Bactérias geneticamente modificadas em Biotecnologia

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Instituto de Ciências Biomédicas 
USP
Bactérias geneticamente modificadas em Biotecnologia
1. Contexto histórico
2. Ferramentas da Engenharia Genética 
2.1. DNA-ligase
2.2. Enzimas de restrição
2.3. Métodos para Transformação genética bacteriana (E. coli)
2.4. Construção de recombinantes bacterianos
2.5. Seleção e Análise dos clones recombinantes construídos
3. Como funciona a técnica CRISPR-CAS9
4. Inovações: Alguns produtos derivados da Engenharia Genética bacteriana
5. Questões 
Profa. Elisabete Vicente. bevicent@usp.br
1. Transferência do material genético - Contexto histórico
Em 1928,
Frederick Griffith um pneumologista inglês observou pela
primeira vez a TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA BACTERIANA
Ele tinha 2 cepas da bactéria que ele chamava Diplococcus
pneumoniae (atualmente melhor denominada Streptococcus
pneumoniae):
- A cepa lisa S (tinha cápsula) viva, quando injetada em
camundongo, levava a sua morte;
- A cepa rugosa R (NÃO tinha cápsula) viva, quando injetada
em camundongo, não causava a sua morte.
Então,
- Inoculou no camundongo cepa lisa S inativada pelo calor,
e também observou que não causava sua morte;
- Inoculou uma mistura da cepa lisa S inativada pelo calor +
cepa rugosa R viva. Esta mistura causava a morte do
camundongo.
Conclusão de Griffith:
Há alguma coisa que é transferida da “cepa rugosa” para a
“cepa lisa” que promove a sua TRANSFORMAÇÃO.
Streptococcus pneumoniae 
- cepa lisa S
A natureza do material genético é o DNA
1944: Avery, MacLeod, McCarty
1. Transferência do material genético - Contexto histórico
Em 1943,
as técnicas da Bioquímica já haviam avançado, 
permitindo aos pesquisadores Avery, MacLeod e 
McCarty realizarem a separação do lisado bacteriano 
chamado de “Principio Transformante” em frações de 
macromoléculas:
- Lipídeos
- Polissacarídeos
- Proteínas
- Ácidos Nucléicos
Experimento:
- Eles incubaram bactérias com cada uma destas 
frações. Verificaram que apenas a Fração que continha 
Ácidos Nucléicos (DNA e RNA) promovia a 
“Transformação Genética: bacteriana. 
Conclusão de Avery, MacLeod e McCarty
A natureza do material genético é o DNA.
Em 1946,
Lederberg e Tatum perceberam que estavam diante de um novo mecanismo de
transferência de material genético entre bactérias.
Eles trabalhavam com dois mutantes auxotróficos da bactéria E. coli. Mutantes
auxotróficos crescem em meio completo, pois estes contêm hidrolisado de
proteínas; e somente crescem em em meio mineral quando estes são
suplementados com os devidos aminoácidos.
Experimento:
Incubaram os dois mutantes auxotróficos juntos em um único tubo que continha
meio completo. Após o cultivo, semearam uma alíquota em meio mineral.
Surpreendentemente, observaram crescimento de algumas colônias.
O que fizeram para entender o que estava ocorrendo?
Resposta: Experimento do Tubo em U. --> Premio Nobel !
- Construíram um “Tubo em U” (este foi o “equipamento”) com uma membrana
semipermeável no fundo, que permita a passagem de DNA, mas não permitia a
passagem de células bacterianas que são bem maiores;
-Os dois mutantes foram semeados em meio liquido completo, cada um deles de um
lado do “Tubo em U” ;
-Após o cultivo, alíquotas de ambos os lados do tubo foram semeadas em meio
mínimo sólido.
Resultado:
-Alíquotas coletadas de nenhum do “Tubo em U” originaram colônias em meio
mínimo sólido. Não foi observada qualquer transferência de material genético.
Conclusão de Lederberg e Tatum
Para que ocorra este tipo de transferência de material genético entre bactérias é
necessário o contato intimo entre ambas as células bacterianas. Chamaram este
novo mecanismo de “CONJUGAÇÃO BACTERIANA” .
A Conjugação NÃO ocorre 
A Conjugação ocorre 
Fig.: Bactérias realizando conjugação. Para que
ocorra a conjugação bacteriana é necessário que
haja contato intimo entre duas bactérias e que estas
estejam viáveis.
Posteriormente se verificou:
- que bactérias capazes de fazer conjugação têm plasmídeos conjugativos;
- Somente alguns plasmídeos são conjugativos.
Assim, as clonagens realizadas em “Engenharia Genética” busca-se trabalhar com plasmídeos 
não conjugativos, visando a sua não distribuição pelo meio ambiente.
