IMUNOLOGIA CLINICA - MATERIAL COMPLETO

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Objetivos
Seção 2 de 5
UNIDADE 1.
Laboratório clínico de imunologia: conceitos e definições
Natália Prearo Moço
OBJETIVOS DA UNIDADE
· Definir conceitos importantes para o estudo de sorologia;
· Fornecer bases teóricas para o preparo de soluções e diluições;
· Relembrar conceitos de imunologia humoral básica;
· Descrever os tipos de força que regem a formação dos imunocomplexos;
· Fornecer base teórica sobre produção e aplicações de anticorpos monoclonais;
· Descrever as boas práticas do laboratório clínico;
· Descrever parâmetros empregados para análise da qualidade de imunoensaios.
TÓPICOS DE ESTUDO
 
Introdução ao laboratório de imunologia clínica–
// Sorologia: conceitos, definições e obtenção da amostra de soro
// Soluções: concentração e diluição
Interação antígeno-anticorpo, anticorpos monoclonais e imunização–
// Relembrando conceitos básicos em imunologia
// Tipos de forças envolvidas na interação antígeno-anticorpo
// Anticorpos monoclonais: obtenção por hibridomas e aplicações
// Imunização ativa e passiva
Boas práticas e controle de qualidade laboratorial–
// Boas práticas em laboratório e noções básicas de biossegurança
// Parâmetros e controle de qualidade nos imunoensaios
Introdução ao laboratório de imunologia clínica
A imunologia clínica é uma área extremamente importante que emprega o conhecimento do sistema imune e dos mecanismos de resposta imunológica para diagnosticar e compreender diversas patologias humanas. 
O sistema imune, definido como o conjunto de células e moléculas responsáveis pelo desencadeamento da imunidade, é essencial para manutenção da homeostasia, uma vez que atua constantemente na tentativa de manter o organismo livre de agentes patogênicos, sejam eles de origem infecciosa ou não. 
De acordo com Abbas, Lichtman e Pilai, em Imunologia celular e molecular, publicado em 2015, quando o sistema imune identifica e reconhece componentes microbianos e agentes estranhos não infecciosos, tais como células necróticas e tumorais, ocorre uma ação conjunta de células imunes e moléculas presentes no soro para elaboração de uma resposta contra as ameaças detectadas. 
No contexto da imunologia clínica, diversos exames laboratoriais complementares são realizados com intuito de auxiliar no diagnóstico clínico de patologias humanas. Estes testes laboratoriais, em sua grande maioria, avaliam a presença e a interação dos antígenos com componentes celulares e moleculares do sistema imune, principalmente de anticorpos e linfócitos.
Dessa forma, a imunologia clínica tem como objetivo o estudo da resposta imunológica frente às doenças infecciosas, além do estudo da ativação anormal do sistema imune em casos de autoimunidade, reações de hipersensibilidade, imunodeficiências e crescimento anormal de células de fenótipo maligno.
Adicionalmente, a imunologia clínica visa o entendimento da modulação do sistema imune por meio de fármacos diversos, em especial os empregados para inibição da rejeição de transplantes. Por fim, ela estuda o desenvolvimento de vacinas e outros agentes imunizantes que são essenciais para a prevenção de doenças infecciosas, conforme pontuam Voltarelli e outros autores, em Imunologia clínica na prática médica, publicado em 2009.
SOROLOGIA: CONCEITOS, DEFINIÇÕES E OBTENÇÃO DA AMOSTRA DE SORO
Um dos mais importantes ramos da área é a sorologia, definida como o estudo analítico do soro sanguíneo. Na prática, um exame sorológico é aquele que visa identificar e quantificar a presença de antígenos e anticorpos no soro de um(a) paciente. Mas antes de se compreender a fundo os exames sorológicos, é preciso relembrar o que é o soro.
O sangue é um tecido conjuntivo formado por elementos celulares e plasma, que podem ser facilmente separados entre si por meio de centrifugação. Após centrifugação simples, observa-se que aproximadamente 45% do volume sanguíneo corresponde aos eritrócitos, também chamados de hemácias. Logo acima dos eritrócitos, sedimenta-se a camada leucoplaquetária, composta por leucócitos e plaquetas. Sobre o sedimento celular, é possível encontrar a fração sobrenadante, que corresponde à parte líquida do sangue, denominada plasma (Figura 1).
Conforme pontuado por Kierszenbaum, em Histologia e biologia celular: uma introdução à patologia, publicado em 2016, o plasma contém diversos elementos orgânicos e inorgânicos, tais como: 
· Aminoácidos;
· Proteínas;
· Lipídios;
· Vitaminas;
· Hormônios;
· Fatores de coagulação;
· Sais minerais.
Figura 1. Sangue total e componentes do sangue após centrifugação. Fonte: Shutterstock. Acesso em: 19/01/2021. (Adaptado).
Em termos práticos, o plasma corresponde in vivo à parte líquida do sangue que contém fibrinogênio e fatores de coagulação entre seus componentes. A obtenção de plasma in vitro por centrifugação requer a adição de anticoagulantes à amostra de sangue. Por outro lado, quando a amostra é coletada na ausência de anticoagulantes, os elementos celulares formam um coágulo de sangue juntamente com o fibrinogênio e os fatores de coagulação.
Sendo assim, após a centrifugação de uma amostra de sangue sem anticoagulantes, obtêm-se o soro, que nada mais é que a parte líquida do sangue sem a presença de fibrinogênio e fatores de coagulação.
Na rotina de um laboratório de análises clínicas, os principais anticoagulantes empregados para obtenção de plasma incluem ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), heparina e citrato de sódio. A escolha do tipo de anticoagulante usado depende diretamente do teste que será feito com a amostra de plasma.
EDTA
O EDTA, indicado para amostras destinadas à realização do hemograma, é um quelante de cálcio que atua sequestrando os íons Ca2+ presentes no plasma, o que resulta no bloqueio da agregação plaquetária e da cascata de coagulação. Em termos comerciais, o EDTA é disponibilizado como um spray seco com aderência na parede dos tubos, que pode estar nas formas dipotássico (EDTA-K2), tripotássico (EDTA-K3) ou dissódico (EDTA-Na2), com pequenas diferenças de uso entre eles, conforme pontuam Silva e outros autores, em Hematologia laboratorial: teoria e procedimentos, publicado em 2016.
Heparina
A heparina é um mucopolissacarídeo que bloqueia a cascata de coagulação por meio da interação com a molécula de antitrombina, importante anticoagulante natural plasmático. Tal interação resulta na inibição dos fatores de coagulação Xa, IXa e trombina, o que aumenta significativamente a ação anticoagulante da antitrombina. O uso de tubos de coleta de sangue com heparina é indicado principalmente para testes de bioquímica e também para imunofenotipagem leucocitária, uma vez que tal anticoagulante preserva a viabilidade dos leucócitos por até 24 horas.
Citrato de sódio
O citrato de sódio, indicado como anticoagulante de escolha para testes de coagulação, atua como agente quelante de cálcio. Ao sequestrar os íons Ca2+ presentes na circulação, o citrato impede diretamente a continuidade da cascata de coagulação.
Para facilitar a rotina e reduzir o risco de erros pré-analíticos, os tubos de coleta de sangue apresentam padronização das tampas, de acordo com o tipo de aditivo presente. Dessa forma, os tubos com EDTA, heparina e citrato de sódio possuem tampas roxa, verde e azul, respectivamente. Já os tubos para obtenção de soro, que podem ser secos ou com adição de ativador de coágulo, apresentam tampa vermelha. 
Há, ainda, os tubos para obtenção de soro com gel separador, que apresentam tampa amarela. Outra importante padronização durante as etapas pré-analíticas é a ordem dos tubos de coleta de sangue, que visa impedir a contaminação da amostra com aditivos, microrganismos e líquido tecidual.
De acordo com Andriolo e outros autores, em Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial para coleta de sangue venoso, publicado em 2010, a ordem atualmente aceita foi determinada pelo documento H3-A6 do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) e pode ser observada no Quadro 1.
Quadro 1. Padronização da ordem dos tubos de coleta de sangue.
Outro aspectoa ser considerado antes da coleta de sangue é o material do tubo, que pode ser de vidro ou de plástico. Os tubos de vidro foram considerados padrão-ouro por muitos anos nos laboratórios clínicos, entretanto, com a crescente preocupação com biossegurança, o uso de tubos de plástico tem ganhado força, uma vez que são mais resistentes, toleram maiores velocidade de centrifugação e geram menores quantidades de resíduo após incineração. 
No contexto da sorologia, as opções disponíveis para coleta de sangue são tubo de vidro seco siliconado (tampa vermelha), tubo de vidro com ativador de coágulo e gel separador (tampa amarela), tubo de plástico com ativador de coágulo sem gel separador (tampa vermelha) e tubo de plástico com ativador de coágulo e gel separador (tampa amarela). 
Após a coleta do sangue nos tubos específicos, é necessário aguardar um determinado período de tempo para que ocorra a coagulação e a retração do coágulo antes que seja feita a centrifugação para obtenção do soro.
Para amostras coletadas em tubos de vidro siliconado, deve-se aguardar aproximadamente 60 minutos, já para os tubos com ativador de coágulo (com ou sem gel separador), o tempo de espera é reduzido para 30 minutos. Logo após esse período, os tubos devem ser submetidos à centrifugação entre dez a quinze minutos com rotação aproximada de 1000–3000 g (ANDRIOLO et al., 2010).
SOLUÇÕES: CONCENTRAÇÃO E DILUIÇÃO
As soluções são definidas como misturas homogêneas compostas por duas ou mais substâncias, nas quais a substância dissolvida é chamada de soluto e a substância que dissolve é chamada de solvente. De modo simplificado, a concentração de uma solução representa a quantidade de soluto presente em uma certa quantidade de solvente. 
Vale salientar que existem diferentes tipos de concentração, uma vez que as unidades de medida das substâncias envolvidas na solução podem ser diferentes. 
