Imunologia clínica 1

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Introdução ao laboratório de imunologia clínica
A imunologia clínica é uma área extremamente importante que emprega o conhecimento do sistema imune e dos mecanismos de resposta imunológica para diagnosticar e compreender diversas patologias humanas. 
O sistema imune, definido como o conjunto de células e moléculas responsáveis pelo desencadeamento da imunidade, é essencial para manutenção da homeostasia, uma vez que atua constantemente na tentativa de manter o organismo livre de agentes patogênicos, sejam eles de origem infecciosa ou não. 
De acordo com Abbas, Lichtman e Pilai, em Imunologia celular e molecular, publicado em 2015, quando o sistema imune identifica e reconhece componentes microbianos e agentes estranhos não infecciosos, tais como células necróticas e tumorais, ocorre uma ação conjunta de células imunes e moléculas presentes no soro para elaboração de uma resposta contra as ameaças detectadas.
No contexto da imunologia clínica, diversos exames laboratoriais complementares são realizados com intuito de auxiliar no diagnóstico clínico de patologias humanas. Estes testes laboratoriais, em sua grande maioria, avaliam a presença e a interação dos antígenos com componentes celulares e moleculares do sistema imune, principalmente de anticorpos e linfócitos.
Dessa forma, a imunologia clínica tem como objetivo o estudo da resposta imunológica frente às doenças infecciosas, além do estudo da ativação anormal do sistema imune em casos de autoimunidade, reações de hipersensibilidade, imunodeficiências e crescimento anormal de células de fenótipo maligno. 
Adicionalmente, a imunologia clínica visa o entendimento da modulação do sistema imune por meio de fármacos diversos, em especial os empregados para inibição da rejeição de transplantes. Por fim, ela estuda o desenvolvimento de vacinas e outros agentes imunizantes que são essenciais para a prevenção de doenças infecciosas, conforme pontuam Voltarelli e outros autores, em Imunologia clínica na prática médica, publicado em 2009. 
SOROLOGIA: CONCEITOS, DEFINIÇÕES E OBTENÇÃO DA AMOSTRA DE SORO
Um dos mais importantes ramos da área é a sorologia, definida como o estudo analítico do soro sanguíneo. Na prática, um exame sorológico é aquele que visa identificar e quantificar a presença de antígenos e anticorpos no soro de um(a) paciente. Mas antes de se compreender a fundo os exames sorológicos, é preciso relembrar o que é o soro.
O sangue é um tecido conjuntivo formado por elementos celulares e plasma, que podem ser facilmente separados entre si por meio de centrifugação. Após centrifugação simples, observa-se que aproximadamente 45% do volume sanguíneo corresponde aos eritrócitos, também chamados de hemácias. Logo acima dos eritrócitos, sedimenta-se a camada leucoplaquetária, composta por leucócitos e plaquetas. Sobre o sedimento celular, é possível encontrar a fração sobrenadante, que corresponde à parte líquida do sangue, denominada plasma.
Conforme pontuado por Kierszenbaum, em Histologia e biologia celular: uma introdução à patologia, publicado em 2016, o plasma contém diversos elementos orgânicos e inorgânicos, tais como: 
· Aminoácidos;
· Proteínas;
· Lipídios;
· Vitaminas;
· Hormônios;
· Fatores de coagulação;
· Sais minerais.
Em termos práticos, o plasma corresponde in vivo à parte líquida do sangue que contém fibrinogênio e fatores de coagulação entre seus componentes. A obtenção de plasma in vitro por centrifugação requer a adição de anticoagulantes à amostra de sangue. Por outro lado, quando a amostra é coletada na ausência de anticoagulantes, os elementos celulares formam um coágulo de sangue juntamente com o fibrinogênio e os fatores de coagulação.
Sendo assim, após a centrifugação de uma amostra de sangue sem anticoagulantes, obtêm-se o soro, que nada mais é que a parte líquida do sangue sem a presença de fibrinogênio e fatores de coagulação.
Na rotina de um laboratório de análises clínicas, os principais anticoagulantes empregados para obtenção de plasma incluem ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), heparina e citrato de sódio. A escolha do tipo de anticoagulante usado depende diretamente do teste que será feito com a amostra de plasma. 
· EDTA: O EDTA, indicado para amostras destinadas à realização do hemograma, é um quelante de cálcio que atua sequestrando os íons Ca2+ presentes no plasma, o que resulta no bloqueio da agregação plaquetária e da cascata de coagulação. Em termos comerciais, o EDTA é disponibilizado como um spray seco com aderência na parede dos tubos, que pode estar nas formas dipotássico (EDTA-K2), tripotássico (EDTA-K3) ou dissódico (EDTA-Na2), com pequenas diferenças de uso entre eles, conforme pontuam Silva e outros autores, em Hematologia laboratorial: teoria e procedimentos, publicado em 2016.
· Heparina: A heparina é um mucopolissacarídeo que bloqueia a cascata de coagulação por meio da interação com a molécula de antitrombina, importante anticoagulante natural plasmático. Tal interação resulta na inibição dos fatores de coagulação Xa, IXa e trombina, o que aumenta significativamente a ação anticoagulante da antitrombina. O uso de tubos de coleta de sangue com heparina é indicado principalmente para testes de bioquímica e também para imunofenotipagem leucocitária, uma vez que tal anticoagulante preserva a viabilidade dos leucócitos por até 24 horas.
· Citrato de sódio: O citrato de sódio, indicado como anticoagulante de escolha para testes de coagulação, atua como agente quelante de cálcio. Ao sequestrar os íons Ca2+ presentes na circulação, o citrato impede diretamente a continuidade da cascata de coagulação.
