos. Conheceu 
sobre a importância da biologia molecular também para a 
perícia criminal e ciência forense, descobriu que as mesmas 
técnicas utilizadas para paternidade podem ser utilizadas 
para perícia, afim de solucionar casos e identificar suspeitos. 
Também aprendeu sobre a técnica de polimorfismo no 
comprimento do fragmento de restrição (RFLP), viu que ela 
é muito utilizada para exames que envolvem investigação 
de vínculo genético.
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial28
Detecção de mutações
INTRODUÇÃO:
Nesse capítulo nós estudaremos a aplicação de técnicas 
moleculares e citogenéticas para a identificação de 
alterações moleculares e cromossômicas. Na primeira parte 
iremos abordar os princípios de cada mutação e o porquê 
que muitas delas causam doenças ou alterações congênitas 
tão aberrantes e prejudiciais à saúde humana. A outra 
parte será focada em explanar os métodos diagnósticos 
comumente utilizados para a detecção dessas mutações.
Mutações
A manutenção do material genético depende das taxas mínimas 
de mutação e também da capacidade de nossas células em identificar 
erros e repará-los. Durante os processos replicativos celulares pode haver 
alterações na estrutura da nova cadeia a ser gerada, essas alterações, 
podendo ser prejudiciais ou não, são chamadas de mutação. Algumas 
formas de mutação podem gerar em uma cadeia proteica defeituosa 
ou com funções alteradas, podendo danificar um processo fisiológico 
importante. Essas mutações são nocivas a seres vivos, podendo levar a 
danos extensos e generalizados. 
Entretanto, há mutações que não são capazes de modificar a 
estrutura de aminoácidos de uma proteína, sendo assim, não alterando 
a função fisiológica daquela proteína. Essas mutações não são nocivas 
e, se passadas pelo mecanismo de reparo celular, são passadas 
despercebidas. Isso por conta da característica degenerativa do código 
genético, a qual um aminoácido pode ser codificado por mais de um 
códon, e nunca um códon pode codificar mais de um aminoácido. Essa 
característica confere um maior poder de manutenção das proteínas, 
suportando pequenos polimorfismos.
As mutações podem ocorrer em dois tipos de células: as somáticas 
e as germinativas. As células somáticas são as do corpo, incapazes de 
transmitir informação de forma hereditária. Sendo assim, uma mutação 
nessa célula, caso nociva, pode causar doença de forma restrita ao 
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 29
próprio indivíduo. Entretanto, mutações nas células germinativas terão a 
capacidade de serem passadas para gerações futuras, já que as células 
germinativas estão envolvidas na fecundação (entre dois gametas) para 
a formação de um zigoto. Esse zigoto teria herdado essa mutação, sendo 
ela molecular, cromossômica ou genômica, iria se desenvolver a partir 
dessas informações mutáveis e geraria indivíduos com características 
e predisposições totalmente diferentes de um indivíduo sem mutação 
prejudicial. Um exemplo disso é a trissomia 21, mais discutida poste-
riormente, que irá levar na Síndrome de Down.
Mutações altamente extensivas e elevadas na linhagem somá-
tica, destruiriam o indivíduo. Taxas de mutações altamente elevadas e 
extensivas na linhagem germinativa, destruiriam a espécie. 
IMPORTANTE:
As células dependem do funcionamento correto de 
milhares de genes e de seus mecanismos de reparo e 
cada um deles pode ser danificado por uma mutação nos 
diversos sítios da sequência que codifica suas proteínas, ou 
nas suas regiões flanqueadoras que promovem a expressão 
ou o processamento de seu mRNA.
Apesar de todos os efeitos, as mutações também são eventos 
necessários para a evolução de organismos simples em organismos 
complexos. Sem a variação genética necessária, a evolução seria 
perdida. Sendo assim, uma perpetuação fiel do material genético não 
permitirá que a raça humana, por exemplo, tivesse existido. Assim, a vida 
e a biodiversidade dependem de um equilíbrio entre a ocorrência de 
taxas de mutação e os processos de reparo.
Erros de replicação
As mutações incluem praticamente todas as alterações 
permanentes concebíveis nas sequências de DNA. Existem mutações 
simples, onde somente uma base é trocada, chamada de mutação 
pontual. Essa mutação pontual pode ser transição, onde umapurina é 
trocada por outra purina ou uma pirimidina é trocada por outra pirimidina 
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial30
como A por G e T por C. O outro caso são as transversões, onde pode 
haver a troca de uma pirimidina por uma purina e vice-versa, como 
A com T e C com G. Outros tipos de erros podem causar inserções e 
deleções extensas, ou rearranjos grosseiros. Porém, essa parte será 
detalhada mais pra frente.
A taxa geral de haver qualquer mutação espontânea em um sítio 
cromossômico é de 1 em 106 por ciclo de replicação do DNA, sendo 
áreas mais “atrativas”, tendo uma maior frequência de mutações. Uma 
das sequências mais propensas para mutação no genoma humano são 
os microssatélites, anteriormente falado. Isso se deve a alguns “deslizes” 
provocados pela DNA polimerase. 
As repetições CA, onde a maquinaria celular não consegue 
replicar com fidelidade, provocando uma redução ou extensão dessas 
sequências na fita nova. Sendo assim, acaba gerando em polimorfismos 
em um sítio cromossômico, podendo fornecer um marcador eficiente 
para o rastreio de mutações hereditárias ou não através da técnica de 
mapeamento genético, que será mais explicada posteriormente.