A concentração comum ou concentração em massa é aquela determinada pela relação entre a massa do soluto e o volume do solvente, que tem como unidade no Sistema Internacional (SI) gramas por litro (g/L):
A densidade, cuja unidade no SI é dada em gramas por microlitro (g/mL), é determinada pela relação entre a massa total e o volume total da solução:
Por fim, tem-se a concentração molar ou molaridade, que é determinada pela relação entre o número de mols do soluto e o volume total da solução cuja unidade no SI é dada em mol/L:
A capacidade que um soluto tem se ser diluído em determinado solvente é chamada de coeficiente de solubilidade, e, em termos gerais, uma solução concentrada é aquela cuja quantidade de soluto é maior do que a quantidade de solvente. Já uma solução diluída é aquela cuja quantidade de soluto é menor do que a quantidade de solvente. 
Dessa forma, quando se quer aumentar a concentração de uma solução, deve-se aumentar o soluto ou reduzir o solvente; por outro lado, quando se quer diluir uma concentração, deve-se aumentar a quantidade de solvente.
Nesse contexto, é possível definir diluição como o procedimento de redução da concentração de uma solução por meio de adição de solvente, sem alterar a quantidade de soluto. Na prática, a diluição de uma solução costuma ser indicada pelo fator de diluição.
Por exemplo: quando se faz uma diluição de fator 10 de uma determinada solução, entende-se que a solução foi diluída 1/10 ou 1:10 (leia-se 1 para 10), ou seja, em dez partes da solução, uma parte é de soluto e nove partes são de solvente. Da mesma forma, para preparar uma diluição 1:5, utiliza-se uma parte de soluto para quatro partes de solvente, e assim por diante.
EXEMPLIFICANDO
Suponha que você tenha comprado um kit de ELISA para dosagem de prolactina. No kit, a maioria dos reagentes veio pronto para uso, entretanto, um deles veio concentrado 10x. Nesse caso, como se deve preparar 10 ml do reagente de uso? Bem, antes de usar esse reagente, você deve diluir 1:10 para que atinja a concentração desejada. Para isso, basta usar uma alíquota de 1 mL do reagente concentrado (uma parte) e diluir em 9 mL de diluente (nove partes), formando assim uma solução diluída de 10 mL (dez partes).
Um tipo de diluição muito empregada na rotina laboratorial é a chamada diluição seriada, que representa um procedimento de diluição progressiva na qual o fator de diluição é rapidamente amplificado, o que permite obter soluções com concentrações bem reduzidas de forma eficaz, além de ser extremamente útil quando o volume da solução inicial é escasso. 
Nas diluições seriadas, a alíquota (amostra que será diluída) é sempre proveniente do material diluído na etapa anterior e o fator de diluição final é o produto dos fatores de diluição em cada etapa. Por exemplo, se você preparar uma diluição 1:2 (fator de diluição 2) a partir de uma solução-estoque. Para fazer uma diluição seriada, você deve diluir novamente essa solução no fator 2, obtendo uma nova solução que agora estará diluída 1:4.
Após diluir novamente essa nova solução 1:4, você terá uma solução 1:8, e assim por diante. Apesar da diluição seriada no fator 2 ser a mais comum, outros fatores podem ser empregados, conforme podemos observar na Figura 2, que demonstra uma diluição seriada de fator 10.
Observe que, para preparar a diluição A, utilizou-se 1 mL da solução estoque e 9 mL de diluente, originando uma diluição 1:10. Em seguida, 1 mL da solução A foi acrescentado em outro tubo contendo 9 mL de diluente, o que formou uma diluição B de 1:100. Essa solução B foi utilizada para preparar a solução C, com adição de 1 mL em 9 mL de diluente, dando origem à diluição de 1:1000. Por fim, 1mL da solução C foi adicionado em 9 mL de diluente, o que originou a solução D com diluição 1:10000.
Figura 2. Esquematização de diluição seriada. Fonte: Shutterstock. Acesso em: 20/01/2021. (Adaptado).
Interação antígeno-anticorpo, anticorpos monoclonais e imunização
O estudo da imunologia clínica requer uma base adequada de conhecimentos sobre imunologia básica, principalmente no que se refere à interação entre antígenos e anticorpos, que é o ponto crucial para o desenvolvimento dos imunoensaios empregados na rotina de um laboratório clínico.
Nesse contexto, torna-se de importante relembrar diversos conceitos básicos de imunologia, como antígeno, epítopo, imunógeno e anticorpo, além de compreender os tipos de forças presentes na formação do complexo antígeno anticorpo, também conhecido como complexo imune ou imunocomplexo.
Adicionalmente, várias técnicas laboratoriais empregadas requerem a produção artificial de anticorpos específicos contra determinados antígenos. A produção de uma grande variedade de anticorpos monoclonais com diferentes especificidades se tornou possível por meio do desenvolvimento da tecnologia do hibridoma, em 1975, o que representou um grande avanço científico que tem sido amplamente empregado desde seu surgimento. 
Por fim, outro aspecto importante no estudo da imunologia clínica é o entendimento dos diferentes tipos de imunização e agentes imunizantes. O processo de imunização, tanto ativa quanto passiva, pode ser conferido de modo não natural aos indivíduos, o que torna possível o controle de inúmeras doenças de origem infecciosa (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2015; LEVINSON, 2014).
RELEMBRANDO CONCEITOS BÁSICOS EM IMUNOLOGIA
Para compreender a formação dos complexos imunes, primeiramente é necessário relembrar conceitos importantes de imunologia básica, o que facilitará o entendimento da interação antígeno-anticorpo. 
Os antígenos são substâncias que apresentam capacidade de se ligar de modo específico aos anticorpos ou aos receptores dos linfócitos T, que atuam como componentes do sistema imune adaptativo. 
Já os anticorpos, também chamados de imunoglobulinas (Ig), são proteínas globulínicas produzidas por plasmócitos derivados de linfócitos B capazes de se ligar especificamente aos antígenos que desencadeiam sua produção durante a resposta imune adaptativa.
As imunoglobulinas desempenham diversos papéis na imunidade adaptativa humoral, dentre as quais se destacam neutralizaçãode microrganismos, opsonização e consequente facilitação da fagocitose de patógenos, além da ativação do sistema complemento pela via clássica.  
Em termos estruturais, as moléculas de imunoglobulina são simétricas, com formato semelhante à letra Y e compostas por quatro cadeias polipeptídicas: duas cadeias leves idênticas com cerca de 25 kDa e duas cadeias pesadas também iguais entre si, com 50-70 kDa cada. Todas as cadeias da molécula do anticorpo apresentam regiões constantes, que são essenciais para as funções efetoras, e regiões variáveis, que atuam no reconhecimento específico dos epítopos.
Dessa forma, o sítio de reconhecimento dos antígenos está localizado na justaposição das regiões variáveis das cadeias leve e pesada nas imunoglobulinas (Figura 3).
Diferenças na composição peptídica das regiões variáveis das imunoglobulinas são essenciais para determinar a especificidade do reconhecimento antigênico. Entretanto, epítopos muito semelhantes podem desencadear uma reação cruzada, na qual o sítio de reconhecimento se liga a um antígeno diferente daquele para o qual foi especificamente produzido.
	Figura 3. Esquematização da estrutura básica das imunoglobulinas. Fonte: Shutterstock. Acesso em: 20/01/2021. (Adaptado).
Diferenças na organização estrutural das regiões constantes das cadeias pesadas determinam a existência de cinco diferentes classes de imunoglobulinas, denominadas IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.
IgA
Anticorpos da classe IgA são encontrados na forma de monômeros e dímeros no soro e na forma secretada nos fluidos corporais, como saliva, leite, lágrimas e suor. Sua função primordial é atuar na proteção de superfícies mucosas.
IgD e IgE
Os anticorpos da classe IgD e IgE são encontrados apenas na forma de monômeros.
Enquanto os IgDs atuam como receptores de superfície de linfócitos B, os pertencentes à classe IgE estão presentes no soro ou ligados aos mastócitos e basófilos, e atuam nas reações de hipersensibilidade de tipos I (também conhecidas como hipersensibilidade imediata ou alergia) e na defesa do organismo contra parasitas helmínticos.  
IgG
As IgGs, classe de imunoglobulinas predominante no soro, são anticorpos monoméricos encontrados tanto na forma secretada quanto na forma de membrana. Entre as funções da IgG na imunidade humoral, incluem-se opsonização de microrganismos, ativação do sistema complemento e citotoxidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). Outra característica importante da IgG é que essa classe é a única com capacidade de atravessar a barreira transplacentária.
IgM
Por fim, os anticorpos da classe IgM podem ser encontrados na forma de monômeros, quando atuam como receptores de linfócitos B, e na forma de pentâmeros no soro. A conformação pentamérica da IgM faz com que cada molécula desse anticorpo apresente dez sítios de reconhecimento antigênico, o que permite a aglutinação de partículas infecciosas. Além disso, a IgM é capaz de ativar o sistema complementar pela via alternativa (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2015; LEVINSON, 2014).
EXPLICANDO
Os anticorpos IgG predominam no soro de recém-nascidos, uma vez que são os únicos capazes de atravessar a placenta. Como são originadas pelo sistema imune materno, atuam somente na proteção contra patógenos que a mãe já tenha encontrado durante a vida, seja de modo natural ou por meio de imunização ativa.
Diversos tipos de moléculas biológicas simples e complexas podem atuar como antígenos, tais como carboidratos, lipídios, ácidos nucleicos e proteínas. Entretanto, a região dos anticorpos responsável pelo reconhecimento antigênico é bem menor do que a grande maioria das macromoléculas e, dessa forma, apenas uma pequena porção do antígeno realmente se liga ao anticorpo. 
Essa região delimitada do antígeno que se liga diretamente à molécula do anticorpo é denominada determinante antigênico ou epítopo. Quando um antígeno apresenta um único epítopo, é chamado de monovalente, já os antígenos que possuem vários epítopos idênticos são denominados multi ou polivalentes. 