Para facilitar a rotina e reduzir o risco de erros pré-analíticos, os tubos de coleta de sangue apresentam padronização das tampas, de acordo com o tipo de aditivo presente. Dessa forma, os tubos com EDTA, heparina e citrato de sódio possuem tampas roxa, verde e azul, respectivamente. Já os tubos para obtenção de soro, que podem ser secos ou com adição de ativador de coágulo, apresentam tampa vermelha. 
Há, ainda, os tubos para obtenção de soro com gel separador, que apresentam tampa amarela. Outra importante padronização durante as etapas pré-analíticas é a ordem dos tubos de coleta de sangue, que visa impedir a contaminação da amostra com aditivos, microrganismos e líquido tecidual.
De acordo com Andriolo e outros autores, em Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial para coleta de sangue venoso, publicado em 2010, a ordem atualmente aceita foi determinada pelo documento H3-A6 do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) e pode ser observada no Quadro 1.
Outro aspecto a ser considerado antes da coleta de sangue é o material do tubo, que pode ser de vidro ou de plástico. Os tubos de vidro foram considerados padrão-ouro por muitos anos nos laboratórios clínicos, entretanto, com a crescente preocupação com biossegurança, o uso de tubos de plástico tem ganhado força, uma vez que são mais resistentes, toleram maiores velocidade de centrifugação e geram menores quantidades de resíduo após incineração. 
No contexto da sorologia, as opções disponíveis para coleta de sangue são tubo de vidro seco siliconado (tampa vermelha), tubo de vidro com ativador de coágulo e gel separador (tampa amarela), tubo de plástico com ativador de coágulo sem gel separador (tampa vermelha) e tubo de plástico com ativador de coágulo e gel separador (tampa amarela).
Após a coleta do sangue nos tubos específicos, é necessário aguardar um determinado período de tempo para que ocorra a coagulação e a retração do coágulo antes que seja feita a centrifugação para obtenção do soro.
Para amostras coletadas em tubos de vidro siliconado, deve-se aguardar aproximadamente 60 minutos, já para os tubos com ativador de coágulo (com ou sem gel separador), o tempo de espera é reduzido para 30 minutos. Logo após esse período, os tubos devem ser submetidos à centrifugação entre dez a quinze minutos com rotação aproximada de 1000–3000 g (ANDRIOLO et al., 2010).
SOLUÇÕES: CONCENTRAÇÃO E DILUIÇÃO
Assoluções são definidas como misturas homogêneas compostas por duas ou mais substâncias, nas quais a substância dissolvida é chamada de soluto e a substância que dissolve é chamada de solvente. De modo simplificado, a concentração de uma solução representa a quantidade de soluto presente em uma certa quantidade de solvente. 
Vale salientar que existem diferentes tipos de concentração, uma vez que as unidades de medida das substâncias envolvidas na solução podem ser diferentes. 
A concentração comum ou concentração em massa é aquela determinada pela relação entre a massa do soluto e o volume do solvente, que tem como unidade no Sistema Internacional (SI) gramas por litro (g/L):
A densidade, cuja unidade no SI é dada em gramas por microlitro (g/mL), é determinada pela relação entre a massa total e o volume total da solução:
Por fim, tem-se a concentração molar ou molaridade, que é determinada pela relação entre o número de mols do soluto e o volume total da solução cuja unidade no SI é dada em mol/L:
A capacidade que um soluto tem se ser diluído em determinado solvente é chamada de coeficiente de solubilidade, e, em termos gerais, uma solução concentrada é aquela cuja quantidade de soluto é maior do que a quantidade de solvente. Já uma solução diluída é aquela cuja quantidade de soluto é menor do que a quantidade de solvente. 
Dessa forma, quando se quer aumentar a concentração de uma solução, deve-se aumentar o soluto ou reduzir o solvente; por outro lado, quando se quer diluir uma concentração, deve-se aumentar a quantidade de solvente.
Nesse contexto, é possível definir diluição como o procedimento de redução da concentração de uma solução por meio de adição de solvente, sem alterar a quantidade de soluto. Na prática, a diluição de uma solução costuma ser indicada pelo fator de diluição.
Por exemplo: quando se faz uma diluição de fator 10 de uma determinada solução, entende-se que a solução foi diluída 1/10 ou 1:10 (leia-se 1 para 10), ou seja, em dez partes da solução, uma parte é de soluto e nove partes são de solvente. Da mesma forma, para preparar uma diluição 1:5, utiliza-se uma parte de soluto para quatro partes de solvente, e assim por diante.
Um tipo de diluição muito empregada na rotina laboratorial é a chamada diluição seriada, que representa um procedimento de diluição progressiva na qual o fator de diluição é rapidamente amplificado, o que permite obter soluções com concentrações bem reduzidas de forma eficaz, além de ser extremamente útil quando o volume da solução inicial é escasso. 
Nas diluições seriadas, a alíquota (amostra que será diluída) é sempre proveniente do material diluído na etapa anterior e o fator de diluição final é o produto dos fatores de diluição em cada etapa. Por exemplo, se você preparar uma diluição 1:2 (fator de diluição 2) a partir de uma solução-estoque. Para fazer uma diluição seriada, você deve diluir novamente essa solução no fator 2, obtendo uma nova solução que agora estará diluída 1:4.
Após diluir novamente essa nova solução 1:4, você terá uma solução 1:8, e assim por diante. Apesar da diluição seriada no fator 2 ser a mais comum, outros fatores podem ser empregados, conforme podemos observar na Figura 2, que demonstra uma diluição seriada de fator 10.
Observe que, para preparar a diluição A, utilizou-se 1 mL da solução estoque e 9 mL de diluente, originando uma diluição 1:10. Em seguida, 1 mL da solução A foi acrescentado em outro tubo contendo 9 mL de diluente, o que formou uma diluição B de 1:100. Essa solução B foi utilizada para preparar a solução C, com adição de 1 mL em 9 mL de diluente, dando origem à diluição de 1:1000. Por fim, 1mL da solução C foi adicionado em 9 mL de diluente, o que originou a solução D com diluição 1:10000.
