2024 GENETICA E CITOGENETICA HUMANA Material Complementar

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Prof. Dr. Alexandre Dias
MATERIAL COMPLEMENTAR
Genética e
Citogenética Humana
 Avalia a arquitetura genômica
 Possibilita a compreensão das variações do DNA no fenótipo
 Possibilita elaborar valores preditivos e/ou terapêuticos
Citogenômica
Variantes no DNA
CNVs
Copy Number 
Variations
SNVs
Single 
Nucleotide 
Variants
Cromossomos
Fonte: adaptado de: Dias; Kulikowski (2019).
Ferramentas citogenômicas
Técnicas 
citogenômicas
MLPA
MMS
NGS
Array
KT
FISH
Sanger
Fonte: autoria própria
Qual metodologia utilizar?
Fonte: autoria própria
Estudo citogenético
Estudo dos cromossomos, sua estrutura, suas anormalidades e seu comportamento, baseados 
em uma suspeita clínica.
Cariotipagem clássica
Fonte: acervo pessoal
 Idade materna avançada
 Genitores com anormalidades estruturais balanceadas
 Gestações anteriores com relatos de anormalidades genômicas
 Malformação fetal – US
 Abortamentos de repetição
 Ansiedade materna
Indicações clínicas para realizar o cariótipo
 Muitos casos sem diagnóstico devido à limitação da técnica!
Como proceder?
 Técnicas citogenômicas
 FISH
 MLPA
 Array
 NGS
Muito utilizado, entretanto...
FISH
 Hibridação in Situ por Fluorescência
 Nível celular
Sondas fluorescentes
 Detecção de anormalidades 
numéricas e estruturais pequenas
Técnicas citogenômicas
Fonte: Christofolini et al. (2015).
 Baseada na hibridação por homologia de uma sonda no genoma de uma célula que, sob 
estímulo luminoso, emite luz visível sob microscopia de epi-fluorescência.
Vantagens:
 Detecta alterações gênicas no nível cromossômico;
 Localização da variante;
 Grande número de sondas para diversas regiões específicas;
 Rapidez e confiabilidade do resultado.
Desvantagens:
 Custo da técnica;
 Durabilidade da sonda.
FISH – Hibridação in Situ por Fluorescência
Fonte: Torres et al. (2013).
Equipamentos necessários:
 Placa aquecedora: denaturação do DNA e da sonda.
 Banho-maria: utilizado para as lavagens pós-hibridação da sonda.
 Termômetro de superfície: verifica a temperatura da placa aquecedora.
 Microscópio de epi-fluorescência: excitação da fluorescência ligada à sonda.
 Sistema de captura de imagem: permite a análise e a documentação do caso.
FISH – Hibridação in Situ por Fluorescência
Fonte: Torres et al. (2013).
 Centromérica
Tipos de sondas para FISH
Centrômero de 15
“Cromossomo marcador”
Fonte: Christofolini et al. (2013).
 Centromérica
Tipos de sondas para FISH
Sonda para X e Y – caracterização de mosaicismo
Fonte: acervo pessoal
 Pintura cromossômica
Tipos de sondas para FISH
Painting de 16
“Cromossomo marcador”
Fonte: Christofolini et al. (2013).
 Sequência única
Tipos de sondas para FISH
Sonda TWIST1 e ELN
“Cromossomo 7” Fonte: Dias et al. (2015).
INTERVALO
 MLPA
 Array
 Necessitam de DNA extraído com excelente qualidade!
MLPA e Array: DNA
Fonte: acervo pessoal
Sangue
Tecido fresco
Tecido parafinado
 PCR multiplex – biologia molecular
 Avalia CNVs em 50 regiões diferentes
do genoma
MLPA
Deleções
Duplicações
CNVs
Variações
estruturais
Fonte: adaptado de: Pinto et al. (2007); Milller et al. (2010); Lee et al. (2012); Connolly et al. (2014).
Patogênicas*
Benignas* Fragmentos de DNA (de ~ 50 pb a 
megabases) com um número variado de 
cópias no genoma
VUS*
* Classificação simplificada
 Pequenos rearranjos: BRCA1, BRCA2, MSH2, MLH1, DMD, APC, SMA, NF1, NF2, VHL, 
TSC1/2, MECP2, NSD1, LDLR, FBN1, CFTR, DPYD, COL5A1, CACNA1A, PKHD1, BRIP1, 
SLC26A4, LMN1B, PRSS1, FRMD7, TPMT, FLCN, DNAI1, EP300, DNAH5, UBE3A, PCCA, 
PCDH15.
 Rearranjos maiores: síndrome de Williams, síndromes de Prader-Willi e Angelman, síndrome 
de DiGeorge, Cri du Chat, Pelizaeus-Merzbacher, CMT1, HNPP etc.
 Regiões subteloméricas.
 Alterações no número de cromossomos: 13, 18, 21, X, Y.
