Prova 2 Bioinformática

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Universidade de Brasília
Prova 2 - Bioinformática
Brasília - DF
2019
Sumário
1	Gene Alvo	6
2	Alinhamento de sequências	6
2.1	Alinhamento Local?	6
2.1.1	Forneça o nome de 1 programa do EMBOSS (nome e link)	6
2.1.2	Forneça o nome de 1 programa no site do EBI (nome e link)	6
2.2	Alinhamento Global?	6
2.2.1	Forneça o nome de 1 programa do EMBOSS (nome e link)	7
2.2.2	Forneça o nome de 1 programa no site do EBI (nome e link)	7
2.3	Alinhamento Múltiplo?	7
2.3.1	Forneça o nome e link de 1 programa do EMBOSS	7
2.3.2	Forneça o nome e link de pelo menos 3 outros programas diferentes na web	7
2.4	Se você fosse visualizar os alinhamentos quais programas utilizaria?	7
2.4.1	Cite 2 programas com nome e link	7
3	BLAST e Homologia	8
3.1	Qual a diferença entre similaridade e homologia?	8
3.2	Defina genes ortólogos e parálogos. Mostre uma figura indicando tal relação	8
3.3	Genes que apresentam evolução convergente podem ser considerados homólogos? Porquê?	9
3.4	Defina o E-value do BLAST	9
3.5	Faça uma tabela mostrando os programas BLAST de acordo com o tipo de sequência de entrada e banco de dados de busca	9
4	BLAST	9
4.1	Dada a sequência nucleotídica de seu gene realize um BLASTn contra o banco NR?	9
4.1.1	Mostre um screenshot da árvore de distância dos resultados de BLAST (Distance tree of results)	10
4.1.2	A partir do relatório taxonômico (mostre um screenshot), quantos hits ocorrem em primatas?	10
4.2	Execute um BLASTp contra o genoma humano	10
4.2.1	Mostre a tabela com hits com E-value melhor que 10-7	11
4.3	Execute um BLASTp contra o genoma de camundongo	11
4.3.1	Mostre a tabela com hits com E-value melhor que 10-7	11
4.4	Gerar os seguintes alinhamentos par-a-par	11
4.4.1	Alinhamento global	11
4.4.2	Alinhamento local	12
4.4.3	Mostre uma tabela com as seguintes colunas para cada um dos quatro alinhamentos gerados: Nome das sequências (seu gene ID x best hit humano/camundongo), Tipo de alinhamento (local ou global), Escore de alinhamento, Porcentagem de identidade, Porcentagem de similaridade e Extensão do alinhamento (número de bases alinhadas).	15
4.5	Com base nos resultados você pode descrever se:	15
4.5.1	Existem genes ortólogos?	15
4.5.2	Existem genes parálogos?	15
5	Alinhamentos	15
5.1	Realize um alinhamento múltiplo dos ortólogos com o programa T-Coffee	15
5.1.1	Mostre um screenshot da tela com os resultados	16
5.1.2	Salvar o alinhamento no formato clustalw. Use este arquivo para carregar no programa Jalview	16
6	Primers de PCR	17
6.1	Usando as primeiras 2000 bases da sequência do seu gene desenhe primers com o Primer3 ou Primer3plus. Utilizar os seguintes parâmetros: Produto de tamanho entre 500 e 600 e Tm ótimo de 64ºC.	17
6.1.1	Mostre um screenshot da página de resultados	18
6.2	Para seu gene de interesse, selecione algum transcrito e execute o Primer-Blast	18
6.2.1	Mostre um screenshot da tela de resultados do Primer-BLAST	19
6.3	O seu par de primer seria específico para o seu gene? Explique e mostre um screenshot	19
6.4	Você deseja verificar se este par de primers amplifica genes de outros primatas. Realize um Primer-BLAST fornecendo a sequência do seu par de primers	20
6.4.1	Mostre um screenshot do formulário de entrada para executar este BLAST	20
6.4.2	Mostre um screenshot dos resultados	20
6.4.3	Cite pelo menos três outras espécies de primatas que teriam este gene amplificado por estes primers (se existirem)	21
Lista de figuras
Figure 1 – Imagem ilustrativa de um alinhamento local.	6
Figure 2 – Imagem ilustrativa de um alinhamento global	6
Figure 3 – Imagem esquemática de um alinhamento múltiplo de 3 sequências de aminoácidos.	7
Figure 4 – Ilustração esquemática da relação entre genes parálogos e genes ortólogos.	8
Figure 5 – Screenshot para a árvore de distância dos resultados do BLASTn. Foi utilizada a sequência nucleotídica do gene HBA1 humano.	10
Figure 6 – Relatório taxonômico do BLASTn. Foi utilizada a sequência nucleotídica do gene HBA1 humano.	10