Interação antígeno-anticorpo, anticorpos monoclonais e imunização
O estudo da imunologia clínica requer uma base adequada de conhecimentos sobre imunologia básica, principalmente no que se refere à interação entre antígenos e anticorpos, que é o ponto crucial para o desenvolvimento dos imunoensaios empregados na rotina de um laboratório clínico.
Nesse contexto, torna-se de importante relembrar diversos conceitos básicos de imunologia, como antígeno, epítopo, imunógeno e anticorpo, além de compreender os tipos de forças presentes na formação do complexo antígeno anticorpo, também conhecido como complexo imune ou imunocomplexo.
Adicionalmente, várias técnicas laboratoriais empregadas requerem a produção artificial de anticorpos específicos contra determinados antígenos. A produção de uma grande variedade de anticorpos monoclonais com diferentes especificidades se tornou possível por meio do desenvolvimento da tecnologia do hibridoma, em 1975, o que representou um grande avanço científico que tem sido amplamente empregado desde seu surgimento. 
Por fim, outro aspecto importante no estudo da imunologia clínica é o entendimento dos diferentes tipos de imunização e agentes imunizantes. O processo de imunização, tanto ativa quanto passiva, pode ser conferido de modo não natural aos indivíduos, o que torna possível o controle de inúmeras doenças de origem infecciosa (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2015; LEVINSON, 2014).
RELEMBRANDO CONCEITOS BÁSICOS EM IMUNOLOGIA
Para compreender a formação dos complexos imunes, primeiramente é necessário relembrar conceitos importantes de imunologia básica, o que facilitará o entendimento da interação antígeno-anticorpo. 
Os antígenos são substâncias que apresentam capacidade de se ligar de modo específico aos anticorpos ou aos receptores dos linfócitos T, que atuam como componentes do sistema imune adaptativo. 
Já os anticorpos, também chamados de imunoglobulinas (Ig), são proteínas globulínicas produzidas por plasmócitos derivados de linfócitos B capazes de se ligar especificamente aos antígenos que desencadeiam sua produção durante a resposta imune adaptativa.
As imunoglobulinas desempenham diversos papéis na imunidade adaptativa humoral, dentre as quais se destacam neutralização de microrganismos, opsonização e consequente facilitação da fagocitose de patógenos, além da ativação do sistema complemento pela via clássica.  
Em termos estruturais, as moléculas de imunoglobulina são simétricas, com formato semelhante à letra Y e compostas por quatro cadeias polipeptídicas: duas cadeias leves idênticas com cerca de 25 kDa e duas cadeias pesadas também iguais entre si, com 50-70 kDa cada. Todas as cadeias da molécula do anticorpo apresentam regiões constantes, que são essenciais para as funções efetoras, e regiões variáveis, que atuam no reconhecimento específico dos epítopos.
Dessa forma, o sítio de reconhecimento dos antígenos está localizado na justaposição das regiões variáveis das cadeias leve e pesada nas imunoglobulinas (Figura 3).
Diferenças na composição peptídica das regiões variáveis das imunoglobulinas são essenciais para determinar a especificidade do reconhecimento antigênico. Entretanto, epítopos muito semelhantes podem desencadear uma reação cruzada, na qual o sítio de reconhecimento se liga a um antígeno diferente daquele para o qual foi especificamente produzido.
Diferenças na organização estrutural das regiões constantes das cadeias pesadas determinam a existência de cinco diferentes classes de imunoglobulinas, denominadas IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.
· IgA: Anticorpos da classe IgA são encontrados na forma de monômeros e dímeros no soro e na forma secretada nos fluidos corporais, como saliva, leite, lágrimas e suor. Sua função primordial é atuar na proteção de superfícies mucosas.
· IgD e IgE: Os anticorpos da classe IgD e IgE são encontrados apenas na forma de monômeros.Enquanto os IgDs atuam como receptores de superfície de linfócitos B, os pertencentes à classe IgE estão presentes no soro ou ligados aos mastócitos e basófilos, e atuam nas reações de hipersensibilidade de tipos I (também conhecidas como hipersensibilidade imediata ou alergia) e na defesa do organismo contra parasitas helmínticos. 
· IgG: As IgGs, classe de imunoglobulinas predominante no soro, são anticorposmonoméricos encontrados tanto na forma secretada quanto na forma de membrana. Entre as funções da IgG na imunidade humoral, incluem-se opsonização de microrganismos, ativação do sistema complemento e citotoxidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). Outra característica importante da IgG é que essa classe é a única com capacidade de atravessar a barreira transplacentária.
· IgM: Por fim, os anticorpos da classe IgM podem ser encontrados na forma de monômeros, quando atuam como receptores de linfócitos B, e na forma de pentâmeros no soro. A conformação pentamérica da IgM faz com que cada molécula desse anticorpo apresente dez sítios de reconhecimento antigênico, o que permite a aglutinação de partículas infecciosas. Além disso, a IgM é capaz de ativar o sistema complementar pela via alternativa.
Diversos tipos de moléculas biológicas simples e complexas podem atuar como antígenos, tais como carboidratos, lipídios, ácidos nucleicos e proteínas. Entretanto, a região dos anticorpos responsável pelo reconhecimento antigênico é bem menor do que a grande maioria das macromoléculas e, dessa forma, apenas uma pequena porção do antígeno realmente se liga ao anticorpo. 
Essa região delimitada do antígeno que se liga diretamente à molécula do anticorpo é denominada determinante antigênico ou epítopo. Quando um antígeno apresenta um único epítopo, é chamado de monovalente, já os antígenos que possuem vários epítopos idênticos são denominados multi ou polivalentes. 