1951: criação do termo “Engenharia Genética”
(“Genetic Engineering”) por Jack Williamson (1908-
2006), em sua novela ficcional “Gragon’s Island”
1. Transferência do material genético - Contexto histórico
A dupla dupla hélice do DNA
Em 1955,
Watson e Crick propuseram que a molécula do DNA 
tem estrutura em dupla hélice
A teoria foi construída com base em 3 conhecimentos:
1. Transferência do material genético - Contexto histórico
1) Conhecimento dos blocos construtores do DNA
Contém três tipos de componentes químicos:
- o fosfato,
- um açúcar (desoxirribose) e Fig.
- quatro bases nitrogenadas (adenina, timina, citosina, guanina)
3. Os resultados de difração de Raios X de Rosalind Franklin 
Raios-X foram disparados nas fibras de DNA purificado. A analise da dispersão destes raios
nas fibras foram captadas em um filme fotográfico.
Neste filme, os raios formam pontos e a interpretação da dispersão destes pontos pode ser
analisada empregando-se cálculos matemáticos.
Esta dispersão forma um ângulo e fornece informações sobre a posição de um ou de um
grupo de átomos na molécula de DNA.
Conclusão permitida por esta técnica: O DNA é uma molécula helicoidal, longa e fina,
contendo duas partes similares que são paralelas e correm ao longo da molécula.
2) Regras de Chargaff
Erwin Chargaff havia relatado que a quantidade de nucleotídeos
apresenta uma proporção numa mesma espécie. Assim,
- o número de timinas (T) é aproximadamente o mesmo de
adeninas (A) e
- O numero de citosinas (C) é aproximadamente o mesmo de
guaninas (G).
- Mas a quantidade de A+T não é necessariamente igual à
quantidade de C+G e essa proporção varia nos organismos
diferentes:
- Ex.: No DNA humano, há 30% de adenina, 30,3% de timina; e.
19,5% de guanina e 19,9% de citosina.
- Ex.: No DNA do rato há 28,6% de adenina, 28,4% de timina; e
21,4% de guanina e 21,5% de citosina.
Rosalind Franklin Foto da difração de raios-X de uma
molécula purificada de DNA mostrando
padrões que permitiram a determinação das
distâncias entre as bases A,T,C,G
constituintes
A dupla dupla hélice do DNA
Em 1955,
Watson e Crick propuseram que a molécula do DNA
tem estrutura em dupla hélice
A teoria foi construída com base em 3 conhecimentos:
1. Transferência do material genético - Contexto histórico
1) Conhecimento dos blocos construtores do DNA
Contém três tipos de componentes químicos:
- o fosfato,
- um açúcar (desoxirribose) e Fig.
- quatro bases nitrogenadas (adenina, timina, cianina, guanina)
3. Os resultados de difração de Raios X de Rosalind Franklin 
Raios-X foram disparados nas fibras de DNA purificado. A analise da dispersão destes raios
nas fibras foram captadas em um filme fotográfico.
Neste filme, os raios formam pontos e a interpretação da dispersão destes pontos pode ser
analisada empregando-se cálculos matemáticos.
Esta dispersão forma um ângulo e fornece informações sobre a posição de um ou de um
grupo de átomos na molécula de DNA.
Conclusão permitida por esta técnica: O DNA é uma molécula helicoidal, longa e fina,
contendo duas partes similares que são paralelas e correm ao longo da molécula.
2) Regras de Chargaff
Erwin Chargaff havia relatado que a quantidade de nucleotídeos 
apresenta uma proporção numa mesma espécie. Assim, 
- o número de timinas (T) é aproximadamente o mesmo de 
adeninas (A) e 
- O numero de citosinas (C) é aproximadamente o mesmo de 
guaninas (G). 
- Mas a quantidade de A+T não é necessariamente igual à 
quantidade de C+G e essa proporção varia nos organismos 
diferentes: 
- Ex.: No DNA humano, há 30% de adenina, 30,3% de timina; e. 
19,5% de guanina e 19,9% de citosina. 
- Ex.: No DNA do rato há 28,6% de adenina, 28,4% de timina; e 
21,4% de guanina e 21,5% de citosina.
Esquema de uma dupla fita de
DNA, sendo replicada.
https://books.google.com.br/books?id=CESjmRQtfrUC&printsec=frontcov
er&source=kp_read_button&redir_esc=y&hl=pt-BR#v=onepage&q&f=false1972 – Criação da PRIMEIRA MOLÉCULA DE DNA RECOMBINANTE:
Paul Berg realizou a primeira experiência bem sucedida onde foram ligadas duas cadeias genéticas diferentes:
- uma cadeia de DNA do fago λ junto ao óperon da galactose de Escherichia coli,
com
- o DNA do vírus SV40 (Simian vírus 40). Criação das Ferramentas da Engenharia Genética 
1. Transferência do material genético - Contexto histórico
O experimento histórico de Paul Berg e col. envolveu inserção de
DNA do bacteriófago lambda no DNA do vírus de símio SV40, cujo
hospedeiro natural é o macaco. O DNA de ambos os vírus ocorre
em “loops” fechados.
