PVH prova I

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Disciplina de Princípios de Virologia Humana
Primeiro semestre de 2019
Primeira prova
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Responda as questões a seguir. Elas têm valor idêntico. Embora o e-mail de envio seja prova de sua identidade, peço que preencha o nome e número de matrícula acima para facilitar a montagem da planilha de notas e menções.
Questão 1: caracterização de um novo vírus (tema – estrutura e genoma)
Você trabalha num laboratório de referência em virologia e recebe uma amostra de líquido pleural e uma biópsia pulmonar de um paciente que contraiu uma pneumonia fulminante de etiologia indeterminada, já tendo sido excluídas causas bacterianas, fúngicas, parasíticas e autoimunes.
Você procede da seguinte maneira para investigar o agente:
i. Você extrai DNA de uma alíquota do líquido pleural e o submete a sequenciamento de alto desempenho (HTS, em inglês) de DNA. Todas as seqüências obtidas são oriundas do genoma do hospedeiro.
ii. Você extrai RNA de uma alíquota do líquido pleural, e trata metade do produto da extração com ribonuclease R. Você então submete tanto a amostra tratada como a não tratada ao HTS de RNA. Apenas a amostra não-tratada revela a presença de seqüências virais. Estas não são classificáveis em quaisquer das famílias conhecidas. Todas seqüências obtidas são únicas, sem que se constatem seqüências que sejam reverso complementar de outras.
iii. Você agradece aos céus que os médicos tiveram a sabedoria de enviar as amostras congeladas em gelo seco, e não conservadas em formol, e processa parte da amostra de biópsia para microscopia eletrônica. Você observa partículas filamentosas no citoplasma dos pneumócitos do tipo I. Como você está num laboratório de bio-risco nível 4, você procede com a investigação e submete outra parte da amostra à ruptura das células e liberação de seu conteúdo (lisado celular). Você então divide o lisado celular em duas partes, e uma delas você usa para extrair RNA novamente. Então, você aplica uma alíquota de lisado celular a um tapete de células A549 em cultura, e em paralelo, usa eletroporação para forçar a entrada do RNA que você extraiu em outro tapete de células A549.
Após doze horas, você começa a observar morte e lise das células A549 em ambos os tapetes. Você recolhe o sobrenadante (meio nutritivo que estava em contato com as células) e o submete à microscopia eletrônica, observando as mesmas partículas filamentosas em abundância.
iv. Tentando descobrir qual é o melhor descontaminante de superfície para este vírus, você constata que aplicação de um detergente comum não o inativa. 
Pergunta: com base nestas informações, dê a classe de Baltimore deste vírus e outras características do genoma e do vírion, justificando sua resposta.
Resposta: O vírus possui um genoma composto por RNA de fita simples, pois o sequenciamento de DNA apresentou apenas sequências do hospedeiro, assim podemos descartar a hipótese de ser um vírus de DNA ou um retrovírus, além do mais o sequenciamento de RNA, da amostra não tratada, apresentou as sequências virais, sem que houvesse nenhuma sequência reverso complementar de outras, indicando assim que se trata de RNA fita simples. O fato de toda a amostra submetida ao tratamento com RNAse R não ter apresentado nenhuma sequência, indica que se trata de um genoma de RNA linear, que muito possivelmente pode ser reconhecido como mRNA, devido a especialidade da enzima em degradar esse tipo de RNA. O resultado de lise celular e partículas virais após a realização da eletroporação para a entrada forçada do RNA viral na célula indica que o genoma desse vírus é infectivo, dessa forma apenas pode se tratar de RNA fita simples positiva, tendo em vista que RNA de fita dupla e Retrovírus já foram descartados nos experimentos passados e que RNA fita simples negativa não é infectivo na ausência de RdRP. Assim podemos concluir que se trata de um vírus de RNA fita simples positiva, que pertence a classe IV na classificação de Baltimore. A visualização de partículas filamentosas no citoplasma das células hospedeiras indica que o vírus possui um capsídeo helicoidal e a não inativação do vírus por detergente comum indica que esse não possui envelope.