O termo imunógeno descreve toda e qualquer molécula que apresenta capacidade de desencadear uma resposta imunológica quando reconhecida pelo sistema imune. Embora todo imunógeno seja um antígeno, o inverso não é verdadeiro, pois alguns antígenos pequenos, chamados de haptenos, conseguem se ligar aos anticorpos, mas não são capazes de estimular a montagem de uma resposta imunológica específica. 
Isso ocorre porque, apesar da possível interação com anticorpos, os haptenos não conseguem ativar linfócitos T auxiliares devido à incapacidade de se ligar às proteínas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) (ABBAS; LICHTMAN; PILAI, 2015; LEVINSON, 2014.). 
TIPOS DE FORÇAS ENVOLVIDAS NA INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO
O reconhecimento do antígeno pela molécula de anticorpo ocorre na justaposição das regiões variáveis das cadeias leve e pesada e, para que isso ocorra, é necessária a formação de uma ligação covalente reversível. 
A reversibilidade da interação antígeno-anticorpo está diretamente relacionada a fatores como pH extremo, concentrações elevadas de sal, presença de detergentes e competição por altas concentrações do epítopo.
A ligação covalente reversível entre antígeno e anticorpo é resultante de diversos tipos de interações, que incluem forças eletrostáticas, pontes de hidrogênio, forças de van der Waals e ligações hidrofóbicas. 
Forças eletrostáticas
As forças eletrostáticas representam a interação entre duas cargas elétricas por meio de atração (quando as cargas são iguais) ou repulsão (quando as cargas são opostas).
Forças de van der Waals
Já as forças de van der Waals, por sua vez, são forças intermoleculares resultantes da união entre nuvens de cargas elétricas opostas presentes no antígeno e no anticorpo, as quais podem ser do tipos dipolo-dipolo, dipolo induzido-dipolo induzido e ligações de hidrogênio.
Pontes de hidrogênio
As ligações ou pontes de hidrogênio são forças intermoleculares permanentes, nas quais o polo positivo é sempre o hidrogênio e o polo negativo pode ser nitrogênio, oxigênio ou flúor (FORTE, 2015; ABBAS; LICHTMAN; PILAI, 2015).
Para avaliar a força da interação entre o antígeno e a molécula de anticorpo, são empregados os conceitos de afinidade, avidez e valência. 
· Afinidade: A afinidade de um anticorpo é determinada pela força de ligação entre uma única região de reconhecimento na molécula de imunoglobulina e o epítopo do antígeno. Como antígenos polivalentes apresentam vários epítopos em sua estrutura, a força da ligação do antígeno ao anticorpo é decorrente da interação de todos esses epítopos com as regiões de reconhecimento disponíveis. 
· Avidez: Dessa forma, na presença de vários epítopos no mesmo antígeno, pode-se dizer que a avidez é a soma de todas as afinidades. Na prática, a avidez está mais diretamente relacionada à força de ligação entre antígeno e anticorpo, uma vez que moléculas de anticorpos como a IgM, que apresentam estrutura pentamérica, podem se ligar fortemente a antígenos polivalentes, pois apresentam grande quantidade de sítios de reconhecimento disponíveis, o que aumenta a avidez da interação.
· Valência: Por fim, a valência de um anticorpo pode ser definida como o número de epítopos que ele pode reconhecer. Lembrando que anticorpos na forma de monômeros, dímeros e pentâmeros apresentam dois, quatro e dez sítios de reconhecimento, respectivamente. 
ANTICORPOS MONOCLONAIS: OBTENÇÃO POR HIBRIDOMAS E APLICAÇÕES
Os anticorpos monoclonais (mAB, do inglês monoclonal antibody) são imunoglobulinas produzidas por um único clone de linfócitos B e, portanto, apresentam a mesma especificidade de reconhecimento de antígenos, uma vez que as imunoglobulinas produzidas por plasmócitos idênticos têm exatamente a mesma estrutura nas regiões variáveis das cadeias leve e pesada, que são responsáveis pelo reconhecimento dos epítopos antigênicos.
As células clonais são observadas na composição das massas tumorais, uma vez que os tumores são originados a partir da expansão clonal de células inicialmente mutadas. Nesse contexto, um tipo específico de tumor maligno denominado plasmocitoma é formado pela proliferação excessiva e descontrolada de plasmócitos idênticos, todos produtores de um mesmo tipo de anticorpo. 
A partir do estudo dos plasmocitomas produtores de anticorpos monoclonais, tornou-se possível o desenvolvimento da tecnologia dos hibridomas. Isso ocorreu no ano de 1975 e foi descoberto pelos cientistas César Milstein e Georges Köhler, que publicaram suas descobertas no artigo intitulado “Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity”. Tal descoberta rendeu aos autores o Prêmio Nobel em Medicina, no ano de 1984. 
A nova tecnologia descrita no artigo possibilitou uma revolução na produção de imunoglobulinas, o que permitiu o desenvolvimento de uma gama enorme de anticorpos monoclonais com especificidades distintas. 
A tecnologia do hibridoma, também chamada de hibridização celular somática, é baseada na formação de uma célula híbrida que resulta da fusão de plasmócitos produtores de determinado anticorpo com células tumorais de mieloma. O uso de células tumorais juntamente com os plasmócitos confere uma elevada capacidade proliferativa ao hibridoma, o que é essencial para a obtenção de grandes quantidades de anticorpos. 
A diferenciação de linfócitos B em plasmócitos produtores do tipo específico de imunoglobulina de interesse é estimulada por meio da injeção do antígeno em uma cobaia de laboratório. Após a fusão celular, a célula híbrida obtida é estimulada a proliferar, dando origem a um clone de células-filhas idênticas, todas produtoras do mesmo anticorpo monoclonal. Os hibridomas são, portanto, células híbridas com capacidade de replicação contínua e produção simultânea de imunoglobulinas específicas direcionadas contra um determinado antígeno.