O termo imunógeno descreve toda e qualquer molécula que apresenta capacidade de desencadear uma resposta imunológica quando reconhecida pelo sistema imune. Embora todo imunógeno seja um antígeno, o inverso não é verdadeiro, pois alguns antígenos pequenos, chamados de haptenos, conseguem se ligar aos anticorpos, mas não são capazes de estimular a montagem de uma resposta imunológica específica. 
Isso ocorre porque, apesar da possível interação com anticorpos, os haptenos não conseguem ativar linfócitos T auxiliares devido à incapacidade de se ligar às proteínas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) (ABBAS; LICHTMAN; PILAI, 2015; LEVINSON, 2014.).
TIPOS DE FORÇAS ENVOLVIDAS NA INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO
O reconhecimento do antígeno pela molécula de anticorpo ocorre na justaposição das regiões variáveis das cadeias leve e pesada e, para que isso ocorra, é necessária a formação de uma ligação covalente reversível. 
A reversibilidade da interação antígeno-anticorpo está diretamente relacionada a fatores como pH extremo, concentrações elevadas de sal, presença de detergentes e competição por altas concentrações do epítopo.
A ligação covalente reversível entre antígeno e anticorpo é resultante de diversos tipos de interações, que incluem forças eletrostáticas, pontes de hidrogênio, forças de van der Waals e ligações hidrofóbicas. 
Forças eletrostáticas
As forças eletrostáticas representam a interação entre duas cargas elétricas por meio de atração (quando as cargas são iguais) ou repulsão (quando as cargas são opostas).
Forças de van der Waals
Já as forças de van der Waals, por sua vez, são forças intermoleculares resultantes da união entre nuvens de cargas elétricas opostas presentes no antígeno e no anticorpo, as quais podem ser do tipos dipolo-dipolo, dipolo induzido-dipolo induzido e ligações de hidrogênio.
Pontes de hidrogênio
As ligações ou pontes de hidrogênio são forças intermoleculares permanentes, nas quais o polo positivo é sempre o hidrogênio e o polo negativo pode ser nitrogênio, oxigênio ou flúor (FORTE, 2015; ABBAS; LICHTMAN; PILAI, 2015).
Para avaliar a força da interação entre o antígeno e a molécula de anticorpo, são empregados os conceitos de afinidade, avidez e valência. 
Afinidade–
A afinidade de um anticorpo é determinada pela força de ligação entre uma única região de reconhecimento na molécula de imunoglobulina e o epítopo do antígeno. Como antígenos polivalentes apresentam vários epítopos em sua estrutura, a força da ligação do antígeno ao anticorpo é decorrente da interação de todos esses epítopos com as regiões de reconhecimento disponíveis. 
Avidez–
Dessa forma, na presença de vários epítopos no mesmo antígeno, pode-se dizer que a avidez é a soma de todas as afinidades. Na prática, a avidez está mais diretamente relacionada à força de ligação entre antígeno e anticorpo, uma vez que moléculas de anticorpos como a IgM, que apresentam estrutura pentamérica, podem se ligar fortemente a antígenos polivalentes, pois apresentam grande quantidade de sítios de reconhecimento disponíveis, o que aumenta a avidez da interação.
Valência–
Por fim, a valência de um anticorpo pode ser definida como o número de epítopos que ele pode reconhecer. Lembrando que anticorpos na forma de monômeros, dímeros e pentâmeros apresentam dois, quatro e dez sítios de reconhecimento, respectivamente. 
ANTICORPOS MONOCLONAIS: OBTENÇÃO POR HIBRIDOMAS E APLICAÇÕES
Os anticorpos monoclonais (mAB, do inglês monoclonal antibody) são imunoglobulinas produzidas por um único clone de linfócitos B e, portanto, apresentam a mesma especificidade de reconhecimento de antígenos, uma vez que as imunoglobulinas produzidas por plasmócitos idênticos têm exatamente a mesma estrutura nas regiões variáveis das cadeias leve e pesada, que são responsáveis pelo reconhecimento dos epítopos antigênicos.
EXPLICANDO
Um clone de células é definido como o conjunto de células geneticamente idênticas derivadas de uma única célula precursora. Cada clone de linfócitosB apresenta o mesmo receptor de superfície (BCR, do inglês B cell receptor), que é um complexo formado por uma imunoglobulina (IgD ou IgM) e duas moléculas de sinalização denominadas Igα e Igβ.
As células clonais são observadas na composição das massas tumorais, uma vez que os tumores são originados a partir da expansão clonal de células inicialmente mutadas. Nesse contexto, um tipo específico de tumor maligno denominado plasmocitoma é formado pela proliferação excessiva e descontrolada de plasmócitos idênticos, todos produtores de um mesmo tipo de anticorpo.
A partir do estudo dos plasmocitomas produtores de anticorpos monoclonais, tornou-se possível o desenvolvimento da tecnologia dos hibridomas. Isso ocorreu no ano de 1975 e foi descoberto pelos cientistas César Milstein e Georges Köhler, que publicaram suas descobertas no artigo intitulado “Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity”. Tal descoberta rendeu aos autores o Prêmio Nobel em Medicina, no ano de 1984. 
A nova tecnologia descrita no artigo possibilitou uma revolução na produção de imunoglobulinas, o que permitiu o desenvolvimento de uma gama enorme de anticorpos monoclonais com especificidades distintas. 
A tecnologia do hibridoma, também chamada de hibridização celular somática, é baseada na formação de uma célula híbrida que resulta da fusão de plasmócitos produtores de determinado anticorpo com células tumorais de mieloma. O uso de células tumorais juntamente com os plasmócitos confere uma elevada capacidade proliferativa ao hibridoma, o que é essencial para a obtenção de grandes quantidades de anticorpos. 
A diferenciação de linfócitos B em plasmócitos produtores do tipo específico de imunoglobulina de interesse é estimulada por meio da injeção do antígeno em uma cobaia de laboratório. Após a fusão celular, a célula híbrida obtida é estimulada a proliferar, dando origem a um clone de células-filhas idênticas, todas produtoras do mesmo anticorpo monoclonal. Os hibridomas são, portanto, células híbridas com capacidade de replicação contínua e produção simultânea de imunoglobulinas específicas direcionadas contra um determinado antígeno.
Resumidamente, a produção dos hibridomas ocorre em diversas etapas sequenciais da seguinte maneira: primeiramente, é feita a administração do antígeno de interesse em camundongos, os quais se tornam imunizados e passam a produzir anticorpos específicos contra o antígeno. 
Em seguida, células do baço dos camundongos imunizados contendo plasmócitos são retiradas e incubadas na presença de células de mieloma, que são negativas para expressão do gene que codifica a enzima hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase (HGPRT). 
A incubação das células deve ser feita na presença de polietilenoglicol (PEG) diluído em meio de cultura com dimetilsulfóxido (DMSO), para que ocorra a fusão das membranas celulares. Depois da fusão, as células são transferidas para o meio de cultura HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina), que mantém a viabilidade das células que expressam HGPRT (Figura 4).
Dessa forma, as células do mieloma que não se fundiram não sobrevivem, pois expressam a enzima. Já os linfócitos B são células sensíveis à cultura e não sobrevivem por longos períodos incubados in vitro. Sendo assim, após um período de tempo, somente as células híbridas permanecem viáveis no meio HAT. 
Por fim, é feita a detecção e a quantificação das imunoglobulinas produzidas para verificar a especificidade do hibridoma produzido e, em seguida, é feita a clonagem e a preservação das células híbridas (COELHO, 2014; PRAMPERO, 2017). 
Figura 4. Tecnologia dos hibridomas para produção de anticorpos monoclonais. Fonte: TORTORA; FUNKE; CASE, 2012, p. 508.
A princípio os anticorpos monoclonais disponíveis eram produzidos em laboratório, a partir de linfócitos B isolados de camundongos sensibilizados com o antígeno de interesse. Devido à origem murina dos linfócitos B que formavam o hibridoma, a administração dos anticorpos monoclonais desencadeava uma forte resposta imune direcionada contra as imunoglobulinas administradas, com produção de anticorpos anti-imunoglobulinas pelo sistema imune do paciente. 
Tal resposta imune indesejada inativava a ação terapêutica dos anticorpos monoclonais, além de induzir possíveis reações adversas no organismo. Essa limitação do uso dos anticorpos monoclonais fez com que, inicialmente, eles fossem empregados apenas com finalidade de pesquisa científica e de diagnóstico laboratorial em imunoensaios diversos, o que aumentou significativamente a especificidade dos testes imunológicos.
Com o desenvolvimento da biotecnologia e da engenharia genética, a tecnologia para produção de anticorpos monoclonais foi progressivamente aprimorada, com o intuito de reduzir a imunogenicidade dos anticorpos monoclonais produzidos. 
Primeiramente, foram desenvolvidos anticorpos quiméricos, nos quais a tecnologia do DNA recombinante permite a substituição de partes da estrutura das imunoglobulinas murinas por humanas, com redução significativa da imunogenicidade do anticorpo produzido, conforme pontuado por Delves e colaboradores, em Roitt, Fundamentos de imunologia, publicado em 2013. 
EXPLICANDO
A tecnologia do DNA recombinante é um conjunto de procedimentos e técnicas que permite a manipulação do material genético dos organismos, com consequente alteração de determinada característica fenotípica. Em termos práticos, com essa tecnologia é possível identificar, extrair e isolar genes de interesse de uma célula doadora, que posteriormente são transferidos para outra célula que não possui tal gene em seu genoma. Dessa forma, uma molécula de DNA recombinante possui material genético de duas ou mais fontes diferentes.
Posteriormente, com o intuito de reduzir ainda mais a imunogenicidade dos anticorpos monoclonais produzidos, teve início o desenvolvimento dos chamados anticorpos humanizados. Em termos práticos, nas imunoglobulinas humanizadas os sítios de reconhecimento antigênico têm origem animal, enquanto o restante da molécula tem origem humana. 