Figure 7 – Screenshot da tabela de best hits do resultado do BLASTp. Todos os best hits da tabela apresentaram E-value melhor que 10-7. Para a realização do BLAST foi utilizada a sequência proteíca da HBA1 humana contra o genoma humano.	11
Figure 8 – Screenshot da tabela de best hits do resultado do BLASTp. Todos os best hits da tabela apresentaram E-value melhor que 10-7. Para a realização do BLAST foi utilizada a sequência proteíca da HBA1 humana contra o genoma de camundongo.	11
Figure 9 –Alinhamento global entre a sequência da HBA1 humana e o best hit do BLASTp contra o genoma humano.	12
Figure 10 – Alinhamento global entre a sequência da HBA1 humana e o best hit do BLASTp contra o genoma de camundongo.	12
Figure 11 – Output do programa water no pacote EMBOSS. É possível visualizar o alinhamento local que devido ao tamanho da sequência e a alta similaridade transformou-se em um alinhamento global. Foi utilizada a sequência proteíca da HBA1 humana e o best hit do BLASTp contra o genoma humano	13
Figure 12 – Output do programa water no pacote EMBOSS. É possível visualizar o alinhamento local que devido ao tamanho da sequência e a alta similaridade transformou-se em um alinhamento global. Foi tuilizada a sequência proteíca da HBA1 humana e o best hit do BLASTp contra o genoma de camundongo.	14
Figure 13 – Screenshot do output do programa T-coffee para o alinhamento múltiplo de 10 sequências proteícas de genes ortólogos da HBA1 humana.	16
Figure 14 – Screenshot do Jalview onde é possível visualizar o alinhamento múltiplo, colorido pela porcentagem de identidade. As regiões mais conversavadas foram selecionadas e aparecem em vermelho.	16
Figure 15 – Screenshot da árvore filogenética gerada pelo programa Jalview para o alinhamento múltiplo de 10 sequências proteícas de genes ortólogos da HBA1 humana.	17
Figure 16 – Screenshot da página de resultados do programa Primer3 para a sequência do gene da HBA1 humana.	18
Figure 17 – Screenshot da tela de resultados do Primer-BLAST para a sequência do mRNA da HBA1 humana.	19
Figure 18 – Screenshot do resultado do Primer-BLAST para a sequência do mRNA da HBA1 humana. É possível notar os resultados específicos para o par de Primer 6, que é o par que possui a maior extensão do tamanho do produto.	19
Figure 19 – Screenshot do formulário de entrada para a execução do Primer-BLAST. É desejável saber se os primers adquiridos amplificam genes de outros primatas.	20
Figure 20 – Screenshot dos resultados do Primer-BLAST. É desejável saber se os primers adquiridos amplificam genes de outros primatas.	20
1 Gene Alvo
O gene alvo do presente trabalho é o HBA1 de Homo sapiens, cujo gene ID é: 3039.
2 Alinhamento de sequências
2.1 Alinhamento Local?
O alinhamento local trata-se de comparar duas sequências, de nucleotídeos ou de aminoácidos, em busca de uma sub-região de maior similaridade entre essas duas sequências.
Figure 1 – Imagem ilustrativa de um alinhamento local.
2.1.1 Forneça o nome de 1 programa do EMBOSS (nome e link)
Um programa do EMBOSS para realizar alinhamento local de sequências é o: water. Cujo a referência para o programa com PMID é: 7265238.
2.1.2 Forneça o nome de 1 programa no site do EBI (nome e link)
Um programa do site EBI para realizar alinhamento local de sequências é o: matcher. Cuja referência para o programa com PMID é: 2448477.
2.2 Alinhamento Global?
O alinhamento global trata-se de comparar, do começo ao fim, duas sequências, de nucleotídeos ou de aminoácidos, em busca de similaridade. 
Figure 2 – Imagem ilustrativa de um alinhamento global
2.2.1 Forneça o nome de 1 programa do EMBOSS (nome e link)
Um programa do EMBOSS para a realização de alinhamentos globais é o: needle. Cuja referência com PMID é: 5420325.
2.2.2 Forneça o nome de 1 programa no site do EBI (nome e link)
Um programa do site do EBI para a realização de alinhamentos globais é o: stretcher. Cuja referência no PMID é: 3382986.