Resumidamente, a produção dos hibridomas ocorre em diversas etapas sequenciais da seguinte maneira: primeiramente, é feita a administração do antígeno de interesse em camundongos, os quais se tornam imunizados e passam a produzir anticorpos específicos contra o antígeno. 
Em seguida, células do baço dos camundongos imunizados contendo plasmócitos são retiradas e incubadas na presença de células de mieloma, que são negativas para expressão do gene que codifica a enzima hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase (HGPRT). 
A incubação das células deve ser feita na presença de polietilenoglicol (PEG) diluído em meio de cultura com dimetilsulfóxido (DMSO), para que ocorra a fusão das membranas celulares. Depoisda fusão, as células são transferidas para o meio de cultura HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina), que mantém a viabilidade das células que expressam HGPRT.
Dessa forma, as células do mieloma que não se fundiram não sobrevivem, pois expressam a enzima. Já os linfócitos B são células sensíveis à cultura e não sobrevivem por longos períodos incubados in vitro. Sendo assim, após um período de tempo, somente as células híbridas permanecem viáveis no meio HAT. 
Por fim, é feita a detecção e a quantificação das imunoglobulinas produzidas para verificar a especificidade do hibridoma produzido e, em seguida, é feita a clonagem e a preservação das células híbridas
A princípio os anticorpos monoclonais disponíveis eram produzidos em laboratório, a partir de linfócitos B isolados de camundongos sensibilizados com o antígeno de interesse. Devido à origem murina dos linfócitos B que formavam o hibridoma, a administração dos anticorpos monoclonais desencadeava uma forte resposta imune direcionada contra as imunoglobulinas administradas, com produção de anticorpos anti-imunoglobulinas pelo sistema imune do paciente. 
Tal resposta imune indesejada inativava a ação terapêutica dos anticorpos monoclonais, além de induzir possíveis reações adversas no organismo. Essa limitação do uso dos anticorpos monoclonais fez com que, inicialmente, eles fossem empregados apenas com finalidade de pesquisa científica e de diagnóstico laboratorial em imunoensaios diversos, o que aumentou significativamente a especificidade dos testes imunológicos.
Com o desenvolvimento da biotecnologia e da engenharia genética, a tecnologia para produção de anticorpos monoclonais foi progressivamente aprimorada, com o intuito de reduzir a imunogenicidade dos anticorpos monoclonais produzidos. 
Primeiramente, foram desenvolvidos anticorpos quiméricos, nos quais a tecnologia do DNA recombinante permite a substituição de partes da estrutura das imunoglobulinas murinas por humanas, com redução significativa da imunogenicidade do anticorpo produzido, conforme pontuado por Delves e colaboradores, em Roitt, Fundamentos de imunologia, publicado em 2013. 
Posteriormente, com o intuito de reduzir ainda mais a imunogenicidade dos anticorpos monoclonais produzidos, teve início o desenvolvimento dos chamados anticorpos humanizados. Em termos práticos, nas imunoglobulinas humanizadas os sítios de reconhecimento antigênico têm origem animal, enquanto o restante da molécula tem origem humana. 
O avanço das técnicas de engenharia genética e a tecnologia do DNA recombinante possibilitaram a produção de anticorpos monoclonais totalmente humanos, sem qualquer vestígio de origem animal em sua composição 
Desde seu desenvolvimento, os anticorpos monoclonais têm sido empregados no contexto da imunologia clínica como reagentes em testes laboratoriais para imunodiagnóstico de tumores, doenças infecciosas, problemas autoimunes e imunodeficiências. Mais recentemente, o uso dos anticorpos monoclonais para imunoterapia tem ganhado destaque, especialmente no tratamento do câncer e doenças autoimunes. 
Para nomear os fármacos de origem monoclonal, utiliza-se um padrão pré-estabelecido que facilita o entendimento do alvo terapêutico e da origem do anticorpo. De acordo com essa norma, o nome do fármaco é formado por quatro partes, sendo um prefixo, dois infixos e um sufixo.
· Prefixo: O prefixo é dado pela sílaba inicial escolhida para nomear o medicamento.
· Infixo: O primeiro infixo é usado para indicar o seu alvo de ação, enquanto o segundo infixo é relacionado à origem do anticorpo monoclonal. Os principais infixos utilizados estão demonstrados no Quadro 2.
· Sufixo: O sufixo utilizado é sempre mabe, que indica que o fármaco é um anticorpo monoclonal (SANTOS et al., 2006).
No Brasil, de acordo com a lista de preço de medicamentos disponibilizada pela Câmara de Regulação do Mercado de Medicamentos (CMED) da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), estão atualmente disponíveis aproximadamente 60 anticorpos monoclonais com atividade terapêutica. No Quadro 3, estão alguns dos anticorpos monoclonais mais utilizados para terapêutica no país.
IMUNIZAÇÃO ATIVA E PASSIVA
A aquisição de proteção imunológica contra doenças infecciosas, processo denominado imunização, pode ser adquirida pelo organismo de modo ativo ou passivo. 
Na imunização ativa, o desenvolvimento da resposta imunológica ocorre após a exposição ao antígeno específico, o que confere participação ativa do sistema imune do indivíduo no processo de produção de anticorpos e células T efetoras, com aquisição de resposta imune humoral e celular. Essa imunização geralmente é de longa duração, porém requer um período de tempo maior para sua elaboração. 
 
O contato com o antígeno na imunização ativa pode ocorrer de forma natural, durante infecções clínicas e subclínicas, e também de modo artificial, por meio da administração de vacinas produzidas com antígenos vivos ou inativos, além de produtos microbianos como toxinas e toxoides.
Já a imunização passiva, cujo desenvolvimento não requer participação direta do sistema imune do indivíduo, é conferida após a administração de anticorpos pré-formados pelo organismo de outro hospedeiro (Figura 5). Dessa forma, o procedimento básico para imunização passiva é o recebimento de soro com imunoglobulinas que foram produzidas especificamente contra o antígeno que desencadeou a resposta imune no organismo produtor. 