Questão 2: permissividade de células ao vírus Zika (tema – replicação)
Vírus têm seu tropismo por células determinado não apenas pelos receptores que elas expressam, mas pela disponibilidade de proteínas intracelulares que sejam necessárias para o ciclo replicativo viral. No caso do vírus Zika (ZIKV), recentemente se descobriu que a proteína Musashi-1 é necessária para a produção de progênie viral. Observe o gráfico a seguir:
No eixo y, temos o número de cópias de RNA do vírus obtidas, ao longo do tempo (eixo x), a partir de células infectadas com o ZIKV. As linhas vermelhas são a produção de vírus em células (KO1 e KO2, em que KO significa knock-out) em que a proteína Musashi-1 foi silenciada por interferência de RNA. Em preto, temos células em que a proteína não foi silenciada (parental), e células em que se usou um RNA não-interferente como controle negativo (control).
Pesquise a literatura e proponha, a partir do dito acima, do que você apurar e do que você concluir com seu próprio raciocínio, uma explicação plausível para a eficácia do ZIKV, demonstrada na literatura, em matar células cancerígenas de glioblastoma multiforme.
Resposta: A proteína Musashi-1 é predominantemente expressa em células tronco neurais e em células cancerígenas, sendo dessa forma importante para a formação do cérebro em embriões. Essa proteína é uma ligante de RNA que está envolvida com a regulação de mRNAs da célula a nível de tradução. O vírus ZIKV, quando infecta a célula, interage com a proteína Musashi-1 por meio do seu 3’ UTR, de tal forma que essa interação é necessária para que haja a replicação do genoma viral. Essa necessidade da proteína é possivelmente a explicação para o tropismo do vírus por células nervosas. Devido ao sequestro da proteína Musashi-1 pelo vírus, essa deixa de cumprir sua função celular e compromete o desenvolvimento da célula hospedeira, além disso com a replicação do genoma viral, esse irá também promover a lise da mesma célula. Em glioblastoma multiforme, é sabido que os níveis de expressão da proteína Musashi-1 podem ser elevados e que essa desempenha funções importantes para os processos de migração/adesão e crescimento tumoral. Dessa forma, com base na informação de que a proteína Musashi-1 pode ser superexpressa nesse tipo de tumor, a utilização do vírus ZIKV em um tratamento oncolítico pode ser eficaz tendo em vista que esse vírus possuí um tropismo pelas células nervosas, já que esses dependem da proteína Musashi-1 para sua replicação e dessa forma conseguem causar a lise celular. Por fim, a utilização desse vírus no tratamento pode ser pouco danosa as células nervosas não oncogênicas vizinhas, tendo em visto que em células já diferenciadas a proteína Musashi-1 é pouco ou não é expressa. 
Questão 3: tema – produção de proteínas virais
Explique como os poliovírus conseguem manter a produção de proteínas virais quando as células ativam a resposta antiviral mediada por interferon.
Resposta: Durante a resposta antiviral mediada por interferon, ocorre a indução da expressão da proteína Pkr que promove a fosforilação de eIF2A, um dos fatores necessários para a iniciação da tradução CAP-dependente, quando esse fator está fosforilado ele se liga fortemente ao fator eIF2B e assim diminui a forma livre de ambos os fatores na célula, portanto bloqueando o processo de tradução celular. Apesar disso, a tradução dos poliovírus não é influenciada, pois esses possuem um processo de tradução CAP-independente. Esse processo é possível pois no genoma viral do poliovírus há um sítio de entrada ribossomal interno (IRES) presente na região 5’ UTR, dessa forma é possível que ocorra a ligação da porção 40S do ribomossomo nesse sítio IRES e posteriormente a varredura do genoma viral em busca de um códon de iniciação,dessa forma a tradução viral é iniciada. Através desse mecanismo, o vírus consegue manter a produção de suas proteínas, mesmo quando a resposta traducional da célula está parada.