O avanço das técnicas de engenharia genética e a tecnologia do DNA recombinante possibilitaram a produção de anticorpos monoclonais totalmente humanos, sem qualquer vestígio de origem animal em sua composição (MARQUES, 2005; MURPHY, 2014).
Desde seu desenvolvimento, os anticorpos monoclonais têm sido empregados no contexto da imunologia clínica como reagentes em testes laboratoriais para imunodiagnóstico de tumores, doenças infecciosas, problemas autoimunes e imunodeficiências. Mais recentemente, o uso dos anticorpos monoclonais para imunoterapia tem ganhado destaque, especialmente no tratamento do câncer e doenças autoimunes. 
Para nomear os fármacos de origem monoclonal, utiliza-se um padrão pré-estabelecido que facilita o entendimento do alvo terapêutico e da origem do anticorpo. De acordo com essa norma, o nome do fármaco é formado por quatro partes, sendo um prefixo, dois infixos e um sufixo.
Prefixo–
O prefixo é dado pela sílaba inicial escolhida para nomear o medicamento.
Infixo–
O primeiro infixo é usado para indicar o seu alvo de ação, enquanto o segundo infixo é relacionado à origem do anticorpo monoclonal. Os principais infixos utilizados estão demonstrados no Quadro 2.
Sufixo–
O sufixo utilizado é sempre mabe, que indica que o fármaco é um anticorpo monoclonal (SANTOS et al., 2006).
Quadro 2. Infixos empregados na nomenclatura de anticorpos monoclonais.
No Brasil, de acordo com a lista de preço de medicamentos disponibilizada pela Câmara de Regulação do Mercado de Medicamentos (CMED) da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), estão atualmente disponíveis aproximadamente 60 anticorpos monoclonais com atividade terapêutica. No Quadro 3, estão alguns dos anticorpos monoclonais mais utilizados para terapêutica no país.
Quadro 3. Principais anticorpos monoclonais (mABs) de uso terapêutico no Brasil.
IMUNIZAÇÃO ATIVA E PASSIVA
A aquisição de proteção imunológica contra doenças infecciosas, processodenominado imunização, pode ser adquirida pelo organismo de modo ativo ou passivo. 
Na imunização ativa, o desenvolvimento da resposta imunológica ocorre após a exposição ao antígeno específico, o que confere participação ativa do sistema imune do indivíduo no processo de produção de anticorpos e células T efetoras, com aquisição de resposta imune humoral e celular. Essa imunização geralmente é de longa duração, porém requer um período de tempo maior para sua elaboração. 
 
O contato com o antígeno na imunização ativa pode ocorrer de forma natural, durante infecções clínicas e subclínicas, e também de modo artificial, por meio da administração de vacinas produzidas com antígenos vivos ou inativos, além de produtos microbianos como toxinas e toxoides (Figura 5). 
Já a imunização passiva, cujo desenvolvimento não requer participação direta do sistema imune do indivíduo, é conferida após a administração de anticorpos pré-formados pelo organismo de outro hospedeiro (Figura 5). Dessa forma, o procedimento básico para imunização passiva é o recebimento de soro com imunoglobulinas que foram produzidas especificamente contra o antígeno que desencadeou a resposta imune no organismo produtor. 
 
Em casos de doenças causadas por toxinas bacterianas, como difteria, tétano e botulismo, os anticorpos pré-formados da imunização passiva são administrados pela injeção de soro contendo antitoxinas específicas que neutralizam as toxinas produzidas pelas bactérias.
Outro exemplo clássico de imunização passiva é o que ocorre nos recém-nascidos, que recebem anticorpos da classe IgG produzidos pelo sistema imune materno por meio da circulação transplacentária. A grande desvantagem da imunização passiva é que ocorre apenas imunidade humoral, com aquisição de proteção de curta duração.
Figura 5. Tipos de imunização da imunidade adquirida. Fonte: Shutterstock. Acesso em: 21/01/2021.
O soro homólogo, produzido por organismos da mesma espécie do indivíduo que irá recebê-lo, apresenta baixo risco de desencadear reações de hipersensibilidade, porém tem risco maior de transmissão de doenças infecciosas.
Por outro lado, o soro heterólogo, produzido por espécies diferentes da espécie-alvo, não traz risco de transmissão de doenças infecciosas, mas apresenta risco elevado de desencadear reações de hipersensibilidade, com possível desencadeamento de reação anafilática grave, além de deposição de imunocomplexos (LEVINSON, 2014; ABBAS; LICHTMAN; PILAI, 2015).
Boas práticas e controle de qualidade laboratorial
A compreensão de que o ambiente laboratorial é uma rede complexa de interações humanas, tecnológicas, educativas e normativas favorece a redução de erros e o aumento do padrão de qualidade do serviço prestado. 
Essa rede complexa de atividades tem sido diretamente afetada pelo progressivo avanço técnico e científico, o que possibilita um número crescente de novos exames complementares disponíveis.
Conforme pontuado por Westgard e Darcy, em “The truth about quality: medical usefulness and analytical reliability of Laboratory tests”, publicado em 2004, estima-se que aproximadamente 70% das decisões médicas sejam embasadas na análise de resultados de exames laboratoriais, o que evidencia a necessidade de emissão de resultados confiáveis para garantir maior segurança nas decisões clínicas.
Nesse contexto, o laboratório clínico deve priorizar o fornecimento de resultados fidedignos e de qualidade. Para isso, é imprescindível que todos os envolvidos na rotina laboratorial trabalhem com disciplina, organização e consciência ética, além de que respeitem as normas de biossegurança e legislação pertinente, de acordo com o tipo de atividade exercida em cada ambiente de trabalho. 
Dessa forma, pode-se concluir que a qualidade final do serviço prestado pelo laboratório clínico é resultante de um intensivo plano de ação de qualidade aliado a normas de biossegurança e programas de educação continuada de seus gestores e funcionários.
BOAS PRÁTICAS EM LABORATÓRIO E NOÇÕES BÁSICAS DE BIOSSEGURANÇA
As boas práticas laboratoriais (BPL) representam um sistema complexo de qualidade que envolve procedimentos de organização, planejamento, execução, monitoramento, registro e arquivamento de exames, com o intuito de permitir a rastreabilidade de todas as etapas da rotina e visando o padrão de qualidade dos resultados obtidos.
Uma das principais ferramentas empregadas para o cumprimento dessas boas práticas é a utilização sistemática de procedimentos operacionais padrão (POPs), que são documentos que devem conter informações detalhadas sobre todas as etapas dos processos executados durante a rotina do laboratório. Tais documentos devem ser redigidos de forma clara e precisa para que a rotina possa ser executada sempre da mesma forma e com a mesma qualidade (MOLINARO et al., 2010).
Além disso, os arquivos com os POPs do laboratório devem estar sempre disponíveis, ser de fácil acesso aos funcionários e todas as mudanças feitas na rotina laboratorial devem ser adicionadas no documento. Após a formulação inicial do POP, o ideal é que sejam feitas revisões periódicas do conteúdo para possíveis ajustes e correções.
Para a correta execução dos procedimentos laboratoriais, tanto a qualidade dos equipamentos quanto dos reagentes é de essencial importância. Todos os equipamentos devem ser periodicamente revisados e calibrados, além de necessitarem de condições ambientais favoráveis de temperatura e umidade para o funcionamento ideal.
A calibração de um equipamento é o conjunto de atividades e operações periódicas para verificar a correspondência entre os valores indicados por ele e os valores obtidos por um padrão de referência, garantindo que os resultados obtidos na rotina estejam corretos. Adicionalmente, a operação e a manutenção desses equipamentos devem ser feitas por profissionais devidamente capacitados, e todas as operações, incluindo as atividades de manutenção e limpeza, devem ser descritas em POPs específicos. 
Os materiais e reagentes empregados na rotina laboratorial também devem ser rigorosamente verificados para garantir a qualidade do serviço. É imprescindível conhecer a procedência, a validade e os meios corretos de uso e armazenamento de todas as substâncias, além de conhecer os certificados de controle de qualidade dos fornecedores.
A biossegurança pode ser definida como o conjunto de medidas, ações e metodologias que visam minimizar ou eliminar os potenciais riscos que as atividades de pesquisa, ensino, produção, tecnologia e prestação de serviços possam causar à saúde do homem, dos animais e ao meio ambiente. Todos os laboratórios, sejam eles de diagnóstico, pesquisa ou desenvolvimento, devem adotar planos de biossegurança vinculados a planos de educação continuada dos trabalhadores envolvidos.
Nesse contexto, os laboratórios clínicos de imunologia devem seguir normas rígidas de biossegurança para garantir a proteção dos profissionais, que em toda a rotina laboratorial estão em exposição constante a riscos físicos, químicos e biológicos. Vale salientar que o risco é definido como a probabilidade de concretização de uma situação de perigo, que por sua vez é definido como uma condição capaz de causar ou contribuir para o dano.
Em termos práticos, a biossegurança no Brasil pode ser dividida em duas vertentes: a biossegurança legal e a biossegurança prática. A biossegurança legal é determinada pela Nova Lei de Biossegurança, regulamentada no ano de 2005, que estabelece a Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio), cuja função primordial é tratar de questões voltadas aos organismos geneticamente modificados (OMGs) e células-tronco embrionárias. 
Já a biossegurança prática é aquela vivenciada na rotina dos estabelecimentos de saúde e laboratórios em geral, que tem como foco a administração dos riscos ocupacionais por agentes físicos, químicos, ergonômicos e biológicos no ambiente de trabalho. 
Entre os possíveis riscos físicos presentes em um laboratório clínico, destacam-se ruídos, vibrações, temperaturas extremas e radiações.Já entre os riscos químicos, incluem-se substâncias químicas presentes em poeiras, névoas, gases e vapores, além dos reagentes e ativos que podem entrar em contato com a pele e vias respiratórias. Os riscos ergonômicos consistem em movimentos repetitivos, jornada prolongada de trabalho, tensões, posições monótonas e exigência de atenção e concentração. 