- 1ª Etapa: os loops foram cortados pela enzima de restrição
EcoRI, originando 2 moléculas lineares;
- 2ª Etapa: para unir as extremidades dessas duas moléculas
lineares, usando um procedimento desenvolvido pelos colegas
de Stanford;
- 3ª Etapa: os dois DNAs foram misturados, onde se reuniram
em “loops” de tal maneira que os novos “loops” combinavam
os DNA de cada fonte.
O experimento de Berg resultou no primeiro “DNA recombinante”
produzido pelo homem, como essas moléculas hibridas passaram a
ser chamadas.
A cerimônia de entrega do Prêmio Nobel de Química de Berg em
1980, compartilhada com Walter Gilbert e Frederick Sanger,
destacou este trabalho.
Fonte:
ftp://atenas.cpd.ufv.br/DBG/material%20curso%20bioinfo/Leitura
%20B%E1sica/Biochemical%20Method%20for%20Inserting%20
New%20Genetic%20Information%20Into%20DNA%20of%20Simi
an%20Virus%2040%20-%20Circular%20S.pdf
1. Transferência do material genético - Contexto histórico
1973 - Criação do PRIMEIRO OGM (ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO)
pelos labs de Herbert Boyer e Stanley Cohen
Genes de Resistência foram inseridos em um plasmídeo da bactéria Escherichia coli. criação das 
Ferramentas da 
Engenharia 
Genética 
Bactérias geneticamente modificadas em Biotecnologia
2. Ferramentas da Engenharia Genética 
2.1. DNA-ligase
2.2. Enzimas de restrição 
2.3. Métodos para Transformação genética bacteriana (E. coli)
2.4. Construção de recombinantes bacterianos
2.5. Seleção e Análise de clones recombinantes construídos
2.1. DNA-ligase
DNA ligase do bacteriófago T4
O fago T4 é um bacteriófago que infecta 
Escherichia coli que é capaz de sofrer um 
ciclo de vida lítico. 
Ao contrário da DNA ligase de E. coli, que 
utiliza como cofator o NAD, ela utiliza o 
ATP.
A DNA ligase de fago T4 é a DNA 
ligase mais utilizada em biologia 
molecular, porque ela pode ligar vários 
tipos de extremidades de DNA. 
- Extremidades abruptas de DNA, e,
- Extremidades coesivas (geradas pela 
ação de enzimas de restrição, que 
veremos a seguir).
Fig.: DNA ligase de fago T4: A imagem
demonstra como a ligase (oval amarela)
catalisa a ligação de duas cadeias de
fragmentos de DNA. A ligase une os dois
fragmentos de DNA para formar uma fita
mais longa de DNA, colando-os juntas.
1967: DNA ligase é descoberta - trabalhos com bacteriófagos lambda (Martin
Gellert).
A enzima DNA ligase
Todos os organismos possuem a enzima DNA ligase que
catalisa a ligação de duas fitas de DNA. E para quê?
Esta enzima é muito importante pois é necessária durante dois
processos básicos celulares:
- “Replicação do DNA” , e
- “Reparo de lesões que estejam presentes no DNA”.
Mecanismo de ação:
A DNA ligase catalisa a formação de duas ligações fosfodiéster
covalentes entre as extremidades hidroxila 3‘ de um
nucleotídeo ("aceitador"), com a extremidade fosfato 5' de
outra ("doadora"). Duas moléculas de ATP são consumidas
para cada ligação fosfodiéster formada.
2. Ferramentas da Engenharia Genética 
2.2. Enzimas de restrição
EXTREMIDADES
COESIVAS
“sticky ends”
EXTREMIDADES 
ABRUPTAS
EXTREMIDADES
COESIVAS
NOMENCLATURA 
As enzimas de restrição recebem nomes de acordo com a 
bactéria que a produziu, Ex.: 
EcoR I 
Gênero: Escherichia
Espécie: coli
Ordem de descoberta: 1ª enzima descoberta nesta bactéria
2.2. Enzimas de restrição
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO 
Proteínas que reconhecem e clivam o DNA em pontos específicos, 
geralmente em sequências de 4, 6 e 8 bases, palindrômicas 
(idênticas em ambas as fitas quando lidas 5’ --> 3’)
 
2.2. Enzimas de restrição
Exemplo de uma frase 
palindrômica:
“SUBI NO ONIBUS”
SUBINOONIBUS
SUBINOONIBUS
Enzimas de restrição: reconhecem sequencias 
palindrômicas 
GAATTC
Você sabe 
Qual foi a 
enzima aqui 
empregada? 
2.2. Enzimas de restrição
Qual enzima 
aqui foi 
empregada? 
2. Ferramentas da Engenharia Genética 
2.2. Enzimas de restrição
reconhecem sequencias palindrômicas 
Algumas Enzimas de restrição (reconhecem sequencias palindrômicas) 
extremidades coesivas 5’
(5’ protruding ends”)
extremidades abruptas 
(“blunt ends”)
NNGGATCCNN
NNCCTAGGNN
NNG_AATTCNN
NNCTTAA_GNN
2. Ferramentas da Engenharia Genética 
2.2. Enzimas de restrição
Alguns Exemplos de Enzimas de 
restrição
2.3. Métodos para Transformação genética bacteriana (E. coli)
Transformação genética por eletroporação
Transformação genética com CaCl2
Os dois métodos mais utilizados para se realizar a transformação genética da bactéria E. coli são: 
1974. Foi o primeiro método de “Transformação genética” de E.
coli desenvolvido.
