Microbiologia ( instrumentos e meios de cultura)

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I Módulo - Microbiologia
Rotina laboratorial
· Princípios
· Uso de EPCs e EPIs ( touca, jaleco limpo, máscara) 
· Uso consciente dos materiais, produtos e equipamentos de forma planejada 
· Senso de coletividade e comunicação
· Proibido alimentar-se e maquiar-se no laboratório
· Ler o planejamento da aula com antecedência ( tem meios que necessitam de tempo para realização; tirar dúvidas quando necessário)
· Manter o ambiente laboral sempre limpo e organizado e repor o material de uso coletivo. 
· Não deixar sobre a bancada materiais quente ou abertos
· Comunicar ao técnico imediatamente qualquer dano ou quebra de material ( Cuidado com risco de patogenicidade do material e para desinfecção e descarte apropriado)
· Todo material deve ser identificado com o nome/ data/ responsável pela elaboração ( serve para sabermos sobre a validade e sobre o domínio do produto) 
· Material de rotina
· Tubo de ensaio 
· Erlenmeyer
· Becker
· Bastão de vidro
· Garrafa de Schott
· Placa de Petri
· Kitassato
· Funil de vidro
· Proveta
· Tubo de durham
· Funil de buchner
· Alças
· Alça de Drigalski
· Swab
· Cabo de koller
· Alça de platina: bacteriológico, agulha e “L”
· Pipetadores
· Pipeta automática
· Pasteur
· Automática
· Pêra
· Pipetadores
· Ponteira
· Microscopia
· Lâmina
· Lâminula
· Câmara de Neubauer
· Cultivo de anaerobiose
· Jarra de aerofilia ou anaerobiose ( Retira o oxigênio para o crescimento de M.O. 
· Equipamentos
· Microscópio
· Cabine de segurança ( fluxo contínuo
· Estufa
· Autoclave
· Balança analítica
· Bomba de vácuo - serve para os meios que não podem ser autoclavados devido a sofrerem oxidação
· Limpeza e esterilização
· Semanal: balanças, autoclave, microscópio e banho-maria
· Mensal: refrigeradores 
· Ocasional ( sempre que usar): fluxo laminar ( devido ao perigo de contaminação)
· Limpeza de material inoculado
1- Recolher o material biológico em caixa apropriada ( SEMPRE USAR LUVAS)
2 - Acondicionar em saco de polipropileno 
3 - Esterilização em autoclave ( 121º C por 15 min) 
4 - Retirar a cultura esterilizada
5 - Imersão em hipoclorito 10% e detergente por 12/24h a depender da cultura
6 - Lavagem e enxágue
7- Secagem em estufa de ambiente
8 - Embalagem individual e esterilização
9 - Armazenagem 
· Meio de cultivos 
· Meios que fornecem crescimento microbiano
· Apresentam componente nutricional
· Condições adequadas para o M.O
· Estéril 
· Condições adequadas de inoculação 
· Finalidade 
· Isolamento ( Sólido ) 
· Ex : Ágar nutriente para bactéria e Ágar Sabouraud para fungos
· Transporte 
· Agente redutor tioglicolato ou L-cisteina
· Meio que garante a viabilidade do M.O
· Minimiza danos durante o transporte
· Manutenção
· Caldo nutriente
· Cuidado com contaminação
· Indicador/identificação 
· Citrato de Simmons e TSI
· Para identificar M.O
· Enriquecimento 
· BHI - Brain heart infusion
· Quanto ao estado físico
· Líquido
· Sem agente solidificante ( Ágar)
· Sem formação de colônia
· Na embalagem vai estar o termo broth
· Uma das funções é para visualizar a fermentação de carboidratos
 
· Sólido 
· Apresenta agente solidificante - ÁGAR ( 18 a 19 g) ou também chamado de ágar ágar, ágar type I, ágar bacteriológico 
· Há formação de colônias visível 
· Serve para avaliação da morfologia, isolamento, crescimento
· Semi-sólido 
· Apresenta agente solidificante - ÁGAR ( 18 g de ágar p/100 ml de água destilada ou 2 a 3% de ágar)
· Serve para avaliar motilidade bacteriana
· Quanto a constituição
· Artificial
· Componentes nutricionais definidos
· Natural
· Componentes nutricionais não definidos
obs: Meio seletivo: é um meio que favorece o crescimento de determinados microrganismos em detrimento de outros, geralmente devido à adição de substâncias inibidoras.
· Meios para fungos
· Sabouraud
· BDA
· Mycosel
· + cloranfenicol ou CAF ( é um ATB)
· Soluções utilizadas
· Sehl Neelsen - é utilizado para a detecção dos bacilos álcool-ácido-resistentes (BAAR)
· Kit de coloração de gram - Essa é uma técnica que leva em consideração características tintoriais das bactérias, auxiliando na classificação das bactérias em dois grandes grupos Gram Positivos (roxa) e Gram Negativos (vermelha). As principais diferenças com relação às bactérias Gram-negativa e Gram-positiva estão relacionadas à composição da parede celular. As bactérias Gram positivas apresentam uma parede celular rígida e espessa constituída basicamente de peptideoglicano, e também apresentam moléculas conhecidas como ácido teicoicos, que estão inseridos na camada de peptideoglicano, enquanto o ácido lipoteicoico está ligado à membrana plasmática. A composição da parede celular das bactérias classificadas como Gram-negativas apresenta uma parede celular com menos peptideoglicano e uma membrana externa. Para realizar a confecção de uma lâmina de acordo com a metodologia de Gram é necessário ter os seguintes reagentes: violeta de genciana, lugol, álcool etílico, fucsina ou safranina. Logo após, é só seguir os passos abaixo para realização da técnica.