 
Em casos de doenças causadas por toxinas bacterianas, como difteria, tétano e botulismo, os anticorpos pré-formados da imunização passiva são administrados pela injeção de soro contendo antitoxinas específicas que neutralizam as toxinas produzidas pelas bactérias.
Outro exemplo clássico de imunização passiva é o que ocorre nos recém-nascidos, que recebem anticorpos da classe IgG produzidos pelo sistema imune materno por meio da circulação transplacentária. A grande desvantagem da imunização passiva é que ocorre apenas imunidade humoral, com aquisição de proteção de curta duração.
O soro homólogo, produzido por organismos da mesma espécie do indivíduo que irá recebê-lo, apresenta baixo risco de desencadear reações de hipersensibilidade, porém tem risco maior de transmissão de doenças infecciosas.
Por outro lado, o soro heterólogo, produzido por espécies diferentes da espécie-alvo, não traz risco de transmissão de doenças infecciosas, mas apresenta risco elevado de desencadear reações de hipersensibilidade, com possível desencadeamento de reação anafilática grave, além de deposição de imunocomplexos (LEVINSON, 2014; ABBAS; LICHTMAN; PILAI, 2015).
Boas práticas e controle de qualidade laboratorial
A compreensão de que o ambiente laboratorial é uma rede complexa de interações humanas, tecnológicas, educativas e normativas favorece a redução de erros e o aumento do padrão de qualidade do serviço prestado. 
Essa rede complexa de atividades tem sido diretamente afetada pelo progressivo avanço técnico e científico, o que possibilita um número crescente de novos exames complementares disponíveis.
Conforme pontuado por Westgard e Darcy, em “The truth about quality: medical usefulness and analytical reliability of Laboratory tests”, publicado em 2004, estima-se que aproximadamente 70% das decisões médicas sejam embasadas na análise de resultados de exames laboratoriais, o que evidencia a necessidade de emissão de resultados confiáveis para garantir maior segurança nas decisões clínicas.
Nesse contexto, o laboratório clínico deve priorizar o fornecimento de resultados fidedignos e de qualidade. Para isso, é imprescindível que todos os envolvidos na rotina laboratorial trabalhem com disciplina, organização e consciência ética, além de que respeitem as normas de biossegurança e legislação pertinente, de acordo com o tipo de atividade exercida em cada ambiente de trabalho. 
Dessa forma, pode-se concluir que a qualidade final do serviço prestado pelo laboratório clínico é resultante de um intensivo plano de ação de qualidade aliado a normas de biossegurança e programasde educação continuada de seus gestores e funcionários.
BOAS PRÁTICAS EM LABORATÓRIO E NOÇÕES BÁSICAS DE BIOSSEGURANÇA
As boas práticas laboratoriais (BPL) representam um sistema complexo de qualidade que envolve procedimentos de organização, planejamento, execução, monitoramento, registro e arquivamento de exames, com o intuito de permitir a rastreabilidade de todas as etapas da rotina e visando o padrão de qualidade dos resultados obtidos.
Uma das principais ferramentas empregadas para o cumprimento dessas boas práticas é a utilização sistemática de procedimentos operacionais padrão (POPs), que são documentos que devem conter informações detalhadas sobre todas as etapas dos processos executados durante a rotina do laboratório. Tais documentos devem ser redigidos de forma clara e precisa para que a rotina possa ser executada sempre da mesma forma e com a mesma qualidade (MOLINARO et al., 2010).
Além disso, os arquivos com os POPs do laboratório devem estar sempre disponíveis, ser de fácil acesso aos funcionários e todas as mudanças feitas na rotina laboratorial devem ser adicionadas no documento. Após a formulação inicial do POP, o ideal é que sejam feitas revisões periódicas do conteúdo para possíveis ajustes e correções.
Para a correta execução dos procedimentos laboratoriais, tanto a qualidade dos equipamentos quanto dos reagentes é de essencial importância. Todos os equipamentos devem ser periodicamente revisados e calibrados, além de necessitarem de condições ambientais favoráveis de temperatura e umidade para o funcionamento ideal.
A calibração de um equipamento é o conjunto de atividades e operações periódicas para verificar a correspondência entre os valores indicados por ele e os valores obtidos por um padrão de referência, garantindo que os resultados obtidos na rotina estejam corretos. Adicionalmente, a operação e a manutenção desses equipamentos devem ser feitas por profissionais devidamente capacitados, e todas as operações, incluindo as atividades de manutenção e limpeza, devem ser descritas em POPs específicos. 
Os materiais e reagentes empregados na rotina laboratorial também devem ser rigorosamente verificados para garantir a qualidade do serviço. É imprescindível conhecer a procedência, a validade e os meios corretos de uso e armazenamento de todas as substâncias, além de conhecer os certificados de controle de qualidade dos fornecedores.
A biossegurança pode ser definida como o conjunto de medidas, ações e metodologias que visam minimizar ou eliminar os potenciais riscos que as atividades de pesquisa, ensino, produção, tecnologia e prestação de serviços possam causar à saúde do homem, dos animais e ao meio ambiente. Todos os laboratórios, sejam eles de diagnóstico, pesquisa ou desenvolvimento, devem adotar planos de biossegurança vinculados a planos de educação continuada dos trabalhadores envolvidos.
Nesse contexto, os laboratórios clínicos de imunologia devem seguir normas rígidas de biossegurança para garantir a proteção dos profissionais, que em toda a rotina laboratorial estão em exposição constante a riscos físicos, químicos e biológicos. Vale salientar que o risco é definido como a probabilidade de concretização de uma situação de perigo, que por sua vez é definido como uma condição capaz de causar ou contribuir para o dano.