É feita uma cultura de bactéria E. coli bem fresca. Quando esta
cultura está no meio da fase exponencial, as células são tratadas
com uma solução CaCl2, e a incubação e feita com os tubos
mergulhados em gelo picado.
Uma alíquota das células tratadas é incubada com uma alíquota de
plasmídeo que será empregado na transformação genética.
Apos a incubação, as células são semeadas em meio completo
solido contendo antibióticos.
Os clones recombinantes serão as colônias crescidas nas placas
contendo meio solido com antibiótico.
Posteriormente, foi desenvolvida uma nova técnica que permite a
obtenção de transformantes com maior eficiência. Ou seja , a
obtenção de mais transformantes com menor quantidade de DNA
plasmidial. Ao invés de fazer o tratamento com CaCl2, a mistura
das células bacterianas + plasmídeo é submetida a uma corrente
elétrica em um equipamento chamado “Eletroporador”. Equipamento Eletroporador e Cubeta de 
incubação 
2.3. Métodos para Transformação genética bacteriana (E. coli)
 Transformação genética com CaCl2
Os dois métodos mais utilizados para se realizar a transformação genética da bactéria E. coli são:
Atualmente, protocolos completos, derivados destes originais
podem ser encontrados em Sambrook, J., Fritsch, E.F., and
Maniatis, T.,
Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold
Spring harbor laboratory press, 1989.
Também podem ser obtidos em vários sites, como:
https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/competent-
cells.html?gclid=EAIaIQobChMIn-OSq_-
n6gIVjISRCh3JlQAGEAAYASAAEgIGqPD_BwE
Transformação genética por eletroporação
1973. COHEN E BOYER
Constroem o primeiro OGM - Organismo geneticamente modificado
Qual foi a sequencia de eventos ?
• Organismos vivos podem ser portadores de genes de outros organismos;
• Enzimas de restrição clivam DNA e, com estes fragmentos, é possível construir DNA recombinante;
• Fragmentos de DNA isolados de um organismo podem ser manipuladas e inseridas outro organismo 1º OGM 
Atualmente, nos preocupamos com:
quais serão as Etapas que serão empregadas para CONSTRUIR o OGM ? a Segurança!
- Qualidade desejada (o que queremos obter afinal?)
- Fonte do DNA:
DNA total, cDNA, PCR, Síntese in vitro, Bibliotecas metagenômicas, outras possibilidades
- Que técnica empregar para Construir o DNA recombinante desejado:
Clonagem dos fragmentos em vetores, diferentes tipos de vetores, CRISP-CAS9,
- Qual será o hospedeiro da molécula recombinante construída
2. Ferramentas da Engenharia Genética 
2.4. Construção de recombinantes bacterianos
Construção de uma molécula de DNA recombinante 
1. Enzimas de restrição
2. DNA-ligase de fago T4
2. Ferramentas da Engenharia Genética 
2.4. Construção de recombinantes bacterianos
1ª Etapa: Construção in vitro
de uma molécula de DNA
recombinante
Mas, 
estas etapas são realizadasem microtubos (do tipo 
“Eppendorf”), 
e
como fazer para amplificar o 
número destas moléculas de 
DNA recombinante? 
2. Ferramentas da Engenharia Genética 
2.4. Construção de recombinantes bacterianos
Hospedagem do plasmídeo recombinante
Emprego do plasmídeo recombinante em TRANSFORMAÇÃO 
GENÉTICA da bactéria E. coli
Clivagem com 
enzima de 
restrição 
Ligação 
covalente pela 
DNA ligase 
DNA exógeno 
Transformação
Genética 
(inserção em 
bactéria)
Plasmídeo
. 
Clivagem com 
enzima de 
restrição 
Seleção
dos clones 
bacterianos 
recombinantes
Semeadura em Meio sólido 
contendo antibiótico 
2.4. Construção de recombinantes bacterianos
2ª Etapa:
- Enzimas: enzimas de restrição 
- DNA ligase de fago T4
Vetores de clonagem ( tamanhos de insertos permitidos) :
- Plasmídeos (0,1 a 10 Kb)
- Fago λ (0,1 a 18 Kb)
- Cosmídeos, combinam vantagens de plasmídeos e de fagos) (20 a 50 Kb)
- BAC (“bacterial artificial chromossomes”), permitem a clonagem de fragmentos de DNA ainda maiores, que 
depois podem ser sub-clonados em plasmídeos.