Como foi visto anteriormente, a DNA polimerase possui um 
mecanismo excelente de revisão, que pode servir também de 
reparo, devido a sua função exonucleásica 3’ – 5’. Entretanto, alguns 
nucleotídeos podem escapar dessa função revisora, gerando mau 
pareamento entre a fita-molde e a fita recém-sintetizada, o que resulta 
em um total de 12 possíveis maus pareamentos, levando em conta o 
mau pareamento das 4 bases. Caso esse mau pareamento não seja 
retirado, haverá uma alteração permanente (mutação), onde que o que 
era um erro de pareamento, vai ser um pareamento comum, como se 
fosse o certo, já que a fita com o nucleotídeo errado irá formar uma 
outra fita com o “nucleotídeo certo” para aquele pareamento, gerando 
um erro permanente. Tautomerizações também são fontes de possíveis 
mal pareamentos, como já foi explicado na Unidade 1.
Lesões no DNA
Os erros na molécula do DNA também podem vir de fatores 
externos, como radiação, fatores químicos (agentes mutagênicos) e pela 
água (já o DNA, para ficar em sua conformação ideal, precisa estar em meio 
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 31
aquoso). Dentre as ações da água, ela pode promover a desaminação da 
citosina, gerando assim uma uracila, que durante a replicação levará na 
geração de uma nova fita com adenina ao invés de uma guanina (que 
deveria ter pareado com uma citosina). A desaminação pode ocorrer com a 
adenina, produzindo uma hipoxantina, que faz ligação de hidrogênio com 
a citosina, ao invés da timina. Por fim, a desanimação também pode atingir 
a guanina, formando a xantina, que ainda tem afinidade com a citosina, 
embora faça somente 2 ligações de hidrogênio. O DNA também sofre 
depurinação pela hidrólise espontânea da ligação N-glicosídica entre a 
pentose e a sua base, formando um nucleotídeo básico na molécula de 
DNA. A ação da metiltransferase em citosinas com o intuito de promover o 
controle da expressão, vai levar na formação da 5-metilcitosina. Essa base 
metilada, quando desaminada pela água, gera uma timina.
Ao contrário da uracila, a timina não é uma base estranha ao DNA, 
portanto, o sistema de reparo não atuará nesse caso, levando em uma 
mutação pontual (G -> A) na fita recém-feita. Sendo assim, o fato do DNA 
não ter uracila acaba conferindo uma vantagem evolutiva, já que previne 
mais taxas de mutações pontuais, podendo ser nocivas.
O DNA também é vulnerável à alquilação, oxidação e radiação. 
EXPLICANDO MELHOR:
A alquilação é a transferência de grupos metil e etil para os 
sítios reativos das bases ou fosfatos que se ligam ao açúcar 
do nucleotídeo. A nitrosamina, um reagente alquilante e 
mutagênico artificial, vai transferir um radical metil para o 
carbono 6 da guanina, formando a O6-metilguanina, capaz 
de se parear com timinas, assim surgindo uma nova fita 
com mutação de C -> T.
Espécies reativas de oxigênios gerados por radiação ionizante 
ou até mesmo por compostos químicos têm a capacidade de oxigenar 
bases, como a guanina, gerando o oxoG. Esse composto é extremamente 
mutagênico, podendo interagir com a adenina e com a citosina. Se ele 
parear com a adenina, irá gerar uma transversão. Assim, a fita nova que seria 
G -> C, será A -> T, uma das mutações mais comuns em alguns cânceres. 
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial32
Radiação ultravioleta (UV) na faixa dos 260 nm pode gerar uma 
fusão fotoquímica entre os pares de base, onde pode ser com duas cadeias 
pirimidinas em posições adjacentes na mesma cadeia. Por exemplo, pode 
haver a fusão de duas timinas, formando dímero de timina. No caso de 
uma timina adjacente a uma citosina, forma uma timina-citosina, sendo 
essas bases incapazes de parear com outras, interrompendo a replicação 
da DNA polimerase.
Tipos de mutações moleculares
Além das mutações pontuais e as silenciosas já mencionadas, há 
outros tipos de mutações, como os polimorfismos, mutação missense, 
mutação nonsensee mutação frameshift. Os polimorfismos são tipos de 
mutações que alteram o tripleto de base (códon) a ser codificado através 
do ribossomo e do tRNA. 
Apesar de levar na mudança do aminoácido, esse aminoácido 
acaba tendo pouca ou nenhuma repercussão sobre a ação da proteína. 
Pode até levar na redução da função proteica, mas por si só não são o 
suficiente para causar doenças.
A mutação missense leva à alteração de uma base no códon do 
mRNA, levando à tradução de um aminoácido incorreto, podendo ter 
alto ou menor grau de interferência. O caso da anemia falciforme leva 
à mutação pontual A -> T, codificando uma valina no lugar do ácido 
glutâmico. Nesse caso, a alteração é de alto grau por produzir uma 
hemoglobina aberrante, dificultando o transporte de hidrogênio.
Na mutação nonsense há troca de uma base gerando um códon 
de parada, ao invés de um códon de um aminoácido. Sendo assim, a 
proteína nascente é truncada (cortada) prematuramente, podendo 
interferir em um alto grau ou não na estrutura da proteína.
A mutação frameshift interfere na janela de leitura dos códons 
do mRNA, devido a inserções ou deleções. Como a janela de leitura 
lê de 3 em 3 bases, então deleções ou inserções vão alterar o início da 
leitura, podendo traduzir um aminoácido incorreto e também gerar um 
stop códon prematuramente.
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 33
Reparo e recombinação
Muitos fatores podem danificar o DNA e, por essa razão, as 
células têm que possuir mecanismos de reparo eficiente de DNA para as 
ocasiões, caso contrário, as células não iriam conseguir sobreviver por 
muito tempo. Para os maus pareamentos ocorridos durante a replicação, 
dois mecanismos de reparo entram em ação. Um é o reparo por excisão, 
onde um nucleotídeo pareado indevidamente é retirando do DNA, 
formando uma lacuna que será preenchida pelo nucleotídeo correto. 