Em termos práticos, a biossegurança no Brasil pode ser dividida em duas vertentes: a biossegurança legal e a biossegurança prática. A biossegurança legal é determinada pela Nova Lei de Biossegurança, regulamentada no ano de 2005, que estabelece a Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio), cuja função primordial é tratar de questões voltadas aos organismos geneticamente modificados (OMGs) e células-tronco embrionárias. 
Já a biossegurança prática é aquela vivenciada na rotina dos estabelecimentos de saúde e laboratórios em geral, que tem como foco a administração dos riscos ocupacionais por agentes físicos, químicos, ergonômicos e biológicos no ambiente de trabalho. 
Entre os possíveis riscos físicos presentes em um laboratório clínico, destacam-se ruídos, vibrações, temperaturas extremas e radiações. Já entre os riscos químicos, incluem-se substâncias químicas presentes em poeiras, névoas, gases e vapores, além dos reagentes e ativos que podem entrar em contato com a pele e vias respiratórias. Os riscos ergonômicos consistem em movimentos repetitivos, jornada prolongada de trabalho, tensões, posições monótonas e exigência de atenção e concentração. Por fim, os riscos biológicos são representados por diferentes tipos de patógenos, tais como vírus, bactérias, fungos e protozoários que podem estar presentes nas amostras clínicas. De acordo com o risco potencial que representam para a saúde humana, tais microrganismos são organizados em diferentes classes.
Um dos mais importantes pontos a se considerar em termos de biossegurança no ambiente laboratorial são contenção e infraestrutura predial, que visam reduzir os riscos da exposição dos profissionais do estabelecimento. 
Na prática, a contenção primária diz respeito à proteção no ambiente interno, enquanto a contenção secundária atua na proteção no ambiente externo. Com o intuito de se estabelecer uma contenção eficaz, torna-se necessária a análise do ambiente para determinar quais são os tipos de risco presentes em cada um dos espaços físicos do laboratório. Após essa análise, é elaborado o chamado mapa de risco, com a representação gráfica de todos os diferentes riscos presentes no ambiente de trabalho (MOLINARO et al., 2010).
Em termos de contenção laboratorial, as barreiras primárias correspondem a equipamentos de segurança que atuam tanto na proteção individual quanto coletiva dos profissionais. A proteção individual é conferida pelo uso de equipamentos de proteção individual (EPIs), tais como luvas, jalecos e protetores oculares, que devem ser obrigatoriamente fornecidos a todos os trabalhadores que necessitem, de acordo com os riscos aos quais são submetidos.
Aos trabalhadores cabe a responsabilidade de armazenar corretamente seus EPIs e usá-los somente para os fins destinados, além de comunicar aos empregadores quando os itens não estiverem mais em condições ideais de uso. Adicionalmente, o empregador deve fornecer instruções e treinamento para o uso correto dos EPIs. 
Os equipamentos de proteção coletiva (EPCs), por sua vez, são destinados à proteção da integridade dos profissionais no ambiente de trabalho e incluem capelas de exaustão, capelas de fluxo laminar, extintores, chuveiros e lava-olhos.
As barreiras secundárias são representadas pela própria infraestrutura do estabelecimento. De acordo com o tipo de risco biológico no local, os ambientes necessitam de diferentes soluções físicas em sua infraestrutura, o que deve ser devidamente previsto no projeto arquitetônico e de instalações prediais de todos os estabelecimentos de saúde.
Dessa forma, quanto maior o risco dos agentes microbianos manipulados no local, maiores devem ser os cuidados com as barreiras secundárias para minimizar o potencial perigo de contaminação dos profissionais. 
Para padronizar a adequação dos ambientes físicos, os laboratórios são classificados em diferentes níveis de biossegurança.
Nível de biossegurança I (NB-1)
Os laboratórios de nível de biossegurança I (NB-1) são laboratórios simples nos quais os únicos microrganismos manipulados são da classe de risco 1, o que não exige grandes soluções físicas na infraestrutura, apenas medidas como identificação do nível de biossegurança, acesso controlado ao laboratório, local exclusivo para EPIs, impermeabilização de tetos, paredes e pisos, além de autoclave com localização próxima ao laboratório.
Nível de biossegurança 2 (NB-2)
Os laboratórios de nível de biossegurança 2 (NB-2), em que pode ser feita a manipulação de patógenos das classes de risco 1 e 2, exigem infraestrutura com todos os requisitos de NB-1 mais alguns detalhes, tais como presença de lavatório para mãos na entrada e na saída, torneiras com acionamento automático (sem uso das mãos), sistemacentral de ventilação, vedação nas janelas, cabines de segurança biológica e adequação do uso de EPIs e EPCs.
Nível de biossegurança 3 (NB-3)
Já os laboratórios de nível de biossegurança 3 (NB-3) necessitam de maiores adequações na infraestrutura, uma vez que devem garantir a segurança durante a manipulação de microrganismos patogênicos da classe de risco 3. Nesses laboratórios, além dos requisitos básicos presentes nos estabelecimentos NB-1 e NB-2, é necessária a presença de cabines de segurança biológica com contenção por pressão negativa e filtro HEPA, roupas especiais, controle rigoroso de acesso, entrada por vestíbulo de dupla saída e cabines de exaustão externa.
Nível de biossegurança 4 (NB-4)
Por fim, os laboratórios de nível de biossegurança 4 (NB-4) são destinados à manipulação dos mais perigosos patógenos conhecidos, que pertencem à classe de risco 4, e, dessa forma, exigem grandes soluções físicas para seu correto funcionamento e adequação às normas. Entre tais exigências se destacam cabine de segurança biológica com contenção de pressão negativa e filtro HEPA, roupas especiais com pressão positiva, acesso restrito, entrada por vestíbulo de dupla saída, cabines de exaustão externa com filtros especiais e autoclave de duas extremidades.