Por fim, os riscos biológicos são representados por diferentes tipos de patógenos, tais como vírus, bactérias, fungos e protozoários que podem estar presentes nas amostras clínicas. De acordo com o risco potencial que representam para a saúde humana, tais microrganismos são organizados em diferentes classes, como pode ser observado no Quadro 4.  
Quadro 4. Classificação dos microrganismos quanto ao risco biológico.
Um dos mais importantes pontos a se considerar em termos de biossegurança no ambiente laboratorial são contenção e infraestrutura predial, que visam reduzir os riscos da exposição dos profissionais do estabelecimento. 
Na prática, a contenção primária diz respeito à proteção no ambiente interno, enquanto a contenção secundária atua na proteção no ambiente externo. Com o intuito de se estabelecer uma contenção eficaz, torna-se necessária a análise do ambiente para determinar quais são os tipos de risco presentes em cada um dos espaços físicos do laboratório. Após essa análise, é elaborado o chamado mapa de risco, com a representação gráfica de todos os diferentes riscos presentes no ambiente de trabalho (MOLINARO et al., 2010).
Em termos de contenção laboratorial, as barreiras primárias correspondem a equipamentos de segurança que atuam tanto na proteção individual quanto coletiva dos profissionais. A proteção individual é conferida pelo uso de equipamentos de proteção individual (EPIs), tais como luvas, jalecos e protetores oculares, que devem ser obrigatoriamente fornecidos a todos os trabalhadores que necessitem, de acordo com os riscos aos quais são submetidos.
Aos trabalhadores cabe a responsabilidade de armazenar corretamente seus EPIs e usá-los somente para os fins destinados, além de comunicar aos empregadores quando os itens não estiverem mais em condições ideais de uso. Adicionalmente, o empregador deve fornecer instruções e treinamento para o uso correto dos EPIs. 
Os equipamentos de proteção coletiva (EPCs), por sua vez, são destinados à proteção da integridade dos profissionais no ambiente de trabalho e incluem capelas de exaustão, capelas de fluxo laminar, extintores, chuveiros e lava-olhos.
As barreiras secundárias são representadas pela própria infraestrutura do estabelecimento. De acordo com o tipo de risco biológico no local, os ambientes necessitam de diferentes soluções físicas em sua infraestrutura, o que deve ser devidamente previsto no projeto arquitetônico e de instalações prediais de todos os estabelecimentos de saúde. 
Dessa forma, quanto maior o risco dos agentes microbianos manipulados no local, maiores devem ser os cuidados com as barreiras secundárias para minimizar o potencial perigo de contaminação dos profissionais. 
Para padronizar a adequação dos ambientes físicos, os laboratórios são classificados em diferentes níveis de biossegurança.
Nível de biossegurança I (NB-1)
Os laboratórios de nível de biossegurança I (NB-1) são laboratórios simples nos quais os únicos microrganismos manipulados são da classe de risco 1, o que não exige grandes soluções físicas na infraestrutura, apenas medidas como identificação do nível de biossegurança, acesso controlado ao laboratório, local exclusivo para EPIs, impermeabilização de tetos, paredes e pisos, além de autoclave com localização próxima ao laboratório.
Nível de biossegurança 2 (NB-2)
Os laboratórios de nível de biossegurança 2 (NB-2), em que pode ser feita a manipulação de patógenos das classes de risco 1 e 2, exigem infraestrutura com todos os requisitos de NB-1 mais alguns detalhes, tais como presença de lavatório para mãos na entrada e na saída, torneiras com acionamento automático (sem uso das mãos), sistema central de ventilação, vedação nas janelas, cabines de segurança biológica e adequação do uso de EPIs e EPCs.
Nível de biossegurança 3 (NB-3)
Já os laboratórios de nível de biossegurança 3 (NB-3) necessitam de maiores adequações na infraestrutura, uma vez que devem garantir a segurança durante a manipulação de microrganismos patogênicos da classe de risco 3. Nesses laboratórios, além dos requisitos básicos presentes nos estabelecimentos NB-1 e NB-2, é necessária a presença de cabines de segurança biológica com contenção por pressão negativa e filtro HEPA, roupas especiais, controle rigoroso de acesso, entrada por vestíbulo de dupla saída e cabines de exaustão externa.
Nível de biossegurança 4 (NB-4)
Por fim, os laboratórios de nível de biossegurança 4 (NB-4) são destinados à manipulação dos mais perigosos patógenos conhecidos, que pertencem à classe de risco 4, e, dessa forma, exigem grandes soluções físicas para seu correto funcionamento e adequação às normas. Entre tais exigências se destacam cabine de segurança biológica com contenção de pressão negativa e filtro HEPA, roupas especiais com pressão positiva, acesso restrito, entrada por vestíbulo de dupla saída, cabines de exaustão externa com filtros especiais e autoclave de duas extremidades.
PARÂMETROS E CONTROLE DE QUALIDADE NOS IMUNOENSAIOS
Em condições ideais, o melhor teste diagnóstico é aquele capaz de fornecer resultados corretos tanto em casos de presença quanto de ausência da doença ou condição em questão. Ou seja, por meio de um teste diagnóstico ideal, é possível detectar resultados sempre positivos em indivíduos acometidos pela doença e sempre negativos naqueles não acometidos. 
Na prática, os testes disponíveis não são perfeitos, e, portanto, cada laboratório deve ser responsável pela escolha da melhor metodologia aplicável à sua realidade, dando prioridade aos testes que sejam mais rápidos, simples, seguros, inócuos e de baixo custo.
A qualidade de um teste diagnóstico depende da análise do procedimento empregado, por meio de validação intrínseca e extrínseca do método. A validação intrínseca de um teste, que mede seu desempenho em comparação com o padrão-ouro, não está diretamente relacionada à prevalência da doença/condição, e envolve a análise dos parâmetros denominados sensibilidade e especificidade. Já a validação extrínseca envolve os parâmetros de precisão, acurácia e reprodutibilidade. 
A sensibilidade de um teste tem a ver com a capacidade de detectar os indivíduos realmente positivos para determinada condição em relação ao total de indivíduos. Em outras palavras, representa a probabilidade de o teste dar positivo dado que o indivíduo está doente, sendo estimada pela proporção de resultados positivos entre os indivíduos sabidamente doentes. Sendo assim, na prática, sabe-se que, quanto maior a sensibilidade do teste, maior será sua capacidade de detectar a doença na população. 
	Em que:
VP = verdadeiro positivo;
FN = falso negativo.
Por outro lado, a especificidade diz respeito à capacidade de detectar indivíduos realmente negativos para uma doença ou condição em relação ao total de indivíduos. Ou seja, representa a probabilidade de o teste dar negativo dado que o paciente não está doente, e é determinada pela proporção de resultados negativos entre os indivíduos sabidamente saudáveis. Na prática, a especificidade está diretamente relacionada à capacidade de detectar indivíduos sadios na população, e, quanto mais específico o teste, menores as chances de resultado falso negativo (REIS; REIS, 2002).
Em que:
VN = verdadeiro negativo;
FP = falso positivo.
Com os dados de sensibilidade e especificidade, é possível determinar dois outros importantes parâmetros: valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN). 
O valor preditivo positivo indica a probabilidade de um indivíduo com resultado positivo realmente estar afetado pela doença/condição, ou seja, representa a proporção de doentes entre todos os indivíduos com resultado positivo. 
Em que:
VPP= valor preditivo positivo;
VP = verdadeiro positivo;
FN = falso negativo.
O valor preditivo negativo indica a probabilidade de um indivíduo com resultado negativo realmente ser sadio, ou seja, refere-se à proporção de sadios dentre todos os resultados negativos.
Em que:
VPN = valor preditivo negativo;
VN = verdadeiro negativo;
FN = falso negativo.
Um bom teste diagnóstico também deve apresentar bons resultados de precisão, acurácia e reprodutibilidade. A precisão é o parâmetro extrínseco que indica se há concordância nos resultados do teste quando ele é feito várias vezes com a mesma amostra ou paciente. A acurácia refere-se à capacidade do teste em apresentar resultados muito próximos ao verdadeiro. Por fim, a reprodutibilidade representa a obtenção dos mesmos resultados quando o teste é feito com a mesma amostra, mas por pessoas e/ou locais diferentes.
SINTETIZANDO
O laboratório de imunologia clínica é de grande importância no contexto das análises clínicas, e nele são realizados diversos exames complementares que auxiliam no diagnóstico de patologias humanas. Os imunoensaios realizados nesses laboratórios são baseados, principalmente, na avaliação da presença e da interação dos antígenos com componentes celulares e moleculares do sistema imune. 
Grande parte dos imunoensaios utiliza como amostra o soro, que representa a parte líquida obtida por centrifugação do sangue coletado na ausência de anticoagulantes, fazendo com que ela não contenha fibrinogênio e fatores de coagulação entre seus componentes. Os tubos de coleta de sangue indicados para obtenção de soro podem ser de vidro ou de plástico e apresentam tampa vermelha (quando secos ou com ativador de coágulo) ou amarela (com ativador de coágulo e gel separador).
O desenvolvimento de testes imunológicos de qualidade requer a produção de reagentes confiáveis, especialmente anticorpos que apresentem boa especificidade em relação ao reconhecimento antigênico. O surgimento da tecnologia do hibridoma, aliada à tecnologia do DNA recombinante, permitiu a produção de grande variedade de anticorpos monoclonais para uso diagnóstico e terapêutico. Os hibridomas são células híbridas originadas por meio da fusão de plasmócitos de um único clone de linfócitos B, com células de mieloma, o que confere às células obtidas uma grande capacidade de proliferação aliada à produção de anticorpos específicos contra um único determinado tipo de antígeno.