Normalmente, esses mecanismos de reparo acontecem em uma das 
fases do checkpoint do ciclo celular. O reparo por excisão conserta 
pareamentos incorretos no DNA, a partir de uma fita molde, que não foi 
danificada. Outra forma de reparo é um pouco mais complexa, devido 
às altas distorções do DNA causadas pelos raios UV, por exemplo. Esse 
mecanismo irá retirar um pequeno fragmento de DNA e substitui-lo por 
um pequeno fragmento complementar. 
Entretanto, algumas lesões são muito graves, o bastante para 
levar à morte celular diretamente. Nessas lesões, há a quebra da 
dupla fita do DNA, gerando duas fitas quebradas. Nesses casos, dois 
mecanismos podem reverter o processo: reparo homólogo e reparo por 
união de extremidades não homólogas. Na junção homóloga, as enzimas 
responsáveis utilizarão uma cadeia de DNA molde para reparar a dupla 
fita quebrada. Nesse processo,será feita a junção de holliday, onde uma 
fita quebrada é amplificada da dupla fita molde não atingida e uma fita 
de DNA da dupla fita não atingida será amplificada no DNA quebrado, 
permitindo que a outra fita quebrada do DNA lesado seja reparada a partir 
da fita migrada do DNA não lesado. Essa junção vai levar ao reparo efetivo 
da dupla fita de DNA quebrada, não perdendo nenhuma informação. Já 
o reparo por extremidades não homólogas consiste na união das duas 
fitas quebradas, sem a reposição do conteúdo que estava entre elas. 
Esse processo só ocorre quando não há uma fita molde para que haja 
o processo e pode haver perda de um gene (deleção) ou inserção de 
pares de bases em um gene (inserção).
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial34
Figura 5: Junção de holliday
Fonte: http://bit.ly/34t0Mvt 
Rearranjos e alterações cromossômicas
Rearranjos cromossômicos fazem parte das mutações que 
abrangem os cromossomos (duplicação de um alelo) ou até mesmo 
os genomas (aneuploidia). Ao contrário das mutações moleculares, as 
mutações cromossômicas ou genômicas causam alterações altamente 
expressivas em sua totalidade dos casos. Os rearranjos incluem 
translocações, inserções, deleções, duplicações e inversões.
Alterações cromossômicas
A aneuploidia é uma aberração genômica onde a célula acaba 
perdendo ou ganhando um cromossomo. Por exemplo, no organismo 
humano, as células somáticas (2n) possuem 46 cromossomos, sendo 
23 vindos do pai e 23 da mãe. Quando um cromossomo é adicionado no 
quadro geral do genoma humano (2n+1), isso é chamado de trissomia.
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 35
A aneuploidia também pode incluir mais de um, tanto para 
mais, quanto para menos, cromossomo (2n-3 ou 2n+2). No entanto, 
um outro caso também pode ocorrer, quando um conjunto completo 
de cromossomos é adicionado (3n) ao genoma do ser vivo. Isso é 
chamado de poliploidia. Esse caso é mais raro em animais, entretanto 
mais presente em insetos, plantas e outros vegetais, por exemplo. Essas 
situações ocorrem devido a não disjunção dos cromossomos, ou seja, 
quando não ocorre a separação das cromátides irmãs durante a meiose.
Em embriões humanos, a falta de ao menos um cromossomo 
autossômico (não sexual) humano é inviável para a geração da vida. 
Sendo assim, as monossomias são, em geral, bastante letais, devido 
a baixa dose de proteínas e de outros produtos que são codificados 
por genes que estão em falta. A maioria das trissomias autossômicas 
também impedem que o embrião se desenvolva até o nascimento. 
Entretanto, em cromossomos menores, aquele embrião consegue se 
desenvolver até o nascimento e viver uma vida. Os cromossomos são 
13, 15, 18, 21 e 22. Quando um cromossomo a mais está presente, ele 
pode comprometer o equilíbrio do produto de genes do cromossomo 
duplicado e dos outros genes, podendo até mesmo predispor algumas 
doenças severas, como acontece nos indivíduos com trissomia 21, tendo 
maior predisposição ao desenvolvimento de leucemias. A trissomia do 
21 é a manifestação mais comum entre os embriões que sobrevivem.
Rearranjos cromossômicos
Os rearranjos fazem parte de outra classe de mutações em larga 
escala, onde grandes pedaços cromossômicos, não eles por inteiro, são 
afetados. Os rearranjos podem ser divididos em duplicações, inserções, 
deleções, inversões, transposições e translocações. As duplicações 
EXPLICANDO MELHOR:
Um genoma onde há mais uma cópia onde deveria ter 
somente duas (47). No caso em que há um cromossomo a 
menos (2n-1), isso acaba sendo chamado de monossomia, 
onde no genoma que deveria estar presente duas cópias, 
está somente 1 (45).
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial36
ocorrem quando uma parte de um cromossomo é duplicada, aumentando 
assim o comprimento daquele cromossomo. As deleções ocorrem quando 
uma parte do cromossomo é removido. Normalmente isso ocorre devido 
a processos de recombinações em resposta a uma agressão ao DNA. O 
reparo de DNA por união de extremidades não homólogas pode levar à 
deleção de genes, já que o DNA quebrado não foi reposto, mas sim colado 
suas extremidades quebradas. As inversões são regiões cromossômicas 
invertidas, apontando para direção contrária do que realmente deveria 
estar. As inserções ocorrem quando trechos de DNA são inseridos no 
genoma, devido, por exemplo, ao processo de reparo por não homologia.