2.3 Alinhamento Múltiplo?
O alinhamento múltiplo é a busca por similaridades, normalmente através de alinhamentos globais, para três ou mais entradas de sequênciasnucleotídicas ou de aminoácidos.
Figure 3 – Imagem esquemática de um alinhamento múltiplo de 3 sequências de aminoácidos.
2.3.1 Forneça o nome e link de 1 programa do EMBOSS
Um programa do EMBOSS para a realização de alinhamentos múltiplos é o: emma. Cuja referência com PMID é: 7984417.
2.3.2 Forneça o nome e link de pelo menos 3 outros programas diferentes na web
Outros 3 programas da web para a realização de alinhamentos múltiplos são: T-coffee, Muscle e MAFFT. As referências com PMID, em ordem são: 10964570, 15034147, 23677614.
2.4 Se você fosse visualizar os alinhamentos quais programas utilizaria?
2.4.1 Cite 2 programas com nome e link
Os programas utilizados seriam Jalview ou Mview. As referências com PMID, em ordem são: 19151095 e 9632837.
3 BLAST e Homologia 
3.1 Qual a diferença entre similaridade e homologia?
A homologia pode ser definida como a similaridade atribuída a descendência de um ancestral comum, enquanto que a similaridade por sua vez pode ser definida como o quanto uma sequência é semelhante ou parecida com outra sequência. Dessa forma a principal diferença entre os dois conceitos é que a similaridade pode ser quantificada, dessa forma podemos medir graus de similaridade, enquanto que a homologia possui um caráter booleano, sendo ou verdadeira ou falsa. 
3.2 Defina genes ortólogos e parálogos. Mostre uma figura indicando tal relação
Genes ortólogos são genes que divergiram por meio de especiação, sendo que cada descendente recebeu uma cópia do mesmo gene original. Nessa caso há um tendência em conserver a função. Por exemplo: A subunidade A da hemoglobina Humana e a subunidade A da hemoglobina Bovina. 
Genes parálogos são genes que divergiram por meio de duplicação em um mesmo organismo, dessa forma uma das cópias pode acumular diferenças significativas e vir a possuir outra função, ou a mesma função com outras características. Por exemplo: Subunidade A da hemoglobina Humana e subunidade B da hemoglobina Humana
Figure 4 – Ilustração esquemática da relação entre genes parálogos e genes ortólogos.
3.3 Genes que apresentam evolução convergente podem ser considerados homólogos? Porquê?
Esses genes que apresentam evolução convergente não podem ser considerados homólogos, pois por definição a homologia é a similaridade atribuída a descendência de um ancestral comum. Logo, no caso de convergência evolutiva, dois genes podem adquirir certo grau de similaridade sem que esses sejam necessariamente relacionados por um ancestral comum. 
3.4 Defina o E-value do BLAST
O E-value é um valor que mostra o número de alinhamentos com escore maior ou igual ao escore obtido e que poderia aparecer puramente ao acaso. Em outras palavras, o E-value mensura a chance de um alinhamento aparecer na lista de best hits apenas por aleatoriedade. 
3.5 Faça uma tabela mostrando os programas BLAST de acordo com o tipo de sequência de entrada e banco de dados de busca
Tabela 1 – Programas do BLAST de acordo com sua sequência de entrada e o banco de dados de busca
	Programas do BLAST
	Sequência de entrada
	Banco de dados de busca
	blastn
	Nucleotídeos
	Nucleotídeos
	blastp
	Aminoácidos
	Aminoácidos
	blastx
	Nucleotídeos
	Aminoácidos
	tblastn
	Aminoácidos
	Nucleotídeos
	tblastx
	Nucleotídeos
	Nucleotídeos
4 BLAST
Com a sequência proteíca de seu gene, execute as seguintes buscas por similaridade com o programa BLAST especializado para a tarefa.
4.1 Dada a sequência nucleotídica de seu gene realize um BLASTn contra o banco NR?
Para a realização do BLASTn foi utilizada a seguinte sequência nucleotídica do gene HBA1: NM_000558.5.
4.1.1 Mostre um screenshot da árvore de distância dos resultados de BLAST (Distance tree of results)
Figure 5 – Screenshot para a árvore de distância dos resultados do BLASTn. Foi utilizada a sequência nucleotídica do gene HBA1 humano.