Insertos:
- Fragmentos de DNA digeridos por Enzimas de Restrição
- Fragmentos de DNA amplificados por PCR
- cDNA (DNA complementar sintetizado a partir de um mRNA)
Hospedeiros finais:
- E. coli
- Levedura (Saccharomyces cerevisiae e outras )
- Células animais,
- Células vegetais
2. Ferramentas da Engenharia Genética 
2.4. Construção de recombinantes bacterianos 
Algumas ferramentas usadas para obter um OGM
Obs: mesmo quando o hospedeiro final não seja E. coli, 
esta bactéria é sempre empregada na primeira Etapa de 
clonagem e seleção dos vetores recombinantes. Somente 
após esta Etapa, DNA recombinante analisado e 
isolado/purificado em quantidade suficiente é empregada 
para realizar a Transformação genética do hospedeiro final.
Etapas anteriores: Foram construídos in vitro dos plasmídeos recombinantes, 
 a mistura de ligação foi empregada na transformação genética 
 de E. coli., e células bacterianas transformadas foram semeadas 
 em meio solido contendo antibiótico.
 
Fig.: (a) Semeadura da mistura de ligação em (b)meio solido contendo antibiótico
2. Ferramentas da Engenharia Genética 
2.4. Seleção e Análise de clones recombinantes construídos
(a) (b)
Nesta Etapa: Seleção das colônias bacterianas que crescem em meio sólido com antibiótico e que contem o inserto desejado. Como deve ser 
feita depende do tipo que plasmídeo que foi empregado na construção in vitro.
 Quando e empregado plasmídeo do tipo 
pBR322 (meto mais antigo, mas ainda em uso) 1) Plasmídeo + inserto são digeridos com a mesma Enzima, por 
Exemplo, com BamHI; e é feita a ligação de ambos com T4-
DNA ligase (a) ;
Os plasmídeos nos quais ocorrer a inserção de DNA no sitio BamHI 
sofrerão interrupção do gene de resistência a Tetraciclina (tet).
2) A mistura de ligação (a) é empregada na transformação genética de 
E. coli;
3) Após a transformação genética, realiza-se a semeadura das células 
em meio sólido contendo Ampicilina (Amp) (b);
4) Um a um, usando um “Grid e palitos esterilizados: (c) os clones que 
crescerem em meio solido com Amp são semeados em em duas 
placas com meio sólido: uma com com Ampicilina e outra com 
Tetraciclina (tet). Os clones que não conseguirem crescem em 
Tetraciclina serão aqueles que contem insertos.
 
(c)
Meio completo + Amp
Meio completo + tet
Colônias
que aqui
crescem
e
aqui
não
crescem
Contêm 
plasmídeos 
com insertos 
2. Ferramentas da Engenharia Genética 
2.4. Seleção e Análise de clones recombinantes construídos
Fig.: Seleção de clones recombinantes construídos com o plasmídeo pBR322
2. Ferramentas da Engenharia Genética 
2.4. Seleção e Análise de clones recombinantes construídos
Quando e empregado plasmídeo do tipo “Bluescript” como
PUC19 ou pBluescript SK
ETAPAS:
- Após a transformação 
genética de E. coli, realiza-se 
a semeadura das células 
bacterianas em meio sólido 
contendo Ampicilina (Amp) + 
Xgal (após ação da -
Galactosidase origina 
substância de cor azul) + 
IPTG (indutor do óperon lac);
- As colônias bacterianas que 
contiverem plasmídeos 
cresceram (AmpR) e serão:
- Azuis (sem insertos), ou 
- Brancos (com insertos).
Explicação:
A inserção de DNA no sitio de 
clonagem do plasmídeo resulta 
na interrupção do gene 
codificador de β-Galactosidase 
e, assim, os clones bacterianos 
não produzirão esta enzima. 
(b)
Plasmídeos “Bluescript” assim são 
chamados porque permitem a seleção direta 
dos clones que contêm plasmídeos com 
insertos (clones brancos). 
1) Eles contêm o promotor e parte do gene 
estrutural codificador da β-Galactosidase 
de E. coli. 
2) Para que o sistema de seleção Bluescript 
funcione, é necessário o emprego de 
linhagens especiais E. coli que capazes 
de fazer a α-complementação; 
3) Possuem um múltiplo sitio para clonagens 
de DNA. A inserção de DNA neste sitio 
resulta na interrupção do gene β-
Galactosidase a não produção da 
Enzima cuja produção pode ser detectada 
com X-GAL + IPTG.
2.4. Seleção e Análise de clones recombinantes construídos
Fig.: Seleção de clones recombinantes construídos com o plasmídeo pUC19
Colônia Branca 
= Transformante com inserto
(o gene codificador de -gal
foi interrompido)
Colônia Azul
= Transformante sem inserto
Identificação visual de colônias recombinantes que contem insertos 
(colônias brancas = receberam plasmídeos onde o gene lacZ foi interrompido) 
Óperon lac
Fig.: Confirmação e estocagem de clones recombinantes E. coli contendo plasmídeos “Bluescript” com insertos (a). Utilizando um 
gabarito (“grid”) e palitos estéreis, as colônias brancas podem ser transferidas para novo meio completo contendo Ampicilina + XGal + 
IPTG. Em todas as placas, deve-se sempre repicar em um ponto o Controle (b) (E. coli recombinante que recebeu o plasmídeo sem 
inserto) que deverá apresentar cor azul, para garantia de que há IPTG + X-Gal no meio.