As translocações são eventos que normalmente acontecem 
durante o processo de meiose. As permutas cromossômicas (crossing 
over) são duas regiões, uma de cada cromossomo, que são trocadas, 
translocadas, de um cromossomo para o outro. Essa característica acaba 
aumentando a variabilidade genética, favorecendo a evolução. 
Esse processo fisiológico é considerado como uma translocação 
recíproca. As translocações não recíprocas envolvem a permuta do 
pedaço de somente um cromossomo ao outro e não vice-versa.
Técnicas para detecção de mutações
Muitas das mutações são causadoras de doenças altamente 
nocivas como os cânceres ou alguma síndrome de caráter cromossômica 
como a síndrome de Down. Entretanto, para identifica-las é necessário 
metodologias precisas para encontrar mutações moleculares ou 
genômicas. A seguir, serão descritas algumas metodologias bastante 
utilizadas em rotina de laboratório de biologia molecular.
PCR
A técnica da Reação em Cadeia da Polimerase, já bem discutida, 
que tem a capacidade de amplificar um determinado trecho genômico 
a partir de um fragmento de primer, é bastante utilizada para amplificar 
regiões codificantes (éxons) polimórficas que estão muito associadas 
com o desenvolvimento de processos carcinogênicos. O RT-PCR é 
bastante utilizado para o diagnóstico de câncer de estômago através da 
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 37
amplificação dos genes HER-2 e topisomerase IIα. Além disso, analisa 
múltiplos genes de diversas doenças. Outra aplicação para o PCR é 
na amplificação de regiões polimórficas para sua posterior digestão 
enzimática em um procedimento chamado de RFLP, como já discutido 
anteriormente. Essa reação também consegue amplificar alelos para 
identificar deleções ou inserções, discriminando o tamanho desse alelo. 
Um exemplo prático é na fibrose cística ao amplificar o gene DF508.
Microarranjos (microarrays)
Os microarranjos de DNA, ou chip de DNA, é um arranjo de pontos, 
sendo cada um uma sonda, distribuídos em uma placa que é capaz de 
identificar uma molécula alvo (DNA ou RNA) através de processos de 
hibridização, produzindo resultados quantitativos. Podem ser utilizados 
para analisar níveis de expressão gênica. Esses microensaios também são 
utilizados para a detecção de duplicações e deleções cromossômicas 
no genoma humano que podem levar a distúrbios genéticos.
Os SNP-array é uma técnica capaz de detectar polimorfismos 
de nucleotídeo único dentro de uma população de DNA. A amostra de 
um paciente é introduzida em um chip (GeneChip) contendo sondas 
específicas que irão hibridizar ao DNA da amostra. Caso haja polimorfismos, 
haverá uma emissão de sinal, correspondente ao DNA marcado, e será 
convertida em dados computacionais por um software específico.
O CGH+SNP array é uma técnica similar, porém com a utilização 
de uma amostra controle de DNA para que haja a comparação de 
fluorescência entre a amostra teste e a amostra controle. Essa é a 
ferramenta mais indicada pela Academia Americana de Genética para 
o estudo de crianças e adultos com suspeitas de síndromes genéticas 
causadas por anomalias cromossômicas, atraso do desenvolvimento 
neuropsicomotor e autismo. 
FISH
Outro exame de citogenética baseado na utilização de sondas 
fluorescentes capaz de detectar mutações e rearranjos cromossômicos 
como deleções. O diferencial é que essa técnica, ao contrário dos 
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial38
microensaios, não érealizada em microchips. É um método histoquímico 
que permite a enumeração, identificação e localização simultânea de 
regiões gênicas polimórficas. 
IMPORTANTE:
Além de rearranjos complexos, há a identificação precisa de 
microssatélites no genoma das amostras analisadas. Uma 
aplicação dessa técnica é a identificação da amplificação 
de genes envolvidos com processos carcinogênicos como 
o HER-2.
Figura 6: Histoquímica do FISH para o marcador HER-2
Fonte: http://bit.ly/33m7Zw9 
Exames de cariótipo
O exame de cariótipo é mais uma vertente da citogenética com o 
objetivo de identificar e analisar os cromossomos e suas regiões. O teste 
é realizado mediante a cultura de célula, para a obtenção do estágio do 
ciclo celular em metáfase, onde encontrará os cromossomos formados 
e conectados ao fuso mitótico, já prestes a se dividir, e sua posterior 
coloração. Através das bandas cromossômicas identificadas, é possível 
visualizar as aberrações cromossômicas numéricas ou estruturais. 
Ou seja, os exames de cariótipo nos permitem ver aneuploidia e os 
rearranjos cromossômicos anteriormente mencionados. O cariótipo é 
recomendado para casais que buscam aconselhamento genético. 
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 39
Um dos métodos utilizados é o cariótipo em sangue periférico 
(LCBS), onde será cultivado linfócitos estimulados com agentes mitógenos 
para a indução da divisão celular e obtenção da metáfase para análise 
cromossômica.
A realização do cariótipo em sangue periférico é referenciada 
para síndromes congênitas, como a síndrome de Down, crianças com 
atraso de desenvolvimento ou aprendizagem, incluindo atraso na fala ou 
déficit intelectual e entre outros. 
Após o interrompimento da divisão celular, através da ação da 
colchicina, a amostra será pré-tratada com uma enzima proteolítica 
(tripsina) e sua posterior coloração. Esta técnica proporciona a produção 
de bandas transversais nos cromossomos que permite a identificação de 
cada par cromossômico individualmente e o estudo numérico e estrutural 
destes com resolução de 400 - 550 bandas. São avaliadas, em média, 20 
células em metáfase para a determinação do cariótipo do paciente.