4.1.2 A partir do relatório taxonômico (mostre um screenshot), quantos hits ocorrem em primatas?
De acordo com o relatório taxonômico, 77 hits ocorrem em Primatas.
Figure 6 – Relatório taxonômico do BLASTn. Foi utilizada a sequência nucleotídica do gene HBA1 humano.
4.2 Execute um BLASTp contra o genoma humano
Para a execução do BLASTp foi utilizada a sequência proteíca da HBA1 humana: P69905. O BLASTp foi executado para o banco UniProt. 
4.2.1 Mostre a tabela com hits com E-value melhor que 10-7 
Todos os best hits da tabela apresentaram E-value melhor que 10-7. 
Figure 7 – Screenshot da tabela de best hits do resultado do BLASTp. Todos os best hits da tabela apresentaram E-value melhor que 10-7. Para a realização do BLAST foi utilizada a sequência proteíca da HBA1 humana contra o genoma humano.
4.3 Execute um BLASTp contra o genoma de camundongo
4.3.1 Mostre a tabela com hits com E-value melhor que 10-7
Todos os best hits da tabela, apresentaram E-value melhor que 10-7. 
Figure 8 – Screenshot da tabela de best hits do resultado do BLASTp. Todos os best hits da tabela apresentaram E-value melhor que 10-7. Para a realização do BLAST foi utilizada a sequência proteíca da HBA1 humana contra o genoma de camundongo.
4.4 Gerar os seguintes alinhamentos par-a-par
4.4.1 Alinhamento global
4.4.1.1 seu gene alvo e o best hit dos resultados do BLAST contra o genoma humano
O best hit do BLASTp contra o genoma humano é a propria sequência do meu gene alvo: P69905.
Figure 9 –Alinhamento global entre a sequência da HBA1 humana e o best hit do BLASTp contra o genoma humano.
4.4.1.2 seu gene alvo e o best hit dos resultados do BLAST contra o genoma de camundongo
O best hit do BLASTp contra o genoma de camundongo é: P01942.
Figure 10 – Alinhamento global entre a sequência da HBA1 humana e o best hit do BLASTp contra o genoma de camundongo.
4.4.2 Alinhamento local
Devido aos tamanhos das sequências alvo e dos best hits e também da alta similaridade entre toda a sequência, os alinhamentos locais foram alinhados de tal forma que esses tornaram-se alinhamentos globais. Isso ocorreu pois a sub-região de maior similaridade entre as duas sequências é a própria sequência completa.
4.4.2.1 seu gene alvo e o best hit dos resultados do BLAST contra o genoma humano
Figure 11 – Output do programa water no pacote EMBOSS. É possível visualizar o alinhamento local que devido ao tamanho da sequência e a alta similaridade transformou-se em um alinhamento global. Foi utilizada a sequência proteíca da HBA1 humana e o best hit do BLASTp contra o genoma humano
4.4.2.2 seu gene alvo e o best hit dos resultados do BLAST contra o genoma de camundongo
Figure 12 – Output do programa water no pacote EMBOSS. É possível visualizar o alinhamento local que devido ao tamanho da sequência e a alta similaridade transformou-se em um alinhamento global. Foi tuilizada a sequência proteíca da HBA1 humana e o best hit do BLASTp contra o genoma de camundongo. 
4.4.3 Mostre uma tabela com as seguintes colunas para cada um dos quatro alinhamentos gerados: Nome das sequências (seu gene ID x best hit humano/camundongo), Tipo de alinhamento (local ou global), Escore de alinhamento, Porcentagem de identidade, Porcentagem de similaridade e Extensão do alinhamento (número de bases alinhadas).
Tabela 2 – Alinhamentos globais e locais entre a HBA1 humana e os best hits do BLAST contra o genoma humano e contra o genoma de camundongo.
	Nome das sequências
	Tipo de alinhamento
	Escore de alinhamento
	Porcentagem de identidade
	Porcentagem de similaridade
	Extensão do alinhamento
	P69905 X P69905
	Global
	733
	100%
	100%
	142 bp
	P69905 X P01942
	Global
	645
	86%
	92%
	142 bp
	P69905 X P69905
	Local
	733
	100%
	100%
	142 bp
	P69905 X P01942
	Local
	648
	85,90%
	92,30%
	142 bp
4.5 Com base nos resultados você pode descrever se:
4.5.1 Existem genes ortólogos?
Sim, com base nos resultados de BLAST é possível dizer que existem genes ortólogos para a HBA1 humana em diversos outros organismos. Um desses exemplos é a HBA1 de Mus musculus.