2. Ferramentas da Engenharia Genética 
2.4. Seleção e Análise de clones recombinantes construídos
Controle (E. coli / pPUC19 
Transformantes E. coli obtidos com a mistura de ligação realizada com
plasmídeo pPUC19 cultivados em meio sólido LB + Amp+ XGAl + IPTG:
Clones azuis (sem insertos) e clones brancos (com insertos.
(b)(a)
Análise dos Plasmídeos 
recombinantes
2. Ferramentas da Engenharia Genética 
2.4. Seleção e Análise de clones recombinantes construídos
Etapa anterior: Identificação dos clones E.
coli que contêm plasmídeos recombinantes.
Nesta Etapa:
Deve-se fazer a análise dos fragmentos de
DNA contidos nos insertos dos plasmídeos
recombinantes. Para isto, será necessário:
- Realizar o isolamento e purificação de
plasmídeo de vários clones bacterianos
recombinantes;
- A análise molecular do inserto presente em
cada um dos plasmídeos recombinantes,
pode ser feita por:
- Separação dos fragmentos em Gel de
agarose submetido a eletroforese e
analise dos padrões da corrida ( este
procedimento é MUITO
EMPREGADO);
- Sequenciamento dos fragmentos de
DNA;
- PCR
Fig,: Análise de fragmentos de DNA em gel de agarose submetido a eletroforese. (a) Cuba de
eletroforese; (b) perfis de migração de fragmentos de DNA em gel e agarose observados sob luz
Ultravioleta (UV( de 254 nm.
(a)
(b)
CRISPR/Cas9: a NOVIDADE mais recente
Cas: “CRISPR-assessorial” é uma endonuclease
CRISPR: 
https://biocienciaforadehora.wordpress.com/2016/03/22/1424/ 
DNA repetitivo ( R ) nas bactérias geralmente fica ao lado de pedaços de DNA de vírus ou de
plasmídeos (S1, S1, S3 ) que atacaram a bactéria
Foi demonstrado que Cas9 purificadas são capazes de clivar uma molécula de 
DNA alvo in vitro quando guiadas por CRISPR RNAs (crRNAs)
3. Como funciona a técnica CRISPR-CAS9
CRISPR/Cas9: 
https://biocienciaforadehora.wordpress.com/2016/03/22/1424/ 
Na verdade, CRISPR é um mecanismo de defesa antigo e natural encontrado em diversas bactérias. 
Nos anos 1980, cientistas observaram um padrão estranho em alguns genomas bacterianos: 
Uma sequência de DNA poderiaser repetida diversas vezes, 
com sequências ÚNICAS entre as repetições. 
Eles chamaram essa configuração estranha de “agrupados de curtas repetições palindrômicas regularmente 
Inter-espaçadas”, ou CRISPR na sigla em inglês.
Conforme a região CRISPR se enche com o DNA de vírus, ela se torna uma galeria das moléculas mais
procuradas, representando os inimigos que o micróbio encontrou.
O micróbio pode então usar esse DNA viral para transformar as enzimas Cas em ARMAS guiadas com precisão.
Depois, o micróbio copia o material genético em cada espaçador (S1, S2, S3, etc ) e o coloca em moléculas RNA.
As enzimas Cas deslizam pela célula. Se encontrarem material genético de um vírus que corresponde a um RNA
CRISPR, o RNA o prende. As enzimas Cas então cortam o DNA em dois, impedindo a replicação do vírus.
RESUMO: Cas9 é uma enzima que corta DNA, e
CRISPR é uma coleção de sequências de DNA que diz à Cas9 onde exatamente deve
cortar.
Tudo o que os pesquisadores precisam fazer é fornecer à Cas9 a sequência correta, chamada RNA
guia, e pronto, podem cortar pedaços de sequências de DNA no genoma onde quiserem.
3. Como funciona a técnica CRISPR-CAS9
CRISPR/Cas9: 
A Cas9 consegue reconhecer uma sequência com até 20 bases, assim pode ser usada para agir em genes 
específicos. Tudo o que é necessário fazer é projetar uma sequência-alvo usando uma ferramenta online, como a da 
“Innovative Genomics” (1) e então ordenar para o RNA guia agir. Em questão de alguns dias a sequência-guia 
chega pelo correio. 
Possibilidades: 
Você pode até consertar um gene defeituoso ao cortá-lo com CRISPR/Cas9 e então injetar uma cópia normal na 
célula.
Ocasionalmente, no entanto, a enzina acaba cortando o lugar errado, e esse é um dos principais obstáculos para um 
uso amplo do sistema.
1.
2. 
https://innovativegenomics.org/blog/how-to-make-a-guide-rna-for-cas9/ 
https://biocienciaforadehora.wordpress.com/2016/03/22/1424/
RESUMO: Cas9 é uma enzima que corta DNA, e
CRISPR é uma coleção de sequências de DNA que diz à Cas9 onde exatamente deve cortar.