RESUMINDO:
E então? Gostou do que lhe mostramos? Para facilitar a 
compreensão deste tema que é tão importante dentro 
da biologia molecular, vamos resumir tudo o que vimos. 
Você aprendeu aqui que mutações podem acontecer 
com o DNA. Aprendeu também sobre as técnicas e 
exames moleculares e citogenéticas para a identificação 
de alterações moleculares e cromossômicas. Viu que 
essas alterações podem estar relacionadas a processos 
oncopatológicos hereditários ou não. Compreendeu os 
princípios de cada técnica, como a FISH, SNP-array e o 
cariótipo banda G. Além de aprender sobre a utilização de 
testes moleculares na identificação de mutação em códons 
ou genes específicos que levam ao desenvolvimento 
de alguns tipos de câncer (como de mama, estômago 
e pulmão). Compreendeu que muitos fatores podem 
danificar o DNA e devido a isso, as células têm que possuir 
mecanismos de reparo eficiente de DNA para as ocasiões, 
caso contrário, as células não iriam conseguir sobreviver 
por muito tempo.
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial40
Detecção de doenças infecto-parasitárias 
e imunogenética
INTRODUÇÃO:
Neste capítulo veremos a aplicação da biologia molecular 
para o diagnóstico de doenças infecto-parasitárias e 
para a obtenção da compatibilidade entre dois tecidos 
sólidos diante de um transplante. Testes mais precisos, 
sensíveis e específicos são necessários para a exata 
identificação desses patógenos, excluindo possibilidades 
de diagnósticos falso-negativos. A mesma lógica serve 
para a identificação da histocompatibilidade.
Doenças infecciosas
A saúde pública brasileira tem sido transformada desde a criação 
do Sistema Único de Saúde (SUS). O SUS é um dos mais complexos 
sistemas de saúde no mundo, onde sua eficácia é reflexo de uma 
política de saúde preventiva e atendimento integral à pessoa. O SUS se 
divide em atenção primária, secundária e terciária, e cada divisão possui 
suas especificidades. Dentro de cada atenção, há o monitoramento de 
doenças altamente infecciosas e de importância epidemiológica no 
Brasil. Por exemplo, existe o Sistema de Notificação Compulsória, que, 
por meio de uma Lista Nacional de Notificação Compulsória de Doenças, 
determina a obrigatoriedade da notificação e comunicação por meio de 
profissionais de saúde ou responsáveis pelos estabelecimentos públicos 
ou privados. 
A importância dessa lista é a notificação visando o rápido controle 
de eventos que requerem pronta intervenção. Dentro dessa lista há 
doenças como Dengue, Botulismo, AIDS, Doença de Chagas, Doença 
de Creutzfeldt-Jakob (causada por príons), Meningite, Sífilis, Influenza 
(novo subtipo viral), Varíola, Antraz, Ebola, Febre amarela, Tuberculose, 
Malária, Pneumococo e entre outras. Há uma lista completa sobre as 
doenças de notificação compulsória e notificação imediata. 
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 41
Além da importância da notificação, os testes diagnósticos 
disponíveis têm que ter eficiência e precisão na detecção desses agentes 
patógenos, já que tem o maior potencial de disseminação e de elevadas 
taxas de mortalidade, caso não sejam controlados. Principalmente 
porque alguns não possuem uma cura ou tratamento bem efetivo 
(Creutzfeldt-Jakob, Ebola, HTLV e HIV, por exemplo). Algumas dessas 
doenças serão abordadas a seguir, explicitando suas formas de infecção, 
geração de doença e métodos diagnósticos.
Retrovírus
Desde a década de 80, os retrovírus foram apresentados a partir 
da descoberta do primeiro vírus dessa família, o HTLV-1. Em 1980, 
dois vírus isolados de pessoas, em diferentes partes do mundo, com 
manifestações leucêmicas, hoje definida como leucemia de células T 
do adulto, e com uma doença neurodegenerativa do sistema nervoso 
periférico (HAM/TSP). Foi determinada a associação desse vírus com 
tais doenças e descoberto seu tropismo pelas células T, sendo então 
chamado de Vírus Linfotrófico de Células T Humana.
Em 1985 descobriu-se um agente viral em pessoas com 
deficiência imunitária, sendo muitos casos associados com pneumonias 
graves. Muitos confundiam esse agente patogênicocom uma outra cepa 
viral do HTLV, entretanto, quando isolado e identificado, descobriram 
que se tratava de outro vírus, portanto nomeado de HIV – Vírus da 
Imunodeficiência Humana, o terceiro retrovírus descoberto dentre a 
população mundial. Assim como o HTLV-1, ele tem tropismo forte pelas 
células T auxiliares (CD4) e, ao contrário do HTLV-1, o HIV-1 tem um 
caráter lítico, ou seja, ele rompe as células infectadas, difundindo pelo 
plasma sanguíneo e infectando novas células. O HTLV-1 possui um ciclo 
lisogênico, no qual se multiplica junto com a célula, tendo sua atuação 
de forma muito lenta. 
Ambos são retrovírus por possuírem um genoma de RNA, porém, 
se inserirem ao DNA genômico por meio da transcriptase reversa. Essa 
enzima, já mencionada em capítulos anteriores, tem o potencial de 
converter um fragmento de RNA em um DNA complementar (cDNA), 
permitindo assim sua integração ao genoma do hospedeiro. 