PARÂMETROS E CONTROLE DE QUALIDADE NOS IMUNOENSAIOS
Em condições ideais, o melhor teste diagnóstico é aquele capaz de fornecer resultados corretos tanto em casos de presença quanto de ausência da doença ou condição em questão. Ou seja, por meio de um teste diagnóstico ideal, é possível detectar resultados sempre positivos em indivíduos acometidos pela doença e sempre negativos naqueles não acometidos. 
Na prática, os testes disponíveis não são perfeitos, e, portanto, cada laboratório deve ser responsável pela escolha da melhor metodologia aplicável à sua realidade, dando prioridade aos testes que sejam mais rápidos, simples, seguros, inócuos e de baixo custo.
A qualidade de um teste diagnóstico depende da análise do procedimento empregado, por meio de validação intrínseca e extrínseca do método. A validação intrínseca de um teste, que mede seu desempenho em comparação com o padrão-ouro, não está diretamente relacionada à prevalência da doença/condição, e envolve a análise dos parâmetros denominados sensibilidade e especificidade. Já a validação extrínseca envolve os parâmetros de precisão, acurácia e reprodutibilidade. 
A sensibilidade de um teste tem a ver com a capacidade de detectar os indivíduos realmente positivos para determinada condição em relação ao total de indivíduos. Em outras palavras, representa a probabilidade de o teste dar positivo dado que o indivíduo está doente, sendo estimada pela proporção de resultados positivos entre os indivíduos sabidamente doentes. Sendo assim, na prática, sabe-se que, quanto maior a sensibilidade do teste, maior será sua capacidade de detectar a doença na população. 
Em que:
VP = verdadeiro positivo;
FN = falso negativo.
Por outro lado, a especificidade diz respeito à capacidade de detectar indivíduos realmente negativos para uma doença ou condição em relação ao total de indivíduos. Ou seja, representa a probabilidade de o teste dar negativo dado que o paciente não está doente, e é determinada pela proporção de resultados negativos entre os indivíduos sabidamente saudáveis. Na prática, a especificidade está diretamente relacionada à capacidade de detectar indivíduos sadios na população, e, quanto mais específico o teste, menores as chances de resultado falso negativo (REIS; REIS, 2002).
Em que:
VN = verdadeiro negativo;
FP = falso positivo.
Com os dados de sensibilidade e especificidade, é possível determinar dois outros importantes parâmetros: valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN). 
O valor preditivo positivo indica a probabilidade de um indivíduo com resultado positivo realmente estar afetado pela doença/condição, ou seja, representa a proporção de doentes entre todos os indivíduos com resultado positivo. 
Em que:
VPP = valor preditivo positivo;
VP = verdadeiro positivo;
FN = falso negativo.
O valor preditivo negativo indica a probabilidade de um indivíduo com resultado negativo realmente ser sadio, ou seja, refere-se à proporção de sadios dentre todos os resultados negativos.
Em que:
VPN = valor preditivo negativo;
VN = verdadeiro negativo;
FN = falso negativo.
Um bom teste diagnóstico também deve apresentar bons resultados de precisão, acurácia e reprodutibilidade. A precisão é o parâmetro extrínseco que indica se há concordância nos resultados do teste quando ele é feito várias vezes com a mesma amostra ou paciente. A acurácia refere-se à capacidade do teste em apresentar resultados muito próximos ao verdadeiro. Por fim, a reprodutibilidade representa a obtenção dos mesmos resultados quando o teste é feito com a mesma amostra, mas por pessoas e/ou locais diferentes.
SINTETIZANDO
O laboratório de imunologia clínica é de grande importância no contexto das análises clínicas, e nele são realizados diversos exames complementares que auxiliam no diagnóstico de patologias humanas. Os imunoensaios realizados nesses laboratórios são baseados, principalmente, na avaliação da presença e da interação dos antígenos com componentes celulares e moleculares do sistema imune. 
Grande parte dos imunoensaios utiliza como amostra o soro, que representa a parte líquida obtida por centrifugação do sangue coletado na ausência de anticoagulantes, fazendo com que ela não contenha fibrinogênio e fatores de coagulação entre seus componentes. Os tubos de coleta de sangue indicados para obtenção de soro podem ser de vidro ou de plástico e apresentam tampa vermelha (quando secos ou com ativador de coágulo) ou amarela (com ativador de coágulo e gel separador).
O desenvolvimento de testes imunológicos de qualidade requer a produção de reagentes confiáveis, especialmente anticorpos que apresentem boa especificidade em relação ao reconhecimento antigênico. O surgimento da tecnologia do hibridoma, aliada à tecnologia do DNA recombinante, permitiu a produção de grande variedade de anticorpos monoclonais para uso diagnóstico e terapêutico. Os hibridomas são células híbridas originadas por meio da fusão de plasmócitos de um único clone de linfócitos B, com células de mieloma, o que confere às células obtidas uma grande capacidade de proliferação aliada à produção de anticorpos específicos contra um único determinado tipo de antígeno.
O funcionamento do laboratório clínico deve ser pautado em medidas que priorizem o padrão de qualidade dos resultados fornecidos e, para isso, deve levar em conta as boas práticas laboratoriais e as normas de biossegurança vigentes. É imprescindível que os laboratórios possuam POPS específicos para todas as etapas da rotina laboratorial, incluindo não somente os procedimentos técnicos dos exames, mas também as atividades de manutenção e limpeza. O controle da qualidade dos equipamentos e reagentes também deve ser rígido. 
Em termos de biossegurança, devem ser tomadas medidas que visem tanto a contenção primária quanto secundária, além da elaboração do mapa de risco com a representação gráfica dos potenciais riscos físicos, químicos, ergonômicos e biológicos presentes em cada ambiente do estabelecimento. As barreiras primárias, com uso de EPIs e EPCs, também são essenciais para a proteção dos profissionais e devem fazer parte da rotina diária do laboratório.