Aplicações da MLPA
Anelamento de sondas no DNA-alvo
 Presença ou ausência da sequência-alvo específica
Amplificação das sondas aneladas pela técnica de PCR
 Havendo anelamento, as sondas serão amplificadas
Análise de fragmentos do produto da PCR
 Número de cópias gênicas, expressão, metilação
A técnica de MLPA
 Painel com resultados de MLPA mostrando sondas deletadas em 15q11 com o kit P064, 
análise utilizando GeneMarker, Softgenetics® 
Aplicação
Fonte: adaptado de: Dutra; Kulikowski (2011).
 Detecção da deleção 15q
del(15)(q26.1-q26.2) OMIM #142340
 MLPA
 PCR multiplex
Avalia CNVs em 50 regiões diferentes do 
genoma
Aplicação
Trissomia do cromossomo 18
Fonte: adaptado de: Dias et al. (2016).
MLPA em
mucosa oral
P036 / P070
Subtelômeros
 Array
Avalia CNVs (perdas e ganhos) 
no genoma completo!
Plataformas de Array
Cy3Cy5
DNA marcado
com fluorocromos
Hibridação
Lavagem
Extração e análise 
dos dados
Fonte: https://www.illumina.com/Fonte: https://www.thermofisher.comFonte: https://www.agilent.com/
http://www.google.com.br/url?sa=i&source=images&cd=&cad=rja&docid=wLDND7WiqL4RoM&tbnid=QifFtAT7Qe7DhM:&ved=0CAgQjRwwAA&url=http://www.nucleomics.be/platforms/microarrays/affymetrix/&ei=FTpHUsj9E4zs9ASA2IGoCg&psig=AFQjCNHpaRDBCGjj75Yq1JO5YivDh3ZvSg&ust=1380486037379291
Resolução
 Utilizado em diversas patologias
 câncer
 investigação etiológica de ADNPM
 anomalias congênitas
 Avaliação de CNVs, SNPs
Vantagens e desvantagens do Array
 Não detecta alterações cromossômicas 
equilibradas (translocações recíprocas, 
inversões)
 Não detecta mosaicos de baixa frequência 
– 30%
 Custo elevado
 Sem cobertura – SUS
Cariótipo X Array
Sobre a resolução...
Nº de bandas cromossômicas
KT de alta resolução
~5 - 10 Mb
Plataformas diferenciadas
SNPs
CNVs – VARIAÇÃO DE NÚMERO 
DE CÓPIAS
~5 – 500 Kb
Array: detecta alterações em ~ 20% dos casos de deficiência 
intelectual e/ou anomalias congênitas com KT normal
Fonte: Dias et al. (2016).
 NGS – Next Generation Sequence
Avalia SNVs no genoma!
 Painéis específicos
 Exoma
 Genoma completo
NGS
• Técnica
• Protocolo molecular
• Análise bioinformática
Análise de 
múltiplas 
variantes no DNA
Fonte: acervo pessoal
 NGS – Next Generation Sequence
Avalia SNVs no genoma!
NGS
Exemplos de
plataformas de NGS
EXOMA
1-3% do genoma
30-50 milhões bp
85% de todas as variantes
Fonte: https://www.illumina.com
Desafio!
 Banco de dados e 
softwares de análise
Análise bioinformática
International Rare Diseases Research Consortium 
Global Alliance for Genomics and Health
MatchMaker Exchange - busca de pacientes com relação genótipo/fenótipo semelhantes
Fonte: Matchmaker 
Exchange (2014).
Concluindo…
Então… por 
que estudar 
citogenômica?
Fonte: Kulikowski et 
al. (2013).
Qual(ais) a(s) vantagem(ns) da utilização das técnicas de FISH, MLPA, Array e NGS quanto à 
técnica de cariotipagem clássica?
a) São mais baratas e efetivas que a cariotipagem.
b) Essas técnicas não necessitam de análise qualificada.
c) Os resultados dos testes citogenômicos são sempre conclusivos e não necessitam de 
exames complementares.
d) São tecnicamente mais artesanais que a técnica de cariotipagem.
e) Possibilitam identificar variantes como SNVs, CNVs e 
anormalidades estruturais pequenas de maneira 
mais assertiva.
Interatividade
Qual(ais) a(s) vantagem(ns) da utilização das técnicas de FISH, MLPA, Array e NGS quanto à 
técnica de cariotipagem clássica?
a) São mais baratas e efetivas que a cariotipagem.
b) Essas técnicas não necessitam de análise qualificada.
c) Os resultados dos testes citogenômicos são sempre conclusivos e não necessitam de 
exames complementares.
d) São tecnicamente mais artesanais que a técnica de cariotipagem.
e) Possibilitam identificar variantes como SNVs, CNVs e 
anormalidades estruturais pequenas de maneira 
mais assertiva.
Resposta
ATÉ A PRÓXIMA!