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial42
A diferença entre ambos os vírus, é que o processo que ocorre 
no HIV acaba sendo muito mais mutagênico, ou seja, criando cDNAs e 
posteriormente RNAs com regiões polimórficas, já o genoma do HTLV-1 
consegue ser muito mais estável. 
Apesar de o HTLV não estar inserido nem mesmo na lista de 
doenças negligenciadas (do tanto que é um patógeno negligenciado), 
sua epidemiologia é altamente concentrada, dentre todos os locais do 
mundo. 
IMPORTANTE:
Um fato importante que aumenta sua importância 
epidemiológica é que, como ambos os vírus, HIV-1 e 
HTLV-1, possuem as mesmas rotas de infecção (via contato 
sexual, lesãocom materiais perfurocortantes infectados 
e entre outro), existem muitos casos de co-infecção por 
ambos os agentes virais.
Existem testes sorológicos para ambas as doenças, porém, a forma 
mais sensível de se diagnosticar esses vírus é através da técnica de PCR, 
a qual irá amplificar as regiões virais a partir de um primer. Essa técnica é 
ainda mais requisitada para os casos de infecção por HTLV-1. Esse vírus, 
por ter uma atuação, em sua maioria, lisogênica, ele não libera partículas 
virais para o meio plasmático, sendo assim, tornando difícil a detecção 
desse vírus por métodos sorológicos e também a sua infecção para novos 
hospedeiros via acidente com materiais infectados, como agulha. Sendo 
assim, a extração do DNA viral no genoma das células infectadas para a 
amplificação via PCR é a melhor forma de diagnóstico desse vírus. 
Um método mais sensível para o diagnóstico do HTLV-1 é o uso da 
técnica de Nested PCR, que é uma segunda amplificação a partir do DNA 
amplificado anteriormente. Essa técnica permite a amplificação de uma 
região dentro da região amplificada. A RT-PCR vai permitir a amplificação 
de mais de uma região gênica de ambos os vírus (HIV-1 e HTLV-1), 
permitindo uma maior discriminação na detecção de ambos os vírus.
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 43
Herpes vírus
Herpes é uma doença que normalmente está associada às 
manifestações dérmicas, como acontece com as pessoas infectadas 
pelo Vírus Varicela-Zóster, o causador da catapora (Varicela) e o herpes 
vírus tipo 1 e 2, causador do herpes simplex. Esses vírus possuem a 
capacidade de permanecer em latência por longos períodos de tempo, 
como o que ocorre com o varicela-zoster, capaz de permanecer em 
latência nos gânglios nervosos, e quando ativado, pode provocar 
doenças do sistema nervoso periférico (SNP). 
O herpes vírus tipo 1 é causador de lesões em mucosas da boca, 
face e tronco, enquanto que o herpes vírus tipo 2 está relacionado às 
infecções na genitália e de transmissão geralmente sexual. Entretanto, 
os dois vírus podem infectar qualquer área da pele ou das mucosas. 
As manifestações clínicas são distintas e relacionadas ao estado 
imunológico do hospedeiro.
O citomegalovírus (CMV) é outro vírus pertencente à família do 
herpes vírus. Seu nome reflete ao fato de ele ser o maior vírus dentre 
todos os outros. Normalmente, esses vírus infectam as pessoas desde 
a sua infância, podendo ser transmitido via respiratória (tosse, espirros, 
fala, saliva, secreção brônquica) sendo essa via a principal, transmissão 
vertical, transfusão sanguínea e entre outros. Ele pode não causar 
nenhuma manifestação clínica, ou causar febre baixa até doenças graves 
que comprometem o aparelho digestivo, sistema nervoso central e retina. 
O Epstein Barr (EBV) é um vírus da família do herpes, também 
conhecido como Herpervírus4 humano, tem a capacidade de gerar um 
processo patológico glandular, também chamado de “febre glandular” 
ou “doença do beijo”, a mononucleose infecciosa. É uma doença de 
baixa mortalidade e letalidade, de manifestações agudas e geralmente 
benignas, com achados clínicos como amigdalo faringite, linfadenopatia 
e hepatoesplenomegalia. 
A técnica de PCR, mais uma vez, é capaz de identificar, quantificar 
e discriminar os tipos virais dos agentes pertencentes à família herpes. 
Sendo assim, a técnica em tempo real, que consegue amplificar mais de 
uma região gênica de cada vírus e quantificar em tempo real, é a melhor 
técnica, de biologia molecular, para o diagnóstico preciso.
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial44
Infecção bacteriana e seus genes de resistência
As bactérias são organismos celulares muito importantes para 
a manutenção da homeostasia corpórea, já que elas participam de 
funções essenciais para o organismo humano, como a defesa inata. 
Entretanto, algumas bactérias que fazem parte de um sistema corpóreo 
(a pele, comoStaphylococcus aureus) podem causar doenças em partes 
diferentes do corpo ou até mesmo na mesma região de colonização, 
isso por conta de sua característicaoportunista, esperando uma brecha 
do sistema imune para gerar doença. 
Entretanto, há outras bactérias que são patogênicas em 
todos os casos, como a Mycobacterium tuberculosis, agente da 
tuberculose; Mycobacterium leprae, agente etiológico da hanseníase; 
Neisseriameningitidis, um diplococo, principal causador da meningite; 
Streptococcus pneumoniae, causador da pneumonia e em casos mais 
graves da meningite também; Treponema pallidum, causador da sífilis; 
Leptospira, agente causador da leptospirose, entre outros.
VOCÊ SABIA?