Tudo o que os pesquisadores precisam fazer é fornecer à Cas9 a sequência correta, chamada RNA guia, e
pronto, podem cortar pedaços de sequências de DNA no genoma onde quiserem.
3. Como funciona a técnica CRISPR-CAS9
Fig.: Esquema da Inserção de um fragmento de DNA usando a técnica CRISPR-CAS9
CRISPR-Cas9 
Esta é a mais recente 
NOVIDADE que permite a 
inserção (clonagem) 
De um fragmento de DNA 
em um vetor.
Permite também a 
alteração de uma 
sequencia específica de 
DNA.
Podem ser empregadas 
nesses processos varias 
células:
- bactérias, 
- leveduras e até
- células animais e ate 
humanas.
3. Como funciona a técnica CRISPR-CAS9
CRISPR/Cas9: 
CasX :
Uma nova proteína com
propriedades bem similares
à Cas9 foi identificada mais
recentemente, por Jill
Banfield e Jennifer
Doudna, (Universidade da
Califórnia, Berkeley).
CasX tem uma grande
vantagem de ser
consideravelmente menor
que Cas9.
Considera-se que quando a
intenção é infiltrar um editor
genético forasteiro dentro
de uma célula, quanto
menor ele seja será melhor,
e mais preciso ele se torna.
Fonte:
https://biocienciaforadeh
ora.wordpress.com/2019
/02/09/descoberto-
editor-de-dna-que-pode-
ser-ainda-melhor-que-o-
crispr/
3. Como funciona a técnica CRISPR-CAS9
4. Inovações: Alguns produtos derivados da Engenharia Genética bacteriana
1) 1982 – Expressão de Insulina humana em E. coli
Foi o primeiro produto comercial obtido pela Tecnologia do
DNA recombinante (TDR) e aprovado para uso em humanos
em 1982 pelo Departamento FDA Americano (“USA Food
and Drug Administration”).
Bristow, A.F. Recombinant-DNA-derived insulin analogues as
potentially useful therapeutic agents. Trends in Biotechnology
11: 301-305, 1993. Fg.: Representação esquemática de estratégias usadas para produzir
insulina para fins terapêuticos.
Hormônio Insulina
Os diabéticos não possuem insulina, que regula a quantidade de glicose no
sangue.
Em 1978, a insulina era produzida a partir de pâncreas congelados de
porcos e gado. Para isto, uma linha de vagões cheios chegavam a uma
fábrica em Indiana/EUA. Para produzir 453 g (1 libra) de insulina, eram
necessários 3.630 kg (8.000 libras) de glândulas de pâncreas de 23.500
animais.
O fabricante, Eli Lilly precisava de 56 milhões de animais por ano para
atender à crescente demanda dos EUA. Então, buscaram uma nova
alternativa para a produção de insulina.
A Genentech tinha o conhecimento necessário para fabricar insulina
humana sintética - em laboratórios, a partir de bactérias, usando sua
tecnologia de DNA recombinante recentemente comprovada.
1. 1982 – Expressão de Insulina humana em E. coli. 
4. Inovações: Alguns produtos derivados da Engenharia Genética bacteriana
Quimosina recombinante
Inicialmente, foi construída uma cepa bacteriana não patogênica E. coli K-12 para a 
produção em larga escala de quimosina. Esta enzima recombinante era idêntica à proteína 
natural, custa menos e pode ser produzida em quantidades abundantes. 
Hoje, cerca de 60% do queijo duro dos EUA é produzido com quimosina geneticamente 
modificada. 
Em 1990, o FDA Americano (“USA Food and Drug Administration”) concedeu a quimosina 
recombinante o titulo “Generally Recognized as Safe” - (GRAS), atribuindo à esta proteína 
recombinante Grau de Segurança para consumo humano.
2. 1990 – Expressão de c-DNA de Quimosina
Quimosina – coalho para a produção de queijos
Encontrada no coalho, é uma enzima necessária para a
fabricação de queijos. Foi o primeiro aditivo alimentar
geneticamente modificado usado comercialmente.
Tradicionalmente, era obtida do coalho, uma
preparação derivada do quarto estômago de bezerros
alimentados com leite.
Atualmente, a maior parte de coalho (coagulante) utilizada em todo mundo é produzida
por leveduras, fungos ou bactérias geneticamente modificadas (OGM),
eliminando os problemas de proteólise acentuada de coquetéis enzimáticos mais
antigos derivados de microrganismos.
Coagulante para queijos contendo 100% de quimosina (100% pura) é produzido por
clones recombinantes de bactérias (Escherichia coli, Kluyveromyces lactis), de
leveduras (S. cerevisiae, Pichia pastoris), e fungos filamentosos (Aspergillus niger var
awamori).
Construção de clones recombinantes que expressam quimosina
O c-DNA de genes que se expressam a quimosina em estômago de ruminantes foram
clonados em vetores de expressão e empregados na transformação genética de
microrganismos hospedeiros. Os OGMs são cultivados nos volumes desejados
ilimitadamente e a enzima é purificada.