O funcionamento do laboratório clínico deve ser pautado em medidas que priorizem o padrão de qualidade dos resultados fornecidos e, para isso, deve levar em conta as boas práticas laboratoriais e as normas de biossegurança vigentes. É imprescindível que os laboratórios possuam POPS específicos para todas as etapas da rotina laboratorial, incluindo não somente os procedimentos técnicos dos exames, mas também as atividades de manutenção e limpeza. O controle da qualidade dos equipamentos e reagentes também deve ser rígido. 
Em termos de biossegurança, devem ser tomadas medidas que visem tanto a contenção primária quanto secundária, além da elaboração do mapa de risco com a representação gráfica dos potenciais riscos físicos, químicos, ergonômicos e biológicos presentes em cada ambiente do estabelecimento. As barreiras primárias, com uso de EPIs e EPCs, também são essenciais para a proteção dos profissionais e devem fazer parte da rotina diária do laboratório.
UNIDADE 2.
Metodologias do laboratório de imunologia clínica
Natália Prearo Moço
OBJETIVOS DA UNIDADE
· Entender os fundamentos que regem os ensaios imunológicos;
· Compreender as técnicas e os objetivos dos diversos ensaios diagnósticos;
· Conhecer a aplicação dos ensaios imunológicos;
· Elucidar a relevância clínica dos resultados dos imunoensaios.
TÓPICOS DE ESTUDO
Fundamentos dos imunoensaios–
// Ensaios de aglutinação
// Tipos de aglutinação e aplicação laboratorial
//  Ensaio de floculação e VDRL
Imuno-hematologia: conceitos e ensaios laboratoriais–
// Sistemas, grupos e coleções sanguíneas
// Sistemas ABO, Rh e os tipos sanguíneos 
// Incompatibilidade sanguínea
Evolução metodológica dos imunoensaios–
// Técnicas baseadas na motilidade de partículas
// Técnicas de absorbância e nefelometria
// Imunoensaios conjugados
Fundamentos dos imunoensaios
No que diz respeito aos testes diagnósticos, o questionamento sobre a veracidade dos resultados está constantemente presente e, em condições ideais, o melhor teste seria aquele capaz de fornecer resultados sempre corretos, seja ao se referir a uma doença ou uma condição do paciente. Na prática, há uma contínua demanda para que o teste empregado apresente o melhor diagnóstico possível, já que, na realidade, a assertividade total ainda não é possível. Para isso, existem os critérios de qualidade que determinam a efetividade dos testes e verificam se os mesmos apresentam os padrões mínimos para a utilização clínica. 
A qualidade de um teste diagnóstico depende da análise do procedimento empregado, por meio de validações intrínseca e extrínseca do método. A validação intrínseca de um teste, que verifica seu desempenho em comparação com o padrão-ouro, não está diretamente relacionada à prevalência da doença/condição, e envolve a análise dos parâmetros denominados sensibilidade e especificidade. Já a validação extrínseca envolve os parâmetros de precisão, acurácia e reprodutibilidade.
A sensibilidade de um teste refere-se à capacidade de detectar os indivíduos que apresentam resultados verdadeiramente positivos para determinada condição em relação ao total de indivíduos. Em outras palavras, representa a probabilidade de o teste dar positivo, dado que o indivíduo está doente, sendo estimada pela proporção de resultados positivos dentre os indivíduos sabidamente doentes. Por outro lado, a especificidade refere-se à capacidade de detectar indivíduos realmente negativos para uma doença ou condição em relação ao total de indivíduos, ou seja, representa a probabilidade de o teste dar negativo, dado que o paciente não está doente e é determinada pela proporção de resultados negativos dentre os indivíduos sabidamente saudáveis. Na prática, quanto mais sensível for o teste, menor a chance de apresentar um resultado falso positivo; e quanto mais específico ele for, menor a chance de ocorrer um resultado falso negativo.
Geralmente um teste que é completamente sensível apresenta pouca especificidade, assim como um teste completamente específico é pouco sensível. O meio termo é utilizado na confecção dos testes e é determinado pelo limite de reatividade, ou limiar de reatividade. Esse parâmetro é utilizado para determinar o ponto exato em que o teste irá considerar um resultado positivo ou negativo de acordo com a reatividade da amostra. Por exemplo, sabe-se que um indivíduo que apresenta a glicose em níveis acima do valor estabelecido, nas condições exigidas pela realização do exame, tem grandes chances de desenvolver diabetes. A determinação do limiar é responsável por condicionar o indivíduo a este cenário e, por isso, deve ser determinado de maneira a considerar vários aspectos que envolvem a patologia/condição. Quanto menor o limiar, maior a chance de condicionar indivíduos saudáveis à doença, já que os critérios de sensibilidade são menores que o normal. Logo, quanto maior o limiar, maior é a chance de negligenciar indivíduos doentes, já que a especificidade exigida pelo ensaio é maior que o normal. Uma maneira de solucionarmos essa deficiência é considerar o intuito do teste a ser realizado. Se há a necessidade de um teste mais específico, aumenta-se o limiar de reatividade e vice-versa. Assim, é garantida a possibilidade de usufruirmos de mais de uma metodologia para a confirmação de casos suspeitos e, desta forma, assegurarmos um resultado de qualidade.
Outro fator importante a ser considerado na realização dos testes é a probabilidade de observar um resultado e relacioná-lo com a real condição do paciente, chamada razão de verossimilhança (likelihood ratio). Esse parâmetro permite a assimilaçãodos resultados obtidos no teste com as manifestações clínicas e queixas relatadas pelo paciente, assim como o seu histórico. O cálculo que estabelece a razão é realizado considerando a probabilidade de um indivíduo com a condição ter um resultado correto dividido pela probabilidade de um indivíduo sem a condição ter um resultado correto. 
Uma razão de verossimilhança positiva indica um aumento da probabilidade de o indivíduo possuir a doença/condição ao apresentar um resultado positivo, e é determinada pela probabilidade de o indivíduo doente apresentar um resultado positivo dividida pela probabilidade de um indivíduo sadio apresentar um resultado positivo. 
Já uma razão de verossimilhança negativa estabelece uma diminuição na probabilidade de o indivíduo possuir a doença/condição ao apresentar um resultado negativo, e é calculada pela probabilidade de uma pessoa doente apresentar um resultado negativo dividida pela probabilidade de uma pessoa sem a doença/condição ter um resultado negativo (MCDEE, 2002).
Com os dados de sensibilidade e especificidade ainda é possível determinar dois outros importantes parâmetros denominados valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN). O valor preditivo positivo indica a probabilidade de um indivíduo com resultado positivo realmente estar afetado pela doença/condição, ou seja, representa a proporção de doentes dentre todos os indivíduos com resultado positivo. Já o valor preditivo negativo indica a probabilidade de um indivíduo com resultado negativo realmente ser sadio, ou seja, refere-se à proporção de sadios dentre todos os resultados negativos.
Um bom teste diagnóstico também deve apresentar bons resultados de precisão, acurácia e reprodutibilidade. A precisão é o parâmetro extrínseco que indica se há concordância nos resultados do teste quando o mesmo é realizado várias vezes com a mesma amostra ou paciente. A acurácia, ou exatidão, refere-se à capacidade de o teste apresentar resultados muito próximos ao verdadeiro. Por fim, a reprodutibilidade representa a obtenção dos mesmos resultados quando o teste é feito com a mesma amostra, mas por pessoas e/ou locais diferentes.
Os testes sorológicos são ensaios realizados para o diagnóstico de doenças por meio da pesquisa de antígenos ou anticorpos específicos que representam um fenótipo para um determinado indivíduo, e as metodologias utilizadas exploram um dos princípios da imunologia clínica, os imunocomplexos formados pela ligação entre um anticorpo e um antígeno. Ao elucidarmos a interação entre estes dois componentes, é possível compreender que esses testes são capazes de identificar tanto antígenos, a partir da utilização de anticorpos específicos, quanto anticorpos, a partir da utilização de antígenos ou até mesmo outros anticorpos. 
É importante ressaltar que a detecção de anticorpos ou antígenos ligados a alguma doença não identifica o indivíduo necessariamente como doente. No caso da vacinação, que consiste em um processo de imunização ativa que induz o organismo a produzir anticorpos contra determinada doença, os testes sorológicos podem ser utilizados para comprovar a memória imunológica e, consequentemente, comprovar o sucesso da imunização. Por exemplo, em uma pessoa vacinada contra a hepatite B, se quantificarmos os anticorpos específicos contra o vírus certo tempo após a administração da vacina, o resultado será reagente, o que não indica doença e, sim, um processo de imunização eficiente.
Dessa forma, os resultados obtidos nos imunoensaios não devem qualificar diretamente a condição do paciente, já que os exames servem como embasamento para a suspeita clínica determinada pelo médico. Além disso, é preciso considerar o contexto obtido por meio da consulta médica, com as queixas do paciente, histórico e condições de saúde naquele momento (COELHO, 2014; DELVES; ROITT, 2013; WILLIAMSON, 2013; VAZ e colaboradores, 2007).
ENSAIOS DE AGLUTINAÇÃO
A aglutinação é um método utilizado em laboratório clínico que emprega antígenos e anticorpos para induzir a agregação de pequenas massas com o conteúdo de interesse. Além de permitir uma análise qualitativa, que fornece resultados negativos ou positivos, a aglutinação pode ser feita de modo semiquantitativo, no qual é apresentado o último título positivo da diluição. Os ensaios de aglutinação são rápidos e podem ser realizados dentro de poucos minutos, apresentam baixo custo e utilizam poucos recursos para a obtenção e interpretação dos resultados. Todavia, são técnicas que detêm baixa sensibilidade se comparadas a outros tipos de imunoensaios (WILLIAMSON, 2013; VAZ e colaboradores, 2007). 