Um dos maiores riscos para a saúde é a sepse. A sepse 
é uma reação imunológica generalizada em resposta à 
difusão plasmática de uma bactéria. Os lipopolissacarídeos 
presentes em sua parede celular irão estimular os 
monócitos e neutrófilos presentes na circulação, que irão 
liberar fatores quimiotáticos, citocinas, capazes de gerar 
toda manifestação pró-inflamatória. Sendo assim, essa 
manifestação pode ser causada por quaisquer bactérias, 
principalmente as contendo fatores de resistência para os 
mais diversos agentes antimicrobianos existentes.
Como explicado anteriormente, a resistência bacteriana é mediada 
pela conjugação entre uma bactéria, que irá transportar um plasmídeo 
contendo um fator de resistência bacteriana para uma outra bactéria 
receptora. Atualmente, existem bactérias resistentes aos antibióticos 
mais potentes, como vancomicina. Isso acaba sendo um grande 
problema para a saúde pública, já que esse paciente infectado com 
a chamada superbactéria, acaba tendo altas chances de mortalidade. 
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 45
Já foi identificado que há uma cepa da Neisseriagonorrhoeae, agente 
causador da gonorreia, como superbactéria. Essa cepa está associada a 
infecções faríngeas. 
Cepas bacterianas e seus genes de resistências podem ser 
identificadas em hemoculturas suplementadas com um antibiótico em 
específico. Entretanto, o resultado dessas hemoculturas demora de 24 a 
36 horas para serem liberadas. Portanto, técnicas em biologia molecular, 
sensíveis e rápidas, são usadas hoje em dia para dar um diagnóstico 
preciso e rápido. Em casos de sepse, por exemplo, um diagnóstico 
rápido tem grandes chances de salvar a vida de um paciente. Um método 
muito eficiente é a amplificação do gene 16S rDNA diretamente da 
hemocultura. O resultado mostrou que essa técnica foi duas vezes mais 
sensível que o método convencional, sugerindo assim a importância da 
aplicabilidade da PCR nesses casos.
Uma outra metodologia é a utilizando de chip-array, onde neles 
terão sondas capazes de hibridizar os plasmídeos contendo os genes 
de resistência. Essa técnica é sensível e muito mais rápida, provendo 
um diagnóstico em tempo hábil para aqueles pacientes com suspeita 
de sepse.
Protozoários
Os protozoários são seres eucariontes, ou seja, possuem núcleo 
celular organizado dentro de uma carioteca. A maioria deles são 
heterótrofos, embora alguns sejam autótrofos, produzem clorofila e com 
ela realizam a fotossíntese, onde vem a fonte de seus alimentos. Existem 
60.000 espécies conhecidas, sendo 10.000 parasitas de diferentes 
animais, e apenas algumas dezenas são agentes etiológicos de doenças 
humanas. Dentre elas, algumas são muito importantes à saúde pública, 
como as causadoras da giardíase, toxoplasmose, doença de chagas, 
leishmaniose, malária, tricomoníase e amebíase, por exemplo. 
A toxoplasmose é causada pelo Toxoplasma gondi, um esporo-
zoário muito relacionado à transmissão de animais a humanos, como por 
exemplo de gatos para grávidas. Nesse caso, há um grande risco para 
lesões na retina e sistema nervoso da criança em desenvolvimento. 
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial46
Mães que já tinham a toxoplasmose (infecção crônica) e 
engravidam, não são capazesde transmitir esse agente ao filho.
A malária é uma doença causada por protozoários que infectam 
o sangue. O Plasmodium falciparum, maior agente causador da malária, 
infecta as hemácias e são capazes de gerar complicações como calafrios, 
febre alta que duram de 3 a 4 horas, profundo mal-estar, cefaleia, náuseas 
e dores articulares. Algumas pessoas têm uma melhora espontânea ou 
uma morte devido a complicações pulmonares, renais e coma cerebral. 
O diagnóstico de todas essas infecções parasitárias pode ser 
realizado via PCR ou RT-PCR, para identificação e quantificação.
Imunogenética
A imunogenéticaé a área do conhecimento voltada ao estudo 
dos aspectos genéticos acerca das interações antígeno-anticorpo, 
mas não envolvendo um patógeno e um anticorpo produzido por um 
linfócito, e sim as características genéticas que definem as interações 
dos anticorpos com antígenos considerados “nossos” e antígenos 
considerados estrangeiros. Dentro dessa área, há divisões que pode em: 
estudo das doenças autoimunes, estudo das deficiências imunológicas, 
estudo dos mecanismos de transplante e estudo dos grupos sanguíneos.
Um dos ramos mais explorados, e que será foco na discussão 
a seguir, é a imunogenética dos transplantes. O transplante de órgãos 
é um procedimento altamente delicado, pois cada indivíduo possui 
uma configuração quanto à compatibilidade mediada pelo complexo 
principal de histocompatibilidade (HLA). Isso significa dizer que, assim 
como as pessoas possuem diferentes polimorfismos em locus contendo 
microssatélites, elas também podem conter diferenças em seus HLAs. E 
será justamente essa compatibilidade que será explorada nesse ramo, 
e pra haver a transfusão de um órgão a um indivíduo, a compatibilidade 
entre os HLAs deve ser a melhor possível. Caso não haja um bom 
nível de compatibilidade, o organismo hospedeiro irá rejeitar aquele 
enxerto transplantado, criando uma reação imunológica, podendo ser 
generalizada. 
Outra complicação é a Doença do Enxerto contra o Hospedeiro, 
atrelada ao transplante de medula óssea ou células tronco, onde as 
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 47
células enxertadas criaram resposta imunológica contra o organismo 
do hospedeiro. Além das complicações envolvendo rejeição, o órgão 
transplantado ou o organismo hospedeiro pode estar infectado com 
alguns vírus como o CMV, Varicela-zoster ou poliomavírus, como 
JCV e BKV, que normalmente estão no organismo humano em forma 
de latência, porém, ao hospedeiro ser submetido às terapias de 
imunossupressão, afim de evitar as repostas imunológicas de rejeição, 
esses vírus podem entrar em forma ativa, gerando suas complicações.