Por que foi empregado o c-DNA do gene da quimosina ?
- Você sabe o que é c-DNA?
É o DNA sintetizado a partir de uma molécula de mRNA (RNA mensageiro) cujos
íntrons (sequencias interagências não traduzidas) já foram removidos, ou seja, o mRNA
já passou pelo processo de “splicing”. Esta reação é catalisada pela ”enzima
transcriptase reversa.
- O c-DNA da quimosina foi empregado porque:
1) genes de eucariotos multicelulares têm “íntrons” e E. coli não processa “íntrons”, ou
seja não faz “splicing”;
2) O m-RNA da quimosina pode ser mais facilmente obtido no estomago dos
ruminantes (onde eram expressos), do que seria a seleção de genes do genoma
completo deles.
Quimosina de bezerros e quimosina microbiana
A quantidade de quimosina que se consegue obter de 
bezerros é sempre inferior às exigências de mercado, e a 
maioria das proteases presentes em coalhos de origem fúngica 
não se mostra muito adequada para a fabricação de alguns tipos 
de queijo, devido à alta atividade proteolítica e pouca 
especificidade. 
Os coagulantes são o que há 
de mais moderno e seguro 
para coagulação de leite 
para a produção de queijos. 
Eles contêm uma substância 
(enzima, chamada 
quimosina), capaz de 
coagular o leite, oferecendo 
um excelente rendimento na 
produção de queijos,
4. Inovações: Alguns produtos derivados da Engenharia Genética bacteriana
Plantas Transgênicas e algumas Aplicações da TDR em cultivo de Plantas
Obs.: Há muita coisa sendofeita tendo como base
a proteína cristal de B. thuringiensis (BT): proteção
contra insetos, proteção contra congelamento
Bacillus thuringiensis é uma bactéria que produz naturalmente uma proteína (toxina Bt) com propriedades
inseticidas.
A bactéria tem sido aplicada às culturas como uma estratégia de controle de insetos há muitos anos, e essa
prática tem sido amplamente adotada na agricultura e jardinagem.
Recentemente, foram desenvolvidas plantas que expressam uma forma recombinante da proteína
bacteriana, que pode efetivamente controlar alguns predadores de insetos.
As questões ambientais associadas ao uso dessas culturas transgênicas não foram totalmente resolvidas.
Culturas
resistentes aos
insetos
Pseudomonas syringae
P. syringae é uma bactéria que não produz uma proteína de superfície chamada "ice-plus" ("ativa a nucleação
do gelo").
Quando ocorre queda de temperatura, este fato incita o desenvolvimento de geadas, levando ao congelando
de brotos de plantas.
A TDR permitiu a construção de cepas P. syringae “ice-minus”, fornecendo um ambiente menos favorável
para a formação de gelo.
Isto foi desenvolvido como um produto comercial conhecido como Frostban. Os testes de campo em
1987 foram a primeira liberação de um OGM no meio ambiente. O teste foi muito controverso e levou à
formação da política de biotecnologia dos EUA.
P. syringae
e a
bactéria
“ice-minus”
herbicida glifosato 
Foram desenvolvidas variedades comerciais de importantes culturas agrícolas (incluindo soja, milho,
sorgo, canola, alfafa, algodão) que incorporam um gene recombinante que resulta em resistência ao
herbicida glifosato (nome comercial Roundup) e simplifica o controle de ervas daninhas pelo glifosato
aplicação. Essas culturas estão de uso comercial comum em vários países.
Uma variedade recombinante de arroz que foi projetada para expressar as enzimas responsáveis pela
biossíntese de β-caroteno (um precursor da vitamina A), em suas partes comestíveis. Essa variedade de
arroz é uma promessa substancial para reduzir a incidência de deficiência de vitamina A na população
mundial. O arroz dourado não está atualmente em uso, enquanto se aguarda a resolução de questões
regulatórias e de propriedade intelectual.
Arroz dourado
Instituto de Ciências 
Biomédicas USP
Bactérias geneticamente modificadas em Biotecnologia
5. Questões 
1. Como foi demonstrado que o material genético é o DNA?
2. O que são enzimas de restrição? Cite um exemplo. 
3.Como podem ser construídas as moléculas de plasmídeos recombinantes?
4.Qual é o mecanismo de transferência de DNA mais empregado para construir 
clones recombinantes de bactérias? Qual é a bactéria empregada como 
hospedeira com maior frequência? Como a inserção de plasmídeos 
recombinantes pode ser feita nesta bactéria hospedeira?
5.Cite um exemplo de um produto hoje em dia no mercado que é produto da 
Tecnologia do DNA recombinante (TDR). Os produtos derivados da TDR podem 
ser empregados em várias áreas, como: saúde humana ou animal, 
melhoramento das condições de cultivos vegetais, etc? Comente, argumentando 
se Sim ou Não. Argumente se a TDR é (ou não é) muito custosa e, assim, 
somente é empregada para a obtenção de proteínas recombinantes para uso na 
área de saúde humana e animal.