4.5.2 Existem genes parálogos?
Sim, com base nos resultados de BLAST contra o genoma humano foi possível observer a ocorrência de genes parálogos, como por exemplo: HBQ1 humana.5 Alinhamentos
Para a realização de alinhamentos, busque ortólogos para o seu gene no banco Gene. Utilizar até 10 sequências ortólogas.
5.1 Realize um alinhamento múltiplo dos ortólogos com o programa T-Coffee
Para a realização do alinhamento múltiplo foi utilizada a sequência proteíca dos seguintes genes ortólogos identificados pelo GeneID: 3039, 732485, 100036557, 100136297, 394454, 25632, 416652, 100172834, 100137279 e 701930.
5.1.1 Mostre um screenshot da tela com os resultados
O cabeçalho do arquivo FASTA foi modificado para conter o nome do gênero dos organismos ao qual a sequência pertencia e dessa forma facilitar a visualização dos resultados.
Figure 13 – Screenshot do output do programa T-coffee para o alinhamento múltiplo de 10 sequências proteícas de genes ortólogos da HBA1 humana.
5.1.2 Salvar o alinhamento no formato clustalw. Use este arquivo para carregar no programa Jalview
5.1.2.1 Mostre um screenshot do Jalview mostrando a região que você considera mais conservada
Figure 14 – Screenshot do Jalview onde é possível visualizar o alinhamento múltiplo, colorido pela porcentagem de identidade. As regiões mais conversavadas foram selecionadas e aparecem em vermelho.
5.1.2.2 Mostre um screenshot de uma árvore filogenética calculada utilizando o método do menu Calculate Neighbor Joining Using % identity
Figure 15 – Screenshot da árvore filogenética gerada pelo programa Jalview para o alinhamento múltiplo de 10 sequências proteícas de genes ortólogos da HBA1 humana.
6 Primers de PCR
6.1 Usando as primeiras 2000 bases da sequência do seu gene desenhe primers com o Primer3 ou Primer3plus. Utilizar os seguintes parâmetros: Produto de tamanho entre 500 e 600 e Tm ótimo de 64ºC.
Para o desenho dos primers foi utilizada a sequência do gene da HBA1 humana: NG_059186.1. Essa sequência possui um tamanho de 843 pares de bases.
6.1.1 Mostre um screenshot da página de resultados
Figure 16 – Screenshot da página de resultados do programa Primer3 para a sequência do gene da HBA1 humana.
6.2 Para seu gene de interesse, selecione algum transcrito e execute o Primer-Blast
Foi selecionada a sequência do mRNA do gene da HBA1 humana: NM_000558.5 
6.2.1 Mostre um screenshot da tela de resultados do Primer-BLAST
Figure 17 – Screenshot da tela de resultados do Primer-BLAST para a sequência do mRNA da HBA1 humana. 
6.3 O seu par de primer seria específico para o seu gene? Explique e mostre um screenshot
Não. O meu melhor par de primer, que é o par de Primer 6, que abrange toda a exntesão do meu gene, não é específico apenas para a HBA1. Ele também poderia ser utilizado para o gene HBA2 humano, tendo em vista que o primer da fita líder é idêntico em sequência ao gene HBA2 (NM_000517.6) e o primer da fita reversa muda em apenas 1 nucleotídeo, porém esse não seria suficiente para que não ocorresse o anelamento. 
Figure 18 – Screenshot do resultado do Primer-BLAST para a sequência do mRNA da HBA1 humana. É possível notar os resultados específicos para o par de Primer 6, que é o par que possui a maior extensão do tamanho do produto.
6.4 Você deseja verificar se este par de primers amplifica genes de outros primatas. Realize um Primer-BLAST fornecendo a sequência do seu par de primers
6.4.1 Mostre um screenshot do formulário de entrada para executar este BLAST
Figure 19 – Screenshot do formulário de entrada para a execução do Primer-BLAST. É desejável saber se os primers adquiridos amplificam genes de outros primatas.
6.4.2 Mostre um screenshot dos resultados
Figure 20 – Screenshot dos resultados do Primer-BLAST. É desejável saber se os primers adquiridos amplificam genes de outros primatas. 
6.4.3 Cite pelo menos três outras espécies de primatas que teriam este gene amplificado por estes primers (se existirem)
Para citar 3 primatas, dentre todos da lista de resultados, que também teriam a HBA1 amplificada por esse par de primers, seriam: Pan troglodytes, Pongo abelii e Macaca mulatta.