Uma reação de aglutinação é composta por duas partículas representadas pelos anticorpos e os antígenos (Diagrama 1). Os anticorpos estão presentes no soro e são as moléculas que se ligam aos antígenos de interesse. Os antígenos estão presentes na superfície de células ou dispersos no soro na forma de proteínas e macromoléculas, porém, nos ensaios de aglutinação, tanto os anticorpos quanto os antígenos podem estar aderidos a uma superfície, e o que determina isso é o objetivo do teste. Estes podem ser aderidos naturalmente nas células como ocorre nas hemácias, nas quais há antígenos que determinam os tipos sanguíneos, ou artificialmente, por meio da ligação em estruturas de suporte presentes nos testes de aglutinação indireta. Esses suportes são partículas inertes de plástico, gelatina, carvão ou látex, que permitem a adsorção de componentes a sua superfície, de maneira que fiquem expostos para as ligações. Ao fim de um ensaio de aglutinação, se houver a ligação entre anticorpos e antígenos, há a produção de um aglomerado nítido a olho nu (MINEO e colaboradores, 2016; WILLIAMSON, 2013).
EXPLICANDO
A adsorção é um processo que permite a junção de dois componentes de uma solução, mas, ao contrário da absorção, o componente adsorvido se adere à superfície do material adsorvente ao invés de ser internalizado. Os recursos utilizados para a confecção desses compostos são: altas temperaturas, pressão e superfície de contato do material adsorvente (MINEO e colaboradores, 2016).
Diagrama 1. Interação entre antígenos e anticorpos provocam aglutinação. Fonte: Shutterstock. Acesso em: 08/02/2021.
TIPOS DE ALUTINAÇÃO E APLICAÇÃO LABORATORIAL
Os ensaios de aglutinação são classificados em diretos e indiretos. A aglutinação direta é aquela na qual os antígenos estão naturalmente presentes na superfície das células, como no exemplo das hemácias. De forma contrária, as reações de aglutinação indireta apresentam os antígenos adsorvidos no suporte de maneira artificial (DELVES; ROITT, 2013). 
Dentre os ensaios de aglutinação indireta inclui-se o PCR Látex, teste que detecta a presença da proteína C reativa (PCR) no soro do paciente. A PCR é uma proteína de fase aguda produzida pelo fígado e serve como um indicador de atividade inflamatória, seja ela de origem infecciosa ou não. Em um quadro grave de infecção, os níveis da proteína podem se elevar até mil vezes em relação ao valor basal. Além disso, a determinação sorológica da PCR é útil para o avaliar a efetividade de um tratamento infeccioso, já que os seus níveis podem oscilar de maneira relativamente rápida durante a terapia (MINEO e colaboradores, 2016; VAZ e colaboradores, 2007). 
O reagente do teste PCR Látex é composto por um suporte de látex com anticorpos anti-PCR adsorvidos em sua superfície, que possuem especificidade a proteína, ou seja, quanto maior o volume da PCR no soro do paciente, maior a aglomeração formada na placa onde o teste é realizado. A sensibilidade técnica deste teste geralmente é próxima de 6 mg/dL, portanto, se o paciente possui 1 mg/dL da proteína, não haverá aglutinação. Logo, a não reatividade do ensaio não significa, necessariamente, a ausência da proteína. Nesses casos, o resultado é representado pela frase “menor que 6 mg/dL. Por outro lado, quando há a presença de aglutinação (Figura 1), é necessário realizar a diluição do soro por titulação. Geralmente a titulação destesensaios é feita no fator 2 e o resultado é obtido de forma semiquantitativa ao multiplicarmos o valor do último título reagente pela sensibilidade técnica. Por exemplo, se o título 1:4 foi o último reagente, então, para a análise semiquantitativa, deve-se multiplicar 46 =24mg/dL (WILLIAMSON, 2013; VAZ e colaboradores, 2007).
No contexto dos ensaios de aglutinação, é preciso ter em mente algumas considerações sobre o conceito de antígeno, já que em alguns destes ensaios, os anticorpos são os antígenos de interesse pesquisados no teste. O antígeno pode ser qualquer substância que se ligue de maneira específica aos anticorpos ou aos receptores dos linfócitos T, sejam eles proteínas, lipídios, entre outros. Tendo em vista que os anticorpos são imunoglobulinas, ou seja, compostos de origem proteica, é possível que eles sejam reconhecidos por outros anticorpos, desde que haja especificidade para tal (ABBAS; LITCHMAN; PILLAI, 2015).
Figura 1. Placa para testes de aglutinação em látex com amostra reagente e não reagente. 1. reagente; 2. não reagente. Fonte: Shutterstock. Acesso em: 08/0/2021.
Outros importantes imunoensaios de aglutinação indireta da rotina laboratorial são o FR Látex e o ASLO Látex. O FR Látex é utilizado para determinar a presença de fatores reumatoides (FR) no soro do paciente, que são anticorpos IgG, IgM ou IgA que reconhecem anticorpos IgG próprios e, com isso, causam a formação excessiva de imunocomplexos que são depositados nas articulações sinoviais e extremidades do corpo, como dedos das mãos e dos pés. Os fatores reumatoides estão presentes em cerca de 70% dos pacientes que têm artrite reumatoide, mas não são considerados um achado específico da doença. Outras doenças como lúpus eritematoso sistêmico, tuberculose e sífilis também podem apresentar níveis elevados dos autoanticorpos (ABBAS; LITCHMAN; PILLAI, 2015).
O princípio do teste FR Látex se baseia em um reagente com suporte de látex revestido com anticorpos IgG humanos. Se o soro do paciente apresentar os FR, a reação de aglutinação será provocada. A sensibilidade técnica do imunoensaio geralmente é de cerca de 8 UI/mL, logo, pacientes com uma concentração menor do que esse valor não apresentarão reatividade e, nesses casos, o resultado é descrito como “inferior a 8 UI/mL. Em resultados positivos, deve-se seguir a orientação de utilizar o último título reagente multiplicado pelo valor da sensibilidade técnica (MINEO e colaboradores, 2016; WILLIAMSON, 2013).
Outra possível técnica para determinação sorológica dos FR é chamada de Waaler Rose (WR), e consiste no uso de dois reagentes coloridos para auxiliarem na interpretação do resultado. Diferentemente do FR Látex, um dos reagentes possui hemácias de carneiro e o outro possui anticorpos IgG de coelho sensibilizados contra hemácias de carneiro. Assim que ambos entram em contato, os anticorpos de coelho se ligam às hemácias de carneiro e, com a adição do soro do paciente, haverá a formação de aglomerados, caso haja a presença de FR. A não reatividade se apresenta em uma coloração homogênea, já a reatividade demonstra a formação de grumos heterogêneos de coloração diferenciada (MINEO e colaboradores, 2016; VAZ e colaboradores, 2007).
EXPLICANDO
O uso de anticorpos de coelho específicos contra células de carneiro é possível por conta da sensibilização. Ao injetarmos uma solução com hemácias de carneiro no coelho, há a indução da produção de anticorpos específicos, que ficam circulantes no soro, os quais são extraídos e utilizados no meio laboratorial.
Por fim, o ASLO Látex é um teste de aglutinação indireta que emprega um suporte de látex sensibilizado com o antígeno estreptolisina que detecta a presença de anticorpos anti-estreptolisina O (ASLO) no soro do paciente. Ao entrar em contato com a toxina estreptolisina O, o sistema imune do indivíduo produz o ASLO e essa substância pode ser detectada e semiquantitativa por meio de titulação, assim como os testes anteriores. A sensibilidade técnica é de cerca de 200 UI/mL, logo, os resultados não reativos devem ser relatados como “inferior a 200 UI/mL, enquanto os reativos devem apresentar o último título multiplicado pelo valor da sensibilidade técnica. A estreptolisina O é uma toxina produzida pela bactéria Gram-positiva Streptococcus pyogenes, que comumente provoca infecções de garganta, faringite e amidalite, e, em casos mais severos, pode ocasionar uma reação cruzada que leva a febre reumática. A febre é consequência de uma resposta imune do nosso corpo a uma proteína bacteriana chamada proteína M, que é muito semelhante às proteínas presentes em diversos tecidos, como o cardíaco, subcutâneo e nervoso. Ao confundir os alvos, o sistema imune provoca uma resposta imune mal direcionada que resulta em inflamação nesses tecidos, como a miocardite (ABBAS; LITCHMAN; PILLAI, 2015; VAZ e colaboradores, 2007).
Atualmente, existem técnicas alternativas com equipamentos automatizados para a quantificação de PCR, FR e ASLO no soro, que ainda utilizam a metodologia da aglutinação com suporte de látex, mas são capazes de quantificar valores decimais dessas proteínas por meio da combinação de outras metodologias que proporcionam maior precisão e sensibilidade (VOLTARELLI e colaboradores, 2009).
ENSAIO DE FLOCULAÇÃO E VDRL
Semelhante a aglutinação, a floculação é resultado de uma aglomeração de partículas presentes no exame Venereal Desease Research Laboratory (VDRL), que serve de triagem para a sífilis. A doença é uma infecção sexualmente transmissível (IST) causada pela bactéria Treponema pallidum e é definida como uma infecção sistêmica que provoca úlceras genitais, lesões de pele e complicações neurológicas, conhecidas como neurossifílis. Além disso, se a pessoa acometida pela doença for gestante, ou se tornar uma enquanto não curada, existe o risco de transmiti-la para o feto. A chamada sífilis congênita pode provocar o aborto espontâneo e consequências neurológicas. 
Após a infecção, a presença da bactéria induz o sistema imune a produzir reaginas, que são anticorpos inespecíficos chamados de não treponêmicos, uma vez que não apresentam especificidade para o T. pallidum. As reaginas são imunoglobulinas resultantes da presença de células danificadas que induzem a ativação inespecífica do sistema imune em diversas outras condições patológicas crônicas além da sífilis, como lúpus eritematoso sistêmico, doenças hepáticas graves, hanseníase e malária. Sabe-se que elas podem ser produzidas também em usuários de drogas injetáveis.