Complexo principal de histocompatibilidade
O complexo principal de histocompatibilidade humano (HLA), 
descrito em 1958, define-se como um conjunto de locus ligados 
intimamente no braço curto do cromossomo 6. Esses locus são 
responsáveis pela produção de aloantígenos, ou seja, antígenos que se 
diferem dentro de uma mesma espécie. Esses antígenos também são 
chamados de Antígenos de Leucócitos Humanos (HLA), cuja importância 
foi reconhecida inicialmente no campo dos transplantes de órgãos, por 
participarem do processo de rejeição quando transferidos para um 
hospedeiro incompatível. 
 O MHC humano é constituído pelas regiões gênicas de classe I, II 
e III. O sistema HLA é codificado por genes de classe I (A, B,C), os quais 
expressam glicoproteínas de superfície celular que são encontradas 
na membrana das células nucleadas do organismo e determinam 
o reconhecimento do antígeno pelo linfócito T. Os linfócitos que 
expressam moléculas CD8 reagem com as moléculas do MHC classe I. 
Esses linfócitos geralmente têm função citotóxica, sendo assim capazes 
de reconhecer qualquer célula infectada, visto que todas as células 
nucleadas expressam moléculas MHC de classe I. Sendo assim, o HLA 
de classe 1 (ou MHC de classe 1) é reconhecido somente por linfócitos 
T CD8. Alguns genes MHC de classe I codificam moléculas MHC não 
clássicas, como HLA-G (que pode ter um papel na proteção do feto 
contra a resposta imunitária materna) e HLA-E (que apresenta peptídeos 
para certos receptores nas células NK).
Os genes HLA de classe II (DR, DQ,DP) são expressos em linfócitos 
B, macrófagos, monócitos, linfócitos T ativados e células dendríticas 
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial48
foliculares, sendo reconhecidos assim como células apresentadoras 
de antígeno. Essas células irão determinar as interações delas com 
linfócitos CD4, afim de apresentar os antígenos a essas células para 
que uma reposta adaptativa seja criada. A maior parte das células 
nucleadas podem ser induzidas a expressar MHC de classe II pelo IFN 
gama. As moléculas de MHC classe II são formadas por duas cadeias 
polipeptídicas, as quais são codificadas por genes nas regiões HLA-DP, 
HLA-DQ ou HLA-DR do cromossomo 6.
A região de classe III contém muitos genes responsáveis por várias 
funções, incluindo proteínas do sistema complemento (C2, C4 e fator B), 
enzimas como a 21-hidroxilase, as enzimas glicosiladoras de moléculas 
HLA, fator de necrose tumoral alfa e beta (TNF), receptor para interferon 
gama, além de outros genes, cujos produtos ainda não foram definidos.
Os genes do sistema HLA são codominantes, isto é, tanto os 
de origem paterna como os de origem materna se expressam na 
membrana celular. O conjunto de antígenos codificados por genes de 
um cromossomo haploide (n) constitui um haplótipo. O conjunto de 
haplótipos paterno e materno constitui o genótipo, ou seja, dois alelos 
do mesmo gene, porém de pessoas diferentes, gerando um diploide 
(2n). Por herança Mendeliana simples, há 25% de probabilidade de dois 
irmãos apresentarem dois haplótipos comuns (HLA idênticos), 50% de 
probabilidade de apresentarem um haplótipo comum (haploidênticos) 
e 25% de probabilidade de não apresentarem identidade (HLA distintos).
Os locus HLA são os mais polimórficos conhecidos dentre do 
genoma humano. Cada loco HLA (A,B,C,DR,DQ e DP) pode ser ocupado 
alternativamente por uma série de genes alélicos. 
SAIBA MAIS:
O polimorfismo MHC é tão elevado que frequentemente 
a heterozigose, em populações acasaladas ao acaso, 
aproxima-se de 100%. É praticamente impossível encontrar 
dois indivíduos, não aparentados, portando o mesmo 
genótipo HLA.
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 49
A diversidade de genes, o polimorfismo, a herança mendeliana 
simples e a participação de genes HLA na resposta imune constituem 
as principais características que tornam o complexo HLA extremamente 
atraente sob o ponto de vista de estudos de doenças e também a razão 
de estudá-lo para entender o porquê de ser tão difícil encontrar um 
doador HLA compatível, sendo empregadas provas para identificar a 
compatibilidade entre indivíduos, antes da transfusão.
Prova Cruzada
A prova cruzada é empregada para identificar anticorpos pré-
formados, específicos para o órgão doador, sendo assim considerado 
uma simulação do transplante in vitro. Ainda que seja o primeiro 
transplante, o teste vai identificar se os receptores do receptor possuem 
sensibilidade contra os antígenos de HLA do doador. Caso o resultado 
seja positivo, então aquele doador apresenta um alto risco para o 
receptor, significando uma resposta cruzada contra o HLA do doador. 
Essa metodologia pode ser aplicada em citometria de fluxo, onde 
será incubado o soro do paciente a receber o órgão com linfócitos do 
doador. Após a incubação, que deve ocorrer a formação de complexo 
antígeno-anticorpo (se no soro houver a presença de anticorpos anti-
HLA), adiciona-se a reação, anticorpos monoclonais marcados com 
fluorescência direcionados aos linfócitos T e B, que será detectada 
pelo citômetro de fluxo a reação positiva ou negativa. A citometria vai 
identificar os anticorpos anti-HLA do doador, devido a sensibilização