1) Confeccione o esfregaço com o material biológico.
2) Cubra o esfregaço com violeta de metila e deixe o corante agir sobre a lâmina, durante por 60 segundos.
3) Escorra o corante e em seguida lave em um filete de água corrente. Logo após cubra a lâmina com lugol e deixe agir por 60 segundos.
4) Escorra o lugol e lave em um filete de água corrente.
5) Adicione à lâmina álcool etílico (99,5º GL), até que saia todo o corante
6) Lave a lâmina em um filete de água corrente.
7) Coloque sob a lâmina fucsina básica 0,1 a 0,2% ou safranina até cobrir toda a lâmina, deixe agir por 30 segundos.
8) Lave a lâmina sob um filete de água corrente.
9) Deixe a lâmina secar ou seque delicadamente com o auxílio do papel filtro.
10) Coloque uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço.
11) Leia em objetiva de imersão (100 X).
· ATB
· Fazer check list e verificação da validade
· Armazenamento e estabilidade
· Material biológico
· Coleção de M.O
· ATCC - é o local de onde veio
· Técnicas de Semeadura
· Repique ( serve para fungos) - Vai cortar fragmentos e colocar no meio
· Esgotamento ( bactérias) - Semear com alça ou agulha bacteriológica, em zig-zag - Serve para obter colônias isoladas. 
· Reta ou picada ( bactérias) - serve para realizar o teste de motilidade - Em um tubo de ensaio, deve-se semear com agulha bacteriológica, no centro do ágar. Dependendo da finalidade, o inóculo deve ser inserido até 2/3 do tubo ou até o fundo deste.
· Microcultivo com ágar cornmeal ou ágar fubá - Esta técnica consiste na preparação de culturas de fungos em lâminas de microscopia para observação direta em microscópio de campo claro. O microcultivo permite na íntegra o estudo das estruturas de reprodução (tanto sexuadas quanto assexuadas) da maioria dos fungos; facilitando a observação das principais características utilizadas para identificar tais micro-organismos. 
• Procedimento
1- Preparo das lâminas
a) O grupo irá receber quatro placas estéreis contendo cada: (i) um tubo em “U” ( pode ser substituído por palito de madeira) e (ii) uma lâmina de microscopia sobre tubo em “U” .
b) Anotar nas placas de Petri os respectivos códigos das culturas de fungos que o grupo irá trabalhar. Será utilizada apenas uma placa por fungo.
c) Em seguida, com auxílio de uma espátula flambada, cortar um quadrado de aproximadamente 1 cm2 do meio Corn meal Agar (ágar fubá) e depositar o bloco de ágar sobre a lâmina. Realizar todo o procedimento próximo a chama do bico de Bunsen.
2- Transferência dos fungos
a) Com auxílio de uma agulha de inoculação (no caso de fungos filamentosos), flambar a agulha e tocar na superfície da colônia do fungo. 
b) Em seguida, tocar a agulha nos quatro cantos do bloco de ágar; flambar a agulha.
c) No caso das leveduras, com auxílio da alça de transferência, tocar a colônia e riscar suavemente duas vezes o bloco de ágar.
d) Tanto para as leveduras quanto para os fungos filamentosos, após inocular o material no bloco, flambar 
a pinça e retirar uma lamínula estéril de dentro do recipiente apropriadoe dispor suavemente a lamínula sobre o bloco de ágar.
e) Colocar um algodão umedecido no interior da placa de Petri de modo a não tocar a lâmina ou a superfície da lamínula. 
3- Incubação e resultado esperado
a) Após preparar todas as placas, estas deverão ser embrulhadas em saco plástico e incubá-las à 25º C durante sete dias, no escuro (BOD).
b) Após o período de incubação, espera-se que os fungos utilizam os nutrientes contidos no meio e crescem formando as estruturas de reprodução sobre a superfície da lâmina e da lamínula.
OBS: 25 a 30 ml de meio para uma placa pequena. 
OBS: toda vez que for coletar uma amostra do M.O deve flambar a alça antes 
· Conservação 
· Repique contínuo ( curto prazo): baseia-se na transferência de fragmentos de culturas fúngicas para um meio de cultura virgem, em períodos determinados. Embora o repique contínuo consuma tempo e apresenta vulnerabilidade aos microrganismos contaminantes, é uma opção para pequenas coleções de culturas que são constantemente utilizadas em curtos períodos de tempo, como aqueles inferiores a um ano. Outro ponto negativo é a possibilidade de mutação. 
· Método castellani ( médio prazo): tem por objetivo conservar culturas fúngicas em água destilada à temperatura ambiente, acondicionando-as em pequenos frascos de vidro âmbar. A literatura afirma tratar-se de uma técnica de fácil reprodução, baixo custo e bastante vantajosa por apresentar pequena influência de microrganismos contaminantes e por requerer pequeno espaço físico para conservação de inúmeras variedades fúngicas. Pontos negativos: retirar toda água.
· Óleo Mineral ( médio prazo): A técnica de conservação em óleo mineral estéril baseia-se no princípio de limitar a quantidade de oxigênio disponível sobre uma cultura fúngica, obtendo uma redução no seu metabolismo, alcançado a estabilidade entre crescimento e morte fúngica. Desse modo, diminui-se a desidratação do meio de cultura, e consequentemente, aumenta-se a longevidade das cepas, mantendo-as viáveis entre dois e três anos. Pontos negativos: retirar o óleo mineral.
· Criopreservação ( longo prazo) - A Criopreservação na temperatura de - 80 °C é o método mais utilizado para fungos e tem como objetivo conservar o organismo em temperaturas baixas, com auxílio de crioprotetores, como o glicerol. Pontos negativos: necessidade de equipamento específico e dos crioprotetores.