Geralmente, a produção de reaginas nessas condições ocorre em concentrações menores que na sífilis, mas ainda assim, pode ocasionar resultados falso positivos no VDRL. Dessa forma, resultados positivos de VDRL requerem a confirmação por testes treponêmicos, os quais detectam de modo específico anticorpos produzidos contra antígenos da bactéria causadora da sífilis, especialmente o teste de imunofluorescência indireta denominado FTA-Abs (do inglês, Fluorescent Treponemal Antibody-absorption).
No VDRL, as reaginas possuem o papel de se ligarem a antígenos purificados compostos de cardiolipinas, lecitinas e colesterol, e com isso formarem os aglomerados que são visíveis no microscópio ao utilizar a objetiva de 10 vezes. Ao contrário dos testes anteriores, este é feito em uma placa de vidro, transparente e com cavidades, que permite a deposição da solução formada durante a confecção do teste, assim como a projeção da luz do microscópio para a leitura. Com o tempo, foram desenvolvidas modificações do VDRL, tais como RPR (do inglês, Rapid Test Reagin), USR (do inglês, Unheated Serum Reagin) e TRUST (do inglês, Toluidine Red Unheated Serum Test), que visam aumentar a estabilidade da suspensão antigênica, além de possibilitar a utilização de plasma e permitir a leitura do resultado a olho nu.
Uma alternativa a essa técnica é a hemaglutinação, que faz uso de hemácias de aves sensibilizadas com um antígeno bacteriano, e quando positivo provoca a aglomeração das hemácias em meio a solução, em contrapartida, quando negativoforma um botão de hemácias no fundo da placa. É mais específico que o RPR, mas ainda é considerado como um teste de triagem (WILLIAMSON, 2013; VAZ e colaboradores, 2007).
De maneira geral, a sensibilidade técnica dos testes manuais de aglutinação pode ser comprometida caso haja o efeito pró-zona, que favorece a ocorrência de resultados falso negativos. Esse fenômeno pode ocorrer caso a quantidade de anticorpos presentes no soro exceda significativamente a quantidade de antígenos disponíveis no reagente dos testes. Logo, casos positivos podem ser camuflados em casos de efeitos pró-zona, já que a solução apresenta uma leve granulação quase imperceptível a olho nu e no microscópio. A solução para esse problema é a diluição da amostra para permitir a equivalência entre os componentes presentes na solução, geralmente, feita a 1:8 (MINEO e colaboradores, 2016; WILLIAMSON, 2013; VAZ e colaboradores, 2007).
Imuno-hematologia: conceitos e ensaios laboratoriais
A imuno-hematologia é um segmento da área de imunologia clínica que estuda as interações sanguíneas nas chamadas reações de hemaglutinação, nas quais o antígeno e/ou anticorpo são pertinentes ao sangue, como em transfusões sanguíneas, análises pré-transfusionais ou doenças ocasionadas pelos processos citados (BRASIL, 2014).
No contexto da imuno-hematologia deve-se levar em conta que os eritrócitos possuem cerca de 340 antígenos distintos, que são classificados em sistemas, grupos e coleções. E existem anticorpos com especificidade correspondente para a maioria destes antígenos eritrocitários. 
Portanto, a metodologia dos ensaios de hemaglutinação pode ser interpretada como a verificação das consequências entre a interação sanguínea de pacientes diferentes, seja ela intencional ou não. Além disso, é primordial considerar o complexo principal de histocompatibilidade (MHC, do inglês Major Histocompatibility Complex) de cada paciente, uma vez que as interações entre esses receptores celulares do doador e receptor devem ser o mais específicas possível (ABBAS; LITCHMAN; PILLAI, 2015; VAZ e colaboradores, 2007).
Conceitualmente, os testes de hemaglutinação são de aglutinação direta, já que os antígenos são naturais dos eritrócitos. Os antígenos de superfície eritrocitária são chamados de aglutinogênios, enquanto os anticorpos são denominados aglutininas. Estes ensaios foram desenvolvidos para triagem das amostras sanguíneas do doador e receptor, já que o erro tem potencial de causar reações que podem levar o paciente a óbito a depender do volume de sangue transferido (DELVES; ROITT, 2013; BRASIL, 2014; WILLIAMSON, 2013; VAZ e colaboradores, 2007).
SISTEMAS, GRUPOS E COLEÇÕES SANGUÍNEAS
Existem, aproximadamente, 340 tipos de antígenos de superfície dos eritrócitos, e 308 destes estão classificados dentro dos 36 sistemas sanguíneos definidos por suas semelhanças genéticas e fenótipos apresentados. Os sistemas são categorizados por antígenos sanguíneos que são originados dos mesmos genes ou grupos de genes que os codificam. Como exemplo, temos o sistema ABO e o Rh, que são os mais famosos por terem relevância clínica. Mas além destes temos também os sistemas MNS, Kell, Lewis, Knops, entre vários outros. Dentro dos sistemas, há ainda, os grupos sanguíneos, que seguem a mesma linha de segregação de antígenos por características afins, e, como exemplo, temos os grupos sanguíneos do sistema ABO, que são denominados grupo A, grupo B, grupo AB e grupo O. Por fim, as hemácias portadoras de antígenos peculiares, que não possuem características afins, sejam genotípicas ou fenotípicas, compõem as coleções e séries sanguíneas. Estas são determinadas por tipos antigênicos que não podem ser categorizados dentro dos sistemas conhecidos.
A função exata de cada um dos antígenos presentes nos sistemas é alvo de estudo científico, justamente para buscar explicações para reações onde os sistemas ABO e Rh não conseguem embasar ocorrências anormais e as suas diferenciações são realizadas por meio de testes genéticos e bioquímicos (WILLIAMSON, 2013; VAZ e colaboradores, 2007).
SISTEMAS ABO, RH E OS TIPOS SANGUÍNEOS
Os sistemas ABO e Rh são os mais populares e considerados os de maior relevância clínica na imuno-hematologia. Os grupos do sistema ABO são responsáveis por determinar o tipo sanguíneo de uma pessoa, ou seja, se uma pessoa tem as suas hemácias com os antígenos pertencentes ao grupo B do sistema ABO, o seu tipo sanguíneo é B. Existem os tipos A, B, AB e O: o tipo A apresenta apenas antígenos do grupo A; o tipo B apresenta apenas antígenos do grupo B; o tipo AB apresenta os grupos de antígenos A e B, simultaneamente; e tipo O não apresenta nenhum deles.
Além dos antígenos que determinam o tipo sanguíneo, o sistema ABO possui anticorpos que estão presentes em cada um dos tipos (Quadro 1), e a tipagem sanguínea é o teste que determina o tipo de sangue do indivíduo, de acordo com os antígenos (aglutinogênios) e anticorpos (aglutininas) detectados (Quadro 2). Um paciente que possui eritrócitos com antígenos do tipo A, naturalmente, apresenta anticorpos anti-B. Já pacientes com hemácias com antígenos B produzem anticorpos anti-A. Esse mecanismo limita as possibilidades de interação sanguínea entre os pacientes, além de permitir que não haja um processo de aglutinação espontânea em nosso organismo, (BRASIL, 2014; VAZ e colaboradores, 2007).
Quadro 1. Tipos sanguíneos com os aglutinogênios e aglutininas.
Quadro 2. Antígenos e anticorpos nos diferentes tipos sanguíneos ABO. Fonte: Shutterstock. Acesso em: 08/02/2021.
A tipagem ABO é composta por duas etapas: i) tipagem direta, que verifica os aglutinogênios presentes nas hemácias; e ii) tipagem reversa, que verifica as aglutininas presentes no soro do paciente. A partir de ambas as provas é possível determinar o tipo sanguíneo do indivíduo em relação ao sistema ABO, conforme demonstrado no Quadro 1, porém, faz-se necessário utilizar mais de uma prova para fins confirmatórios. 
Para realização tipagem ABO direta é necessária uma amostra de sangue total, coletada em tubo com anticoagulante EDTA. A partir do sangue total é, então, obtida uma suspensão feita com um concentrado de hemácias do paciente, geralmente com 3-5% de concentração, livre de impurezas do soro. Em dois tubos diferentes, contendo a suspensão de hemácias, são adicionadas as aglutininas anti-A e anti-B. Após centrifugação, os tubos que apresentarem aglutinação representam o tipo sanguíneo do paciente (Quadro 2). Por exemplo, se o tubo em que o soro anti-A foi colocado apresentar aglutinação isoladamente, há o indicativo que o paciente possui hemácias com o antígeno A presentes na superfície, logo, ele é do tipo sanguíneo A. Assim como quando nenhum dos tubos apresentar aglutinação é possível deduzir que o paciente seja do tipo O, já que não há aglutinogênio na superfície dos eritrócitos desse tipo para provocarem a reação (BRASIL, 2014; VAZ e colaboradores, 2007).
Já a tipagem ABO reversa utiliza o soro ou plasma do paciente para a realização do teste e a solução adicionada é composta por concentrados de hemácias que têm os tipos conhecidos, ou seja, utiliza-se um reagente de concentrado de hemácias do tipo A e outro reagente de concentrado de hemácias do tipo B. Dessa forma, utiliza-se dois tubos de ensaio com o soro do paciente e, em um tubo aplica-se hemácias A e no outro tubo aplica-se hemácias B. Se o tubo com hemácias A apresentar aglutinação isoladamente, sabe-se que este paciente é do tipo sanguíneo B, já que naturalmente apresentam anticorpos anti-A. Se houver aglutinação apenas no tubo com hemácias B, sabe-se que o indivíduo tem sangue tipo A devido a presença de anticorpos anti-B. Por fim, se houver aglutinação em ambos os tubos o indivíduo é o tipo O, pois apresenta anticorpos anti-A e anti-B e se não houver aglutinação em nenhum dos tubos o tipo de sangue é AB, uma vez que não há anticorpos anti-A nem anti-B.
Sabe-se ainda que a respeito do grupo sanguíneo A, existem variações fenotípicas quantitativas e qualitativas que podem levar a uma